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CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN SANIDAD ANIMAL
(CISA – INIA)
GENOTIPADO DE LOS AISLADOS DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANAS
REV. 2013
PNT/CISA/PPA/GENOTIPADO/1
PÁGINA 1 of 8
CONTENIDO
CENTRO DE INVESTIGACION EN
SANIDAD ANIMAL (CISA-INIA)
Laboratorio de Referencia de la UE de PPA (EURL-ASF)
Centro de Investigación en Sanidad Animal
CISA-INIA, Valdeolmos 28130, Madrid, Spain.
Contacto
Dr. Carmina Gallardo
Virginia Pelayo
E-mail: eurl.asf@inia.es
1. OBJETO.
2. ALCANCE.
3. REFERENCIAS.
3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN.
3.2. DOCUMENTOS A UTILIZAR CONJUNTAMENTE.
4. GENERALIDADES.
5. REALIZACIÓN.
5.1. MATERIALES Y REACTIVOS.
5.2. PREPARACIÓN.
PNT/CISA/PPA/GENOTIPADO/1
PROCEDIMENTO NORMALIZADO DE TRABAJO (PNT)
PARA EL GENOTIPADO DE LOS AISLADOS DEL VIRUS DE LA
PESTE PORCINA AFRICANA
5.3. MÉTODOS.
5.4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
5.5
PUNTOS CRÍTICOS
5.6
MEDIDAS DE SEGURIDAD.
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GENOTIPADO DE LOS AISLADOS DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANAS
REV. 2013
1. OBJETO.
El objeto del presente procedimiento es describir el método a seguir para la
caracterización molecular o genotipado de los aislados del virus dela peste porcina
africana (VPPA).
2. ALCANCE.
Este procedimiento es de aplicación al ácido nucleico extraído siguiendo el
procedimiento descrito en el PNT/CISA/PPA/EXTRACCIÓN ADN/1 -“Extracción del
ADN del virus de la peste porcina africana para su detección mediante reacción en
cadena de la polimerasa -PCR-“- en los siguientes tipos de muestra de origen porcino
y en homogeneizados de garrapatas del género Ornithodoros.
3. REFERENCIAS.
3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN.
1.
2.
3.
4.
5.
AFRICAN SWINE FEVER. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial
Animals (mammals, birds and bees). CHAPTER 2.8.1. OIE, 2012
[http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.08.01_ASF.pdf]
Bastos ADS, Penrith ML, Cruciere C, Edrich JL, Hutchings G, Roger F, Couacy-Hymann
E, Thomson GR (2003) Genotyping field strains of African swine fever virus by partial
p72 gene characterisation. Arch Virol 148: 693–706
Boshoff CI, Bastos AD, Gerber LJ, Vosloo W. (2007). Genetic characterisation of
African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (1973-1999). Vet
Microbiol. Mar 31;121(1-2):45-55.
Gallardo C, Mwaengo DM, Macharia JM, Arias M, Taracha EA, Soler A, Okoth E,
Martín E, Kasiti J, Bishop RP (2009) “Enhanced discrimination of African swine fever
virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR)
genes” Virus Genes , Feb;38(1):85-95.
Gallardo C, Anchuelo R, Pelayo V, Poudevigne F, Leon T, Nzoussi J, Bishop R, Pérez C,
Soler A, Nieto R, Martín H, Arias M. African swine fever virus p72 genotype IX in
6.
PNT/CISA/PPA/GENOTIPADO/1
PÁGINA 2 of 8
domestic pigs, Congo, 2009. Emerg Infect Dis. 2011 Aug;17(8):1556-8.
Nix RJ, Gallardo C, Hutchings G, Blanco E, Dixon LK. (2006). Molecular epidemiology
of African swine fever virus studied by analysis of four variable genome regions. Arch
Virol. Dec;151(12):2475-94.
PPA REVISIONES:
1.
2.
3.
Arias, M., Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2012). African swine fever. In: Zimmerman, J.,
Karriker, L.A., Ramirez, A., Schwartz, K.J, Stevenson, G.W. (Eds), Diseases of swine,
10th Edition. John Wiley and Sons, United States of America, pp. 396-404.
Arias, M.; Sánchez, C.; González, M.A.; Carrasco, L. y Sánchez-Vizcaíno, J.M. (2002).
“Peste porcina Africana” In “Curso digital de enfermedades infecciosas porcinas”. On
line, July, 2002. [http://www.sanidadanimal.info/cursos/curso/7/7-ppa.htm]
Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). RECOGNIZING
AFRICAN SWINE FEVER. A FIELD MANUAL. 2000 Edition.
[ http://www.fao.org/docrep/004/X8060E/X8060E00.HTM]
4.
Costard S, Mur L, Lubroth J, Sanchez-Vizcaino JM, Pfeiffer DU. Epidemiology of
African swine fever virus. Virus Res. 2012 Nov 1.
3.2. DOCUMENTOS A UTILIZAR CONJUNTAMENTE.
•
•
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA PESTE PORCINA
AFRICANA (PNT/CISA/PPA/MUESTRAS/1).
EXTRACCIÓN DEL ADN DEL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA PARA SU
DETECCIÓN MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
(PNT/CISA/PPA/DNA EXTRACCIÓN/1)
4. GENERALIDADES.
4.1. ABREVIATURAS.
ADN: ácido desoxirribonucleico.
CVR: región central variable
pb.: pares de bases
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E+: Control positivo de extracción.
E-: Control negativo de extracción.
R+: Control positivo de reacción.
R-: Control negativo de reacción.
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.
PPA: Peste porcina africana.
VPPA: Virus de la peste porcina africana.
4.2. . PRINCIPIO.
La epidemiología molecular es una herramienta esencial en el control de las
enfermedades que permite determinar la dinámica de una enfermedad y el
origen de nuevos brotes. El genoma del VPPA consiste en una molécula lineal de
ADN de doble banda con un tamaño que oscila entre los 170 y los 193 kbp
dependiendo del aislado viral. Consta de una region central conservada (125 kbp)
y dos zonas variables en los extremos del genoma.
El genotipado de los aislados del VPPA se basa en el análisis de tres regiones
independientes del genoma del VPPA localizadas en la región central conservada
y que comprenden; i) el extremo carboxi terminal de la proteína p72 codificada
por el gen B646L que permite la clasificación de los aislados virales en los 22
genotipos hasta el momento descritos (Boshoff et al., 2007), ii) secuencia
completa de la proteína p54 codificada por el gen E183L (Gallardo et al., 2009) y
iii) la secuenciación de la región central variable (CVR) dentro del gen B602L
caracterizada por la presencia de secuencias repetidas en tándem (Nix et al.,
2006; Gallardo et al., 2011).
La CVR es la región de elección para el subtipado de los aislados del VPPA y por
lo tanto para establecer el origen de un brote y la dinámica de la enfermedad.
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5. REALIZACIÓN.
5.1. MATERIALES Y REACTIVOS.
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Cámara fotográfica o videocámara con impresora.
Congelador de <-10ºC.
Congelador ≤-70ºC.
Cubeta para geles de agarosa horizontales y accesorios (bandejas,
peines, conectores).
Fuente de alimentación.
Gradillas (racks) refrigerantes para tubos de mini centrífuga de 1,5 y
tubos de reacciones de PCR 0,2 ml de 96 pocillos.
Guantes de látex o de nitrilo.
Micropipetas automáticas monocanal de 1-10 µl.
Micropipetas automáticas monocanal de 2-20 µl.
Micropipetas automáticas monocanal de 20-200 µl.
Micropipetas automáticas monocanal de 100-1000 µl.
Minicentrífuga de tubos de PCR
Nevera de 4±3ºC.
Termociclador para PCR convencional.
Transiluminador de luz ultravioleta.
Puntas de micropipeta de rangos 1-200 y 200-1000 µl, estériles.
Puntas de micropipeta con filtros resistentes a aerosoles de rangos 1-10,
2-20, 20-200 y 100-1000 µl, estériles.
Tubos tipo eppendorf estériles, aptos para micro centrífuga, de
volúmenes 0,2 ml, 0,5 ml, 1,5 ml y 2 ml.
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REACTIVOS
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B) REACTIVOS PARA EL PROCESO DE DETECCIÓN DEL ADN:
A) REACTIVOS NECESARIOS PARA LA AMPLIFICACIÓN:
•
AmpliTaq Gold® DNA polimerasa con buffer II y Cl2Mg [Ref.: N8080243 (Roche) o
características similares]. Conservar <-10ºC.
•
Primers del VPPA utilizados en el genotipado conservar a <-10ºC en
alícuotas (fecha de caducidad: 1 año). Se utilizan 3 parejas diferentes de
primers para amplificar tres regiones independientes del genoma del
VPPA:
⇒
⇒
⇒
⇒
⇒
⇒
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p72- U
p72-D
PPA89
PPA722
CVR1
CVR2
[5´- GGCACAAGTTCGGACATGT - 3´]
[5´- GTACTGTAACGCAGCACAG- 3´]
[5´- TGTAATTTCATTGCGCCACAAC - 3´]
[5´- CGAAGTGCATGTAATAAACGTC - 3´].
[5´- ACTTTGAAACAGGAAAC (AT) AATGATG -3´]
[5´- ATATTTTGTAATATGTGGGCTGCTG- 3´]
•
Deoxinucleótidos trifosfato (dNTP) mezcla, conteniendo 10 mM de cada
dNTP [Ref. 11581295001 (ROCHE) o de características similares]. Conservar a <-10ºC.
•
H2O estéril libre de nucleasas, grado PCR.
•
Controles de referencia: los siguientes controles deben incluirse en cada
proceso de amplificación.
o
o
o
o
E+: Control positivo de extracción obtenido durante el proceso
de extracción del ADN del VPPA. Conservar a <-10ºC. Fecha de
caducidad: 6 meses.
E-: Control negativo de extracción obtenido durante el proceso
de extracción del ADN del VPPA.
R+: Control positivo de reacción. ADN obtenido de muestra
positiva de PPA. Se recomienda preparar un control positivo en
el límite de detección de la técnica Conservar a <-10ºC.
Conservar a <-10ºC. Fecha de caducidad: 6 meses.
R-: Control negativo de reacción: agua destilada incluida en el
paso de la amplificación para descartar contaminaciones.
•
•
•
•
•
•
•
Agarosa MP 100 [Ref. 1 388 983001 (Roche) o de características similares]. Conservar a Tª
ambiente.
Azul de bromofenol [Ref.: 1.08122.0025 (Merck) o de características similares]. Conservar a
Tª ambiente.
Bromuro de etidio 0.625 mg/ml [Ref.: E406 (Amresco) o de características similares].
Conservar a Tª ambiente.
Glicerol 87% [Ref. 1.4094.2500 (MERCK) o de características similares]. Conservar a Tª
ambiente.
Marcador peso molecular VI de ADN [Ref.: 11062590001 (Roche) o de características
similares]. Conservar a <-10ºC.
TAE buffer 50x (Tris base, ácido acético y EDTA) [Ref.: A16911000 (AppliChem o de
características similares]. Conservar a Tª ambiente.
Xileno cianol [Ref.: X4126 (Sigma) o de características similares]. Conservar a Tª ambiente.
5.2. PREPARACIÓN
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS.
• Solución de agarosa 2% → Disolver 2gr (±0,1gr) de agarosa MP en 100 ml
•
•
•
de TAE 1x y calentar en microondas hasta que la agarosa esté totalmente
disuelta.
Tampón de carga 6x [azul de bromofenol 0.25%, xileno cianol 0.25%, glicerol 30%] → Disolver
0,1gr (±0,01gr) de azul de bromofenol + 0,1 gr (± 0,01gr) xileno cianol en
17,24 ml de glicerol. Ajustar con agua destilada has un volumen final de
50ml. Conservar a <-10ºC en alícuotas. Fecha de caducidad: 1 año.
Tampón de electroforesis 1x→ Diluir 40 ml de TAE (50x) en 1.960 ml de
agua destilada. Conservar a Tª ambiente. Fecha de caducidad: 2 meses.
Marcador peso molecular VI de ADN → 200 µl de Marcador VI + 200 µl
de tampón de carga 6x + 400 µl de tampón de electroforesis 1x.
Conservar a 4±3ºC. Fecha de caducidad: 6 meses.
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5.3. MÉTODOS.
B.
5.3.1. PROCESO DE AMPLIFICACIÓN (PCR):
A.
Amplificación del extremo carboxi terminal de la proteína p72 del VPPA
utilizando la pareja de primers p72- U y p72-D. Estos primers amplifican 478
pb de la proteína p72 del aislado español del VPPA de referencia Ba71V
(GenBank accession no. ASU18466- Figura 1). Los primers ha sido descritos
por Bastos y col. 2003.
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Amplificación de la secuencia completa del gen E183L que codifica para la
proteína p54 del VPPA utilizando los primers PPA89 y PPA722. Estos
primers amplifican 676 bp que incluye la proteína p54 del aislado español
del VPPA de referencia Ba71V (GenBank accession no. ASU18466- Figura 2).
Los primers ha sido descritos por Gallardo y col. 2009.
Fig. 2: Secuencia obtenida utilizando los primers PPA89/722 (marcados en amarillo) que incluyen la
proteína p54.
Fig. 1: Secuencia obtenida con los primers p72U/D (marcados en amarillo) dentro de la proteína P72
En un tubo de micro-centrífuga de 1,5 ml estéril, se preparará la mezcla de PCR para el
número total de muestras a analizar (incluyendo los E+, E-, R+ y R-) más, al menos, una
muestra adicional (para compensar posibles errores de pipeteo).
1
2
3
4
5
6
7
REACTIVOS DE LA
MEZCLA DE REACCIÓN
H2O
PCR Buffer 10X
Cl2Mg 25 mM
dNTPs 10 mM
Primers p72U 20 µM
Primer p72D 20 µM
Taq Gold 5 U/µl
Volumen de la mezcla
1x VOLUMEN
(reaccción 25µl)
16,375µl
2,5µl
2,5µl
0,5µl
0,5µl
0,5µl
0,125µl
23 µl
En un tubo de micro-centrífuga de 1,5 ml estéril, se preparará la mezcla de PCR para el
número total de muestras a analizar (incluyendo los E+, E-, R+ y R-) más, al menos, una
muestra adicional (para compensar posibles errores de pipeteo).
CONCENTRACIÓN
FINAL
Añadir 2µl del ADN extraído a cada tubo de PCR de 0,2 ml.
Incluir los controles de reacción R+ y R-.
1X
2,5 mM
0,2 mM
0,4 µM
0,4 µM
0,025 U/µl
1
2
3
4
5
6
7
REACTIVOS DE LA
MEZCLA DE REACCIÓN
H2O
PCR Buffer 10X
Cl2Mg 25 mM
dNTPs 10 mM
Primers PPA89 20 µM
Primer PPA722 20 µM
Taq Gold 5 U/µl
Volumen de la mezcla
1x VOLUMEN
(reaccción 25µl)
16,375µl
2,5µl
2,5µl
0,5µl
0,5µl
0,5µl
0,125µl
23 µl
CONCENTRACIÓN
FINAL
Añadir 2µl del ADN extraído a cada tubo de PCR de 0,2 ml.
Incluir los controles de reacción R+ y R-.
1X
2,.5 mM
0,2 mM
0,4 µM
0,4 µM
0,025 U/µl
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C.
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Amplificación de la región central variable (CVR) localizada en el gen B602L
utilizando la pareja de primers CVR1 y CVR2. Estos primers amplifican
665pb del aislado español del VPPA de referencia Ba71V (GenBank accession
no. ASU18466- Figura 3) e incluyen las secuencias repetidas en tándem que
se encuentran en el gen B602L. Los primers ha sido descritos por Gallardo y
col. 2011.
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Después de añadir la muestra, cerrar bien los tubos y dar un golpe de centrífuga
para bajar la mezcla de PCR. Colocar los tubos en un termociclador automatizado
provisto de tapa térmica y correr el programa de incubación detallado a
continuación.
CICLO DE PCR (ES EL MISMO CICLO PARA LAS TRES REGIONES).
Fig. 3: Secuencia obtenida con los primers CVR1/2 (marcados en amarillo) dentro del gen B602L.
DESCRIPCIÓN
Activación de la ADN polimerasa
Desnaturalización ADN
Anillamiento de los primers
Elongación del ADN
Paso extra de elongación
Conservación a 4°C.
Temperatura
95ºC
95ºC
55ºC
72ºC
72ºC
Tiempo
10 min
30 sec
1 min
1 min
10 min
Nº ciclos
1x
40 x
1x
Conservar los productos amplificados a 4ºC hasta proceder con la electroforesis.
(máximo 18 horas).
5.3.2. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA:
En un tubo de micro-centrífuga de 1,5 ml estéril, se preparará la mezcla de PCR para el
número total de muestras a analizar (incluyendo los E+, E-, R+ y R-) más, al menos, una
muestra adicional (para compensar posibles errores de pipeteo).
1
2
3
4
5
6
7
REACTIVOS DE LA
MEZCLA DE REACCIÓN
H2O
PCR Buffer 10X
Cl2Mg 25 mM
dNTPs 10 mM
Primers CVR1 20 µM
Primer CVR2 20 µM
Taq Gold 5 U/µl
Volumen de la mezcla
1x VOLUMEN
(reaccción 25µl)
16,375µl
2,5µl
2,5µl
0,5µl
0,5µl
0,5µl
0,125µl
23 µl
CONCENTRACIÓN
FINAL
Añadir 2µl del ADN extraído a cada tubo de PCR de 0,2 ml.
Incluir los controles de reacción R+ y R-.
1X
2,5 mM
0,2 mM
0,4 µM
0,4 µM
0,025 U/µl
1.
Preparar una solución de agarosa al 2% en tampón de electroforesis (TAE
1x). Calentar la solución en microondas hasta que la agarosa esté
completamente disuelta y añadir bromuro de etidio (BrEt) para obener una
concentración final de 0,5 µg/ml. Agitar para homogeneizar.
2.
Preparar la bandeja sellando los extremos y colocar los peines. Verter la
agarosa disuelta sobre la bandeja. Esperar que gelifique (unos 20 minutos).
3.
Poner la bandeja en la cubeta y añadir tampón de electroforesis hasta que
cubra el gel. Quitar los peines con cuidado.
4.
Preparar las muestras añadiendo 1 µl del tampón de carga 6x a 5 µl del
producto amplificado de PCR.
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5.
Cargar 6 µl de cada muestra en los pocillos del gel. Añadir 6µl del Marcador
de peso molecular en el primer pocillo de cada peine
6.
Conectar a la fuente de alimentación (las muestras migran hacia el polo
positivo). Aplicar 150-200 voltios y dejar correr el gel aproximadamente entre
30-40 minutos.
NOTA: Con voltajes bajos, la velocidad de migración de los fragmentos de ADN es proporcional al
voltaje aplicado. Sin embargo, el intervalo efectivo de separación disminuye al incrementarse el
voltaje, por lo que no debe de aplicarse más de 5 u 8 V/cm2 del gel.
Finalmente colocar el gel sobre un transiluminador de luz UV para visualizar las
bandas de ADN.
5.4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
En la figura 4 se muestra un ejemplo del resultado obtenido en la caracterización
molecular de una aislado (S) obtenido en los brotes ocurridos de PPA en la región
del Cáucaso comparado con ADNs positivos de referencia obtenidos de aislados
pertenecientes al genotipo I (I) y II (II) del VPPA. Los primers p72 U/D amplifican
un fragmento de ~478 pb dentro del extremo carboxi terminal de la proteína
p72. La comparación de la secuencia del producto amplificado con secuencias
homólogas disponibles en el Genbank nos permitirá clasificar el aislado objeto de
estudio dentro de uno de los 22 genotipos descritos hasta el momento.
Fig. 4: Resultados de caracterización molecular del VPPA mediante PCR
PNT/CISA/PPA/GENOTIPADO/1
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Los primers PPA89/722 amplifican un fragmento de ~676 pb que incluye la
secuencia completa de la proteína p54. Se pueden observar,cuando se analizan
aislados de diferentes genotipos, pequeñas variaciones en el tamaño del
producto amplificado debido a la presencia de aminoácidos repetidos en tándem.
La caracterización molecular utilizando la proteína p54 es una herramienta
alternativa que permite diferenciar con mayor resolución entre aislados de un
mismo genotipo de la p72. Es especialmente útil para el genotipado de aislados
circulantes en el oeste de África donde el geontipo I de la proteína p72 es el
predominante.
Aunque tanto la proteina p72 cómo la p54 son muy útiles para realizar una
primera clasificación de los aislados del VPPA, la región central variable (CVR) es
la región de elección para el subtipado de los mismos. Cómo se puede observar
en la figura 4, el producto de PCR amplificado utilizando los primers CVR1/2 nos
permite diferenciar a los aislados por su tamaño. El producto amplificado
correspondiente al aislado objeto de estudio (S) presenta un tamaño idéntico al
producto amplificado obtenido con el aislado de referencia perteneciente al
genotipo II (II). Las variaciones de tamaño se deben a las inserciones y
delecciones de secuencias de aminoácidos repetidas en tándem presentes
dentro del gen B602L (indicadas con un código de colores en la figura 5).
Fig.5. Alineamiento de la secuencia de la CVR de diferentes aislados del VPPA. La ID de colores
representa las secuencias repetidas en tándem.
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5.5. PUNTOS CRÍTICOS
Siendo una de las ventajas de la técnica de PCR su elevada sensibilidad, el punto
crítico durante todo el proceso de análisis es el riesgo de contaminación de las
muestras y, por tanto, los posibles falsos positivos que en este caso se obtendrían. La
contaminación puede deberse al propio VPPA presente en las muestras que puedan
ser positivas o en los controles positivos empleados en el proceso de extracción, o al
ADN del VPPA resultante de la amplificación y manipulado durante el análisis de los
amplicones de una PCR anterior mediante la electroforesis en gel de agarosa. Por
ello, es imprescindible seguir y cumplir unas estrictas normas de trabajo para
minimizar el riesgo de contaminación intrínseco a la técnica de PCR:
•
•
•
•
•
Todos los pasos que implican el análisis de muestras por PCR se realizarán
en espacios diferenciados, con equipamiento y material específicos para
cada uno: preparación de muestras, extracción de ADN, montaje de mezcla
de PCR, análisis por electroforesis de los productos de PCR.
Trabajar siempre con guantes de látex o nitrilo limpios en el laboratorio de
PCR.
Cada vez que el técnico que esté realizando el análisis acceda a una zona de
PCR diferente, deberá cambiarse los guantes desechando los que tenía
puestos.
El material será de uso exclusivo para el paso del procedimiento para el que
esté destinado por su situación/identificación.
Utilizar una punta de pipeta diferente cada vez que se pipetee en un tubo
conteniendo alguna muestra o ADN.
•
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Nunca se abrirán los tubos con producto amplificado en otro laboratorio
que no sea el destinado exclusivamente al análisis de los mismos mediante
electroforesis.
5.6. MEDIDAS DE SEGURIDAD.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Leer y seguir cuidadosamente el protocolo.
Conservar los reactivos a la temperatura indicada antes y después de su
utilización.
No mezclar reactivos ni instrucciones de diferentes kits.
Evitar cualquier contaminación de los reactivos.
No utilizar los reactivos una vez superada la fecha de caducidad.
No comer, beber ni fumar en el laboratorio.
No pipetear los reactivos con la boca.
Utilizar siempre guantes de látex o nitrilo.
El bromuro de etidio es una sustancia cancerígena, principalmente cuando
está en polvo. Asegurarse de pedirlo siempre en solución y con gotero.
Manipularlo exclusivamente en el laboratorio destinado para ello,
siguiendo las normas de seguridad establecidas por el Servicio de Seguridad
Biológica (guantes, bata, manguitos, gafas de protección). En caso de
contacto, lavar inmediatamente con agua abundante y avisar al Servicio de
Seguridad Biológica del centro. Avisar al mismo servicio si ocurre un vertido
de algún reactivo conteniendo bromuro de etidio.