Download Maize chlorotic mottle virus (MCMV)

DIRECCIÓN GENERAL
DE SANIDAD VEGETALDE
PROTOCOLO
DE DIAGNÓSTICO
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
Maize chlorotic mottle virus
(MCMV)
C
N
R
F
MEDIANTE ELISA Y TÉCNICAS
DE BIOLOGÍA MOLECULAR (PCR)
DIRECCION GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
Subdirección de Diagnóstico Fitosanitario
Departamento de Fitopatología
Laboratorio de Virología
ENERO 2015
Quejas / Denuncias
Dudas en
Órgano Interno de Control en el SENASICA
Campañas Fitozoosanitarias:
+52(55)5905 1000, ext: 51648
+52(55)3871 8300, ext: 20385
01 800 987 9879
www.sagarpa.gob.mx
www.senasica.gob.mx
“Este programa es público, ajeno a cualquier partido político,. Queda prohibido el uso con fines distintos a los establecidos en el programa”
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
Dirección General de Sanidad Vegetal
Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria
Subdirección de Diagnóstico Fitosanitario
Departamento de Fitopatología
Laboratorio de Virología
F
Protocolo de Diagnóstico
R
Maize chlorotic mottle virus
(MCMV)
C
N
MEDIANTE ELISA Y TÉCNICAS
DE BIOLOGÍA MOLECULAR (PCR)
Versión 00
Enero 2015
Quejas / Denuncias
Dudas en
Órgano Interno de Control en el SENASICA
Campañas Fitozoosanitarias:
+52(55)5905 1000, ext: 51648
+52(55)3871 8300, ext: 20385
01 800 987 9879
www.sagarpa.gob.mx
www.senasica.gob.mx
“Este programa es público, ajeno a cualquier partido político,. Queda prohibido el uso con fines distintos a los establecidos en el programa”
2
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
Protocolo de Diagnóstico de Maize chlorotic mottle virus (MCMV) MEDIANTE
ELISA y técnicas de biología molecular (PCR)
Nombre
Cargo
Ing. Fabiola Alva Martínez
Técnico de laboratorio
M.C. María del Rosario Ramírez
Técnico de laboratorio
M.C. Jessica Berenice Valencia
Luna
Técnico de laboratorio
Firma
Elaboran:
M.C. María del Rocío Hernández
Hernández
N
Revisan:
M.C. Oscar Morales Galván
M.C. Abel López Buenfil
F
Subdirector de
Diagnóstico
Fitosanitario
Director del CNRF
C
Autoriza:
Jefa del
Departamento de
Fitopatología
R
M.C. Grisel Negrete Fernández
Responsable del
Laboratorio de
Virología
Datos de Control
Revisión:
Fecha de Elaboración:
Laboratorio:
No. de Páginas:
00
Enero de 2015
Virología
18
3
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
INDICE
Pág.
I. Antecedentes
5
1.- Posición taxonómica
2.- Objetivo
3.- Origen y distribución
5
III. Síntomas y daños
6
IV. Transmisión y vector
7
F
II. Hospedantes
VI. Protocolo de Diagnóstico
1.- Envío
R
V. Importancia
7
8
N
2.- Recepción e inspección
3.– Técnicas de detección
C
4.- Almacenamiento de muestras
5.– Destrucción de muestras
VII. Referencias
17
4
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
I. ANTECEDENTES
Nombre: Maize chlorotic mottle virus (MCMV)
Nombre Común: Virus moteado clorótico del maíz.
1.– Posición Taxonómica:
Orden: Actualmente no asignado. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV).
Familia: Tombusviridae
Género: Machlomovirus
2.- Objetivo:
El presente documento tiene como finalidad describir los procedimientos o metodologías aplicados
para la detección y diagnóstico del Virus moteado clorótico del maíz (MCMV).
3.- Origen y distribución
F
El virus moteado clorótico del maíz (MCMV) es
pequeño de partícula icosaédrica (Fig.1) con
ssRNA de cadena sencilla de sentido positivo,
su genoma está constituido por seis marcos de
lectura abierta (ORF).
N
R
Se encuentra asociado con la enfermedad de
la necrosis letal del maíz resultado de un sinergismo de una infección mixta con especies de
Potyvirus (Xie, et al. 2011).
II. HOSPEDANTE
C
Fig.1
Partícula viral de MCMV mediante micrografía
electrónica de contraste negativo.
Fuente: ICTV, 2012.
Actualmente se encuentra reportado en China,
Hebei, Sichuan, Yunnan, Thailandia, Kenya,
Mozambique, Tanzania, Uganda, México,
USA, Argentina, Brazil y Perú (CABI 2014).
El maíz (Zea mays L.) es el hospedante natural reportado para MCMV, en el año de 1973 en Perú
por Hebert y Castillo. Posteriormente fue reportado en Estados Unidos en 1976 (Bockelman, et al.
1982). Se han publicado hospedantes que pueden ser infectados de manera experimental, los
cuales se encuentran en la familia Poaceae, entre 73 especies de 35 géneros diferentes.
Bockelman, et al. 1982 reportan el trabajo realizado con la inoculación de dos variantes
MCMV-Kansas y Perú (MCMV-K y MCMV-P) en especies de pastos nativos que son reservorios,
clasificando a estos hospedantes en cuatro grupos: hospedantes con síntomas sistémicos,
hospedantes con infecciones latentes, hospedantes con infección sólo de hojas inoculadas y
hospedantes inmunes. En Hawaii, reportan Brunt et al., 2010 como especies hospedantes a Bromus
mollis, Panicum dichotomiflorum, P. máximum, P. miliaceum y Zea mays. En estudios realizados con
especies de Bromus spp. y Panicum spp. infectadas de manera natural o experimental han buscado
la variante Hawaiana de MCMV pero se desconoce hasta al momento.
A continuación se muestra en una tabla los trabajos realizados por Scheets, 2004, resultado de la
prueba para la susceptibilidad de la variante MCMV-K, MCMV-P o ambas en 73 especies de plantas
de 35 géneros.
5
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
Tabla 1. Géneros de plantas sometidas a prueba de susceptibilidad.
(Scheets, 2004).
Géneros1
No susceptibles
Axoponus
Géneros
Susceptibles
Ambos*
Andropogon
Agropyron
Chloris
Avena
Bromus
Elymus
Bouteloua
Cenchrus
Festuca
Buchloe
Cynodon
Lolium
Calamovilfa
Dactylis
Oryza
Eleusine
Digitaria
Paspalum
Eragrostris
Echinochloa
Poa
Euchlaena
Panicum
Saccharum
Hordeum
Phalaris
Secale
Setaria
Sorgastrum
Zea
F
Sorghum
Spartina
Tripsacum
R
Triticum
1
III. SÍNTOMAS Y DAÑOS
N
La lista de hospedantes en esta tabla son resultado de la inoculación experimental,
no de una infección natural en campo.
* Géneros con especies no susceptibles y susceptibles.
C
Los síntomas de la enfermedad varían dependiendo de la edad
de la planta en el momento de la infección, el medio ambiente y la
variedad de maíz (Nelson, et al. 2011; Scheets, 2004).
Los síntomas que pueden presentarse asociados al MCMV son:
 En las hojas se observan rayas verde pálido o manchas que
corren paralelas a las venas que pueden unirse para crear un
moteado clorótico.
 El moteado clorótico puede ser seguido por necrosis de la
hoja, retraso del crecimiento (reducción de la distancia entre
los entrenudos de las hojas) y muerte de la planta.
 Las orejas de las mazorcas son cortas, con mal formaciones
y a menudo con cascaras que envejecen prematuramente.
Las inflorescencias masculinas (borlas) pueden acortarse.
Fig. 2 Planta de maíz infectada con
MCMV.
Fuente: Lab. Virología/CNRF
 Las reducciones de rendimiento son posibles con infecciones
naturales y van hasta el 60% con infecciones experimentales.
6
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
IV. TRANSMISIÓN Y VECTOR
El MCMV se transmite a través de insectos vectores (Figura 3), mecánicamente, y por semilla en muy
bajos porcentajes. Están reportadas como vectores seis especies de la Familia Chrysomelidae: gusano de la raíz (Diabrotica undecimpunctata, D. longicornis y D. virgifera); escarabajo pulga del maíz
(Chaetocnema pulicaria), escarabajo pulga (Systena frontalis) y escarabajo de la hoja (Oulema melanopa); tanto la larva como el adulto son vectores, este ultimo transmite al MCMV durante seis días
después de la adquisición (Nault, et al. 1978). También reportan al trips del maíz (Frankliniella williamsi) de forma semipersistente (Cabanas, et al. 2013). Posiblemente se transmite también por medio del suelo infestado, ya que el virus puede sobrevivir en residuos de maíz.
A
B
C
G
F
F
E
N
R
D
V. IMPORTANCIA
C
Fig. 3: A) Diabrotica undecimpunctata, B) D. longicornis, C) D. virgifera,
D) Chaetocnema pulicaria, E) Systena frontalis, F) Oulema melanopa, y
G) Frankliniella williamsi.
Fuente: A), B) y C ) www.insectimages.org; D), E) y F); G) Borbón, 2013
El cultivo de maíz (Zea mays L.) ocupa el segundo lugar de importancia como grano de consumo en el
mundo. Es afectado por una gran gama de insectos, malezas y patógenos que limitan su producción
(Nelson, et al.2011). Se han reportado hasta 57 virus afectando al cultivo (Brunt et al., 2010).
El virus moteado clorótico del maíz (MCMV) fue descrito en Perú causando pérdidas del 10 al 15 % en
cultivares de maíz harinoso y dulce. En el Estado de Kansas se detectó en combinación con el Wheat
streak mosaic virus (WSMV) causando la enfermedad “necrosis letal del maíz” (Nault, et al. 1978).
Los productos del cultivo de maíz para importación al territorio Nacional, como: semilla simiente,
experimental o grano para consumo, se encuentran regulados mediante hojas de requisitos que se
puede consultar en: Módulo de Requisitos Fitosanitarios para la Importación (http://
sistemas.senasica.gob.mx/mcrfi/).
7
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
VI. PROTOCOLO DE DIAGNÓSTICO
1.– Envió de muestra
Material Vegetal: La muestra puede ser semillas o planta completa, incluyendo las raíces con la
tierra adherida a ellas, o bien parte de la planta (hojas, brotes, yemas, flores y semillas) que incluya
tejidos dañados y sanos. No deberá lavarse nunca la muestra. Para detección en concreto de MCMV
el tipo de muestra será tejido foliar de hojas jóvenes desarrolladas o germinados.
Envase y transporte: las muestras se deben de colocar envueltas en papel absorbente en
bolsas de plástico o papel limpias. Deben estar en buen estado, esto es, que no presente necrosis,
que no esté deshidratada y que el tejido esté lo más fresco posible, procurando enviarla con un 60 a
80% de humedad relativa. Tras su colección el tiempo transcurrido hasta su envío deberá ser lo más
corto posible (no superior a 24 hrs). Durante ese periodo, la muestra se mantendrá refrigerada
(sin congelar). En el caso de semillas, enviar en sobres de papel o recipientes herméticos.
2.– Recepción e inspección del material
F
Etiquetado: Si la muestra se compone de más de una variedad o lote, será necesario que esto
se señale en la hoja de remisión, además de que el material que corresponda a cada uno de éstos
deberá venir bien identificado y separado. A cada variedad o lote, se le hará un diagnóstico por
separado. Registrar y reportar los síntomas e incidencias en el cultivo, plagas observadas,
tratamientos fitosanitarios o de otro tipo aplicados al cultivo, incidencias meteorológicas
extraordinarias ocurridas (heladas, granizo, encharcamiento, etc.) y cualquier otra información que se
considere para el diagnóstico.
N
R
Las muestras que se reciben para diagnóstico, se registran en la bitácora con el número de control
que acompaña a la muestra. Posteriormente, se revisa que el material vegetal se encuentre en
buenas condiciones y que esté libre de partículas de suelo u otro material para llevar a cabo las
técnicas de detección, si es necesario, la muestra debe de desinfectarse con hipoclorito de sodio al
1%. Debe evitarse recibir muestras deterioradas, en descomposición o colonizadas por organismos
saprofitos.
C
El tejido que se toma para realizar el diagnóstico debe ser representativo de toda la muestra, se
recomienda hacer un muestreo al azar en el caso de muestras asintomáticas. En el caso de semillas,
es importante ponerlos a germinar en cámara húmeda y posteriormente tomar el tejido para el
diagnóstico (Fig 4). Para la prueba de RT-PCR, se toma 0.1 gr. de tejido y se congela a -70 ° C, para
la prueba de ELISA, se toma 0.2 g y se mantiene a 4 ° C, previo a su procesamiento. Es necesario,
tomar como mínimo dos submuestras de cada muestra para realizar el diagnóstico, es decir, realizar
dos repeticiones por muestra.
Fig. 4 Semillas de maíz germinadas en cámara húmeda
Fuente: Lab. Virología/CNRF
8
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
3.- Técnicas de detección
Actualmente se demanda la producción de material vegetal sano, principio que se basa en elegir
plantas sanas libres de enfermedades virales, que sirvan de material inicial y multiplicarlas en
condiciones que permitan conservar su buen estado sanitario.
Por lo cual, la utilización de métodos de diagnóstico pueden tener diferente punto de vista, identificar
el agente responsable de una enfermedad para poder elegir los métodos más apropiados de manejo;
o la detección que trata solamente de reconocer la presencia o ausencia de un virus fitopatógeno, sin
embargo la aplicación de ambos términos no se pueden separar. El diagnóstico visual no es fiable
porque los síntomas de la infección son variables o pueden ser ausentes
Para la detección de MCMV mediante la técnica de ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay:
'ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas') se lleva acabo de acuerdo al manual del fabricante
(Agdia®), se emplea una DAS- ELISA (Double Antibody Sandwich) con el anticuerpos de captura y
detección de tipo policlonal.
Los métodos moleculares, que involucran la amplificación por medio de PCR (Polymerase Chain
Reaction) o RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction), respectativamente de
acuerdo al genoma del virus a analizar, pueden dar una mayor certeza del virus infectante por la
sensibilidad permiten detectar concentraciones muy bajas en tejido infectado.
C
N
R
F
El flujo del proceso para diagnosticar al MCMV por ambas técnicas se muestra a continuación:
Fig. 5 Diagrama de flujo para el diagnóstico de MCMV
3.1 Técnica de ELISA
a. Sensibilizar la placa de poliestireno. Diluir la gammaglobulina purificada (anticuerpo)
de acuerdo a la recomendación del fabricante en solución amortiguadora (SOLAM) de
cobertura (Anexo) suficiente para la cantidad de muestras a analizar. Colocar 100 μL de la
dilución anticuerpo específico para MCMV, considerando en el formato de distribución de
muestras, el número de muestras, testigos negativos y positivos con su repetición. Incubar
en cámara húmeda 4 horas a temperatura ambiente (20–25° C) o durante toda la noche a
4°C.
b. Lavar la placa de 3 a 5 veces1 con PSTB-T 1X (Anexo)
9
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
c. La muestra vegetal de interés se macera u homogeniza con SOLAM de extracción (Anexo).
Ésta se adiciona, con su repetición, en los pozos previamente seleccionados. Se colocan en los
pozos correspondientes a los testigos negativos 100μL de control negativo comercial. Diluye el
testigo positivo y lo coloca 100μL de esa dilución en los pozos. Deja incubar en cámara húmeda
durante 2 horas a temperatura ambiente (20–25° C) o toda la noche a 4 °C.
d. Lavar la placa de 6 a 10 veces1 con PSTB-T 1X (Anexo)
e. Diluir en ECI Buffer (Anexo) el anticuerpo policlonal con el conjugado enzimático en la
proporción señalada por el proveedor para ambos anticuerpos. 100 μL de esta mezcla se
depositan en cada pozo y se mantiene la placa en cámara húmeda 2 horas temperatura
ambiente (20–25° C).
f. Lavar la placa de polietileno de 6 a 10 veces con PSTB-T 1X (Anexo). Tomar la placa y tirar su
contenido en una tarja, sacude con vigor y repetidas veces sobre hojas de papel secante hasta
ver los pozos secos. Toma la placa de microtitulación, inclinada y llena cada uno de los pozos
sensibilizados empezando por los de la primera línea, posteriormente la segunda y así
sucesivamente, hasta cubrir todos los necesarios, deja reposar durante 1 minuto y vuelve a tirar
el contenido de la placa y a sacudir vigorosamente sobre el papel secante.
g. Preparar la solución de sustrato de la enzima diluyendo el para-nitrofenil fosfato (1mg/mL)
en SOLAM de sustrato (Anexo). Colocar 100μL en todos los pozos de trabajo, incluyendo los
blancos. Incuba en condiciones de oscuridad durante 60 minutos, se recomienda realizar la
medición de la densidad óptica cada 15 minutos hasta completar los 60 minutos.
F
h. Encender y programar lector de placas de ELISA.
R
i. Observar si hay coloración en los pozos. La medición de la reacción se hace con la ayuda
de un lector de placas de ELISA a una longitud de onda de 405 nm para la enzima fosfatasa
alcalina.
j. Las lecturas se realizan después de adicionado el sustrato y los resultados deberán
interpretarse de acuerdo a los siguientes criterios (Cruz y Frías, 1997).
C
N
 Para considerar aceptables los resultados de una placa de ELISA, la media de las
lecturas de densidad óptica del testigo negativo deben ser menor a 0.06 y del testigo positivo
diluido aproximadamente de 0.20.
 La reacción se considerará positiva (presencia del fitopatógeno) si la lectura de densidad
óptica es mayor o igual a tres veces la media del testigo negativo. Si el testigo negativo
presenta en promedio valores de densidad óptica menores de 0.03, sólo se considerarán
positivos aquellas muestras con densidades ópticas mayores a 0.1.
 Cuando sólo una de las muestras es positiva y/o si la diferencia con su repetición es mayor
o igual al 50% de su valor, la muestra debe procesarse nuevamente para determinar la
presencia del fitopatógeno.
 Las pruebas que resulten positivas o sospechosas deberán analizarse una segunda vez
para su confirmación.
k. Los resultados se anotan en la bitácora de registro de muestras del laboratorio de virus,
indicando la fecha emisión de respuesta.
l. Capturar el resultado en base de datos.
3.2 Técnica de RT-PCR
Extracción de RNA por el reactivo Plant RNA Purification Reagent (Invitogen® No. Cat. 12322012).
a. En el área gris del laboratorio, pesa de 100 mg de tejido en una balanza analítica y coloca
en un mortero previamente estéril y congelado, triturar la muestra hasta dejarla en una
consistencia de polvo.
10
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
b. Deposita todo el polvo en un tubo de microcentrífuga estéril de 1.5 mL, con 500 μL Plant RNA
Purification Reagent (Invitogen® No. Cat. 12322-012), agita en vortex por 30 segundos hasta
que el macerado este totalmente resuspendido.
c. Incuba por 5 minutos sobre hielo. (Poner horizontalmente para maximizar el área durante la
extracción).
d. Clarificar la solución, por centrifugación a 13 000 rpm por 2 minutos. Transferir el sobrenadante
a otro tubo de microcentrífuga estéril de 1.5 mL.
e. Adiciona 100 μL de NaCl 5M para clarificar el extracto y mezcla por inversión.
f. Adiciona 300 μL de cloroformo. Mezclar por inversión.
g. Centrifuga por 10 minutos a 13 000 rpm y transfiere cuidadosamente el sobrenadante a un tubo
de microcentrífuga de 1.5 mL limpio y estéril.
h. Precipita el RNA con un volumen igual de isopropanol frío, y mezcla por inversión e incuba al
menos por 10 minutos sobre hielo.
i. Centrifuga a 4 oC por 10 minutos a 13 000 rpm,
j. Decanta el sobrenadante, teniendo cuidado de no perder el pellet (pastilla). Lava la pastilla con
1 mL de etanol al 70 % y centrifuga a 13 000 rpm por 5 minutos, escurre los excesos de la
pastilla sobre papel absorbente y espera a que seque
F
k. Resuspende la pastilla en 30 μL de agua estéril libre de nucleasas y procede a la verificación de
la integridad, calidad y cantidad del RNA.
Verificación de la integridad del RNA en electroforesis.
N
R
a. Prepara 80 mL de agarosa al 2.0 %, en buffer TAE o TBE a 1X con 1μL de Bromuro de etidio
en cámara de electroforesis. Otra manera de hacer la tinción es al final de la programación de
electroforesis, el gel se sumerge en una solución de 0.5 µg/mL de bromuro de etidio por 15 a 30
minutos, el proceso es más lento pero seguro ya que se contamina menos y el ADN migra más
rápido. (Nota: El volumen a preparar dependerá de la capacidad de la cámara a utilizar).
b. Coloca 10 μL de RNA mezclados con 3 μL de buffer de carga (Solución Halt) en los pozos del
gel previamente sumergido en buffer TAE o TBE a 1X y corre la electroforesis a 5 minutos 80
volts y 45 minutos 90 volts.
C
c. Observa el gel en un transiluminador de luz Ultra Violeta (UV) y toma la fotografía con un
analizador de imágenes.
d. Analiza la imagen y verifica la integridad.
Verificación de la calidad y cantidad del RNA por espectrofotometría
a. Lee la calidad y cantidad de RNA en espectrofotómetro.
b. Verifica que la calidad de tu muestra se encuentre entre 1.7 y 2.0 de pureza en la relación
260/280 y 260/230.
RT-PCR para la amplificación de MCMV
Para el diagnóstico de MCMV se utilizarán los siguientes iniciadores que codifican para el gen de
la cápside (Liu, et al. 2011):
Nombre del
primer
Secuencia 5'-3'
MCMV_F
ATGGCGGCAAGTAGCGGTCTACCCGAGGTAGAA
MCMV_R
TCAATGATTTGCCAGCCCTGGGCCTGGAACCAGG
Tamaño
pb
711
11
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
b. Se realiza la mezcla RT para MCMV, de acuerdo a las siguientes condiciones:
Reactivo
Concentración inicial
Volumen
1X tubo
RNA total
2.0 μL
Agua grado PCR
6.5 µL
dNTP´s
10 mM
4.0 µL
MCMV_F
10 pmoles/ L
1.0 μL
MCMV_R
10 pmoles/ L
1.0 μL
Volumen final
14.5 μL
c. Incuba las muestras con la siguiente temperatura:
Temperatura
Tiempo
Ciclos
70 ° C
5'
1
4°C
2'
1
F
d. Al finalizar el tiempo de incubación coloca las muestras en hielo y deposita a cada tubo 5.5 μL
de la siguiente mezcla.
Concentración
inicial
Volumen
1 tubo
Buffer
5X
4.0 μL
40U/ μL
0.5 μL
200U/μL
1.0 μL
RNAse out
N
Transcriptase Reversa
R
Reactivo
Volumen Final
5.5 μL
C
e. Incuba la mezcla de RT con las siguientes temperaturas:
Temperatura
Tiempo
Ciclos
42 ° C
60 minutos
1
5 minutos
1
o
95 C
f. Posteriormente realiza la mezcla de PCR para MCMV, de acuerdo a las siguientes condiciones:
12
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
Reactivo
Concentración
inicial
Volumen
1X tubo
Buffer
10 X
2.5 μL
MgCl2
50 mM
1.0µL
dNTP`s
10 mM
2.0  L
MCMV_F
10 pmoles/ L
1 μl
MCMV_R
10 pmoles/ L
1 µL
Taq DNA polimerasa
5u/ L
0.2  L
cDNA
2.0  L
Agua grado PCR
15.3  L
25  L
Volumen final
g. Coloca los tubos en el termociclador con el siguiente programa:
Temperatura
Tiempo
Ciclos
94 °C
10 minuto
1
o
30 segundos
58 °C
30 segundos
72 °C
1 minuto
30
10 minutos
1
F
94 C
o
R
72 C
PCR
N
g. Concluido el programa térmico, analizar los productos de PCR mediante electroforesis en
agarosa al 2 %, teñido con bromuro de etidio o algún otro intercalante.
C
h. Corre la electroforesis a 5 minutos 80 volts y 45 minutos 90 volts, apaga la fuente de poder y
observa sobre un transiluminador de luz UV o con un analizador de imágenes. Un fragmento de
711 pb (Fig 5).
Fig. 5: 100 pb DNA Ladder Invitrogen ®. (-): Negativo [agua]. (+): Positivo. M: Muestra
Fuente: CNRF
13
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
3.3 Preparación de soluciones amortiguadoras
3.3.1 ELISA Directa (DAS-ELISA)
a. Solución amortiguadora de cobertura
Disolver en 1000 mL de agua destilada:
Carbonato de Sodio (anhidro)
1.59 g
Bicarbonato de Sodio
2.93 g
Azida de sodio
0.2 g
Ajustar el pH a 9.6 (+/- 0.2). Almacenar a 4°C (en refrigeración)
b. Solución amortiguadora de Fosfatos (Lavado) PBST
Disolver en 1000 mL de agua destilada:
8.0 g
Fosfato de Sodio, dibásico (anhidro)
1.15 g
Fosfato de Potasio, monobásico (anhidro)
0.2 g
Cloruro de Potasio
0.2 g
Tween 20
F
Cloruro de sodio
0.5 g
R
Ajustar el pH a 7.4 (+/- 0.2)
N
Nota: la Solución de lavado puede prepararse concentrada y posteriormente diluirse. Prepare una
concentración 20X (20 veces concentrada).
b. Solución amortiguadora de Extracción (Macerado de muestras vegetales)
Disolver en 1000 mL de Solución amortiguadora de Fosfatos 1X (PBST):
C
Sulfito de Sodio (anhidro)
1.3 g
Polyvinylpyrrolidona (PVP) PM 24 - 40,000
20.0 g
Azida de Sodio
0.2 g
Albúmina de huevo (pollo) en polvo, Grado II
2.0 g
Tween-20
20.0 g/mL
Ajustar el pH a 7.4 (+/- 0.02). Almacenar a 4°C.
d. Solución amortiguadora para diluir el antisuero conjugado (ECI).
Disolver en 1000 mL de Solución amortiguadora de Fosfatos 1X (PBST):
Albúmina de suero de bovino (BSA)
2.0 g
Polyvinylpyrrolidona (PVP) PM 24 - 40,000
20.0 g
Azida de Sodio
0.2 g
Ajustar el pH a 7.4 (+/- 0.02). Almacenar a 4°C.
14
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
e. Solución amortiguadora para PNP (Revelado).
Disuelva en 800 mL de agua destilada:
Dietanolamina
97.0 ml
Azida de Sodio
0.2 g
Cloruro de Magnésio hexahidratado
0.1 g
3.3.2 Preparación de diluciones
Leer las características de cada uno de los viales que contienen los antisueros, en donde se indican; el
volumen, concentración y la dilución a la que deben prepararse las mezclas. Por lo general indican una
relación de 1:200 (1 μL de antisuero en 200 μL de solución amortiguadora).
a. Dilución de antisuero primario
Sensibilizar la placa: El anticuerpo primario se diluye en solución amortiguadora de cobertura.
Preparar el volumen total de la placa en base al número de pozos empleados, tanto para las
muestras como para los testigos: 2 para el testigo positivo (con proteína viral y dos para el testigo
negativo (sin proteína viral).
b. Dilución del testigo positivo:
F
Colocar 300 μL de solución amortiguadora de extracción en un vial de 2 mL, tome 100 μl del control positivo comercial correspondiente al virus problema, agregar a la solución y mezclar perfectamente. Colocar 100 μl en un pozo, incluyendo la repetición de éste.
c. Conjugado:
R
Diluir el antisuero conjugado a una enzima (fosfatasa alcalina), en solución amortiguadora de conjugado (ECI). Por lo general, indican una relación de 1:200 (1 μL de antisuero en 200 μL de solución amortiguadora). Preparar el volumen total de pozos empleados.
d. Revelado:
C
N
Diluir la pastilla de P-nitrofenilfosfatos (PNP) en solución amortiguadora de revelado (PNP), en
una proporción 1:1 (peso mg / volumen mL). Se recomienda envolver y cubrir con papel aluminio
el recipiente.
3.3.3 Preparación de soluciones PCR
Buffer de carga 6X (Solución Halt )
a. Pesar 0.025g de azul de bromofenol, 0.025g de Xilen cianol FF en un vaso de precipitados de
20mL.
b. Disolver los colorantes en 4mL de sacarosa en agua al 40% o 3mL de glicerol.
c. Aforar a 10mL con agua ultrapura y almacenar a 4 °C.
Preparación 1ml de una solución "naranjal" de corrida 6X.
a. Pesar 75 mg de naranja G.
b. Disolver en 500μL de agua destilada estéril en tubo de centrifuga de 1.5 a 2.0mL
c. Adicionar y disolver en vortex.
d. Agrega180 µL de glicerol y dar vortex.
e. Completar el volumen final con la adición de 245 μL de agua destilada estéril, dar vortex.
f. Guardar la solución en refrigeración
15
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
Cloruro de Sodio (NaCl) 5M
a. Pesar 292.2g de NaCl y agregar en matraz aforado.
b. Disolverlo en 800mL y aforar a 1000mL con agua ultrapura.
c. Esterilizar por autoclave.
d. Conservar a temperatura ambiente.
TAE 50X
a. Disolver 242.2g de base trizma en 400mL de agua ultrapura.
b. agregar 200mL de EDTA 500mM y 57.1mL de ácido acético glacial.
c. Ajustar en pH 8.0 y aforar a 1L.
d. Esterilizar en autoclave.
TAE 10X
a. Disolver 540.0 g de base trizma y 275.0 g de ácido bórico en 1L de solución EDTA 0.5 M pH 8.0.
b. Disolverlo y aforar a 1000mL con agua ultrapura.
c. Esterilizar en autoclave.
4.- Almacenamiento de muestras
R
F
d. Guardar la solución en un frasco y revisar que este bien cerrado.
El resto de la muestra se conserva a 4° C, envueltas en papel absorbente dentro de bolsas o frascos de
polietileno, según sea el caso, en caso de requerir un segundo diagnóstico.
N
5.– Destrucción de muestras
Las muestras únicamente se almacenaran a 4° C para ser desechadas posteriormente.
C
En caso de que el diagnóstico resulte positivo y concluido el tiempo de almacenamiento reglamentario,
la muestra es esterilizada por calor húmedo o calcinada. En caso contrario, únicamente se almacena en
refrigeración para ser desechadas posteriormente.
16
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
VII. REFERENCIAS
Bockelman, D. L, Claflin, L. E. and Uyemoto, J. K. 1982. Host range and seed-transmission
studies of maize chlorotic mottle virus in grasses and corn. Plant Disease 66:216-218.
Borbón, C. M. 2013. Especies del género Frankliniella (Thysanoptera: Thripidae) registradas en
la Argentina, una actualización. Revista de la facultad de Ciencias agrarias. Universidad Nacional
de Cuyo. 45 (1). Disponible en: <http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1853
-86652013000100021&lng=es&nrm=iso>. ISSN 1853-8665.
Cabanas, D., Watanabe, S., Higashi, C.H.V. and Bressan, A. 2013. Dissecting the Mode of Maize
Chlorotic Mottle Virus Transmission (Tombusviridae: Machlomovirus) by Frankliniella williamsi
(Thysanoptera: Thripidae). Journal of Economic Entomology 106(1):16-24.
Cruz, F. M. y Frías, T. G. A. 1997. Guía ilustrada de la prueba de inmunoadsorción con enzimas
ligadas para la detección de fitopatógenos. Secretaria de Agricultura, Ganadería y Desarrollo
Rural. Subsecretaria de Agricultura y Ganadería. Comisión Nacional de Sanidad Agropecuaria.
Dirección General de Sanidad Vegetal. Centro Nacional de Referencia de Diagnóstico
Fitosanitario. 19 p.
Brunt, A. A., Crabtree, K., Dallwitz, M. J., Gibbs, A. J., Watson, L. and Zurcher, E. J. (eds.). 2014.
Plant Viruses Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20th August 1996.
http://biology.anu.edu.au/ Groups /MES /vide/
F
International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). 2012. Virus Taxonomy: Ninth Report
of the International Committee on Taxonomy of Viruses edited by Andrew M. Q. King, Michael J.
Adams, Elliot J. Lefkowitz. Elsevier. Academic Press. p.1327.
R
Liu Hongyi, Liu Zhongmei, Zhang Jinlan and Zhang Hongxiang. 2011. Detection and
identification of Maize chlorotic mottle virus from imported maize seeds. Journal of Northeast
Agricultural University. 42 (10):36-40.
Nelson, S., Brewbaker, J. and Hu, J. 2011. Maize chlorotic mottle. College of Tropical
Agriculture and human Resources. University of Hawaii at Manoa. Plant Disease. PD-79.
N
Nault, L. R., Styer, W. E., Coffey, M. E., Gordon, D. T., Negi, L.S. and Niblett, C. L. 1978.
Transmission of maize chlorotic mottle virus by chrysomelid beetles. Phytopathology. 68:10711074
Scheets, K. 2004. Maize chlorotic mottle. In: H. Lapierre and P-A. Signoret (eds.) Viruses and virus
diseases of Poaceae (Gramineae). Institut Nacional de la Recherche Agronomique, Paris.
C
Xie, L., Zhang, J., Wang, Q., Meng, C., Hong, J. and Zhou, X. 2011. Characterization of Maize
chlorotic mottle virus associated with Maize lethal necrosis disease in China. Journal of
Phytopathology. 159: 191-193.
17
DIRECCIÓN GENERAL DE SANIDAD VEGETAL
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA FITOSANITARIA
DIRECTORIO
Secretario de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural
Pesca y Alimentación
Lic. Enrique Martínez y Martínez
Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad
Agroalimentaria
F
MVZ. Enrique Sánchez Cruz
R
Director General de Sanidad vegetal
N
Dr. Francisco Javier Trujillo Arriaga
C
Director del Centro Nacional de Referencia
Fitosanitaria
M.C. José Abel López Buenfil
Arte y diseño Ing. J. Alejandro Cotoc Roldán
18
Foto de Portada: http://senasica.gob.mx