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FACULTAD DE MEDICINA
MAESTRÍA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS
CON ESPECIALIDAD EN FARMACOLOGÍA
“MODULACION PEPTIDERGICA DE LA CORRIENTE DE K + RECTIFICADOR
TARDIO, IKv, EN NEURONAS SIMPATICAS ”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS
CON ESPECIALIDAD EN FARMACOLOGÍA
PRESENTA
Q. B. P. Eduardo Iván Acosta Gómez.
ASESOR
Dr. Humberto Cruzblanca Hernández
Profesor Investigador Titular B.
Colima, Colima, Octubre del 2004
AGRADECIMIENTOS
A mi asesor, Dr. Humberto Cruzblanca Hernández, por su apoyo durante
mi formación como maestro en ciencias, por haberme aceptado para formar
parte de su laboratorio y por su asesoría y paciencia en la elaboración de la
presente tesis.
Al Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología, CONACyT, por apoyar
con la beca de manutención con numero 171306 otorgada durante la maestría.
Al fondo Ramón Alvarez-Buylla de Aldama, al Centro Universitario de
Investigaciones Biomédicas, CUIB, de la Universidad de Colima.
A
los
investigadores
del
Centro
Universitario
de
Investigaciones
Biomédicas, quienes participaron en mi formación, durante la maestría.
DEDICATORIA
“A mis padres, Oscar Eduardo y Marisela, a mi hermano, Oscar Rene, por su
apoyo y consejo incondicional, ya que son para mi un ejemplo a seguir y que
gracias a ello he logrado todo lo que soy”
“A mis amigos que me impulsaron y apoyaron a seguir, durante el transcurso de
la maestría”
INDICE
I. FIGURAS Y TABLAS.
1
II. ABREVIATURAS.
2
III. RESUMEN.
4
ABSTRACT
6
IV. INTRODUCCION.
7
V. DESARROLLO.
V.1 ESTADOS CONFORMACIONALES DEL RECEPTOR 7-TM.
V.1.1 Modelos cinéticos de activación del receptor 7-TM.
9
11
V.1.1.1 Modelo de activación de dos estados.
11
V.1.1.2 El modelo de activación de multiestados.
13
V.1.1.3 Implicaciones funcionales de la activación en multiestados
del receptor 7-TM.
15
V.2
SEÑALIZACION INDEPENDIENTE DE PROTEINAS G.
V.3
FUNCIONAL.
16
DIMERIZACION DE RECEPTORES 7-TM Y SU IMPACTO
21
V.3.1 Modelo de activación de las proteínas G por dimeros de receptores
7-TM.
24
V.4
ANTECEDENTES.
28
V.5
HIPOTESIS.
29
V.6
OBJETIVO GENERAL.
V.6.1 Objetivos particulares.
V.7
MATERIAL Y METODOS.
29
29
30
Cultivo Celular.
30
Electrofisiología.
31
Microinyección.
31
Soluciones fisiológicas.
32
V.8
RESULTADOS.
34
V.8.1 La modulación angiotensinérgica de IKV e IKM tienen diferente curso
temporal.
34
V.8.2 El aumento de IKV por la angio II es sensible a la diálisis.
35
V.8.3 El análogo no hidrolizable del ATP, el AMP-PNP, reduce el efecto
de la angio II sobre IKV .
37
V.8.4 El aumento de la IKV por el receptor AT1 es dependiente de
proteínas G.
38
V.8.5 El péptido antagonista de Gq bloquea la modulación de IKM, sin
afectar significativamente el aumento de IKV .
39
V.8.6 El péptido bradicidina también aumenta a la KI V en neuronas del
GSC.
V.9
VI.
41
DISCUSION.
42
V.10 CONCLUSIONES.
45
V.11 PERSPECTIVAS.
45
BIBLIOGRAFIA.
46
I. FIGURAS Y TABLAS
FIGURA 1: Estructura de la rodopsina vista de lado y desde la cara extracelular.
9
FIGURA 2: Conformaciones propuestas de los estados inactivo y activo del
β2-adrenérgico
receptor
(β2AR).
11
FIGURA
3:
Modelo
de
activación
secuencial
del
receptor
7-TM.
14
FIGURA
4:
Diferentes modos de desensibilización del receptor 7-TM.
18
FIGURA 5: Modelo de activación de la proteína G por dímeros de receptores
7-TM.
25
FIGURA 6: Esquematización de tres mecanismos por el cual se genera la
diversidad
de
señalización
por
receptores
7-TM.
26
FIGURA 7: La angio II incrementa a IKV y reduce a IKM con distinto curso
temporal.35
FIGURA 8: La diálisis reduce el efecto de la angio II sobre la amplitud de IKV
36
FIGURA 9: La potenciación de IKV se debe a un proceso dependiente de ATP.
37
FIGURA 10:
El
GDPβS reduce el efecto de la angio II sobre IKV .
39
FIGURA 11: Efecto diferencial del péptido antagonista 2A sobre la modulación
peptidérgica
de
IKV
e
IKM.
40
FIGURA 12: El péptido bradicidina
incrementa la amplitud de la IKV .
41
TABLA
1:
Soluciones
fisiológicas.
32
II. ABREVIATURAS
AMPc: Adenosin monofosfato.
AMP-PNP: Análogo no hidrolizable del ATP.
angio II: Angiotensina II.
ATRAP: AT1 Receptor-Associated Protein.
BAPTA:
Ácido
1,2-bi-aminofenil-etilenoglicol-NNNN-tetraacetico.
Ca2+)
BK: Bradicinina.
C-Terminal: Carboxilo terminal.
EPSP: Potencial postsinaptico excitatorio lento.
FRET: Fluorescence resonance energy transfer.
GABA: Ácido γ-amino butírico.
GDP: Guanosin bifosfato.
GRKs: Proteínas cinasas de receptores acoplados a proteínas G.
GP-2A: Péptido antagonista de la proteína Gq.
GSC: Ganglio superior cervical.
GTP: Guanosin trifosfato.
ICaN: Corriente de calcio tipo N.
(Buffer
de
ICaT: Corriente de calcio tipo T.
IKV : Corriente de potasio tipo rectificador tardío.
IP3: Inositol trifosfato.
K+: Ion Potasio.
mGlur: Receptor metabotropico al glutamato.
mS: Mili segundos.
mV: Mili Volts.
MΩ
Ω : Mega ohms.
NRPTKs: Tirosino cinasas del tipo no receptor.
Oxo-M: Oxotremorina-M.
PKA: Proteina cinasa A.
PTX: Toxina Pertussis.
RT-PCR : Reacción en cadena de la polimerasa del trascripto reversa.
rpm: Revoluciones por minuto.
Rs: Resistencia en serie.
SFB: Suero fetal bovino.
TTX: Tetrodotoxina.
T½: Vida media.
7-TM: Receptores con 7 dominios transmembranales.
β 2AR: Receptor β2-adrenérgico.
τ : Constante de tiempo τ.
[Ca2+]i: Concentración intracelular libre del ión calcio.
III.
RESUMEN
La interacción receptor 7-TM-proteína G constituye uno de los principales
mecanismos moleculares de traducción de información celular. Por citar algunos
procesos fisiológicos mediados por dicha interacción molecular se incluyen la
traducción de señales visuales, olfativas y gustativas pero también la acción de
ciertas hormonas y neurotransmisores. En estas respuestas celulares, como en
muchas otras, el receptor capta la información extracelular y la transfiere a la
proteína G, cuya función consiste en amplificarla y traducirla en un mensaje
intracelular o delimitado a la membrana. Los detalles del anterior proceso de
traducción de información ha sido motivo de numerosas revisiones (ej. Gether,
2000; Rashid et al., 2004; Wess, 1998) por lo que en la primera parte de la
presente tesis se hace una revisión de la literatura que concierne a tres
novedosos mecanismos de traducción de información por los receptores 7-TM.
El primero, se refiere a que mas de un estado conformacional del receptor tiene
la capacidad de estimular diferentes proteínas G. El segundo plantea un nuevo
paradigma de señalización independiente de las proteínas G. El tercero se
aparta del modelo clásico del receptor 7-TM como una entidad monomérica
funcional. En la segunda parte de la tesis se describen los primeros resultados
de experimentos realizados en las neuronas del ganglio superior cervical, con el
fin
de
caracterizar
las
propiedades
de
la
cascada
de señalización que interviene en la modulación de la corriente de K+ tipo
rectificador tardío, IKV . Se muestra que la modulación de la IKV por el receptor
AT1 a la angiotensina II (angio II) tiene un curso temporal lento (τ = 40.7 seg.)
respecto a la modulación de la corriente de K+ tipo M ( τ = 6.8 seg.). Además el
aumento de la KI V producido por la angio II es sensible a la diálisis del medio
intracelular. Los resultados indican que el ATP es un elemento indispensable
para la modulación de IKV ya que la substitución de este nucleótido por un
análogo no hidrolizable, reduce el aumento de la IKV inducido por la angio II de
10.1 a 1.8 pA/pF. En la modulación de la IKV interviene una proteína G insensible
a la toxina Pertussis, sin embargo, Gq no parece contribuir significativamente al
efecto de la angio II. Finalmente se reporta que otro receptor peptidérgico, el
receptor a la bradicidina también aumenta la densidad de corriente de la IKV en
una magnitud de 16.6 pA/pF y con un curso temporal muy similar al efecto de la
angio II.
En lo futuro se planea identificar los elementos de la cascada de
señalización que emplea el receptor AT1 y determinar los niveles de
convergencia y divergencia con la ruta empleada por el receptor a la bradicidina.
ABSTRACT
The coupling between seven transmembrane receptors (7-TM) and Gproteins constitutes the major molecular mechanism for cell signal transduction.
For instance these proteins mediate physiological processes such as vision,
olfaction
and
taste.
neurotransmitters
Moreover
stimulate
in
G-protein
the
central
coupled
nervous
receptors
to
system
regulate
many
cell
excitability. In these processes the 7-TM receptor stimulates the exchange of
GDP for GTP in the heterotrimeric G-protein, thereby allowing to the Gα and Gβγ
dimer to active their downstream effectors. Details of the G-protein activation has
been reviewed elsewhere (eg. Gether, 2000; Rashid et al., 2004; Wess, 1998).
For this reason, in the first part of the thesis, three novel mechanisms of signal
transduction are reviewed as follows: 1) Different conformational state of the 7TM receptor have the capacity to stimulate different G-proteins; 2) G-protein
independent signaling by 7-TM receptors; 3) Signal transduction mediated by
association between functional 7-TM monomers. In the second part of the thesis,
the properties of the biochemical pathway activated by the angiontensin II AT1
receptor, is described. In superior cervical ganglion neurons, the activation of this
unknown pathway enhances the delayed rectifier K+ current, IKV . It was found that
the effect of angio II on IKV has a slow time course (τ =40.7 sec) with respect to
the angio II-induced inhibition of the M-type K+ current (τ =6.8 sec). In addition
the extent of the enhancement of IKV was sensitive to the cell dialysis and
disrupted by the inhibitor of the G-proteins, GDPβS, and by the nonhydrolyzable
ATP analog, AMP-PNP. Blocking Gq signaling with the antagonist peptide, GP2A, suggest that this type of G-protein does not contribute significantly to the IKV
modulation. Nevertheless the GP-2A reduced the inhibition of the M-type K+
current. Finally it is reported that the peptide bradikinin enhances IKV current
density in an amount of 16.6 pA/pF, which is in extent and time course similar as
angio II does.
IV. INTRODUCCION
Las células captan señales del medio extracelular a través de distintos
tipos de receptores localizados en su membrana plasmática. Estos receptores al
ser estimulados disparan cascadas moleculares para la traducción de
información, que permite a las células responder a ciertos estímulos externos. La
gran mayoría de los receptores son proteínas que pertenecen a la superfamilia
de receptores con siete dominios de transmembrana (receptores 7-TM). Dicho
nombre se adopta porque este tipo de receptor lo constituye un péptido con una
estructura secundaria de siete α-hélices, las cuales atraviesan igual número de
veces la membrana.
La relevancia evolutiva de este tipo de receptor se refleja en el hecho de
que entre el 1 y 5% del genoma de los mamíferos son genes que codifican a
receptores 7-TM (Wess, 1998). Por ello no es casual que el 50% de las
moléculas desarrolladas por la industria farmacológica, actúen sobre los
receptores 7-TM y dentro de las 100 fármacos con mayor demanda en el
mercado, el 25% son drogas que regulan la función de receptores 7-TM (Slusarz
y Ciarkowski, 2004).
Los receptores 7-TM también se les refiere como receptores acoplados a
proteínas G heterotrimericas (proteínas G). La razón de ello es porque la
interacción receptor 7-TM-proteína G constituye uno de los principales
mecanismos moleculares de traducción de información celular. Por citar algunos
procesos fisiológicos disparados por dichas interacciones moleculares, se
incluyen la traducción de señales visuales, olfativas y gustativas pero también la
acción de ciertas hormonas y neurotransmisores.
Las proteínas G están constituidas por una subunidad alfa (Gα), una
subunidad beta (Gβ) y una gamma (Gγ). El modelo clásico de traducción de
información establece que el receptor 7-TM transita de un estado inactivo a otro
activado, disparado por el estímulo externo (Ej. fotón o molécula agonista). El
receptor 7-TM activado estimula en la Gα el intercambio del guanosin difosfato
(GDP) por guanosin trifosfato (GTP). La unión del GTP reduce, por un efecto
alostérico, la afinidad de la subunidad Gα por el dímero Gβγ y el cual se disocia
del complejo Gα-GTP. Una vez separados, tanto la Gα como el dímero Gβγ
pueden activar o inhibir a sus respectivas proteínas efectoras (Ej. diversos
canales iónicos y enzimas que sintetizan segundos mensajeros).
Los detalles del anterior mecanismo clásico de traducción de información
ya han sido revisados en anteriores tesis de Maestría realizadas en el laboratorio
de Neurobiología Celular del CUIB (López, 2002; Mendoza, 2003). Por lo
anterior, la primera parte de la presente tesis de Maestría consiste de una
revisión de la literatura que concierne a tres novedosos mecanismos de
traducción de información por receptores 7-TM, los cuales se apartan del clásico
modelo molecular aquí brevemente descrito. El primero de ellos sugiere que
distintos estados conformacionales del receptor tienen la capacidad de señalizar
diferentes proteínas G. El segundo mecanismo plantea un nuevo paradigma de
señalización independiente de las proteínas G. El tercero se aparta del modelo
clásico del receptor 7-TM como una entidad monomérica funcional. Es decir,
ciertos hallazgos indican que la dimerización del receptor 7-TM (ya sea homo- o
heterodimerización) es otro mecanismo que en algunos casos permite el acople
con la proteína G y en otros, regula la eficacia de la interacción receptor 7-TMproteína G.
Finalmente, en la segunda parte de la presente tesis de Maestría se
describen los primeros resultados de experimentos realizados en las neuronas
del ganglio superior cervical, tendientes a caracterizar la cascada de
señalización que interviene en la modulación de la corriente de K+ tipo
rectificador tardío IKV , por receptores activados por neuropéptidos.
V.
DESARROLLO
V.1 ESTADOS CONFORMACIONALES DEL RECEPTOR 7-TM.
El modelo convencional que aborda la activación de los receptores 7-TM
por ligandos difusibles
(ej. hormonas, neurotransmisores) establece que la
unión del agonista a un dominio del receptor, dispara una secuencia de cambios
estructurales en el receptor que le permiten activar a la proteína G a la cual se
acopla. Poco se conoce sobre la naturaleza física de estos cambios
estructurales y a la fecha solo se dispone de la estructura tridimensional de la
rodopsina, la cual se postula corresponde al estado inactivo del receptor
(Palcewski et al., 2000). La estructura detallada (2.8 Å) de la rodopsina muestra
que las siete alfa hélices forman un racimo con disposición contraria a las
manecillas del reloj (vista desde la cara extracelular) y las hélices ostentan
dobleces o torceduras e inclinación de distinto grado respecto al plano de la
membrana (Figura 1). La tercera hélice, es la mas inclinada respecto a dicho
plano y las hélices 1, 4, 6 y 7, se caracterizan por torceduras a nivel de residuos
prolina altamente conservados.
FIGURA 1: Estructura de la rodopsina vista de lado (izquierda) y desde la cara
extracelular (derecha). Las 7 hélices TM (indicadas por los números) están organizadas en
contra de las manecillas del reloj. Un nicho en el sitio de unión del ligando contiene
covalentemente unido un cromóforo, 11-Cis-retinal. Tomado de Shoneberg, 2002.
No obstante que la rodopsina difiere de ser un típico receptor activado por
ligando (la unión del ligando no es parte del proceso de activación la cual es
disparada por la fotoisomerización del retinal previamente unido al receptor) es
posible extrapolar algunos de los resultados respecto a los cambios
estructurales que subyacen a transición de la rodopsina a su estado activo
(metarodopsina II). La información al respecto proviene de estudios realizados
con técnicas de espectroscopia (ej. resonancia paramagnética del electrón,
EPR; absorbancia de UV del triptofano) combinada con mutagénesis o con la
adición de fluoróforos en residuos cisteína altamente conservados. Una
conclusión de estos estudios es que la fotoactivación de la rodopsina involucra el
movimiento relativo de las hélices 3 y 6, cuyo extremo citoplásmico se aleja del
correspondiente de la hélice 3.
La primera información acerca de los cambios conformacionales de un
receptor activado por ligando proviene de estudios de espectroscopia de
fluorescencia sobre el receptor β2- adrenérgico (β2AR). A dicho receptor se le
añadió covalentemente, en específicos residuos de cisteina (Cys), moléculas
fluorescentes
que
detectan
la
polaridad
del
Empleando estas técnicas el grupo de Gether
ambiente local molecular.
encontró que la unión del
isoproterenol al β2AR induce un cambio conformacional alrededor de la Cys 125
de la hélice 3 y la Cys 285 de la hélice 6 indicando que la parte citoplásmica de la
hélice 6 se mueve hacia un ambiente mas hidrofóbico (Gether et al., 1997). Este
resultado es completamente consistente con lo reportado por la rodopsina y se
ilustra en el modelo estructural de la Figura 2, en donde se observa el
desplazamiento de la parte citoplásmica de la hélice 6 (TM6 en la figura) hacia
una región mas hidrofóbica de la membrana.
FIGURA 2: Conformaciones propuestas de los estados inactivo y activo del receptor β 2adrenérgico (β
β 2AR). La conformación inactiva del receptor (izquierda) es caracterizada por la
cercanía del extremo citoplasmático de la hélice TM 6 con el respectivo de la TM 3. En la
hipotética conformación activa (derecha) del receptor el lado citoplasmático del TM6 se separa
de la hélice 3 y se inserta en la región hidrofobica, marcada por las líneas. Este supuesto
rearreglo del TM6 puede ser explicado cuando se observa el cambio de todas las cisteinas a un
medio menos polar por la activación del receptor. Tomado de Schoneberg, 2002.
En resumen, Los estudios de espectroscopia en los receptores rodopsina
y β2AR sugieren fuertemente que el movimiento de las hélices 3 y 6 refleja parte
de los cambios estructurales que subyacen a la activación del receptor 7-TM.
V.1.1 Modelos cinéticos de activación del receptor 7-TM.
Los modelos cinéticos que a continuación se describen se basan en el
supuesto de que el receptor 7-TM actúa como un monómero.
V.1.1.1 Modelo de activación de dos estados.
El modelo cinético mas simple que describe la activación del receptor 7TM es un modelo de dos estados, el inactivo y el activo. Este modelo también es
conocido como el modelo del complejo ternario formado por el agonista, el
receptor y la proteína G a la cual se acopla. Dicho modelo fue propuesto a
consecuencia de que en la ausencia de agonista el receptor 7-TM puede
espontáneamente transitar a un estado activo. Una virtud del modelo es que
explica el efecto de distintos tipos de ligandos, incluyendo la acción de agonistas
inversos, los agonistas parciales y los antagonistas neutrales, bajo el supuesto
de que dichos ligandos se unen con distinta afinidad a un sitio común en el
receptor. Otra premisa de este modelo es que el estado activo se debe a un
único estado conformacional.
El modelo de dos estados propone que el receptor solo existe en un
estado conformacional inactivo (R) y otro activo (R*) (Samama et al., 1993); en
ausencia del agonista, el estado inactivo prevalece. Sin embargo ya que la
barrera de energía es muy baja entre los estados R y el R* cierta fracción de
receptores espontáneamente transitan al estado R* hasta alcanzarse un
equilibrio entre R y R*. Por lo tanto el modelo postula que los agonistas se unen
con alta afinidad al estado R*, por lo que hay un cambio en el equilibrio
incrementando la fracción de R* y con esto estabiliza este estado funcional. Por
el contrario, los agonistas inversos estabilizan el estado R inhibiendo al receptor.
Finalmente, los antagonistas neutros son ligandos que se unen con la misma
afinidad al estado R y R* y por ende no causan cambios en el equilibrio R y R*
(Samama et al., 1993).
No obstante que el modelo de dos estados puede explicar y reproducir
datos experimentales de diversos tipos de ligando, cierta evidencia indica que la
correlación entre la afinidad del ligando y la funcionalidad del complejo ternario
no siempre se cumple. Esta discrepancia se ha observado en el receptor a la
dopamina D2s , al cual se le han hecho mutaciones en dos residuos serina
ubicados en la hélice 5, los cuales son importantes para la unión de
catecolaminas (Wiens et al., 1998). Así, en la línea celular C6 la activación del
receptor β-AR estimula la síntesis de adenosin monofosfato cíclico (AMPc) y
cuando se transfectan estas células con el receptor D2S silvestre, la dopamina
reduce en 81% el aumento del AMPc. Sin embargo, el efecto inhibitorio de la
dopamina desaparece (0%) en la mutación S194A pero no (78%) en la S193A,
no obstante que la afinidad a la dopamina aumenta 250 veces en la segunda y
solo 20 veces en la primera. Esta discrepancia entre la afinidad de la unión del
ligando y la funcionalidad del complejo ternario también ocurre con el agonista
dihidrexidina en donde el efecto inhibitorio de dicho ligando desaparece en
ambas mutaciones pero sin cambios significativos en la afinidad (1-7 µM) (Wiens
et al., 1998).
Otro problema del modelo de dos estados se relaciona con la cinética de
activación del receptor 7-TM. El modelo predice que la rapidez con que el
receptor alcanza el estado conformacional activo esta determinada por el valor
de la constante de rapidez de asociación del ligando al receptor (K 1). Sin
embargo, los estudios de espectroscopia de fluorescencia realizados en el
receptor β2-AR indican que el movimiento de la hélice 6 es mas lento que el que
predice el valor correspondiente de K1 (Gether, 2000). Esto significa que la
interacción ligando-receptor no es el principal factor que limita la rapidez de la
transición al estado conformacional activo.
V.1.1.2 Modelo de activación de multiestados.
Una manera de resolver la anterior discrepancia es proponer que la unión
del agonista ocurre de manera secuencial con distintos grupos estructurales del
receptor 7-TM, lo cual generaría estados conformacionales intermedios ( R’, R’’
etc.) entre los estados inicial R y final R* (Figura 3).
FIGURA 3: Modelo de activación secuencial del receptor 7-TM. Receptor hipotético que se
ilustra por 7 hélices visto desde la cara externa de la membrana. Se observa un estado del
receptor sin ligando (R) que puede ir hacia otros estados R0 y R* . R0 es estabilizado por un
agonista inverso y R* por un agonista. R puede tener una transición espontánea al estado R*
(actividad basal). La unión del agonista según la bibliografía, sugiere que ocurre
secuencialmente una serie de estados conformacionales intermediarios (R’ y R’’) entre R y R* y
que tiene funcionalmente varios sitios de interacción con el receptor. La unión puede involucrar
una interacción inicial, después, la unión de grupos remanentes ocurre de una manera
secuencial como resultado de un movimiento de la posición de los dominios TM que permite la
interacción con los grupos funcionales. Cada interacción entre el receptor y el agonista estabiliza
una o mas dominios TM, hasta que el receptor se estabiliza en el R*.Tomado de Gether, 2000.
Este modelo de etapas múltiples es compatible con una rápida asociación
del agonista al receptor (determinado principalmente por el complejo AR’) y una
relativamente lenta transición al estado conformacional R*. Como se ilustra en la
figura 3 la unión puede involucrar una interacción inicial entre el receptor y un
grupo estructural del agonista, después ocurre la unión de grupos remanentes
de una manera secuencial como resultado de un movimiento espontáneo de los
hélices transmembranales (TM). Cada interacción entre el receptor y los grupos
estructurales del agonista estabilizan uno o mas dominios TM y finalmente el
receptor alcanza el estado activo R*. Por otro lado se asume que la proteína G
contribuye a estabilizar solo el estado AR* (Gether et al., 1996; Gether et al.,
2000).
V.1.1.3
Implicaciones
funcionales
de
la
activación
en
multiestados del receptor 7-TM.
El modelo de multi-estados también es compatible con el fenómeno
conocido como “agonist-specific trafficking”, el cual se refiere a la capacidad de
ciertos receptores de activar preferentemente una cascada de señalización
dependiendo de la estructura química del agonista que activa al receptor. Un
concepto implícito en este fenómeno es que dependiendo de la naturaleza
química del agonista se estabiliza de manera preferente algún estado
conformacional (R’, R’’ o R*).
Un ejemplo de la activación preferente de cierta cascada de señalización
se encuentra en el receptor a la dopamina DopR99B clonado de D.
Melanogaster; el cual es homologo al receptor D1 de los mamíferos. Cuando el
receptor DopR99B se expresa en el ovocito de Xenopus, la dopamina
rápidamente incrementa la concentración de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) y luego
con un curso temporal lento aumenta el nivel del AMPc (Reale et al., 1997).
Dado que las isoformas I, III y VIII de la enzima adenilil ciclasa son activadas por
el complejo Ca2+-calmodulina, es posible que el aumento del AMPc sea
consecuencia del previo aumento de la [Ca2+]i. Sin embargo, este no es el caso
porque el BAPTA-AM, un buffer de Ca2+, solo bloquea el transiente de Ca2+ pero
no el aumento del AMPc. Otra diferencia sustantiva en la activación de estos dos
sistemas de segundos mensajeros es que la toxina pertussis (PTX), una toxina
que bloquea la interacción de receptores 7-TM con miembros de Go/i, solo
inhibe el aumento del AMPc dejando intacto el aumento de la [Ca2+]i. Es decir,
en el ovocito del Xenopus el receptor DopR99B se acopla a dos tipos de
proteínas G las cuales subsecuentemente activan una específica cascada de
señalización. En este sistema el fenómeno de “agonist-specific trafficking” se
observa con los agonistas específicos del receptor tipo D1, (±)-6-cloro-APB y
R(+)-6-bromo-APB, los cuales aumentan la [Ca2+]i con similar eficacia que la
dopamina, sin embargo, no modifican el nivel de AMPc del ovocito (Reale et al.,
1997).
Otro ejemplo que favorece la idea de que el receptor 7-TM puede tener
múltiples estados conformacionales funcionalmente activos se encuentra en el
receptor a taquininas tipo 2 (NK2). La expresión de este receptor en las células
HEK293 y su estimulación por los dos agonistas naturales, el péptido
neuroquinina A (NKA) y su forma truncada NKA-(4-10), sucede con distinta
cinética de activación y efectos celulares. Empleando la técnica de microscopía
de fluorescencia FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) se ha
demostrado que la activación del receptor NK2 con el NKA-(4-10) es rápida (en
el rango de segundos) mientras que la NKA lo hace con una fase rápida
(segundos) y otra lenta (minutos) (Palanche et al., 2001). Ambos agonistas
generan transitorios de Ca2+, sin embargo solo la NKA estimula la vía de la
adenilil ciclasa y por ende el aumento del AMPc (Palanche et al., 2001). Al igual
como lo hace el ya citado receptor a la dopamina DopR99B, el receptor NKA
estimula la vía del AMPc de una manera independiente del aumento de la
[Ca2+]i. Es decir, no obstante que el receptor NK2 tiene la capacidad de estimular
dos vías de segundos mensajeros, su acción celular depende del tipo de
agonista que lo estimula. Subsecuentes estudios han determinado que el
extremo amino-terminal del receptor NK2 juega un papel relevante en este
ejemplo de “agonist-specific trafficking”, ya que mutaciones en esta región
eliminan la estimulación de la vía del AMPc pero dejan intacta la capacidad del
receptor NK2 para estimular los transitorios de Ca2+ (Lecat et al., 2002).
En resumen, la literatura hasta aquí abordada sugiere que la activación
del receptor 7-TM es un proceso con varios estados conformacionales, de los
cuales el movimiento de la hélice 6 (TM6) es el más aparente. Algunos de los
estados conformacionales son favorecidos por ciertos agonistas y pueden
traducirse en el acoplamiento selectivo con ciertas proteínas G. La capacidad del
receptor 7-TM de adoptar distintos estados funcionales hace más compleja la
traducción de información mediada por estas proteínas de membrana.
V.2
SEÑALIZACION INDEPENDIENTE DE PROTEINAS G.
Como ya se mencionó, los receptores 7-TM también se les refiere como
receptores acoplados a proteínas G. Este sinónimo se adopta ya que el modelo
clásico de traducción de información establece que la señal extracelular captada
por el receptor 7-TM es transmitida a la(s) proteína(s) G a la(s) cual(es) se
acopla. Dicho esquema de flujo de información se cumple para la gran mayoría
de las respuestas celulares mediadas por este tipo de receptor, sin embargo,
recientemente se han reportado acciones de los receptores 7-TM que no están
mediadas por las proteínas G. Al respecto, Heuss y Gether (2000) han
propuesto algunos criterios que sustentan este novedoso paradigma de
señalización. El primero establece que el receptor 7-TM debe activar en la
misma célula tanto la ruta dependiente como aquella que se sospecha es
independiente de las proteínas G. El propósito es determinar si maniobras
experimentales que afectan la interacción receptor 7-TM-proteína G (ej. GDPβS,
mutaciones) no alteran la respuesta celular mediada por la supuesta ruta
independiente. El segundo criterio consiste en identificar cada uno de los
elementos de las cascada independiente de las proteínas G. El tercer criterio
propuesto por Heuss y Gerber (2000) solo se aplica para aquellos agonistas que
en la misma célula activan tanto receptores ionotrópicos como receptores 7-TM
(ej. glutamato, acetilcolina, GABA).
Un ejemplo que satisface el primer criterio de Heuss y Gether (2000); se
ha documentado en los fibroblastos y en la línea celular CHO. En estas células
el receptor a la angiotensina II (angio II) AT1 estimula, a través de Gq/11, la vía de
la fosfolipasa Cβ y con ello la subsiguiente movilización de Ca2+ intracelular.
Asimismo el receptor AT1 estimula la vía Jak-STAT y la subsecuente
proliferación celular. El grupo de Bernstein (Doan et al., 2001) a disecado en el
receptor AT1 los requerimientos estructurales de ambas vías de señalización. De
esta forma, mutaciones de 5 tirosinas (292, 302, 312, 319 y 339) localizadas en
el extremo carboxilo terminal (C-terminal) tienen el efecto de desacoplar al
receptor AT1 de Gq/11. Este efecto se deduce porque el receptor AT1 mutado
(mutante M5) no estimula la síntesis de inositol trifosfato (IP3) ni tampoco
produce aumento del [Ca2+]i, sin embargo, en las mismas células el receptor M5
preserva su capacidad para estimular la vía Jak2-STAT1 (Doan et al., 2001).
Otro ejemplo que cumple este criterio se describió en las neuronas del ganglio
de la raíz dorsal. En estas células el péptido nociceptina al activar al receptor
ORL1 inhibe tanto a la corriente de Ca2+ de alto umbral tipo N (ICaN), como a la
corriente de Ca2+ de bajo umbral tipo T (ICaT) (AbdAlla y Smith, 1997). La
inhibición de ICaN tiene todas las características de ser dependiente del voltaje,
indicando que en este efecto el receptor ORL 1 se acopla a la proteína Go/i
(Dunlap e Ikeda, 1998). Por el contrario, la inhibición de ICaT ocurre sin cambios
en la cinética de activación y tampoco es revertida por un pulso despolarizante.
Interesantemente, cuando a
l s neuronas se dializaron con un análogo del GDP
(GDPβS), un inhibidor general de las proteínas G, el receptor ORL 1 mantuvo
intacta su capacidad para inhibir ICaT y, como era de esperarse, su efecto sobre
ICaN fue completamente eliminado (AbdAlla y Smith, 1997).
Ejemplos que satisfacen el segundo criterio de Heuss y Gether (2000)
involucra a las proteínas arrestinas y/o a la proteína tirosino cinasa Src. Antes de
mencionar estos casos, brevemente se menciona la función que clásicamente se
les atribuye a estas proteínas. Las arrestinas son parte del mecanismo molecular
que subyace al fenómeno de desensibilización homóloga que ostentan algunos
receptores 7-TM. Dicho tipo de desensibilización se debe a la endocitosis del
receptor y este proceso involucra las siguientes etapas: a) el receptor 7-TM
primero es fosforilado en su C-terminal por un tipo especifico de enzimas
conocidas como proteínas cinasas de receptores acoplados a proteínas G
(GRKs); b) unión de la arrestina al C-terminal fosforilado y desacople del
receptor de la proteína G (Figura 4); c) endocitosis del receptor vía vesículas
revestidas con la proteína clatrina.
FIGURA 4: Diferentes modos de desensibilización del receptor 7-TM. Se indica que la
Epinefrina se une al β2AR que normalmente se acopla a Gs. PKA puede fosforilar el receptor,
desacoplándolo de la GS. βARK fosforila al receptor; sin embargo la fosforilación no interfiere con
unión de la GS. La fosforilación por βARK, atrae a otra proteína, la β-arrestina, que al asociarse
con el receptor, previene la unión de la GS o dispara la endocitosis del receptor. Tomado de
Waxham, 1999.
Por su parte la proteína Src es prototipo de la superfamilia de proteínas
con actividad tirosino cinasa del tipo no receptor (NRPTKs), entre las que se
incluyen las familias Jak, Abl, Tec y Fak. Las NRPTks se localizan en el citosol
pero en cercanía con la cara interna de la membrana plasmática, en endosomas
y el núcleo celular (Siegel et al., 1999). Una de las proteínas blanco de Src es
Ras implicando que la vía de las MAPK cinasas puede ser activada a través de
Src. En este contexto se ha reportado que la β-arrestina, además de intervenir
en la internalización del receptor, actúa como proteína adaptadora que recluta a
Src para formar un complejo de señalización organizado alrededor del receptor
β2-AR
(Luttrell et al., 2001). La formación de este complejo es consistente con el
hecho de que en ciertos tipos de células el receptor β2-AR estimula a la vía las
MAPK cinasas, ya que esta acción es atenuada si se inhibe la interacción de la
β-arrestina con el receptor β2-AR o con la cinasa Src.
Otra posible ruta de señalización independiente de proteínas G y
dependiente de Src opera en las neuronas CA3 del hipocampo. La estimulación
repetitiva de las fibras musgosas genera en dichas neuronas piramidales un
potencial postsinaptico excitatorio lento (mGluR EPSP) debido a la activación de
los receptores metabotropicos de glutamato del tipo mGluR1. Por otra parte, en
estas mismas neuronas CA3 el receptor a la adenosina induce una lenta
corriente de potasio (K+), a través de una cascada de señalización donde
interviene la proteína Go/i. Tomando como punto de comparación el efecto del
receptor a la adenosina se encontró que el GDPβS bloquea la activación de la
corriente lenta de K+ pero no impide la generación del mGluR EPSP (Heuss et
al., 1999). Evidencia adicional indica que Src tiene un papel relevante en el
efecto de los receptores mGluR1 ya que la activación directa de Src genera la
misma corriente catiónica que subyace al mGluR EPSP y por lo tanto Src ocluye
la acción de este tipo de receptor 7-TM (Heuss et al., 1999).
En los ejemplos anteriores donde se involucra a las arrestinas y a la
cinasa Src como elementos que intervienen en ciertos efectos celulares de los
receptores 7-TM, se infiere que el C-terminal de estos receptores juega un papel
relevante en el acople con dichas proteínas. Las arrestinas y Src no son las
únicas proteínas que directamente interaccionan con el C-terminal del receptor
7-TM. Otra proteína es la oxido nítrico sintasa endotelial (eNOS). Esta enzima se
localiza en las caveolas debido a su directa interacción con la proteína
caveolina-1, la cual además tiene la función de bloquear la interacción de la
eNOS con su activador, el complejo Ca2+-calmodulina. Sin embargo, hay una
fracción de eNOS que coinmunoprecipita con el receptor a la bradicidina B2 o
con el receptor a la angio II AT1 (Ju et al., 1998). La interacción de la eNOS con
el receptor B2 comprende un domino submembranal que abarca los aminoácidos
310 a 334 del C-terminal de este receptor. Al igual que con la caveolina-1 la
interacción de la eNOS con los receptores B2 y AT1 tiene un efecto inhibitorio
sobre la enzima, sin embargo, el mecanismo es distinto ya que dichos
receptores no impiden la interacción del complejo Ca2+-calmodulina con la
enzima. La eNOS es la enzima que en el endotelio sintetiza al mensajero
transcelular oxido nítrico (NO); en consecuencia la interacción de estos
receptores con la enzima puede tener la función de limitar la síntesis de NO
independientemente de la activación de las proteínas G a las cuales se acoplan
los receptores B2 y AT1. Otra proteína que específicamente interacciona con el
C-terminal del receptor AT1 se conoce como ATRAP (de “AT1 Receptor-
Associated Protein”), sin embargo, se desconoce cuales son las consecuencias
funcionales de esta interacción (Daviet et al., 1999).
Hasta aquí se ha revisado algunos trabajos indicando que la interacción
de ciertos receptores con proteínas distintas a las proteínas G, tiene efectos
celulares como son la activación de la vía de las MAPK cinasas o la vía JakSTAT y en ambos casos la estimulación de la proliferación celular. En este
efecto mitogénico, independiente de las proteínas G, que tienen ciertos
receptores en tipos celulares específicos, juega un papel relevante las NRPTKs
Src y Jak2 (Doan et al., 2001., Luttrell et al., 2001). La activación de Src no solo
puede tener consecuencias funcionales a nivel de proliferación celular sino
también efectos de menor latencia como es la modulación de canales iónicos
(Heuss et al., 1999). En este contexto resulta interesante determinar si en la
inhibición de CI aT por el receptor ORL 1 (AbdAlla y Smith, 1997), interviene una
NRPTKs como Src. Por ultimo, el C-terminal de los receptores 7-TM juega un
papel relevante en la capacidad de señalización del receptor. Esto se concluye
porque: a) contribuye al acoplamiento del receptor con las proteínas G; b) su
fosforilación por las proteínas cinasas GRKs dispara la internalización del
receptor; c) la directa interacción con otras proteínas (ej. Jak, Src, eNOS,
ATRAP) activa rutas de señalización independientes de las proteínas G.
Por mucho tiempo el estudio de la señalización de los receptores 7-TM se
había enfocado sobre el clásico modelo de acople con las proteínas G y la
subsecuente generación de mensajeros. Sin embargo ahora este modelo de
señalización intracelular no es suficiente para explicar la amplia gama de
respuestas biológicas activadas por los receptores 7-TM (Marinissen y Gutkind,
2001). Es decir, en adelante primero se debe demostrar si una respuesta celular
regulada por los receptores 7-TM depende o no de las proteínas G.
V.3 DIMERIZACION DE RECEPTORES 7-TM Y SU IMPACTO FUNCIONAL.
El concepto clásico de que los receptores 7-TM operan como entidades
monoméricas se ha ido modificando en los últimos años por estudios de
microscopía de fuerza atómica, FRET o ensayos de coinmunoprecipitación, los
cuales indican que ciertos receptores 7-TM forman dímeros. La dimerización
puede ocurrir entre receptores idénticos (homodímeros) o entre subtipos e
incluso entre receptores de distintas familias (heterodimeros). La evidencia física
mas convincente de la formación de dímeros proviene de un estudio de
microscopía de fuerza atómica de la rodopsina (Fotiadis et al., 2003). La
dimerización parece modificar distintas propiedades del receptor incluyendo su
afinidad al ligando, la desensibilización, la especificidad para estimular cascadas
de señalización o el trafico del receptor hacia la membrana plasmática (Filizola
et al., 2004).
Quizá el ejemplo mejor estudiado sobre el impacto funcional de la
dimerización se refiere al receptor GABAB. Aunque este receptor fue
farmacológica y funcionalmente caracterizado desde principios de los 80, no fue
hasta fines de la década pasada cuando se clonó la subunidad GABAB1. Sin
embargo, su expresión en sistemas heterólogos inmediatamente demostró que
la proteína GABAB1 era retenida en el retículo endoplásmico, sugiriendo que este
receptor requería de una proteína de tráfico para la adecuada inserción y
expresión funcional del receptor en la membrana (Bowery, 2002). Este enigma
fue rápidamente resuelto con la clonación de la subunidad GABAB2, cuya
estructura secundaria y topología también es típica a la de un receptor 7-TM,
con la excepción de que carece del dominio de la unión al GABA (Bowery,
2002). Es decir, el receptor funcional GABAB existe como un heterodímero
GABAB1-GABAB2 debido a la interacción de sus respectivos C-terminal.
Evidencia adicional demuestra que la subunidad GABAB2 no solo es
indispensable para la inserción de la subunidad GABAB1 a la membrana, sino
también es esencial para el acople del heterodímero con las proteínas G
(Robbins et al., 2001).
Hasta ahora el receptor GABAB parece ser el único receptor 7-TM nativo
que para ser funcional debe estar constituido por un heterodímero. En los otros
ejemplos
de
dimerización
esta
conformación
modifica
las
propiedades
intrínsecas del monómero, como sucede con los dímeros integrados por los
receptores a la somatostatina SST2A y SST3. Estos subtipos de receptores
cuando se coexpresan en las células HEK 293 existen en su mayor parte como
monómeros
pero
una
fracción
se
reconstituye
como
homodimeros
y
heterodímeros (Pfeiffer et al., 2001). Cada homodímero se acopla a proteínas G
que a su vez inhiben a la enzima adenililciclasa. Por su parte, el heterodimero
SST2A -SST3 solo es activado por el agonista selectivo al SST2A , L-779,976, pero
no al agonista selectivo del receptor SST3; esta selectividad por el agonista
SST2A permite que el heterodímero también dispare la inhibición de la
adenililciclasa.
Otra
propiedad
distintiva
del
heterodimero
es
que
su
desensibilización es mas lenta que la de los correspondientes homodímeros
(Pfeiffer et al., 2001).
Un ejemplo de hetero-oligomerización entre distintos tipos de receptor
involucra a los receptores a la somatostatina SST5 y a la dopamina D2. Ambos
receptores al expresarse por separado en la línea celular CHO-K1, inhiben a la
enzima adenililciclasa. El efecto inhibitorio del SST5 desaparece cuando se corta
un segmento de su C-terminal (mutación ∆318 SST5). Sin embargo, cuando el
receptor ∆318 SST5 se coexpresa con el D2 se reconstituye su función al grado
que la máxima inhibición inducida por el receptor ∆318 SST5 ( 26%) es similar a
la generada por el receptor D2 (30%); además, el antagonista del receptor D2,
sulpiride, elimina el efecto de la somatostatina (Rocheville et al., 2000). Estos
resultados sugieren que en el estado de heterodímero con el receptor D2, el
receptor ∆318 SST5 restaura su capacidad de inhibir a la adenililciclasa. Otra
propiedad emergente del dímero SST5-D2 consiste en que la estimulación del
D2 aumenta la afinidad del SST5 a su agonista y viceversa (Rocheville et al.,
2000).
Recientemente se ha reportado que el receptor 7-TM puede formar
heterómeros incluso con un receptor ionotrópico. Esta peculiar asociación la
constituye el receptor a la dopamina D5 y el receptor al GABA tipo GABAA . En
neuronas corticales y del hipocampo los receptores D5 y GABAA se colocalizan
en los ejes de las dendritas, sugiriendo una potencial interacción entre estos
receptores. Estudios de inmunoprecipitación y Western blot en homogenizados
de hipocampo han confirmado la presencia de dímeros resultado de la
interacción selectiva del C-terminal del receptor D5 con la segunda asa
intracelular de la subunidad γ2 del receptor GABAA (Liu et al., 2000). La
coexpresión de estos receptores en células HEK-293 indica que esta asociación
es mutuamente inhibitoria ya que la pre-estimulación del receptor al GABAA
reduce la síntesis del AMPc inducida por el D5. Apegado ha lo anterior la preestimulación del receptor D5 reduce las corriente de cloro generada por el
receptor GABAA . Este ultimo efecto inhibitorio se ha confirmado en los
receptores endógenos D5 y GABAA que expresan las neuronas de hipocampo
(Liu et al., 2000).
Los ejemplos de dimerización citados hasta aquí indican que esta
novedosa constitución del receptor 7-TM es imprescindible en el receptor GABAB
para su expresión funcional o bien en otros receptores modifica propiedades
como: i) la afinidad del receptor al ligando (ej. SST2A -SST3; SST5-D2); ii) el
curso temporal de la desensibilización (ej. SST2A -SST3); iii) la eficacia del
receptor para activar su respectiva cascada de señalización (ej. D5-GABAA ); iv)
la capacidad de acoplarse a su respectiva proteína G (SST5-D2). La
dimerización del receptor también parece modificar el tipo de proteínas G a las
cuales se acopla en su forma monomérica. Esta propiedad se ha descrito con
los receptores a opiáceos tipos µ y δ. Estos receptores cuando se expresan por
separado en las células CHO, se acoplan a una proteína G sensible a la PTX
para reducir la síntesis de AMPc inducida por la forskolina (un activador directo
de la adenililciclasa). Sin embargo cuando se co-expresan los receptores µ y δ,
el heterodímero reduce la síntesis del AMPc de una manera insensible a la PTX
(George et al., 2000). Esto sugiere que los receptores µ y δ pueden acoplarse a
diferentes
proteínas
heterodímeros.
Otro
G
dependiendo
estudio
donde
si
se
están
formando
monómeros
ha
analizado
la
o
interacción
receptor/proteína G es en el heterodímero formado por el receptor a la angio II
AT1 y a la bradicidina B2, expresados en la línea celular HEK293. La aplicación
de angio II en células expresando un nivel bajo del receptor AT1 prácticamente
no estimula a las proteínas G (medida por la unión de GTP γS) y tampoco la
hidrólisis de fosfoinositidos (AbdAlla et al., 2000). Sin embargo, cuando se
coexpresa el receptor B2, la angio II produce un incremento notable en los
anteriores parámetros bioquímicos; este efecto se debe a un aumento en la
eficacia del receptor de acoplarse a su respectiva proteína G porque un mutante
del receptor AT1, con incapacidad para acoplarse a las proteínas G, no
reproduce el efecto de la coexpresión del receptor AT1 silvestre y el B2 (AbdAlla
et al., 2000). La consecuencia de la asociación AT1-B2 también se evaluó en
células musculares lisas en donde el decremento de la expresión de B2, por la
introducción de un antisentido contra B2, reduce la amplitud de los transitorios de
Ca2+ intracelular producidos por la estimulación de las células con angio II.
V.3.1 Modelo de activación de las proteínas G por dímeros de
receptores 7-TM.
La dimerización de receptores 7-TM plantea la pregunta acerca de cómo
este complejo activa a las proteínas G asociadas a este. Breitwieser (2004) ha
propuesto un modelo mínimo el cual se reproduce en la Figura 5. En la primera
etapa la activación del dímero puede ocurrir por dos mecanismos: i) el agonista
puede unirse a cada uno de los receptores monoméricos promoviendo su
dimerización; ii) el agonista se une a dímeros pre-existentes. En el primer caso
la activación de cualquiera de los monómeros puede inducir la asociación
mientras que en el segundo mecanismo se postula que la activación del dimero
pre-existente ocurre cuando cada receptor se une a su respectivo ligando. En
este modelo las etapas subsecuentes son idénticas a la activación de las
proteínas G por monómeros de receptores 7-TM. Este modelo sin embargo, no
representa las interacciones alostericas potenciales entre los receptores y/o que
contribuyen para el cambio conformacional requerido y así generar el estado
activo necesario para producir las interacciones con la proteína G y/o llevar
acabo su desensibilización e internalización (Baneres y Parello, 2003;
Breitwieser, 2004).
FIGURA 5: M odelo de activación de la proteína G por dímeros de receptores 7-TM. (1)
Indica las posibles formas de activación de la proteína G, es decir, la formación del dímero
puede ser inducida por la unión del agonista a cualquier monómero o bien la formación del
dímero requiere de la coactivación de los respectivos monomeros. Los receptores 7-TM
activados forman un bolsillo que puede acoplar la unión de la proteína G heterotrimerica y su
activación y desactivación siguen el modelo convencional (2), (3) y (4b). El dímero tiene la
capacidad de activar mas de una proteína G (4a). Tomado de Breitwieser, 2004.
El modelo anterior implícitamente plantea que en el estado de dímero el
receptor 7-TM tiene el potencial de diversificar su capacidad y eficiencia de
señalización. Por ejemplo, en su estado monómerico un receptor puede
acoplarse a un tipo de proteína G mientras que al constituir un heterodímero
puede acoplarse a otro tipo de proteína G; este seria el caso de la interacción
entre los receptores a opiáceos tipos µ y δ citados en el apartado anterior. La
Figura 6 ilustra una versión mas elaborada de este mecanismo de diversificación
de la capacidad de señalización del receptor 7-TM. Otra posibilidad es que la
heterodimerización aumente la eficiencia de acople a la misma proteína G,
amplificando (ej. dímero AT1-B2) o incluso restaurando (ej. dímero ∆318 SST5D2) el proceso de traducción de información.
FIGURA 6: Esquematización de tres mecanismos por el cual se genera la diversidad de
señalización por receptores 7-TM. (A), Varios ligandos se unen con distinta afinidad al receptor
7-TM y con ello mediar distintos efectos sobre las señales de transducción, desensibilización e
internalización. La oligomerización del receptor (B) puede general un
perfil funcional y
farmacológico distinto al de su estado monomérico. Uno de ellos puede se la activación de
diferentes proteínas G (C). Tomado de Rashid et al., 2004.
Es evidente que la hetero-oligomerización puede conferir una diversidad
notable de fenotipos de señalización por el receptor 7-TM. Dado que en la
mayoría de los casos de dimerización de receptores 7-TM provienen de estudios
realizados en sistemas de expresión heteróloga, es fundamental determinar si
dichas asociaciones realmente suceden en células diferenciadas. Cabe recordar
que
distintos
mecanismos
celulares
pueden
limitar
la
formación
de
heterodimeros e incluyen: i) la regulación de los niveles de expresión de cada
receptor; ii) la localización de receptores en regiones específicas de una célula
polarizada y/o en especializaciones de la membrana como las caveloas; iii) la
formación especifica de complejos de señalización organizados alrededor de
proteínas adaptadoras como Homer, PSD-95 etc. Confirmar estas asociaciones
entre receptores nativos permitirá entender el impacto fisiológico de la
dimerización. Asimismo, en el caso de una enfermedad que involucre a cierto
receptor
7-TM
(ej.
esquizofrenia,
depresión),
desarrollar
una
estrategia
farmacológica que contemple el posible estado dimérico del receptor
(Breitwieser, 2004).
V.4
ANTECEDENTES.
Como ya se menciono, las células captan señales del medio extracelular
a través de distintos tipos de receptores, como pueden ser la familia de
receptores 7-TM. Estos una vez estimulados disparan cascadas de señalización,
permitiendo a la célula responder estímulos externos. Así por ejemplo las
neuronas simpáticas del ganglio superior cervical (neuronas GSC) aumentan su
excitabilidad en respuesta a neurotransmisores como la acetilcolina o a
neuropéptidos como la bradicidina (BK) y la angio II. Este cambio en la
excitabilidad se manifiesta como una lenta despolarización que conduce a
aumento en la frecuencia de disparo y subsecuente liberación de noradrenalina.
Dado que los receptores activados por dichos agonistas inducen los mismos
efectos sobre la excitabilidad, es probable que ellos modulen las mismas
corrientes iónicas. En efecto, una de ellas es la corriente de K+ tipo M (IKM) la
cual es inhibida por el receptor colinérgico muscarínico M1, el receptor a la
angiotensina II tipo AT1 y el receptor a la bradicidina tipo B2 (Cruzblanca et al.,
1998; Hamilton et al., 1997; Shapiro et al., 1994).
En el laboratorio estamos interesados en identificar los mecanismos
iónicos y bioquímicos que permiten mantener la alta frecuencia de disparo tónico
de las neuronas GSC. Al respecto, recientemente se demostró que la angio II al
estimular el receptor AT1 aumenta la amplitud de la corriente de K+ tipo
rectificador tardío IKV (Mendoza González et al., 2003). La modulación de IKV es
insensible a la toxina PTX lo cual sugiere que el receptor AT1 se acopla a una
proteína G que no pertenece a la familia Go/i. Sin embargo, a la luz de que el
receptor AT1 puede prescindir de las proteínas G (sección V2. de la tesis) para
activar rutas bioquímicas de regulación, es indispensable evaluar esta
posibilidad. Por lo anterior en la parte experimental de la presente tesis se hace
una mayor caracterización de la cascada de señalización que interviene en la
modulación de la IKV . Asimismo, dado que en las neuronas GSC los receptores
AT1 y B2 inhiben a la IKM (Cruzblanca et al., 1998; Shapiro et al., 1994), se
determinará sí la BK aumenta la amplitud de la IKV .
V.5
HIPOTESIS.
La modulación de la angio II sobre la corriente de potasio tipo rectificador
tardío, IKV , esta mediada por proteínas G.
V.6
OBJETIVO GENERAL EXPERIMENTAL.
Caracterizar las propiedades de la cascada de señalización que interviene
en la modulación angiotensinérgica de la corriente del tipo rectificador tardío IKV .
V.6.1 Objetivos particulares.
a) Comparar
los
cursos
temporales
de
la
modulación
angiotensinérgica de IKV e IKM.
b) Determinar si el incremento de la IKV por angio II es sensible a la
diálisis.
c) Determinar si la inhibición de las proteínas G elimina el aumento
de IKV por el receptor AT1.
d) Probar el efecto del péptido antagonista de la proteína Gq
(antagonista GP-2A) sobre la modulación peptidérgica de IKV e IKM.
e) Evaluar el efecto del análogo no hidrolizable del ATP, el AMP-PNP,
sobre la modulación de IKV .
f) Determinar si la bradicinina tiene efecto sobre la amplitud de la IKV .
V.7 MATERIAL Y METODOS
Cultivo Celular: Los experimentos se realizaron en neuronas del GSC,
mantenidas en cultivo primario (rata Wistar, de 2-4 semanas de edad). Las ratas
se
anestesiaron
con
cloroformo
y
posteriormente
se
sacrificaron
por
decapitación. Se enjuaga la cabeza con agua para quitar la sangre y se disecan
rápidamente ambos GSC, los cuales se encuentran a nivel de la bifurcación de
las arterias carótidas. Una vez extraídos los ganglios se limpian y descapsulan
cuidadosamente para evitar dañar a las neuronas contenidas ahí. Con el fin de
facilitar la difusión de las enzimas durante la etapa de dispersión enzimática, se
realizaron varios cortes transversales del GSC. Las enzimas empleadas fueron
papaína (Roche; 20 U/ml), colagenasa (Sigma; 1.8 mg/ml) y dispasa II (Roche; 5
mg/ml), disueltas en solución de Hanks modificada (ver soluciones); las
soluciones son continuamente oxigenadas hasta antes de su uso, ya que esto
ayuda para una mayor sobrevivencia de las neuronas.
Después de su incubación con las enzimas, los ganglios se pasan
repetidamente a través de pipetas Pasteur con puntas pulidas al calor, con el fin
de facilitar la disociación mecánica de las células. Una vez logrado la disociación
del tejido, las enzimas se diluyen añadiendo medio DMEM (Dulbecco’s Modified
Eagle Médium, GIBCO); la suspensión se centrifuga a 2000 rpm durante 5 min.
Se resuspenden las neuronas con sumo cuidado en medio fresco conteniendo
además ahora 10% de suero bovino fetal (SFB) y se centrifugan por segunda
ocasión a 2000 rpm durante 5 min. Después las neuronas son nuevamente
resuspendidas en una pequeña cantidad de volumen, para posteriormente ser
sembradas en pedazos de vidrio (4 x 4 mm aprox.) tratados previamente con
polilisina (500ng/ml) (SIGMA), se dejan reposar durante 2 horas para que las
células se adhieran muy bien al vidrio. Después de este periodo a las neuronas
se les adiciona DMEM + 10% SFB + una mezcla de antibiótico y antimicótico
(ver soluciones) y se incuban por lo menos durante 8 hrs. La incubación es a
37oC y en una atmósfera de 5% CO2, hasta antes de su empleo para los
experimentos electrofisiológicos.
Electrofisiología: Para el registro de la IKV se transfirió uno de los fragmentos
de vidrio conteniendo neuronas a una cámara de registro de capacidad de 200 µl
y se bañaron con solución Ringer Normal (ver soluciones) a una tasa de 2.6
ml/min. La IKV se registró mediante la técnica de “Patch-Clamp” en la
configuración de “célula entera”, utilizando pipetas de vidrio (Drummond) con
una resistencia de 1.2-1.6 MΩ . Los registros se realizaron con el amplificador
EPC7 (HEKA Helektronik) y un sistema de adquisición analógico-digital de 12
bits (Indec Systems). La resistencia en serie fue en promedio 2.43 MΩ .
Para el registro de la IKV se bloquearon previamente las corrientes de Na +
y Ca2+ con 500 nM de TTX y 200 µM de Cd2+, respectivamente, siendo ésta la
solución control. La IKV se generó con pulsos comando despolarizantes de 100
mseg de duración, en el rango de -40 a 0 mV (el voltaje de sujeción fue de -50
mV). Antes de su adquisición a 5 kHz, la IKV se filtró a 1 kHz. En los
experimentos donde se registró la IKM. Su análisis de IKM se hizo de acuerdo a
Cruzblanca y cols. (1998). Todos los experimentos se efectuaron a temperatura
ambiente.
Para el análisis de IKV su amplitud a 0 mV se obtuvo de la diferencia entre
el promedio de la corriente basal (5 mseg) y el promedio del nivel de la corriente
alcanzada al final del pulso comando, promediándose los 2 últimos mseg. Lo
anterior se hizo después de haber restado la corriente de fuga. Por otro lado el
efecto de la angio II o de la BK sobre la IKV se cuantificó midiendo la densidad de
corriente (pA/pF) en la condición control y en presencia de alguno de los
neuropéptidos.
Microinyección: En los experimentos donde se microinyectó en el citoplasma
de las neuronas el péptido antagonista de la proteína Gq (péptido GP-2A), se
utilizó el sistema Eppendorf constituido por un micromanipulador automático
(5171) acoplado al inyector programable (5246). Las pipetas utilizadas para la
microinyección fueron de borosilicato (1B120F-4 WPI) también se llenaron con
una solución 0.05% de dextran-fluoresceína para identificar las células
inyectadas y que permanecieron vivas después de este procedimiento.
La microinyección provee varias ventajas sobre otras técnicas de
transferencia de proteínas o genes. En el caso de la transferencia de genes la
microinyección es muy útil para aquellas células que exhiben una baja eficiencia
de transfección, como es el caso de las células diferenciadas y en particular de
las neuronas. Además usando esta técnica se pueden introducir a la célula
anticuerpos, péptidos, proteínas, vectores, RNA, fármacos etc. (LaMorte et al.,
1999).
En algunos experimentos se introdujo el péptido GP-2A por diálisis a
través de la pipeta de patch-clamp.
Este mismo procedimiento se empleó
cuando se substituyó al GTP por GDPβS o bien cuando se reemplazo al ATP
por el AMP-PNP (ver soluciones internas). Los tiempos de diálisis antes de
aplicar la angio II se indican en el texto correspondiente.
Se utilizaron los siguientes fármacos y toxinas: TTX, angio II, BK, GDPβs,
AMP-PNP y Antagonista GP-2A de Calbiochem; Oxo-M de RBI; BAPTA y
Dextran-Fluoresceína de Molecular Probes.
Soluciones Fisiológicas (Tabla 1)
Reactivo
Hanks (mM)
NaCl
137
KCl
5.4
KH2PO4
0.44
NaH2PO4
0.34
HEPES
5
CaCl2
MgCl2
Glucosa
5
Ringer (mM)
160
2.5
10
5
1
8
Control (mM)
160
2.5
10
5
1
8
Tetrodotoxina
Cd2+
PH
7.4
7.4
0.0005
0.1
7.4
Solución Antibiótico-Antimicótico (100X): Penicilina G sódica: 10.000
unidades/ml, Sulfato de Estreptomicina 10.000 µg/ml y Anfotericina B 25 µg/ml
en 0.85% de solución salina.
Solución Interna estándar de la pipeta para el registro de la I KV (mM): KCl,
175; MgCl2, 5; HEPES, 5; Na 2-ATP, 3; Na-GTP, 0.1; BAPTA, 0.1; Leupeptina,
0.08; pH 7.4 con KOH.
Solución Interna de la pipeta para identificar si el efecto de la Angio II
sobre la I KV es mediado por proteínas G (mM): KCl, 175; MgCl2, 5; HEPES, 5;
Na2-ATP, 3; GDPβs, 2; BAPTA, 0.1; Leupeptina, 0.08; pH 7.4 con KOH.
Solución Interna de la pipeta para identificar si el efecto de la Angio II
sobre la I KV es mediado por la proteína Gq (mM): KCl, 175; MgCl2, 5; HEPES,
5; Na 2-ATP, 3; Na-GTP; Antagonista-2A, 0.0895; BAPTA, 0.1; leupeptina, 0.08;
pH 7.4 con KOH.
Solución interna de la pipeta para ver si el efecto de la Angio II sobre la I KV
es sensible al ATP (mM): KCl, 175; MgCl2, 5; HEPES, 5; AMP-PNP, 3; NaGTP, 0.1; BAPTA, 0.1; Leupeptina, 0.08; pH 7.4 con KOH.
Solución de microinyección: Dextran-Fluoresceína, 0.05%; Antagonista GP2A, 440 µM.
V.8
RESULTADOS.
La etapa experimental de la presente tesis consiste en caracterizar las
propiedades generales de la cascada de señalización que participa en la
modulación de la corriente de K+ tipo rectificador tardío, IKV , por receptores 7-TM
a neuropéptidos.
V.8.1 La modulación angiotensinérgica de IKV e IKM tienen diferente
curso temporal.
En las neuronas GSC la estimulación del receptor AT1 resulta en la
inhibición de IKM e ICaN (Shapiro et al., 1994). Aunado a estos efectos, Mendoza
González (2003) reportó que en esas mismas neuronas el receptor AT1 modula
a una tercera corriente iónica, es decir, al rectificador tardío KI V . Contrario al
efecto sobre IKM e ICaN la angio II aumenta la amplitud de IKV . Con el objeto de
hacer una primera caracterización de las propiedades de la modulación de IKV ,
se compararon los cursos temporales del efecto de la angio II sobre IKM e IKV .
Empleando una concentración de angio II de 500 nM, la cual produce el efecto
máximo sobre IKM (Shapiro et al., 1994), se encontró que la inhibición de KI M
ocurre con un curso temporal rápido comparado con el efecto de la angio II
sobre IKV ; P< 0.05 (Figura 7). Para cuantificar esta diferencia a ambos cursos
temporales se ajustaron funciones exponenciales simples (decreciente para IKM y
co-exponencial para IKV ), obteniendo que el aumento de IKV ocurre con una
constante de tiempo de 40.7 ± 5.4 seg, mientras que la inhibición de IKM sucede
con una constante de tiempo de solo 6.8 ± 1.1 seg.
Angio II (500 nM)
-10
Control
-10
1 nA
50 ms
350
B
A 3.5
300
200 pA
250
100 ms
IK V (nA)
IKM (pA)
3.0
c
200
a
150
2.5
100
50
2.0
0
50
100
Tiempo (s)
150
0
20
40
60
80
Tiempo (s)
FIGURA 7: La angio II incrementa la amplitud de IKV y reduce a IKM con distinto curso
temporal. Curso temporal del aumento de la corriente medido al final del pulso de prueba de IKV
+
(A) y de la inhibición de IKM (B). Ambas corrientes de K se registraron en intervalos de 4
segundos, en solución control (círculos negros) o en presencia de angio II (círculos blancos).
Nótese que la latencia del efecto de la angio II sobre IKV es mayor, así como el tiempo requerido
para alcanzar su máximo. Los registros de IKV en (A) se generaron con un pulso despolarizante
de -60 a –10 mV (100 ms), en la condición control y 2 min. después de bañar a las neuronas con
500 nM de Angio II. Los registros de IKM en (B) se obtuvieron con un pulso comando de –25 a –
60 mV (500 ms) para desactivar a la IKM. La línea discontinua en cada registro indica el nivel cero
de corriente(c= Control; a= angio II.)
V.8.2 El aumento de IKV por la angio II es sensible a la diálisis.
100
El lento curso temporal que tiene la modulación de IKV (τ = 40.7 seg) no
solo contrasta con la inhibición de IKM sino también con la modulación de ICaN la
cual puede por dos vías de señalización bien caracterizadas en las neuronas
GSC. En estas neuronas los receptores muscarínicos M1 y M4 inhiben a ICaN con
constantes de tiempo de 1 y 9 seg, respectivamente (Zhou et al., 1997). La
inhibición lenta se debe a la interacción del receptor M1 (Bernheim et al., 1992)
con la proteína Gq (Haley et al., 2000) y requiere de un segundo mensajero de
naturaleza lipídica (Liu y Rittenhouse, 2003). Por su parte, la inhibición rápida se
debe a la interacción del dímero Gβγ, liberado de Go, con el canal de Ca2+ tipo N
(Delmas et al., 1998; Dolphin, 1998). Lo anterior lleva a postular que el curso
temporal de la modulación de IKV refleja, en términos generales, la naturaleza de
la cascada señalización implicada. Una primera hipótesis es que en dicha
cascada de señalización participan elementos citosólicos como pueden ser
enzimas y precursores de segundos mensajeros. Si este es el caso entonces la
modulación de IKV debe ser sensible a la dilución del citosol que provoca la
configuración de “célula entera” del patch-clamp.
Por lo anterior se comparó el efecto de la angio II sobre IKV en neuronas
dializadas por dos y cinco minutos antes de iniciar la adquisición de los registros
control. Los primeros dos minutos de diálisis con la solución interna estándar se
deben al tiempo necesario para que, una vez alcanzada la configuración de
“célula entera”, se estabilice la resistencia en serie (Rs = 2.43 MΩ ). Como se
puede apreciar en la gráfica de la figura 8, el efecto de la angio II fue menor al
aumentar el tiempo de la diálisis a 5 min; P< 0.05. Es decir, en neuronas
dializadas por 2 min el aumento de IKV fue de 15.6 ± 1.3 pA/pF (n = 7) mientras
que en aquellas células dializadas por 5 min, la angio II aumentó la IKV en 9.1 ±
1.3 pA/pF (n = 10).
Angio II
(500 nM)
20
7
KV
(pA/pF)
15
10
10
FIGURA 8: La diálisis del medio intracelular reduce el efecto de la angio II sobre la
amplitud de IK V. Resumen de la comparación del efecto de la angio II sobre IKV en neuronas
dializadas durante dos y cinco minutos. Se aprecia claramente que hay una disminución en el
efecto de la angio II al prolongar el tiempo de diálisis; P< 0.05. Sobre las barras se indica el
número de células en cada condición.
V.8.3 El análogo no hidrolizable del ATP, el AMP-PNP, reduce el
efecto de la angio II sobre IKV .
La sensibilidad del efecto de la angio II a la diálisis del medio intracelular
apunta hacia un mecanismo convencional de modulación de canales iónicos
debido a un proceso de fosforilación (Hilgemann, 1997), Este mecanismo
bioquímico constituye un proceso común a través del cual un vasto numero de
señales extracelulares
producen sus efectos biológicos (Hunter, 1995). En la
fosforilación de proteínas juega un papel central el ATP dado que las proteínas
cinasas rompen el grupo fosfato de esta molécula para transferirlo a su proteína
blanco. Por lo anterior se determinó si la modulación de IKV requiere de la
hidrólisis de ATP y para ello se substituyo equimolarmente a esta molécula por
un derivado no hidrolizable, el AMP-PNP. En estos experimentos las neuronas
se dializaron por 5 min. antes de iniciar los registros de la IKV . La figura 9
muestra la respuesta de una neurona dializada con la solución interna estándar
(panel izquierdo) y de otra célula dializada con AMP-PNP (panel derecho). Se
puede apreciar que el AMP-PNP reduce notablemente el efecto de la angio II
sobre la IKV . En resumen, en las neuronas dializadas con ATP el aumento de la
IKV fue de 10.1 ± 1.9 pA/pF (n = 6) y este efecto se reduce a solo 1.8 ± 1.1 pA/pF
(n = 5) en aquellas células dializadas con AMP-PNP (Figura 9). Es decir el ATP
es elemento indispensable para la modulación de KI V por el receptor AT1; P<
0.05.
ATP
AMP-PNP
Angio II (500 nM)
Angio II
Angio II
C
50 ms
10 pA/pF
C
Incremento de IKV (pA/pF)
10 pA/pF
14
12
6
10
8
6
4
5
2
0
ATP
AMP-PNP
FIGURA 9: La potenciación de IKV se debe a un proceso dependiente de ATP. Efecto de la
angio II sobre IKV en una neurona dializada por 5 min. con solución interna estándar (ATP) y en
otra célula dializada con AMP-PNP (AMP-PNP). Nótese que la substitución equimolar del ATP
prácticamente elimina el efecto de la angio II sobre la IKV; P< 0.05. La gráfica resume el efecto de
la angio II en cada condición experimental; sobre las barras se indica el número de neuronas
registradas en cada caso.
V.8.4 El aumento de la IKV por el receptor AT 1 es dependiente de
proteínas G.
La demostrada capacidad de los receptores 7-TM de activar cascadas de
señalización dependientes e independientes de las proteínas G (ver sección V.1
y V.2) vuelve imprescindible determinar si una respuesta fisiológica es o no
sensible a maniobras experimentales que bloquean la activación de las
proteínas G. Para la presente tesis este procedimiento es mas necesario ya que
se ha demostrado que el receptor AT1 en otras células, tiene directa interacción
con proteínas citosólicas como Jak2, e-NOS, ATRAP (Daviet et al., 1999; Ju et
al., 1998; Doan et al., 2001) u con otros receptores 7-TM como el receptor B2 a
la bradicidina (AbdAlla et al., 2000). Por lo anterior se evaluó el efecto del
GDPβS, un inhibidor de las proteínas G sobre la modulación de IKV . En estos
experimentos las neuronas se dializaron con una solución interna libre de GTP y
con 2 mM de GDPβS con el fin de lograr el máximo bloqueo de las proteínas G.
Los registros de KI V de la figura 10 muestran el efecto de la angio II en una
neurona dializada por 5 min. con la solución interna estándar (panel izquierdo) y
en otra dializada, en el mismo lapso, con GDPβS (panel derecho). Nótese que
en esta última célula el efecto de la angio II es mínimo respecto al observado en
la neurona control. La gráfica de la figura 10 resume los resultados de estos
experimentos. En el grupo control el aumento de IKV fue de 9 ± 1.2 pA/pF (n = 8)
mientras que en las células dializadas con el GDPβS el aumento fue de solo 2.7
± 0.5 pA/pF (n = 6); P< 0.05. Esto sugiere que el receptor AT1 se acopla a una
proteína G para modular a la IKV .
Angio II (500 nM)
12
GDPβ
S Angio II
20 pA/pF
C
8
Incremento deI KV (pA/pF)
Contro
l Angio II
10
20 pA/pF
C
8
6
4
2
0
20 ms
6
Control
GDPβS
FIGURA 10: El GDP β S reduce el efecto de la angio II sobre IKV. Efecto de la angio II sobre
IKV en una neurona dializada con la solución interna estándar (control) y en otra célula en la que
se eliminó el GTP y se añadió 2 mM de GDPβS a la solución interna (GDPβS). En cada par de
registros el trazo señalado con C es el obtenido antes de la aplicación de la angio II. Nótese el
típico aumento de la IKV provocado por la angio II en la neurona control mientras que este efecto
fue prácticamente abolido en la célula dializada con GDPβS; P< 0.05. La gráfica de barras
resume estos resultados: el aumento de IKV se redujo de 9 ± 1.2 pA/pF (n = 8) a solo 2.7 ± 0.5
pA/pF (n = 6), en las células dializadas con el análogo del GDP.
V.8.5 El péptido antagonista de Gq bloquea la modulación de IKM , sin
afectar significativamente el aumento de IKV .
Experimentos de RT-PCR realizados en el laboratorio revelan que las
neuronas GSC expresan las siguientes subunidades Gα de las proteínas G:
Gαo, Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαz, Gαq, Gα11 y Gαs. En un estudio previo Mendoza
González (2003) demostró que la modulación de IKV no es afectada por la toxina
pertussis (PTX), indicando que la proteína G a la cual se acopla el receptor AT1
es insensible a la PTX. Por lo anterior a Gq, G11, Gs o Gz pueden ser
potenciales elementos de la cascada de señalización que interviene en la
modulación de IKV .
En la presente tesis se evaluó la posible participación de Gq debido a
que: a) se ha demostrado que Gq interviene en la inhibición muscarínica de IKM
(Haley et al., 1998; Haley et al., 2000); b) se ha propuesto a Gq y/o G11 como la
proteína G que interviene en la acción inhibitoria del receptor AT1 sobre IKM
(Shapiro et al., 1994). Por lo anterior se estudió el efecto de un péptido
antagonista de Gq (GP-2A) sobre la modulación angiotensinérgica de IKM e IKV .
La eficacia farmacológica del péptido GP-2A ha sido probada en miocitos
cardiacos en donde bloquea la activación de la vía Jak-STAT3 por el receptor
AT1 y Gq (Hunt et al., 1999) y en nuestros experimentos se estudió, como control
positivo, el efecto del péptido GP-2A sobre la inhibición de IKM inducida por 20
nM de angio II. La figura 11 resume los resultados de estos experimentos.
Nótese que el péptido GP-2A reduce la inhibición de IKM de 52.4 ± 4.5% a 19 ±
6.1% (barras llenas). En contraste, la modulación angiotensinérgica de IKV
prácticamente no se ve alterada por el péptido GP-2A (barras vacías); el
aumento de IKV en neuronas control fue de 11.4 ± 2.1 pA/pF mientras que en las
células inyectadas con el GP-2A el incremento fue de 9.3 ± 1.7 pA/pF; P < 0.05.
Este resultado sugiere que Gq no contribuye significativamente a la modulación
de IKV .
CONTROL
GP-2A
Angio II
10 pA/pF
Angio II
10 pA/pF
C
C
50 ms
FIGURA 11: Efecto diferencial del péptido antagonista 2A sobre la modulación
peptidérgica de IKV e IKM. Efecto de la angio II (20 nM) sobre IKV (barras vacías) e IKM (barras
llenas), en neuronas inyectadas con el marcador fluorescente dextran-fluoresceína (D-F)
(Control) y en células co-inyectadas con Dextran-Fluoresceína mas el péptido GP-2A (GP-2A).
Como es de esperarse, el antagonista de la proteína Gq reduce la inhibición de IKM; P< 0.05. En
contraste, el aumento de la KI V es prácticamente similar en las neuronas control (11.4 ± 2.1
pA/pF) y en las células inyectadas con el GP-2A (9.3 ± 1.7 pA/pF).
V.8.6 El péptido bradicidina también aumenta a la IKV en neuronas del
GSC.
En las neuronas del GSC la estimulación del receptor a la BK tipo B2, al
igual que el receptor AT1, también estimula la liberación de noradrenalina e
inhibe a la IKM (Boehm y Cubista, 2002; Jones et al., 1995). Si el receptor AT1 y
el receptor B2 comparten los mismos efectos celulares es posible que este último
también tenga una acción moduladora sobre la IKV . Esta posibilidad se refuerza
ya que en el músculo liso y en la línea celular HEK 293, ambos tipos de
receptores forman heterodímeros y esta interacción directa se traduce en
incremento en la activación de las proteínas G a las cuales se acoplan (AbdAlla
et al., 2000). Apegado a lo anterior se procedió a investigar si la BK es capaz de
incrementar a la IKV . La figura 12 muestra que la BK aumenta la amplitud de la
IKV con un curso temporal similar al efecto de la angio II (Figura 7). En un total de
11 neuronas tratadas con 100 nM de BK el incremento en la densidad de
Bradicidina
(100 nM)
5200
corriente de la IKV fue de 16.6 ± 2.6 pA/pF; P< 0.05. Este valor es prácticamente
idéntico al obtenido con la angio II, a un tiempo de diálisis de 2 min. (Figura 8).
FIGURA 12: El péptido bradicidina también incrementa la amplitud de la IKV. Se muestra a
la izquierda el curso temporal del efecto de la BK (100 nM) sobre la amplitud de la IKV. Dicha
+
corriente de K se registró en intervalos de 4 seg., en solución control (círculos negros) o en
presencia de BK (círculos blancos). En los registros de la IKV que se muestran, el incremento en
la densidad de corriente fue de 16.5 ± 2.7 pA/pF; P< 0.05.
V.9
DISCUSION.
Se reporta en esta tesis, una caracterización parcial de la cascada
bioquímica de señalización que interviene en el aumento de la IKV por el receptor
a la angio II, AT1. Se muestra que la angio II incrementa a la IKV y reduce a la IKM
con distinta latencia y curso temporal, es decir: i) la latencia del efecto de la
angio II sobre IKV es mayor que sobre IKM; ii) el tiempo requerido para alcanzar el
aumento máximo de KI V es mayor que el lapso necesario para inhibir a la IKM
(Figura 7). Se desconoce la naturaleza de la cascada de señalización que
interviene en la inhibición angiotensinérgica de IKM, sin embargo, se postula que
el receptor AT1 emplea la misma ruta bioquímica que interviene en la inhibición
muscarínica de IKM (Shapiro et al., 1994). En ella participa el receptor
muscarínico M1, la proteína Gq y una fosfolipasa que hidroliza al PIP 2 (Haley et
al., 1998; Haley et al., 2000; Hamilton et al., 1997; Suh y Hille, 2002). En esta
cascada bioquímica la señal que dispara la inhibición de IKM es el vaciamiento
del nivel de PIP 2 en la membrana (Suh y Hille, 2002; Zhang et al., 2002). Es
posible que el receptor AT1 también emplee la misma ruta del receptor M1 para
inhibir a IKM ya que el bloqueo de Gq con el péptido GP-2A redujo el efecto de la
angio II (Figura 11). Como el péptido GP-2A no altero el efecto de la angio II
sobre IKV , es muy probable que el receptor AT1 active otra cascada bioquímica
para aumentar a la IKV . Asimismo, dada la diferencia en los cursos temporales de
la modulación de la IKM e IKV es probable que la ruta que modula a IKV tenga más
etapas bioquímicas.
En los experimentos se demostró la participación de una proteína G en la
acción del receptor AT1. Aunque esto parece obvio, estrictamente fue
imprescindible determinar este punto ya que el receptor AT1 también puede
activar cascadas de señalización independientes de proteínas G (ver inciso V.2).
Por ejemplo, se ha demostrado que el receptor AT1 interactúa con proteínas
citosolicas como Jak2, e-NOS y ATRAP (Daviet et al., 1999; Doan et al., 2001;
Ju et al., 1998). Los resultados indican que el GDPβS, prácticamente eliminó el
efecto de la angio II (Figura 10). Es probable que la proteína G que interviene en
la modulación de IKV no pertenece a la familia Gi porque Mendoza González
(2003) reportó que la inhibición de esta familia con la toxina PTX, no modificó el
aumento de IKV inducido por la angio II. Sin embargo no se puede descartar a Gz
porque es el único miembro de esta familia que es insensible a la PTX y porque
experimentos de RT-PCR revelan que las neuronas GSC expresan a esta
proteína (observaciones no publicadas).
Sería muy interesante evaluar la
participación de Gz porque sus propiedades bioquímicas son compatibles con el
curso temporal de la modulación de IKV . Por ejemplo, su tasa de intercambio de
GDP por GTP (0.02 min-1) es de las mas lentas entre los miembros de la familia
Gi y una vez formado el complejo (Gαz-GTP), su vida media (T½) es de ∼ 10
min, un tiempo 10 veces mayor a la T½ de Gαq-GTP (∼ 1 min) y 100 veces
mayor a la T½ de Gαo/i-GTP (10-20 seg) (Ross, 1995). Estas propiedades
bioquímicas pueden explicar el lento curso temporal del aumento de IKV (τ = 40.7
± 5 seg) y la aparente irreversibilidad del efecto de la angio II.
En la presente tesis se evaluó la participación de Gq en la modulación de
IKV , debido a que esta proteína se ha implicado en la inhibición de IKM por el
receptor AT1 (ver primer párrafo de la discusión). Los resultados obtenidos con el
péptido GP-2A sugieren que esta proteína no contribuye de manera importante a
la modulación de KI V . Sin embargo, es necesario sustentar con otros enfoques
esta conclusión como el empleo de RNA de interferencia (iRNA) contra Gq o la
sobrexpresión de RGS2, maniobras que abolen la señalización por esta proteína
G (Haley et al., 1998; Suh et al., 2004). Queda por estudiar otras proteínas G
insensibles a la PTX y que son expresadas por las neuronas GSC incluyendo a
G11 y Gs.
Otra propiedad de la modulación de IKV es que la magnitud del efecto de
la angio II fue dependiente del tiempo de diálisis (Figura 8). Esta conducta
sugiere la participación de elementos citosólicos como pueden ser enzimas y/o
precursores de segundos mensajeros. Esta posibilidad se refuerza con el
relativamente lento curso temporal con que la angio II incrementa la amplitud de
la IKV . En los experimentos se determinó si el ATP es esencial para la
modulación de IKV ya que esta molécula es hidrolizada por proteínas cinasas
para transferir el grupo fosfato (fosforilación) a sus respectivas proteínas blanco
(Hilgemann, 1997). Los resultados muestran que el derivado no hidrolizable del
ATP, AMP-PNP prácticamente eliminó el aumento de IKV (Figura 9) , sugiriendo
que el ATP es indispensable para el efecto de la angio II. Sin embargo, este
resultado no permite distinguir si la dependencia al ATP se debe a un proceso
de fosforilación y/o a que el ATP es precursor de algún segundo mensajero
soluble en el citosol como en el caso del AMPc.
Finalmente se demostró que la bradicidina también aumenta la amplitud
de IKV con similar magnitud y curso temporal al efecto de la angio II (Figura 12).
Las neuronas GSC expresan los dos tipos de receptores a la BK (Seabrook et
al., 1997), sin embargo, el receptor B2 es el más abundante y responsable de la
mayoría de los efectos de la BK en estas neuronas. Por ejemplo, el receptor B2
inhibe a KI M (Jones et al., 1995) a través de la fosfolipasa C y la subsecuente
liberación de Ca2+ desde depósitos sensibles al IP 3 (Cruzblanca et al., 1998;
Haley et al., 2000). Por lo anterior sería conveniente determinar si el efecto de la
BK sobre KI V esta mediado por la anterior vía de señalización. Otro tópico a
evaluar en lo futuro surge de la formación de heterodímeros constituidos por los
receptores AT1 y B2, descrita en otras células (AbdAlla et al., 2000; AbdAlla et
al., 2001), la cual se traduce en un aumento en la eficiencia de acople con las
proteínas G. Dado que los valores obtenidos del aumento de KI V y su curso
temporal son prácticamente idénticos entre la angio II y la BK, este efecto común
puede deberse a que: 1) cada receptor utiliza la misma cascada de señalización;
2) el efecto de la angio II y BK esta mediado por un heterodimero de estos
receptores.
Ya que es posible que la modulación peptidérgica de IKV sea parte de la
respuesta celular que subyace al aumento del tono simpático inducido por la
angio II y la BK, es conveniente determinar si el aumento de IKV es el mecanismo
responsable de mantener la alta frecuencia de disparo de las neuronas GSC.
Dado que IKV contribuye a la fase repolarizante del potencial de acción, el
aumento de esta corriente de K+ tendría el efecto de acelerar la repolarización
de la membrana y con ello limitar la fracción canales de Na + inactivados durante
cada potencial de acción. Estos dos factores, en principio, favorecerían una
frecuencia de disparo alta y sostenida. En concordancia con este mecanismo se
ha documentado que miembros de las familias Kv2 y Kv3, las cuales generan
corrientes de K+ tipo rectificador tardío, son relevantes para mantener altas
frecuencias de disparo neuronal (Rudy y McBain, 2001; McCrossan et al., 2003).
V.10 CONCLUSIONES.
1. El receptor AT1
parece estimular dos rutas de traducción de
información, una rápida que inhibe a KI M y otra lenta que aumenta a
IKV .
2. El receptor AT1 se acopla a una proteína G para modular a la IKV . Al
parecer Gq no tiene un papel relevante.
3. El aumento de IKV por el receptor AT1 es sensible a la diálisis por lo
que su cascada de señalización probablemente requiere de la síntesis
de un segundo mensajero soluble en el citosol y de un proceso
bioquímico que dependiente del ATP.
4. La BK aumenta la densidad de corriente de IKV , tal vez empleando el
mismo mecanismo de señalización que la angio II.
V.11 PERSPECTIVAS.
Las perspectivas de este trabajo son: 1) identificar la proteína G
involucrada (G11, G12, G13, Gs, Gz, ) en la modulación peptidérgica de IKV ;
2) identificar las enzimas y los segundos mensajeros que intervienen en esta
cascada
de
señalización;
3)
esclarecer
el
mecanismo
bioquímico
(fosforilación o desfosforilación) que subyace a la modulación de IKV ; 4)
Identificar las subunidades de canales de K+ que forman al canal iónico que
genera a la IKV ; 5) determinar los cambios en las propiedades biofísicas del
canal de K+ modulado por el receptor AT1; 6) describir en detalle la
modulación de IKV por la BK e identificar los niveles de convergencia y/o
divergencia entre las acciones de la BK y la angio II.
VI.
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