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Timeo danaos et dona ferentes. Hepatitis C: resistencias
y tipado.
Dr. Josep Quer
Responsable Línea de Investigación Básica en
Hepatitis C. Malalties Hepàtiques. Vall d'Hebron
Institut de Recerca /VHIR). Hospital Universitari Vall
d'Hebron (HUVH). Universitat Autònoma de
Barcelona. Ciberehd.
Cuando una persona se infecta de nuevo por el
VHC desarrolla, en el 80% de los casos, una infección
crónica de muy larga duración, que evoluciona
lentamente y puede conducir a cirrosis (20% de
pacientes a los 20-40 años desde el momento de la infección). Esta cirrosis puede
descompensarse, aparecer complicaciones (varices hemorrágicas, encefalopatía
hepática, ascitis, hepatocarcinoma) y en este momento, la única solución es el
trasplante de hígado. Cualquier tratamiento que pare la progresión del daño
hepático es coste-efectiva.
A diferencia de lo que ocurre con el virus de la Hepatitis B y el VIH que son
infecciones crónicas que nunca se curan, la infección por el virus de la Hepatitis C
(VHC) es una infección curable. De hecho, siempre ha sido una infección curable,
pero la eficacia de curación virológica (tasa de respuesta virológica sostenida
(RVS) definida como mantener el ARN del VHC negativo 12 semanas después de
parar el tratamiento, no superaba el 10% con los primeros regímenes (año1991)
de Interferón (IFN) y solo llegó al 50% con pegIFN más Ribavirina (Rbv)
(14;15;31). Actualmente, con la combinación de Antivirales de Acción Directa
(AADs), incluso en tratamientos por vía oral libres de IFN, se consiguen tasas de
RVS superiores al 90%. Los actuales AADs aprobados para uso clínico
pertenecen a cuatro grupos y actúan bloqueando la actividad de tres proteínas noestructurales cuya función es esencial para la replicación del virus:
 NS3, concretamente se inhibe la actividad Serina-proteasa NS3 (PI):
Simeprevir. Paritaprevir/ritonavir.
 NS5A, es la proteína central de control de la replicación viral y que está
involucrada en la formación y liberación de la partícula viral (NS5AI):
Ledipasvir, Daclatasvir, Ombitasvir.
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
NS5B o RNA-polimerasa -RNA dependiente (RpRd), frente a la cual
contamos con dos familias de inhibidores, los inhibidores Nuclos(t)ídicos
(NI) que bloquean el centro activo de la polimerasa, y los No-Nuclos(t)ídicos
(NNI) que actúan sobre un centro alostérico cambiando la estructura
tridimensional de la enzima: Sofosbuvir, Dasabuvir.
Los pacientes que desarrollan RVS, experimentan numerosos beneficios en su
salud, se reduce de manera significativa el riesgo de sufrir hepatocarcinoma de
novo y la muerte debida a daño hepático, mejora la fibrosis, se reduce la
inflamación y se consigue una mejora en la calidad de vida del paciente.
Las guías de tratamiento recomiendan tratar a todos los pacientes infectados
crónicamente y cuanto antes mejor.
Por tanto, contamos con un gran arsenal de inhibidores [en 2016 va a
aprobarse Grazoprevir (PI), Elbasvir (NS5AI) y Velpatasvir (NS5AI)] , con tasas de
RVS superiores al 90-95%. A pesar de estas grandes perspectivas de eliminación
del virus, y tal como dice el sacerdote troyano Laoconte a sus conciudadanos
cuando reciben el regalo del caballo de Troya: "Timeo danaos et dona ferentes",
que significa "Temos a los dánaos (griegos) incluso cuando traen regalos". A
pesar de la excelente eficacia de los tratamientos anti-VHC, la enorme carga de la
infección por VHC y su naturaleza en quasispecies va a dificultar su erradicación
en ausencia de una vacuna. Se estima que en el mundo, entre 160 (2,27%) y 170
millones de personas están crónicamente infectadas por VHC(17;21) de las cuales
tan solo el 15% están diagnosticadas. En España, la prevalencia se estima entre
1,2% (472.000) y 2% (1M) de los cuales solo el 35-40% son conscientes de ello.
Nos enfrentamos, además, a un virus que posee una enorme capacidad de
generar variabilidad. El VHC es una virus de ARN de cadena sencilla y polaridad
positiva de 9.6Kb, que posee una elevada tasa de recambio (vida media (t1/2)
estimada ~ 2-5 horas); con una producción y eliminación de 1010 a 1012 viriones
por día(9;14;18). Debido a la falta de actividad de lectura y corrección de errores
de la RpRd, se estima que tiene una tasa de mutación muy elevada, del orden de
10-3 - 10-4 mutaciones/nucleótido/ciclo de replicación(2). La mayoría de variantes
que se producen son eliminadas por el sistema inmune o porque son incapaces de
infectar y replicar por pérdida de función de alguna proteína(8;24). No obstante, un
número de variantes sobreviven y mantienen la infección crónica. La frecuencia a
la cual encontramos cada una de estas variantes en la población de genomas
virales, depende de su capacidad de replicación (fitness)(6;29) además de otros
factores virales o del hospedador. La consecuencia de la alta variabilidad, es la
continua producción de variantes, algunas de ellas con relevancia clínica que
puede afectar la patogenia. Esta compleja mezcla de variantes diferentes pero
muy parecidas, se le denomina quasispecies (6;11;16;29). La variabilidad entre
virus de una quasispecies en un paciente, puede ser del 1 al 10%.
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El peor escenario se dibuja cuando un paciente falla al tratamiento con AADs.
En la mayoría de casos, el fallo terapéutico se produce por recaída "relapse" del
virus una vez se para el tratamiento y en menor grado por ruptura "breakthrough"
durante el tratamiento. El fallo terapéutico suele ir acompañado de la selección de
mutaciones de Resistencia o RAS (Resistance amino acid-associated
substitutions) frente al inhibidor usado y que en muchos casos esta mutación
puede tener resistencia cruzada frente a otros inhibidores de la misma familia, por
ejemplo la mutación Y93H (Tirosina (Y) en posición 93 de NS5A que cambia a
Histidina (H)) da resistencia al VHC frente a Daclatasvir, Ledipasvir y Ombitasvir, y
esto va a dificultar el retratamiento de estos pacientes. La mejor manera de evitar
la emergencia de estas variantes resistentes es eliminar el virus con el primer
tratamiento. Para ello es esencial diseñar el régimen de tratamiento más efectivo
para cada paciente "medicina de precisión", y para ello es esencial aportar a la
práctica clínica datos objetivos predictivos de RVS. Los factores asociados con
fallo terapéutico dependientes del paciente son: grado de fibrosis, fallo a
tratamiento previo, adherencia al tratamiento, fallo de restauración de la
Respuesta Inmune, interacción de los AADs con medicamentos que esté tomando
el paciente, otras comorbilidades, etc.... Respecto al virus: fallo en el subtipado,
infección mixta, presencia de mutaciones de resistencia, mayor fitness viral,
diferente potencia de los inhibidores en el sentido de barrera genética (número de
cambios de nucleótidos necesarios para generar resistencia o menor sensibilidad)
a la resistencia.
Una de las consecuencias de esta gran capacidad que tiene el VHC de generar
variabilidad, es que el VHC se clasifica en siete genotipos (GT1-7), que difieren en
un 30-35% a nivel de nucleótidos. Dentro de cada genotipo, el VHC se clasifica en
subtipos (1a, 1b, 1c, etc.) con cerca del 20-25% en la divergencia entre subtipos
dentro del mismo genotipo(28). La clasificación del virus en subtipos, ha adquirido
gran relevancia en el momento en que se ha demostrado que todos los
tratamientos basados en el uso combinado de AADs es Subtipo-dependiente. En
general el subtipo 1a tiene peor respuesta virológica que el 1b(12;20;25;26) lo
cual condiciona la necesidad de combinar con Ribavirina en los 1a y más larga
duración para conseguir RVS similares a los 1b(19). Respecto a otros subtipos, los
datos de estudios recientes sugieren que el subtipo va a condicionar la eficacia de
los tratamientos con AAD. Por ejemplo, el inhibidor de NS5A Ledipasvir (Gilead)
tiene una menor potencia frente a subtipo 6e comparado con 6a, o 4d comparado
con 4a. También se ha observado menor eficacia de Simeprevir, Asunaprevir o
Sofosbuvir en 2b comparado con 2a(25) entre muchos otros ejemplos. Una razón
no negligible de fallos terapéuticos incluye un tratamiento inadecuado debido a un
error en el método de subtipado (4) que puede llegar a ser de hasta el 16%
usando los métodos comerciales de genotipado actuales (22). Es este sentido, en
un estudio de tratamiento de pacientes no-cirróticos G4 12semanas con Viekirax
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(Ombitasvir-Paritaprevir/ritonavir de Abbvie), mostró que en el subgrupo tratado
sin Ribavirina, los 3 pacientes que fallaron al tratamiento (2 relapse y 1
breakthrough) eran de subtipo 4d y en todos los casos se seleccionaron RAS a
NS3 (D168V) y NS5A (L28S or L28V)(10). Otro estudio en pacientes G4 tratados
12w con Harvoni (Ledipasvir+Sofosbuvir de Gilead) dos de los tres subtipos 4r
fallaron al tratamiento(1). En otro estudio de pacientes retratados 12w con
Harvoni+Rbv en que se incluyeron 51 pacientes G1 con fallo previo a
pegIFN+RBV+SOF o SOF+RBV todos de curaron excepto uno que al reanalizarlo
resultó estar infectado por G3s (30) sugiriendo que o bien el paciente no fue
correctamente clasificado y era G3a y por tanto no debería haber entrado en el
estudio dirigido a G1, o bien que el paciente tenía una infección mixta G1+G3a no
detectada por las técnicas de baja resolución, en este caso Harvoni+Rbv pudo
haber eliminado G1 pero no G3a, que es hoy por hoy el subtipo de más difícil
tratamiento con los actuales AADs.
Algunos subtipos presentan RAS de manera natural, como p.e. G1g que lleva
T54S resistente a Telaprevir, Boceprevir y Narlaprevir (5); S122R de resistencia
moderada a Simeprevir está presente en todos los aislados G2, o D168Q asociada
a elevada resistencia a Simeprevir está presente en todos los pacientes infectados
por G3. En muchos casos esto no afecta la eficacia del tratamiento combinado,
por tanto, no solo la mutación, sino también a la estructura del centro sobre el cual
actuará la droga será un terreno a estudiar (25).
Un dato que debe considerarse, es que el VHC puede recombinar, de manera que
el nuevo virus en mitad 5' sea de un subtipo (p.e. 2k) y en cambio en la parte no
estructural (NS) 3' sea de otro subtipo (1b)(13). Cabe destacar, que los
tratamientos van dirigidos a proteínas de la parte NS, por tanto el subtipado o bien
se realiza secuenciando el genoma entero(3), o si no es posible en la región NS
(p.e. NS5B) (22).
En resumen, un correcto subtipado que a su vez permita detectar infecciones
mixtas va a permitir ajustar mejor los tratamientos a las necesidades de cada
paciente y esto supone un ahorro en el aspecto social y económico del tratamiento
de la Infección por VHC contemplado en el Plan Estratégico de la Hepatitis C del
MINECO. Además, el fallo terapéutico lleva consigo la selección de mutaciones de
resistencia. Ningún tratamiento antiviral está libre de fracasos debido a las
resistencias de tipo RAS, incluyendo las terapias triples con o sin Ribavirina,
utilizando inhibidores de cualquier industria farmacéutica y su determinación es
importante para decidir que tratamiento de rescate poder ofrecer al paciente. No
obstante, se ha observado que existe un número importante de pacientes en que
a pesar de mantener el ARN negativo del VHC al final del tratamiento, pasadas
unas semanas se produce una reactivación, es decir reaparece el virus y no se
detectan mutaciones específicas de resistencia. Una posible explicación, es que o
bien han desparecido las RAS en el momento del estudio, que la respuesta
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inmune no se ha recuperado, o bien debido a la fitness viral (capacidad de
replicación). Recientemente se ha demostrado, que un virus con alta fitness
puede ser resistente a diferentes AADs incluso a Sofosbuvir en ausencia de
mutaciones de tipo RAS(7;27). Conocer este valor antes de iniciar un tratamiento
es un dato que puede ser de gran utilidad para personalizar el tipo y duración de
este.
La metodología que permite obtener toda esta información referente al virus
(subtipado, infecciones mixtas, presencia de RAS y complejidad de la
quasispecies) es la secuenciación masiva en paralelo. El Vall d’Hebron Institut de
Recerca (VHIR) del Hospital Universitario Vall d’Hebron (HUVH) (23) ha
desarrollado una metodología basada en la plataforma 454/GS-Junior. Consiste en
la secuenciación de miles de viriones de VHC circulantes en suero/plasma de un
paciente con infección crónica. Estos genomas (secuencias) se comparan con
unos patrones de referencia y por filogenia molecular se clasifican en subtipos. Al
estudiar miles de genomas, permite detectar si el paciente está infectado por más
de un subtipo a la vez (infección mixta) así como estudiar si los genoma presentan
mutaciones de resistencia a AADs. En la actualidad, está metodología ha sido
transferida a un laboratorio de Diagnóstico Clínico (Laboratorio de Patología
hepática- HUVH) y da servicio a todo el Sistema de Salud de Catalunya.
En 2016, se va producir un recambio tecnológico, y la plataforma GS-Junior va
a ser sustituida por la plataforma de Secuenciación de Molécula de ADN Única en
Tiempo Real (SMRT™, single-molecule real time sequencing) que se basa en una
tecnología de secuenciación por síntesis basada en la obtención de imágenes de
fluorescencia en tiempo real. La tecnología SMRT se construye sobre una óptica
de recogida avanzada denominada guía de onda “modo cero” (ZMWs, zero-mode
waveguides), se basa en una estructura de confinamiento de nanofotones que
consiste en una cavidad circular recubierta de una película de aluminio sobre un
sustrato de sílice de ~70nm de diámetro y ~100nm de profundidad. La
secuenciación se realiza sobre un chip (SMRT Cell) que contiene hasta 1M de
celdas ZMW. Dentro de cada una de ellas se encuentran fijas una ADN polimerasa
activa y una molécula de ADN molde de cadena sencilla circular. A medida que se
incorpora un nucleótido marcados por su grupo fosfato (cada nt está marcado con
un fluorocromo diferente) durante el proceso de secuenciación a la cadena de
ADN, se libera el complejo fluoróforo-fosfato y se detecta más un pulso de luz
fluorescente. La óptica ZMW permite que la luz penetre e ilumine solo el fondo del
pocillo, de forma que se crea un espacio de visualización que permite monitorizar
la actividad de la ADN polimerasa. El volumen de cavidad observable dentro de
una ZMW iluminada es de 20-30nm, que permite un volumen de ~20zeptolitros
(10-21 litros).
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La SMRT-NNGS permite secuenciar fragmentos desde 300 a 20.000 nucleótidos y
por tanto permite secuenciar genoma viral entero, solucionando zonas ricas en
GC, largas inserciones y delecciones, reduciendo los costes de secuenciación.
Esta tecnología permite aumentar la eficiencia de secuenciación y ensamblaje de
fragmentos y permite la detección directa (sin reacciones previas) de
modificaciones epigenéticas (metilación) mediante la medida de la variación en la
cinética de incorporación de bases (registra películas de 30-240minutos en tiempo
real).
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