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Utilización de la PCR para el diagnóstico en
Ictiopatología
Alicia Gibello, María del Mar Blanco, Lucas Domínguez y José F. FernándezGarayzábal
Departamento de Patología Animal I (Sanidad Animal). Facultad de Veterinaria.
Universidad Complutense de Madrid. Avda. Puerta de Hierro s/n. 28040 Madrid (España)
Resumen
Las enfermedades infecciosas constituyen uno de los principales problemas en piscicultura, tanto desde el
punto de vista sanitario como económico. Realizar de forma rápida el diagnóstico de los animales enfermos y
evitar el desarrollo de ciertas enfermedades mediante la detección de los animales portadores del patógeno
constituyen, junto con la vacunación y las buenas prácticas de manejo, las medidas más eficaces de prevención
de estas patologías. En las últimas décadas se han desarrollado diversas técnicas de diagnóstico rápido basadas
en métodos genéticos, entre los que destaca la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este trabajo se
evalúan las ventajas e inconvenientes de la utilización de la técnica de PCR en la detección de los
microorganismos patógenos para los peces.
Abstract
From a sanitary and an economical point of view, infectious diseases are one of the most important problems
in pisciculture. The rapid establishment of the diagnosis of diseased animals, as well as the detection of carrier
fish can provide a highly eficiency system to prevent these diseases. In the last decades, several diagnostic
methods based on genetic technology have been developed, but PCR is more frecuently used than any other
nucleic acid based techniques. The purpose of this review is to examinate the use of PCR as an approach to
diagnosis of fish pathogens.
Introducción
La cría de peces en condiciones intensivas genera factores de estrés ligados a las propias
condiciones de producción, a las altas densidades de los animales y a la calidad del agua,
que favorecen la aparición de enfermedades de tipo ambiental, toxicológicas e infecciosas
(Reno, 1998). Las enfermedades infecciosas constituyen una de las causas más importantes
de las pérdidas económicas en cualquier piscifactoría. La aplicación de vacunas es el
método de elección para el control de estas enfermedades; sin embargo, la obtención de
vacunas eficaces para prevenir enfermedades de etiología vírica es difícil, siendo la
tendencia actual el desarrollo de vacunas de ADN, cuya efectividad sólo se ha demostrado
hasta el momento a nivel experimental (Boudinot y col., 1999). En el caso de las
enfermedades de etiología bacteriana, sólo algunas de ellas (boca roja, forunculosis,
vibriosis y enterosepticemia del pez gato) se han podido controlar utilizando vacunas
tradicionales (bacterias inactivadas) (Rocha y Coll, 2000). Además, el control y
erradicación de las estas patologías de origen bacteriano resulta cada vez más difícil debido
a la limitación del uso de antibióticos en acuicultura (Cacho, 1999), y al fenómeno cada
vez más frecuente del aumento de antibiorresistencias (Toranzo y col., 1984; Inglis y col.,
1991; Teshager y col., 2000). Esta situación resulta aún más compleja si consideramos que
en muchas de las patologías infecciosas, gran parte de los animales que sobreviven a la
enfermedad pueden resultar portadores del patógeno durante largos períodos de tiempo.
Estas circunstancias hacen que las condiciones de manejo y el diagnóstico rápido de los
animales enfermos y/o portadores, constituyan una de las medidas más eficaces en la
prevención de estas patologías (Blanco y col., 2000). En este sentido, el examen de la
muestra, el aislamiento del agente etiológico y su identificación, y la determinación de un
tratamiento adecuado constituyen los pasos indispensables del diagnóstico clínico
microbiológico en cualquier laboratorio de referencia.
En la actualidad, los métodos de diagnóstico de algunas de las enfermedades víricas
(basados en el cultivo celular y la posterior identificación del virus) y parasitarias, como la
PKD o la enfermedad del torneo, continúan siendo complejos y requieren un mayor tiempo
de realización que los empleados en general para las enfermedades de origen bacteriano.
En este sentido, los medios de aislamiento selectivos y los sistemas de identificación
rápida, han supuesto un gran avance para el diagnóstico bacteriológico. No obstante, la
detección de algunas bacterias patógenas mediante los métodos microbiológicos
tradicionales presenta diversos inconvenientes, entre los que se pueden citar:
La lentitud del crecimiento bacteriano, acompañada de la complejidad de los
medios de aislamiento para algunos patógenos, que ralentiza considerablemente el
diagnóstico. Esta situación podemos encontrarla en el caso de las patologías
producidas por Pseudomonas anguilliseptica (Doménech y col., 1997) y
Renibacterium salmoninarum (Bandín y col. 1996).
La existencia de distintos perfiles bioquímicos compatibles con varios
microorganismos, que como en el caso de Yersinia ruckeri (Furones y col., 1993) o
las flavobacterias (Bernardet y Kerouault, 1989), dificulta su identificación.
La localización intracelular del microorganismo, que dificulta el proceso de
detección, como en el caso de Piscirickettsia salmonis (Fryer y col. 1992).
En todos estos casos se hace necesaria la aplicación de métodos de diagnóstico
alternativos, bien inmunológicos como el ELISA o la inmunofluorescencia (IF) o
genéticos, como los sistemas de hibridación y la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), que posibiliten la detección rápida y fiable del agente causal de la enfermedad.
Debido a que el cultivo del microorganismo no supone un requisito imprescindible para su
detección, las técnicas de diagnóstico rápido evitan los problemas de aislamiento e
identificación de estos patógenos difíciles de detectar mediante métodos microbiológicos
tradicionales (Pace, 1997), y permiten su aplicación directamente sobre las muestras de
tejidos animales.
La técnica de PCR como sistema de diagnóstico
Para algunos científicos, el futuro de la Microbiología clínica depende del desarrollo y de
la integración de los métodos genéticos de diagnóstico ya que, en general, ofrecen una
mayor sensibilidad que los métodos inmunológicos (Brown y col., 1994; Hung y col.,
1998). Durante los últimos 15 años hemos asistido al desarrollo de diversos sistemas de
diagnóstico genético basados en la formación de un híbrido de ADN entre el ácido nucleico
de un organismo con una sonda de ADN específica. De los métodos basados en este
principio, la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es sin duda el más
utilizado.
La técnica de PCR permite amplificar de manera selectiva fragmentos del ADN de un
determinado microorganismo, situados entre dos regiones cuyas secuencias son conocidas.
Estas dos regiones se utilizan como iniciadores en la reacción de síntesis del ADN, que está
catalizada por la enzima ADN polimerasa. La reacción de PCR consta de varios ciclos de
amplificación sucesivos, cada uno de los cuales incluye tres fases: desnaturalización,
hibridación y elongación. Tras la serie de ciclos, el resultado que se obtiene es la
amplificación exponencial del fragmento de ADN seleccionado (Figura 1).
Figura 1: Amplificación exponencial a partir de un fragmento de ADN molde tras una serie de ciclos de PCR (Adaptado
de Andy Vierstraete, 2001 http://allserv.rug.ac.be/~avierstr/principles/pcr.html)
La detección del fragmento amplificado se realiza mediante electroforesis en gel de
agarosa, en la que los fragmentos de ADN se separan según su tamaño, y cuya
visualización se realiza mediante la tinción del gel con bromuro de etidio y posterior
exposición a la radiación ultravioleta (Figura 2). Sin duda alguna, la PCR ha llegado a
convertirse en una técnica de gran aplicación en la identificación de segmentos específicos
de ADN; si éstos proceden de un microorganismo patógeno, entonces la PCR se convierte
en un importante método de diagnóstico (Boyle and Blackwell, 1991). Las ventajas de la
PCR sobre otros métodos de diagnóstico genético radican en su:
Simplicidad y rapidez
Especificidad
Sensibilidad
Figura 2: Esquema de la técnica
Simplicidad y rapidez
Una de las grandes ventajas de la PCR frente a otras técnicas es sin duda, la rapidez de la
reacción. Las reacciones de PCR requieren tiempos muy pequeños (en general, inferiores a
5 minutos), en cada una de las fases de cada ciclo. Por otro lado, el número de ciclos de la
reacción no debe sobrepasar el mínimo necesario (en general entre 20 y 35 ciclos), ya que
un aumento innecesario del número de ciclos puede originar amplificaciones inespecíficas.
De este modo, el tiempo de realización del diagnóstico va a depender en gran medida del
método empleado en la extracción de ADN a partir de las muestras clínicas. En los casos
más sencillos, el resultado final del diagnóstico de varias muestras clínicas puede obtenerse
al cabo de las 3 a 8 horas desde su recepción en el laboratorio (Gustaffson y col., 1992).
Este tiempo es mayor en el caso de P. salmonis o R. salmoninarum, necesitándose al
menos de uno a tres días para completar el diagnóstico debido a que la preparación de las
muestras es más dificultosa y se necesitan dos reacciones sucesivas de PCR (Mauel y col.,
1996; Cook y Lynch, 1999); en cualquier caso, el tiempo requerido es inferior al tiempo
mínimo empleado en el diagnóstico de estos microorganismos mediante los sistemas
tradicionales (en torno a los 12 o 14 días).
La preparación previa de las mezclas de reacción (a falta de añadir el ADN de la muestra),
y su almacenamiento en el congelador (a -20ºC) hasta la recepción de nuevas muestras
clínicas, supone un ahorro de tiempo considerable en el diagnóstico. Además, la
posibilidad que ofrecen algunas casas comerciales de adquirir las mezclas de reacción listas
para su utilización aumenta la sencillez de la técnica.
La producción de Taq polimerasas de mejor rendimiento (como aquéllas que sólo se
activan a altas temperaturas, dificultando la aparición de reacciones inespecíficas), la
disponibilidad de termocicladores automáticos que almacenan los distintos programas de
PCR utilizados y que aseguran la reproducibilidad de los ensayos, junto con la posibilidad
de sintetizar con gran facilidad los oligonucleótidos que se utilizan como iniciadores,
permiten la utilización de la técnica de PCR en cualquier laboratorio de diagnóstico.
Especificidad
La especificidad de la reacción de PCR va a estar condicionada por el carácter restrictivo
del fragmento de ADN a amplificar entre las estirpes de una misma especie, entre las
especies de un mismo género y entre un grupo de microorganismos filogenéticamente
relacionados. En este sentido, existen reacciones de PCR encaminadas a la detección de un
género, como en el caso de las Pseudomonas (Widmer y col., 1998); en otras ocasiones se
pretende la detección de una especie o subespecie, como en el caso de Photobacterium
damselae (Osorio y col., 2000); incluso se pueden buscar estirpes virulentas de un
patógeno, como por ejemplo la detección de las cepas virulentas de Aeromonas
salmonicida subsp. salmonicida, para lo cual se ha desarrollado una reacción de PCR
basada en la amplificación de un gen que sintetiza una proteína de la envuelta A
(Gustafson y col., 1992).
Las reacciones de PCR pueden diseñarse para la amplificación de fragmentos de genes
basados en caracteres genéticos (la existencia de un transposón, ARN ribosómico),
bioquímicos (una enzima del metabolismo), o factores de patogenicidad (hemolisinas,
fimbrias etc.). En función del gen elegido, varía el número de copias del ácido nucleico a
amplificar existente en el microorganismo, incidiendo por tanto en la sensibilidad de la
reacción. Así por ejemplo, para la detección de Y. ruckeri se han descrito dos sistemas de
PCR basados respectivamente en la amplificación de un gen cromosómico del sistema
"quorum sensing" (Temprano y col. 2001), y en la amplificación de una región del ADN
que codifica el ARN 16S (Gibello y col. 1999); ambos métodos son específicos de esta
especie, pero el ADN que codifica el ARN ribosómico presenta mayor número de copias
por célula y por tanto, una mayor sensibilidad en su aplicación sobre muestras de tejidos.
La especificidad de la PCR requiere la optimización de las fases de la reacción
(fundamentalmente en la temperatura de hibridación), y un buen diseño de los iniciadores.
Así pues, una vez determinada la zona de ADN a amplificar, la elección de los iniciadores
debe realizarse teniendo en cuenta dos requisitos fundamentales:
1. el análisis de su estructura molecular, que afecta a la sensibilidad de la técnica
(existencia de zonas de hibridación internas, contenido equilibrado en bases G-C y
A-T,...) y
2. que posean una alta especificidad, lo cual puede conseguirse mediante la elección
de zonas poco conservadas en el ADN a amplificar (Figura 3).
En cualquier caso, la especificidad de la reacción va a estar siempre condicionada por la
formación del híbrido entre los iniciadores y sus secuencias complementarias en el ADN,
que está determinada por la temperatura de la fase de hibridación. Por este motivo, cuanto
mayor sea la temperatura de la fase de hibridación, dentro de los límites posibles, mayor
será la especificidad. Los ensayos de optimización de la reacción de PCR y los relativos a
la especificidad de la reacción resultan, pues, imprescindibles en el desarrollo de cualquier
sistema de detección basado en esta técnica (Figura 4).
Figura 3: Esquema del ARN ribosomal 16S bacteriano. Se muestran las regiones que
presentan variabilidad entre las distintas especies de bacterias (regiones V). En la
secuencia de ADN de estas regiones se basa el diseño de los oligonucleótidos
iniciadores empleados en las PCRs utilizadas en el diagnóstico de determinadas
bacterias patógenas para peces (ver Tabla 1)
Figura 4: Reacción de PCR específica para la detección
de Yersinia ruckeri
Línea 1: Y. ruckeri (cepa de colección)
Línea 2: control negativo
Línea 3: patrón de peso molecular
Líneas 4-7: Y. ruckeri (aislados clínicos)
Líneas 8-10: otras especies de Yersinia
Tal y como se ha indicado, en función de la especificidad de la reacción, los sistemas de
diagnóstico basados en la PCR están dirigidos a la detección de algún género en concreto,
tal y como sucede en las patologías producidas por microsporidios (Bell y col., 1999) y/o
determinadas especies de microorganismos como Photobacterium damsela, donde se
puede aplicar una PCR específica de especie o de subespecie, distinguiendo entre
Photobacterium damsela subsp. piscicida o la subespecie damselae. (Osorio y col., 2000).
Sin embargo, las muestras clínicas pueden contener en ocasiones más de un
microorganismo potencialmente patógeno, cuya presencia puede ser importante para el
diagnóstico del proceso infeccioso. Así por ejemplo, en trucha y salmón suelen ser
frecuentes las infecciones mixtas producidas por A. salmonicida y Flavobacterium
psychrophilum y A. salmonicida y Tenacibaculum maritimum (antes Flexibacter
maritimus), en las que A. salmonicida actúa como patógeno primario, habiendo una
infección posterior de las úlceras producidas en la forunculosis, por parte de las bacterias
filamentosas. En nuestro laboratorio de Ictiopatología también hemos visto con relativa
frecuencia, en truchas cuya fase de engorde se realiza en el mar, brotes infecciosos
causados por Y. ruckeri y V. anguillarum. En todos estos casos, la detección de más de un
microorganismo en una misma reacción de PCR sería de gran utilidad.
En este contexto, la detección específica de varios microorganismos patógenos en una
muestra puede requerir la utilización de una PCR múltiple o MULTIPLEX. En
Ictiopatología únicamente se ha descrito un método de PCR múltiple que permite detectar
la presencia de distintos virus ARN implicados en la necrosis pancreática infecciosa (IPN),
necrosis hematopoyética infecciosa (IHN) y septicemia hemorrágica vírica (VHS), en una
única reacción (Williams y col.1999). Esta metodología se ha empleado con éxito, en
cultivos celulares y muestras de riñón y bazo de salmón, infectados con los tres virus. Pero
además, el éxito alcanzado por los sistemas de PCR múltiple desarrollados para detección
de varios patógenos humanos en mariscos (Brasher y col. 1998) y en muestras clínicas de
otras especies animales (Greco y col., 2001), auguran un gran porvenir a esta modalidad de
PCR. Además, la detección de varios microorganismos en una muestra tiene un interés
adicional en la certificación de zonas libres de ciertas patologías. Esta certificación forma
parte de las medidas necesarias para evitar la propagación de ciertos patógenos a través del
comercio de huevos y peces entre las distintas piscifactorías (Blanco y col. 2000 ).
En la actualidad estamos desarrollando un proyecto de investigación en nuestro
laboratorio, en colaboración con el Centro de Investigación en Sanidad Animal de
Valdeolmos (CISA-INIA) cuyo objetivo es el desarrollo de métodos de PCR múltiple para
los principales virus de peces y determinadas bacterias patógenas de crecimiento lento o
identificación difícil.
Sensibilidad
Una de las ventajas de la PCR es que tanto la cantidad como la calidad del ADN a
amplificar, no necesitan ser muy altas. El ADN extraído a partir de una única célula o de
un lisado de células obtenido por hervido en agua, puede ser suficiente para una buena
reacción de amplificación. Esta alta sensibilidad de la técnica de PCR hace posible la
detección del microorganismo de interés directamente de las muestras clínicas o del
ambiente acuático sin la necesidad de un cultivo previo, tal y como se ha descrito para la
detección de F. psychrophilum (Wiklund y col., 2000), en una piscifactoría afectada por la
enfermedad bacteriana del agua fría. Supone, por tanto, un sistema eficaz en la prevención
de las enfermedades producidas por algunos patógenos que, como en el caso de A.
salmonicida y Photobacterium damselae subsp. piscicida, pueden presentar en el agua,
formas viables pero no cultivables que son importantes desde un punto de vista
epidemiológico (Morgan y col., 1993; Magariños y col. 1994).
La sensibilidad de la PCR también permite la detección del patógeno en los primeros
estadíos de la infección, así como de infecciones subclínicas (Palenzuela y col., 1999). Esto
es importante en el diagnóstico de ciertas parasitosis, como por ejemplo, las infestaciones
producidas por Pleistophora anguillarum, en las que la PCR resulta eficaz en la detección
del parásito a los tres días post-infección en comparación con los doce días necesarios para
el diagnóstico mediante técnicas inmunológicas (Hung y col., 1998).
No obstante, la alta sensibilidad de la PCR puede dar lugar en algunos casos, a resultados
falsos-positivos (Vaneechoutte y Eldere). Entre las causas más frecuentes de este problema
está la contaminación de la muestra a analizar con ADN procedente de otras muestras
clínicas o de los productos de PCR obtenidos en amplificaciones previas (Wilson, 1997).
La adopción de medidas de seguridad que eviten el riesgo de contaminación, como la
preparación de la reacción de PCR en un lugar distinto al sitio donde se procesan las
muestras, la utilización de puntas de pipeta con filtro, etc. pueden evitar estos problemas de
contaminación (Orego, 1990).
La estabilidad molecular del ADN puede también dar lugar a la obtención de resultados
falsos-positivos. Los ensayos de PCR no diferencian entre el ADN procedente de células
vivas o muertas, y este hecho puede dar lugar a la obtención de resultados erróneos (Hiney
y Smith, 1998), como la amplificación del ADN de bacterias muertas tras un tratamiento
efectivo con un antibiótico, o en animales vacunados con microorganismos inactivados (la
presencia de microorganismos muertos puede ser debida no sólo al tratamiento con un
antibiótico, sino también a la lisis del microorganismo en el interior del macrófago). Se ha
constatado la amplificación por PCR del ADN de células muertas de A. salmonicida,
presentes en órganos de peces vacunados frente a forunculosis (Hoie y col. 1997). Sin
embargo, no todos los ensayos de PCR presentan este inconveniente, por ejemplo, en
truchas no infectadas y vacunadas frente a boca roja no se han detectado amplificaciones
frente a Y. ruckeri (Altinok, 2001). Por tanto, una cuestión importante en la detección de
ciertos patógenos por PCR, es la diferenciación entre las bacterias viables y las células
muertas que dan lugar a reacciones positivas.
Desde el punto de vista del diagnóstico, la distinción entre microorganismos muertos y
vivos puede ser de especial importancia en el control de algunas enfermedades infecciosas
que se pueden transmitir verticalmente, como en el caso de R. salmoninarum (Miriam y
col., 1997). En estos casos, la amplificación del ADN a partir de ARN mensajero, presente
únicamente en células vivas (RT-PCR), constituye una buena alternativa para evitar la
obtención de falsos-positivos. Esta técnica de RT-PCR requiere de un paso adicional, que
consiste en la síntesis del ADN a partir del ARN mensajero mediante la enzima
transcriptasa inversa, y presenta una dificultad de manejo debida a la labilidad de la
molécula de ARN. No obstante, la RT-PCR es la técnica que se utiliza de forma habitual en
las PCR destinadas a la detección de virus ARN (Tabla 1), tales como el virus de la
necrosis pancreática infecciosa (IPNV), o el de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV).
Virus
Agente
Tipo de ensayo
Gel amplificado
Referencia
ISA
RT-PCR
segmento 8 genómico
VHS
RT-PCR
gen N
Einer-Jensen y col.,1995
VHS
RT-PCR
gen G
Williams y col., 1999
VER
NESTED-RT-PCR
proteína de la envuelta
Thiery y col. 1999
IPN
RT-PCR
gen VP3
Blake y col., 1995
IPN
RT-PCR
gen VP2
Sweeney et. al, 1997
IHN
RT-PCR
gen N
Williams y col., 1999
CC
PCR
fragmento ADN genómico
SD
RT-PCR
glicoproteína E2
Mjaalandy col., 1997
Boyle & Blackweell, 1991
Villoing y col., 2000
Bacterias
Agente
Tipo de ensayo
Gel amplificado
Referencia
R. salmoninarum
NESTED RT-PCR
ARNr 16S
R. salmoninarum
PCR
antígeno p57
Miriam y col., 1997
R. salmoninarum
NESTED RT-PCR
ARNr antígeno p57
Cook y Lynch, 1999
R. salmoninarum
PCR
antígeno p57
McIntosh y col., 1996
L. garvieae
PCR
ARNr 16S
Zlotkin y col., 1998a
L. garvieae
PCR
dihidropteroatosintasa
(enzima metabólica)
S. iniae
PCR
ARNr 16S
Zlotkin y col., 1998b
Y. ruckeri
PCR
ARNr 16S
Gibello y col., 1999
Y. ruckeri
PCR
"quorum sensing"
Temprano y col., 2001
A. salmonicida
PCR
proteína de la envuelta
Gustafson y col., 1992
A. salmonicida
PCR
ARNr16S
O’Brien y col., 1994
A. hydrophila
PCR
hemolisina
Baloda y col., 1995
F. psychrophilum
PCR
ARNr 16S
Toyama y col. 1994
F. psychrophilum
PCR
ARNr 16S
Urdaci y col., 1998
F. psychrophilum
NESTED-PCR
ARNr 16S
Wiklund y col. 2000
P. damselae
PCR
ARNr 16S
Osorio y col., 2000
subsp. damselae
PCR
gen ureC
Osorio y col., 2000
P. salmonis
NESTED-PCR
ARNr 16S
Mauel y col., 1996
V. vulnificus
PCR
hemolisina
Coleman y col., 1996
V. anguillarum
PCR
hemolisina
Hirono y col., 1996
P. anguilliseptica
PCR
ARNr 16S
Blanco y col., 2001
Magnússon y col., 1994
Aoki y col., 2000
Parásitos
Agente
Tipo de ensayo
Gel amplificado
Referencia
C. shasta
PCR
ARNr 18S
Palenzuela y col., 1999
M. seriolae y relacionados
PCR
ARNr 18S
Bell y col., 1999
M. cerebralis
PCR
ARNr 18S
Andreé y col., 1998
Tetracapsula bryosalmonae
PCR
ARNr 18S
Saulnier y Kinkelin, 1997
Tabla 1: Sistemas de PCR desarrollados para la detección de organismos patógenos para peces.
ISA: anemia infecciosa del salmón; VHS: septicemia hemorrágica vírica;
VER: retinopatía y encefalopatía vírica; IPN: necrosis pancreática infecciosa;
IHN: necrosis hemorrágica infecciosa; CC: viremia del pez gato;
SD: enfermedad del sueño.
A pesar de que se han descrito métodos de PCR de alta sensibilidad capaces de detectar
menos de 20 UFC por gramo de órgano (Gustafson y col., 1992; Wiklund y col., 2000), la
PCR realizada a partir de muestras clínicas presenta, en general, una sensibilidad bastante
menor a la obtenida a partir de ADN purificado o de microorganismos aislados. En el caso
de patógenos bacterianos, el límite de sensibilidad a partir de muestras de tejidos oscila
entorno a 104-105 UFC por ml o g de muestra comparados con 102-103 UFC por ml
obtenido con el ácido nucleico purificado (McIntosh y col. 1996, Urdaci y col. 1998,
Gibello y col. 1999) (Figura 5). Esta reducción en la sensibilidad de la técnica se atribuye a
la existencia de sustancias inhibidoras en los tejidos y órganos de los animales. Los
inhibidores más frecuentes de las muestras clínicas incluyen diversos componentes de los
fluidos corporales y tejidos (hemoglobina y proteínas séricas de la sangre, grasas,
glicógeno, etc.) y determinados reactivos añadidos durante el procesado de la muestra
(heparina, etc.). Aunque se han descrito un amplio número de inhibidores, su identidad
concreta y modo de acción son en general inciertos (Wilson, 1997). No obstante, las
sustancias que inhiben la reacción de PCR actúan a distintos niveles:
1. Interfiriendo la lisis del microorganismo, necesaria para la liberación del ácido
nucleico a amplificar.
2. Degradando o capturando el ADN a amplificar.
3. Inhibiendo la actividad de la polimerasa.
Figura 5: Detección de Y. ruckeri por PCR a partir de muestras de tejidos
Línea 1: Y. ruckeri (cepa de colección)
Línea 2: patrón de peso molecular
Líneas 3-5: riñón, hígado y bazo de truchas inoculadas
Líneas 6-7, 8-9, 10-11: riñón, hígado y bazo de truchas infectadas
naturalmente
Líneas 12-14: riñón, hígado y bazo de truchas no infectadas
En ocasiones, el efecto de estas sustancias inhibidoras puede reducirse mediante la
utilización de sistemas de extracción del ácido nucleico a partir de las muestras clínicas.
Sin embargo, algunos compuestos orgánicos utilizados en la extracción (fenol, proteinasas
y otros agentes desnaturalizantes) pueden inhibir la actividad de la polimerasa y por lo
tanto resulta necesario valorar en cada caso, el sistema de extracción del ácido nucleico,
tanto si se utiliza un sistema tradicional (extracción con fenol/cloroformo, con tiocianato de
guanidinio, etc.) o kits comerciales. Una solución sencilla a la presencia de sustancias
inhibidoras consiste en la dilución de la muestra (Wilson, 1997). Sin embargo, a mayor
dilución de la muestra se obtiene un descenso en la sensibilidad de la técnica de PCR ya
que, además de reducir la concentración de los inhibidores, se produce una dilución de los
microorganismos presentes inicialmente en la muestra y por tanto, una reducción en la
cantidad de ADN a amplificar. Las consecuencias negativas de este efecto podrían resultar
importantes en aquellos casos en los que el número de microorganismos presentes en la
muestra es bajo; por ejemplo, en los estadíos iniciales de una infección o en animales
portadores asintomáticos. Para paliar el efecto de la dilución y la limitación en el
rendimiento de la reacción debida a una escasa cantidad de ADN a amplificar, se puede
recurrir a los siguientes procedimientos:
Amplificación del ADN a partir del ARN mensajero (RT-PCR)
Sistemas de re-amplificación del fragmento (NESTED-PCR)
Amplificación de secuencias repetidas en el ADN o genes en mayor número de
copias.
En la bibliografía se pueden encontrar diversos ejemplos para cada una de estas
alternativas (Tabla 1). Así por ejemplo, en la detección de R. salmoninarum, se han
utilizado distintos ensayos de PCR.
Aunque en la mayoría de los casos la determinación cualitativa del producto de PCR
puede ser suficiente para el diagnóstico de un proceso infeccioso, en otras situaciones la
cuantificación del número de microorganismos iniciales presentes en la muestra puede
resultar necesaria para la confirmación de una enfermedad. Este sería el caso de la
forunculosis, donde es preciso distinguir entre animales enfermos y animales portadores, y
en ciertas enfermedades parasitarias como las hexamitosis en salmónidos, donde la mera
presencia del parásito no indica un problema de infestación (Post, 1987). No son tan
problemáticos aquellos casos como la enfermedad de la boca roja de las truchas en las que
en los animales portadores, el patógeno (Yersinia ruckeri) se localiza en un órgano
concreto (en este caso, el intestino), (Busch y Lingg, 1975). Otras circunstancias en las que
la cuantificación del microorganismo resulta necesaria son las siguientes:
Cuando el número de microorganismos suponga un punto crítico dentro del análisis
de riesgo y control de puntos críticos de la instalación (ARCPC). Por ejemplo, la
determinación en el agua de formas viables y no cultivables del patógeno.
En el caso de infecciones mixtas, en las que la presencia de un patógeno oportunista
como Aeromonas hydrophila, puede no tener importancia en el diagnóstico del
agente causal de la enfermedad.
En el diagnóstico de enfermedades víricas.
En estas situaciones, los sistemas de PCR cuantitativa ("competitive-PCR" o "real-time
PCR") pueden resultar una alternativa para la determinación de la cantidad de
microorganismos presentes en una muestra. Este método resulta ser más rápido y sensible
que la PCR tradicional y de hecho, se ha utilizado en estudios sobre los mecanismos de
transmisión de diversos patógenos, como el virus del pez gato del canal (CCV), y las rutas
de entrada e invasión de los tejidos del hospedador (Kancharla y Hanson, 1996). Algunas
de estas técnicas ya se han aplicado al análisis de bacterias como P. salmonis (Heath y col.,
2000) y ciertos virus patógenos en acuicultura (Overtuf y col., 2001; Tang y Lightner
2001). Sin embargo, en la actualidad, el coste económico que suponen estas técnicas y la
complejidad de las mismas, no compensan su utilización generalizada en Ictiopatología.
Valoración final
La sintomatología y lesiones de muchas de las enfermedades infecciosas de los peces
carecen de la especificidad suficiente como para establecer un diagnóstico definitivo del
posible agente etiológico. Esto hace que sea necesario la identificación laboratorial precisa
del agente etiológico. Cualquier sistema de diagnóstico clínico debe permitir la
identificación fiable y específica del agente causal, en el menor tiempo posible, para poder
utilizarse de manera rutinaria. La técnica de PCR cumple estos requisitos, y por ello en
estos momentos existen diversas técnicas de PCR descritas para la totalidad de los agentes
infecciosos o parasitarios de mayor significación clínica en acuicultura. Aunque la técnica
de PCR se utiliza cada vez con mayor frecuencia en los laboratorios de Microbiología
clínica, esto no significa que sea, ni deba ser, una técnica sustitutiva del diagnóstico
tradicional basado en el aislamiento y posterior identificación del agente etiológico. La
utilización de la técnica de PCR como sistema de diagnóstico rutinario deberá ser evaluada
en cada caso concreto, teniendo en cuenta las características de cada laboratorio y las
dificultades de aislamiento y/o identificación que presenten los diferentes microorganismos
patógenos.
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Artículo publicado en la Revista AquaTIC nº 15, noviembre 2001