Download Dr. César Raúl González Bonilla. Dr. Saúl Rojas Hernández

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E
INVESTIGACION
“Desarrollo de un sistema acarreador de antígenos mediante la
expresión de un dominio de unión a biotina fusionado con el
autotransportador ShdA en la superficie
de Salmonella enterica serovar Typhimurium”
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN CIENCIAS EN MORFOLOGIA
PRESENTA:
Q.F.B. BERENICE SÁNCHEZ ARELLANO
DIRECTORES DE TESIS
Dr. César Raúl González Bonilla.
Dr. Saúl Rojas Hernández
MÉXICO, D. F.
2009
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AGRADECIMIENTOS
Le agradezco al Dr. César Raúl González Bonilla, por permitirme hacer mi tesis
de maestría con el, por todo el apoyo recibido durante el proceso, por enseñarme
cosas nuevas cada día, por motivarme a aprender y a ser mas autocritica.
M en C Juan Carlos Vázquez Islas, por todo el apoyo que me das siempre, por
escucharme, regañarme, darme consejos y sobre todo jalarnos juntos para
obtener este grado, por que siempre estas aquí con migo a mi lado, no importó
que tan mal o bien estuviera todo siempre estas ahí. Gracias por estar con migo.
Al Dr. Bernardo Martínez Miguel, por ayudarme a aprender mas, explicarme y
tenerme paciencia, y por ser el hermano que eres por ser un pan de Dios.
M en C. Julio Elías Alvarado, por ayudarme a entender mas, por enseñarme
nuevas técnicas, y ayudar a comprender un poco mas el proyecto, por se un
excelente amigo, y apoyarme cuando lo necesite y aun ahora.
Dra. Ericka N Pompa Mera, por ayudarme en el proyecto, dando siempre buenos
consejos y ayudando a que todo saliera bien, explicando cuando lo necesitaba y
apoyándome todo el tiempo. Gracias.
Dra. Melisa Martínez Paniagua; a ti te debo literal la maestría, me apoyaste con la
fundación Martínez Paniagua, me explicaste tanto cosas de la maestría como
cosas de la vida, me apoyaste en todo momento, y lo sigues haciendo, eres la
única persona que siempre creyó en mi y eso vale mucho para mi, por eso eres mi
amigüis por siempre y para siempre.
A mi Mamá, por que gracias a ella estoy aquí, por que por ella me intento superar
cada día de mi vida para que se sienta un poco mas orgullosa, y mas satisfecha
de lo que has hecho por mi.
A mi hermana, que gracias a ella que me dio su apoyo y a mi sobrino estoy
concluyendo una etapa más la cual no seria posible si no me hubieras dado tu
apoyo incondicional.
A Iker, mi sobrino. Por que siempre cuanto con el para explicarle mis artículos y
me pregunte para que es eso para que sirve y como se hace, y si le puedo
explicar ya la hice..., por que es impresionante su sed de aprender mas y de
preguntar siempre que hago en el laboratorio y cuando puede acompañarme a
trabajar, espero algún día poder llevarlo a trabajar al laboratorio y que sea un
investigador u lo que decida ser. GRACIAS mi Quicho de sololoi.
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INDICE.
RESUMEN………………………………………………………………………………...7
ABSTRACT……………………………………………………………………………......9
ANTECEDENTES………………………………………………………………………..11
JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………………18
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………………………………………18
HIPÓTESIS……………………………………………………………………………….18
OBJETIVOS……………………………………………………………………………....19
DISEÑO EXPERIMENTAL……………………………………………………………...19
MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………….....20
RESULTADOS……………………………………………………………………………26
DISCUSIÓN……………………………………………………………………………....34
CONCLUSIONES………………………………………………………………………...36
PERSPECTIVAS……………………………………………………………….…………37
CRONOGRAMA.....................................................................................................38
REFERENCIAS………………………………………………………………………….39
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Este proyecto se realizará en la Unidad de Investigación médica en Inmunología e
Infectología. Hospital de Infectología “Dr. Daniel Méndez Hernández” Centro
Médico Nacional “La Raza”, IMSS. Av. Jacarandas esq. Vallejo s/n
Colonia “La Raza”. Delegación Azcapotzalco. México DF 02200.
Tel 57255900 ext. 24321. E mail: crgb@prodigy.net.mx
Tutor Interno
Dr. Saúl Rojas Hernández
Instituto Politécnico Nacional.
Escuela Superior de Medicina sección de estudios de posgrado e investigación.
Departamento de inmunología.
Fuentes de financiamiento, conto con Beca institucional por parte del Instituto
Politécnico Nacional, así como la Beca Tesis para concluir la maestría, conto con
el apoyo de UC MEXUS-CONACYT con el numero Grant Number; CN-07-122, en
CONACYT el numero de oficio es 09 B5 61 2800/1605
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RESUMEN.
Antecedentes. Los “acarreadores vivos” son bacterias atenuadas modificadas
mediante ingeniería genética, que producen proteínas recombinantes heterólogas
y constituyen un tipo de vacuna muy prometedor, pues se administran por vía oral
y transportan antígenos pasajeros directamente hasta células dendríticas y
macrófagos. Aunque han demostrado que son capaces de generar respuesta
inmunológica efectiva contra diversos microorganismos en modelos animales,
existen problemas técnicos que han dificultado su desarrollo y utilización en
humanos. La producción de la proteína pasajera puede constituir una carga
metabólica importante para la bacteria acarreadora y también existe la posibilidad
de que le confiera propiedades que aumenten su patogenicidad. Por otro lado, la
localización de las proteínas recombinantes en los diferentes compartimientos
bacterianos puede influir en la eficiencia de la respuesta inmune, pues se sabe
que la expresión de los antígenos pasajeros en la superficie favorece la
producción de anticuerpos. En general, para lograr la expresión de antígenos en la
superficie bacteriana, se requiere construir proteínas de fusión en flagelina, fimbria
o proteínas de membrana externa o utilizar sistemas de transporte y excreción de
proteínas propias de la bacteria. Sin embargo, la expresión de antígenos en la
superficie es generalmente pobre y pueden no lograr un plegamiento análogo a la
proteína nativa. Para solucionar estos problemas utilizamos un sistema ligandoreceptor que permite “acoplar” antígenos de interés directamente a la superficie de
vector bacteriano. Para ello, antígenos previamente biotinilados se conjugarán a
avidina expresada en la superficie de Salmonella enterica serovar Typhimurium
como una proteína de fusión al dominio β del autotransportador ShdA. Con ello, se
evitarán métodos complejos de ingeniería genética y se cuenta con un acarreador
universal que permite la evaluación rápida de candidatos a vacuna.
Justificación. Existe la necesidad de mejorar las vacunas basadas en la
estrategia de “vectores bacterianos”, de tal modo que se incremente la calidad y
cantidad de proteínas pasajeras que produzcan, sin que constituyan una carga
metabólica importante para la bacteria acarreadora y sin que se modifiquen sus
propiedades biológicas. Para lograr una mejor respuesta de anticuerpos es
conveniente que los antígenos pasajeros se expresen en la superficie bacteriana
Planteamiento del problema. La producción de proteínas recombinantes en
bacterias atenuadas puede ser ineficiente por diversas causas, tales como
estabilidad de plásmidos, toxicidad o carga metabólica. Por otro lado, las proteínas
recombinantes pueden conferir nuevas propiedades patogénicas a las bacterias
transformadas. Consecuentemente, es necesario un sistema que asegure la
estabilidad y seguridad de los acarreadores bacterianos.
Hipótesis. El acarreador bacteriano Universal, expresara en la superficie de E.coli
y Salmonella entérica serovar Typhimurium a la bandera molecular Flag y a la
Avidina.
Objetivos. Se desarrollo un acarreador bacteriano universal, consistente en una
cepa de Salmonella enterica serovar Typhimurium SL3261 que expresa en su
superficie a la avidina como una proteína de fusión al dominio beta del
autotransportador ShdA.
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Material y métodos. El gene que codifica para la avidina se amplifico por PCR a
partir del plásmido PAH3545, se insertará en el plásmido pENP01 y se transformo
en Escherichia coli HB101. El gene de fusión resultante esta bajo el control del
promotor inducible nirB, conteniendo la avidina, la porción translocadora del
dominio α de ShdA, el dominio β de ShdA y la secuencia FLAG, que sirve como
bandera molecular. La producción de la proteína de fusión Avidina-ShdA-Flag se
evaluó mediante electroforesis en geles de acrilamida en condiciones reductoras y
no reductoras (SDS-PAGE) e inmuno-electrotransferencia utilizando anticuerpos
contra FLAG a partir de extractos crudos de proteína bacteriana. La translocación
de la proteína de fusión a la superficie bacteriana se evaluó por
inmunofluorescencia indirecta (IFA) y citometría de flujo. Y se transformo en
Salmonella enterica serovar Typhimurium.
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Abstract
"Live acarreadores" are dimmed bacteria modified through genetic engineering,
that produce recombinant heterologous proteins and are a very promising vaccine
type given orally and take antigens passengers directly to macrophages and
dendritic cells. Although they have shown they are capable of generating effective
immune response against various microorganisms in animal models, there are
technical problems that have hampered their development and use in humans.
Transient protein production may constitute an important metabolic burden for the
acarreadora bacteria and also the possibility of implying properties to increase its
pathogenicity. On the other hand, the location of recombinant in different
compartments bacterial proteins can affect efficiency of immune response,
because you know the expression of antigens passengers on the surface favours
the production of antibodies. Although the mechanism is unclear, this relates
possibly accessibility to lymphocytes B, which allows a more efficient presentation
of antigens passengers. In general, build protein flagellin, fimbria or outer
membrane protein fusion or use own bacteria protein excretion and transport
systems is required for the expression of antigens on the bacterial surface.
However, the expression of antigens on the surface is generally poor and they can
not achieve an analogous to the native protein folding. We use a system to solve
these problems ligand-receptor allowing "flatten" Antigen of interest directly to the
surface of bacterial vector. This new procedure allows lead peptides or complete
proteins could adapt to the transport of non protein molecules and other
biotechnological applications. To do this, previously biotinilados antigens
conjugarán avidina expressed on the surface of salmonella enterica serovar
Typhimurium as a protein fusion domain autotransportador ShdA β. This complex
methods of genetic engineering can be avoided and there is a universal carrier that
allows rapid evaluation of vaccine candidates. Justification. There is a need to
improve vaccines based on the strategy of "bacterial vectors", so to increase the
quality and quantity of temporary proteins that produce without constitute an
important metabolic burden for the acarreadora bacteria and without modifying
their biological properties. To achieve a better antibody response is appropriate
passengers antigens are expressed on the bacterial surface. Approach to the
problem. Production of recombinant dimmed bacterial proteins can be inefficient for
various reasons, such as stability of plasmids, toxicity or metabolic burden. On the
other hand, recombinant proteins can confer new pathogenic properties
transformed bacteria. Consequently, a system to ensure stability and security of
the bacterial acarreadores is required.
Hypothesis. The bacterial carrier universal, expressed on the surface of e. coli
and enteric Salmonella Typhimurium serovar molecular flag Flag and the Avidina.
Objectives. Build a bacterial carrier universal, consisting of a strain of salmonella
enterica serovar Typhimurium SL3261 expressing its surface to the avidina as a
protein fusion to the beta of the ShdA autotransportador domain. Material y
métodos. The gene that encodes for the avidina amplifico for PCR of the
PAH3545, plasmid is inserted in the pENP01 plasmid and will be transformed into
Escherichia coli HB101. The resulting fusion gene will be under the control of the
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inducible promoter nirB, containing the avidina, the translocadora ShdA α domain
portion, the β ShdA and the stream FLAG, to serve as molecular flag domain.
Production of Avidina-ShdA-Flag fusion protein will be evaluated through
electrophoresis gels of acrylamide in conditions reducing and not reducing (SDSPAGE) and immuno-electrotransferencia using antibodies against FLAG from
crude extracts of bacterial protein, periplasm and outer membrane proteins. The
translocation of the bacterial surface fusion protein will be evaluated by indirect
immunofluorescence (IFA) and flow cytometry. Transformed salmonella enterica
serovar Typhimurium.
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ANTECEDENTES.
I: Empleo de vectores bacterianos vivos atenuados en la generación de
vacunas.
El desarrollo de vacunas es uno de los campos científicos que más auge tienen en
la actualidad, pues existe la necesidad de mejorar la eficacia e incrementar la
bioseguridad de las vacunas ya existentes, así como de desarrollar nuevas
vacunas contra enfermedades hasta hoy poco atendidas por los sistemas de
salud.
Entre las diferentes alternativas para el desarrollo de vacunas se encuentran los
“vectores vivos”. Estas vacunas son virus, parásitos protozoarios, bacterias gram
positivas o gram negativas, atenuados mediante ingeniería genética, que
producen proteínas recombinantes o llevan plásmidos que contienen genes con
maquinaria de expresión eucariótica de otros microorganismos. Diversas bacterias
atenuadas, como Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Shigella spp. y otras,
han sido utilizadas como “vectores vivos” de antígenos, ya que son capaces de
producir proteínas recombinantes heterólogas con propiedades antigénicas (1;2).
Las bacterias gram negativas, especialmente Salmonella, ofrecen ventajas
teóricas sobre otros sistemas acarreadores porque se administran por vía oral y
transportan antígenos pasajeros directamente hasta células dendríticas y
macrófagos (células presentadoras de antígeno profesionales), induciendo
respuesta inmune humoral y celular, tanto sistémica como en las mucosas (3). Por
ello, Salmonella es un “vector vivo” que ha sido utilizado ampliamente resultados
muy prometedores en modelos animales, pues ha demostrado su efectividad en
infecciones por otras bacterias, virus y parásitos. Además, ha sido utilizada
también en el tratamiento de algunos tumores (4), en modelos de vacunas
anticonceptivas (5;6) y en la modulación de respuestas alérgicas (7).
Salmonella typhimurium SL3261es una cepa mutante en el gen aro A con lo cual
se vuelve autotrófica para aminoácidos aromáticos, ácido p-aminobenzóico y 2,4dihidroxibenzoato (los dos últimos metabolitos no presentes en los tejidos de los
vertebrados) (8-10) Este vector ha sido extensamente evaluado en diferentes
modelos animales (principalmente el murino) debido a que esta es capaz de
infectar células dendríticas y macrófagos (11-13)
Sin embargo, los ensayos clínicos han tenido un éxito limitado y después de más
de dos décadas de investigación en este campo, todavía no existe una vacuna
basada en vectores bacterianos cuyo uso en programas de salud pública se
encuentre cercano. El éxito de este tipo de vacunas se ha visto limitado por
diversos motivos (Figura 1). Los “vectores vivos” bacterianos, son organismos
genéticamente modificados (GMOs) que serían liberados al medio ambiente, por
lo que debe asegurase su estabilidad y bioseguridad (14), pues existe la
posibilidad de que la modificación genética y la introducción de genes foráneos
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incremente su virulencia o patogenicidad. La experiencia previa del hospedero con
la bacteria acarreadora, por infección con la bacteria silvestre o administración
anterior de una cepa atenuada, puede interferir con la repuesta inmunológica
hacia la proteína pasajera. Este fenómeno se debe posiblemente a la supresión
epitópica asociada a la expansión clonal dominante hacia antígenos del vector,
aunque se ha demostrado que es posible modularlo si se administra previamente
una dosis de antígeno pasajero (15). Por otro lado, la producción de una proteína
recombinante heteróloga constituye una carga metabólica adicional para la
bacteria, lo que puede afectar su viabilidad y “capacidad de adaptación” al medio
(“bacterial fitness”) (16). Por tanto, es importante seleccionar las mutaciones
adecuadas para lograr atenuación sin afectar otras funciones bacterianas, así
como sistemas de expresión de antígenos y las rutas de inmunización (17).
Figura No. 1 Problemas relacionados con el desarrollo de vacunas en vectores
vivos bacterianos.
En general, las proteínas recombinantes se producen mediante sistemas basados
en plásmidos que contienen genes de resistencia a antibióticos. Aunque se ha
demostrado que la administración de ampicilina es capaz de incrementar la
respuesta de anticuerpos en modelos animales, porque permite la persistencia de
las bacterias transformantes y evita la competencia con otras bacterias por el
nicho ecológico del intestino (18), la utilización de antibióticos en programas de
vacunación sería impractico e inconveniente. Por ello, es necesario eliminar la
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necesidad de utilizar antibióticos, para lo cual se han ideado procedimientos de
estabilización de plásmidos. La estabilidad de los plásmidos depende varios
factores, como el sitio de origen de replicación (ori) que determina el número de
copias por bacteria y, consecuentemente, la cantidad de proteína recombinante
(19-21). Aunque los plásmidos de alto número de copias con promotores
constitutivos fuertes inducen una alta producción de proteínas recombinantes, en
general disminuyen considerablemente la viabilidad bacteriana. Con fines
biotecnológicos de producción y purificación de proteínas, se puede solucionar
este problema fermentando primero a las bacterias en condiciones de baja
temperatura hasta obtener suficiente biomasa y luego cambiar las condiciones de
cultivo (22). Sin embargo, la situación con un bacteria acarreadora es diferente,
pues e requiere producción de proteína recombinante in situ, cuando alcanza a las
células presentadoras de antígeno, por ello se prefieren los promotores inducibles,
por ejemplo en condiciones de anaerobiosis (23). Sin embargo, se ha demostrado
que sistemas de expresión basados en plásmidos de bajo número de copias,
inducen respuesta inmunológica adecuada, con la ventaja de que es posible cotransformar plásmidos compatibles en una sola bacteria con lo que se logra la
expresión de por lo menos dos proteínas recombinantes de manera simultánea
(24). Los genes relacionados con partición regulan la incompatibilidad y la
segregación de plásmidos (25) por tanto sus mutaciones pueden contribuir a su
estabilización. También es posible estabilizar plásmidos de alto número de copias
mediante sistemas de recombinación cromosómica (26;27). Otra posibilidad
consiste en utilizar bacterias que tengan mutaciones letales en su cromosoma y
que puedan ser complementadas por plásmidos (28;29) o la integración
cromosómica de los genes pasajeros heterólogos (30-33) o de la T7 RNA
polimerasa que transcomplemente genes en plásmidos controlados por el
promotor T7 (23).
Existe la idea general de que los antígenos que se encuentran en la superficie
bacteriana inducen mejores respuestas de anticuerpos (34)(2). Por ello, se han
ideado diversos métodos para expresar polipéptidos en la superficie de bacterias
acarreadoras. Es posible expresar péptidos en periplasma, membrana externa,
flagelos (35) o fimbrias, con el propósito de realizar ensayos ligando-receptor,
análisis topológicos, bioseparaciones e identificación de epitopos (36). Algunas
proteínas de membrana externa como LamB, PhoE, OprF, TraT y OmpC Contienen
sitios permisivos donde es posible insertar péptidos foráneos sin afectar la estructura
y función (1;37-40), que pueden modular respuestas inmunológicas (41) o tienen
capacidad de unión en sistemas ligando-receptor (42). Otra alternativa a los sistemas
de translocación a la superficie bacteriana, consiste en la utilización de bacterias que
mueran en los tejidos del hospedero. Por ejemplo, se han descrito cepas
auxotróficas dependientes de ácido diaminopimélico que se lisan rápidamente en
ausencia de este factor de crecimiento, liberando su contenido al medio, el cual
que es captado por células presentadoras. Este sistema es una alternativa a la
utilización de mecanismos sofisticados de secreción de antígenos (43)
Los autotransportadores son una alternativa atractiva para expresar antígenos en
la superficie de bacterias gram negativas, porque constituyen un sistema de
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secreción sencillo que no implica la participación de otras proteínas. Estas
proteínas han sido utilizadas no solo en el desarrollo de vacunas, sino como
absorbentes bacterianos completos, para estudios de interacciones receptorligando, exposición de péptidos para la creación de librerías y producción de de
proteínas biológicamente activas con fines terapéuticos y biotecnológicos (44;45).
En nuestro laboratorio hemos utilizado al autotransportador MisL para translocar
antígenos a la superficie de Salmonella (46) y para liberar antígenos al medio
mediante procesamiento proteolítico (47)
II. Sistema de secreción tipo V: Autotransportadores.
Los autotransportadores conforman el sistema de secreción tipo V de las bacterias
gram negativas (48;49). Se denominan de esta manera porque representan un
mecanismo de secreción simple, que no requiere de moléculas accesorias para
translocar proteínas hacia la membrana externa o al medio exterior (50).
El modelo clásico de los autotransportadores consiste en proteínas que poseen 3
dominios, una secuencia señal N-terminal, un dominio pasajero α (que es la
proteína madura por translocar) y un dominio β C-terminal (48;51;52) . Este último
dominio, posee 14 hojas β-plegadas anfipáticas que conforman una estructura de
β-barril, con un poro central por el cual pasa el dominio pasajero α, para ser
translocado hacia la superficie celular (figura 2).
Figura 2. Modelo estructural de las proteínas autotransportadoras.
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Sistema de secreción tipo V ó autotransportador (AT). (A) Estructura primaria del AT. Cada uno
de los dominios principales implicados en la secreción es indicado. (B) Secreción del dominio
pasajero a través de la membrana externa. Paso 1: inserción del dominioβ en la membrana
externa y formación del poro central común enβ el -barril. Paso 2: La región linker dirige la
secreción a través del poro. Paso 3: El dominio de autochaperona activa el plegamiento del
dominio pasajero tan pronto como este emerge del β-barril. Paso 4: Una vez plegado el dominio
pasajero, este es expuesto en la superficie de la bacteria y finalmente la molécula efectora se libera
hacia el medio extracelular después de un corte proteolítico. Los cuadros representan la forma
plegada ó madura del polipéptido. Peri: periplasma; EM: medio extracelular; OM: membrana
externa. (Tomada de Desvaux, et al., 2004)
15
El carácter anfipático de las hojas β-plegadas permite al β-barril anclarse en la
membrana externa, en tanto que la propiedad hidrofílica del poro permite el paso
del dominio pasajero por su interior (48). Sin embargo, tránsito de la proteína
pasajera a través del poro tiene limitaciones conformacionales. Las proteínas de
fusión que forman puentes de disulfuro, conduce a un plegamiento de la proteína
recombinante que puede interferir en el proceso de translocación, como sucede en
el caso de la proteína DsbA. Sin embargo, esto no ocurre en todos los casos, la
secreción de polulanasa de Klebsiella oxytoca, el intermediario periplásmico con
puentes de disulfuro, es un prerrequisito para una translocación efectiva hacia la
membrana externa (52). Más aún, algunos dominios pasajeros homólogos y
heterólogos pueden ser translocados, después de ser plegados por chaperonas
citoplásmicas (53;54). A diferencia El dominio C de la proteasa de IgA1 (C-IgA1P)
de Neisseria gonorrhoeae se ensambla como una estructura oligomérica con un
poro central hidrofílico y semejante a un anillo (formado entre los monómeros de
estructuras β-barril) por el cual se secreta el dominio α (54). Estos hallazgos
difieren del modelo clásico de los autotransportadores básicamente, en que el
modelo clásico describe una estructura única y monomérica, mientras que para el
caso del C-IgA1P, se describe a una estructura oligomérica, cuyo conducto de
translocación es aquel poro formado por todas los monómeros y no el poro central
de cada β-barril monomérico descrito en el modelo clásico. Para el caso de CIgA1P, un mínimo de seis monómeros se ensamblan para formar el complejo
oligomérico. El poro hidrofílico central, mide aproximadamente 2 nm. de diámetro
(54).
Cuando el dominio pasajero atraviesa la membrana interna, la proteína
autotransportadora se comporta como un intermediario periplásmico. No se sabe
por qué el intermediario periplásmico no es susceptible a la degradación
enzimática a nivel de periplasma. Una hipótesis es que, el intermediario
periplásmico forma un complejo con chaperonas periplásmicas, aunque también
es posible que el mismo intermediario periplásmico tenga características de
autochaperona, (55). Una vez que el dominio pasajero es translocado a la
superficie bacteriana, el dominio pasajero puede permanecer ligado a la
membrana externa o ser liberado al medio exterior, por un mecanismo auto
catalítico o por acción de otras proteasas (48).
En este trabajo utilizamos al autotransportador ShdA. Es una proteína
autotransportadora presente en Salmonella enterica serovar Typhimurium, la cual
se una a fibronectina y juega un papel en la colonización del ratón (56;57). A la
fecha, debido a la relativa simplicidad de su mecanismo de transporte, el dominio
de ShdA ha sido empleado en nuestro laboratorio para clonar, expresar y
autoexponer con fines vacunales, sobre la superficie de Salmonella enterica
serovar Typhimurium, péptidos y proteínas heterológas de parásitos como
Plasmodium falciparum y Trichinella spiralis (58).
16
III. Tecnología de la Avidina-Biotina.
La biotina (vitamina H) es una coenzima esencial que sintetizan las plantas,
animales y la mayoría de los procariontes. En su estado fisiológicamente activo
dentro de las células, la biotina se une covalentemente a las enzimas metabólicas
biotin carboxilasa y descarboxilasas, que juegan un papel importante en
gluconeogénesis, lipogénesis, metabolismo de aminoácidos y transducción de
energía (59)
La avidina es una glicoproteína que se encuentra en la clara del huevo de gallina
(66-69 kDa) compuesta por cuatro monómeros idénticos, cada una de los cuales
puede unir una molécula de biotina con extraordinaria afinidad (Ka=1015 M) (60);
esta proteína es soluble en soluciones acuosas y estable a un amplio rango de
temperaturas y pH. A pesar de su origen eucariótico, la avidina se produce
exitosamente en Escherichia coli como una proteína recombinante o bien como
proteína de fusión no glicosilada que mantiene sus propiedades fisicoquímicas
(61-63)
La versatilidad del sistema de la avidina-biotina tiene múltiples aplicaciones
biotecnológicas (64;65), en el diagnóstico y la farmacología, así como en la
identificación de interacciones ligando-receptor (66;67). El sistema se fundamenta
en que la unión de la biotina a casi cualquier molécula (ácidos nucleicos,
antígenos, anticuerpos, enzimas, receptores) no afecta significativamente sus
propiedades fisicoquímicas y biológicas y permite la interacción con la avidina, la
cual tiene cuatro sitios de unión a la biotina, por lo que funciona como un sistema
amplificador (65).
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JUSTIFICACIÓN.
Existe la necesidad de mejorar las vacunas basadas en la estrategia de “vectores
bacterianos”, de tal modo que se incremente la calidad y cantidad de proteínas
pasajeras que produzcan, sin que constituyan una carga metabólica importante
para la bacteria acarreadora y sin que se modifiquen sus propiedades biológicas.
Para lograr una mejor respuesta de anticuerpos es conveniente que los antígenos
pasajeros se expresen en la superficie bacteriana
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
La producción de proteínas recombinantes en bacterias atenuadas puede ser
ineficiente por diversas causas, tales como estabilidad de plásmidos, toxicidad o
carga metabólica. Por otro lado, las proteínas recombinantes pueden conferir
nuevas propiedades patogénicas a las bacterias transformadas. Por ello es
necesario un sistema que asegure la estabilidad y seguridad de los acarreadores
bacterianos y que al mismo tiempo permita el transporte de antígenos heterólogos
en su superficie con la finalidad de inducir una respuesta inmune humoral
adecuada.
La ventaja de este sistema que proponemos aquí, es que no requiere ingeniería
genética para cada antígeno que se desee expresar, pues solo son necesarios
dos pasos para construir un candidato a vacuna: (i) la expresión de la proteína de
fusión Avidina-ShdA en la superficie bacteriana (como única manipulación de
ingeniería genética), y (ii) un antígeno biotinilado.
HIPÓTESIS.
El acarreador bacteriano Universal, expresara en la superficie de E.coli y
Salmonella entérica serovar Typhimurium a la bandera molecular Flag y a la
Avidina.
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OBJETIVOS.
General.
Construir una cepa vacunal de Salmonella typhimurium SL3261 que exprese en la
superficie una proteína de fusión constituida por el autotransportador ShdA y la
avidina.
Específicos.
1.- A partir del plásmido pENP01 (el cual contiene el dominio β y parte del dominio
α de ShdA) clonar la secuencia de la β dominio avidina (cDNA y secuencia de los
aminoácidos 26-38)
2.- Evaluar la expresión, translocación, de la proteína de fusión generada en
Escherichia coli HB101 y Salmonella enterica serovar Typhimurium SL3261
DISEÑO EXPERIMENTAL.
El proyecto contempla dos fases: a) La construcción de las cepas de Salmonella
capaces de acoplar antígenos biotinilados b) La evaluación de la capacidad de
translocación de la Avidina a la superficie por el autotransportador.
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MATERIAL Y MÉTODOS.
Cepas bacterianas
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli HB101
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL3261 (8)
Condiciones de cultivo.
Las cepas fueron conservadas a -80ºC. Se descongelaron y cultivaron en medio
sólido Infusión cerebro-corazón (BHI agar) con 3µL de ampicilina por cada mL de
medio de cultivo. En el caso de Salmonella, el cultivo se suplemento con 2µL de
2,3-ácido dihidroxibenzoico (DHB) (Sigma, St. Louis, Mo). La inducción del
promotor nirB se realizará inoculando colonias aisladas en 45 mL de medio líquido
tioglicolato suplementados con 135µL de ampicilina y 90 µL de DHB al 0.01% a
37ºC con agitación constante hasta lograr un crecimiento bacteriano cuya
densidad óptica DO540 nm de 1.0 Este cultivo se utilizó para los ensayos de SDSPAGE, Western-blot, inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo.(46)
Plásmidos.
PAH3545 (Donado por el Dr. Manuel L. Penichet; Departamento de Microbiología
y Genética Molécular , Universidad de California.)
pENP01; tiene como estructura base al plásmido pnirBLTB, rio abajo contiene un
sitio múltiple de clonación artificial (LINKER) con 5 sitios de restricción par las
enzimas Xba I, Hind III, Spe I, Sal I, y Xhi I, seguido por la secuencia codificante
de FLAG y la forma acotada de ShdA. (68)
pnirB-LTB-βShdA-FLAG; contiene el promotor nirB y la secuencia señal LTB , el
dominio β translocador completo del autotransportador ShdA (277 aa) mas (110
aa) del dominio a seguido de la secuencia que codifica para el péptido bandera
FLAG. (58)
pnirB-LTB-βShdA-FLAG-NANP; contiene el promotor nirB y la secuencia señal
LTB, rio abajo de LTB se encuentra la secuencia que codifica para el tetrapéptido
NANP, seguido de la secuencia que codifica para el péptido bandera FLAG, el
cual es un octapéptido que permite la detección de todas las proteínas de fusión
de interés.
pnirB-LTB-βShdA-FLAG-Avidina; contiene el promotor nirB y la secuencia señal
LTB, seguido de la secuencia que codifica para el péptido bandera, seguido del
plásmido que codifica para Avidina.
20
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la obtención de pJAH2 y
pJAH3.
Se preparó una reacción a un volumen final de 30 µl, que contiene DNA templado
(plásmido pJAH2 y pJAH3), amortiguador de amplificación (Tris-HCl/KCl), MgCl2
1.5 mM, mezcla de los 4 desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTP´s) 2mM, 20
pocomoles de cada uno de los oligonucleótidos, agua inyectable y 2.5 U de Taq
polimerasa platinum. Y la reacción se hizo en un termociclador Epppendorf
Mastercycler gradient.
El programa de temperaturas incluye un ciclo de desnaturalización previa de 94°C
por 5 min., 30 ciclos de desnaturalización 94°C por 15 seg., alineamiento de 58°C
por 2 min., y extensión de 72°C por 5 min., seguidos de un ciclo de extensión
final de 72°C por 10 min.
El producto de la amplificación se separo por electroforesis en geles de agarosa al
1% teñidos con 1µl de bromuro de etidio (10 mg/ml). Se incluyo un marcador de
tamaños moleculares de 1 Kb para verificar el peso del producto.
Se realiza una purificación por columna de Gene-clean Qiagen. Para su
secuenciación.
Extracción de proteínas totales.
Se realizo a partir de cultivos en Tioglicolato de las clonas de interés, se toman
alícuotas y se centrifugan a 14,000 rpm por 1 min. ( si es necesario se repite la
misma operación quitando el sobrenadante y añadiendo mas cultivo).
Se lava el botón 4 veces con solución salina, centrifugando a 14,000 rpm por 1
min. Eliminando el sobrenadante en cada lavado. Se añadieron 50 µl de agua
miliQ y 50µl de buffer de carga para proteínas (Tris base-Azul de bromofenolGlicerol-SDS) mas 50 µl de β-mercapto.
Una vez realizado esto se llevaron los tubos a baño maría por 10 min. Y se
homogenizo la muestra con una jeringa Hamilton.
Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida en condiciones
reductoras (SDS-PAGE)
Las proteínas se separaron en un gel de poliacrilamida al 12.5% en condiciones
reductoras según el método de Laemmli (Laemmli, 1970), la separación se llevo a
cabo en una cámara de electroforesis vertical, se utilizo solución amortiguadora de
corrimiento Tris-Glicina (Tris base 25mM, GlicinamM, SDS 0.01% pH 8.3) y
condiciones de corrimiento fueron a 35 mA por una Hora. Este gel se transfirió a
una membrana de nitrocelulosa. De manera paralela se corrió otro gel bajo las
mismas condiciones antes señaladas, el cual se fijo 3 hrs en solución de metanol,
ac. Acético y agua (porciones 45:10:45) posteriormente las bandas fueron teñidas
21
con azul de Coomassi por 30 min y se decoloro con sol decolorante (metanol, ac
acético, agua, 30:10:60) hasta obtener una visualización nítida de las bandas de
las proteínas.
Western-blot o inmunoelectrotransferencia (EIT)
Las proteínas separadas por SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa o de nylon cargada positivamente. La transferencia fue llevada a
cabo a 150V por una hora, a 4°c. Posteriormente la membrana fue bloqueada con
PBS-leche al 5% toda la noche, al día siguiente se lavo con 10 ml de PBS 1X y se
incubo toda la noche con el primer anticuerpo anti-FLAG biotinilado en dilución
1:250, la solución de bloque y la de primer anticuerpo, se suplemento con azida de
sodio a una concentración final de 0.05%, para evitar contaminación.
Al día siguiente se realizaron 3 lavados de 5 min con 10 ml de PBS, se
adicionaron 5 ml de Streptavidina HPR (conjugada a peroxidasa de rábano) en
dilución de 1:500, y se incubo por 2 horas, se realizaron 3 lavados con PBS 1X de
10 ml cada uno, por 5 min cada lavado.
Para revelar la membrana se puso en contacto con una mezcla de 50 ml de PBS,
30 mg de 4-cloro-1-naftol disuelto en 10 ml de metanol y 100 ml de peróxido de
hidrogeno; durante 10 a 20 seg, y la reacción se detiene con agua destilada o PBS
(pH 7.4).
Inmunoflurescencia indirecta
Se cultivarán las cepas bajo en anaerobiosis hasta lograr un D.O540 nm de 1.0. Se
tomará una alícuota equivalente a 1X108 bacterias, se depositarán en tubos
eppendorf de 1.5 mL. Se lavará tres veces con PBS 1X estéril, centrifugando a
6000 rpm en cada caso. El botón bacteriano se resuspenderá en 60 µL de
anticuerpos anti-Flag dilución 1:100. Se incubará durante 1 hora a 37ºC con
agitación constante. Se lavará dos con 1.5 mL de PBS 1X estéril, centrifugando a
6000 rpm en cada caso. El botón bacteriano, se resuspenderá con 60 µL del
segundo anticuerpo, una IgG de cabra anti-ratón-FITC (conjugada con
isotiocianato de fluoresceína) en una dilución 1:100. Se incubará a 37ªC con
agitación y en la oscuridad. Se centrifugará a 6000 rpm y el botón bacteriano se
lavará dos veces con PBS 1X para retirar el exceso del segundo anticuerpo sin
reaccionar. Al final el botón bacteriano se resuspenderá en 500µL de PBS y se
realizarán frotis en portaobjetos, que se analizará en un microscopio de
fluorescencia Olympus BX40.
22
Citometría de flujo
Se cultivarán las cepas bajo condiciones reductoras (anaerobiosis) hasta lograr
una D.O.540 nm de 1.0. Se tomará una alícuota equivalente a 108 bacterias, se
depositarán en tubos eppendorf de 1.5 mL. Se lavarán tres veces con PBS 1X
estéril, centrifugando a 6000 rpm en cada caso. El botón bacteriano se
resuspenderá en 60 µL de anticuerpos anti-Flag 1:250. Se incubará durante 45
minutos a 37ºC con agitación constante de 250 rpm (aparato Shaker-Enviroment).
Transcurrido lo anterior, se lavarán dos veces las bacterias con 1.5 mL de PBS 1X
estéril, centrifugando a 6000 rpm en cada caso. El botón bacteriano, se
resuspenderá con 60 µL del segundo anticuerpo, una IgG de cabra anti-ratón-FITC
en una dilución 1:100. Se incubará 37ºC con agitación y en la oscuridad por 30
minutos. Se centrifugara a 6000 rpm y el botón bacteriano se lavará dos veces
con PBS para retirar el exceso del segundo anticuerpo. Al final, el botón
bacteriano se resuspenderá en 500µL de PBS 1X y se analizará las muestras en
un equipo de Citometría de flujo Becton-Dickinson, utilizando el Software
ELLQuestR.
Construcción de los candidatos a vacuna.
La manipulación de ácidos nucleicos se realizará de acuerdo a las
recomendaciones de Sambrook y Russell (70). El gene que codifica para la
avidina (123 aminoácidos de la proteína funcional) se amplificará por PCR a partir
del plásmido PAH3545 utilizando los “primers” 5´CCGCTCGAGCGG CAG GCG
AGT GAA GAT GTT GAT GCC 3’ y 5’ CCCAAGCTTGGG GCG CGC AAA TGC
AGC CTG ACC GGC AAA TGG ACC 3´, diseñados de acuerdo a la secuencia
reportada de la avidina (71). Estos “primers” contienen sitios XhoI y Hind III para la
clonación dirigida.
23
Figura 3. Modelo esquemático de la proteína de fusión ShdA-Avidina, propuesto
para captar antígenos heterólogos biotinilados en la superficie de Salmonella
enterica serovar Typhimurium SLK3261
El producto esperado de la amplificación de 393 bp será purificado e insertado en
el plásmido pENP01 y transformado en Escherichia coli HB101. El plásmido
resultante llevará un gene de fusión bajo el control del promotor inducible en
anaerobiosis nirB, conteniendo a partir del extremo 5´, el gene de la avidina, la
porción translocadora del dominio
 de ShdA, el dominio
 de ShdA y la
secuencia FLAG que servirá como bandera molecular debido a que no se cuenta
con anticuerpos contra avidina (Monoclonal anti Flag SIGMA F3165- 5 MG). La
representación esquemática de la proteína de fusión esperada se presenta en la
Figura 3. Las clonas transformantes conteniendo el plásmido correcto serán
identificadas mediante análisis de restricción a partir de mini-preparaciones de
DNA plasmídico y serán secuenciadas.
Evaluación de la producción de proteína recombinante.
La producción de la proteína de fusión Avidina-ShdA-Flag será evaluada mediante
electroforesis en geles de acrilamida en condiciones reductoras y no reductoras
(SDS-PAGE) (72) e inmuno-electrotransferencia (western blot) (73) utilizando
anticuerpos contra FLAG (Monoclonal anti Flag SIGMA F3165- 5 MG) a partir de
extractos crudos de proteína bacteriana. La translocación de la proteína de fusión
a la superficie bacteriana será evaluada por inmunofluorescencia indirecta (IFA) y
citometría de flujo. El DNA plasmídico de las clonas con mejor producción de la
proteína de fusión Avidina-ShdA-Flag serán purificados y transformados en
Salmonella enterica serovar Typhimurium y las clonas transformantes serán
evaluadas de la misma manera. Se evaluará la capacidad de unión de la proteína
fusión Avidina-ShdA-Flag.
24
Estrategia de Clonación.
Xba I
LTB
Hind III
Spe I
LTB
Hind III
Sal I
pnirB
Xho I
Xho I
(Nhe I/Xba I)
FLAG
Nhe I
FLAG
pENP-01
pENP-01
Hind III ⁄ Xho I
shdA
Amp r
BamHI
3450 pb
shdA
3438 pb
+
Hind III
Xho I
Hind III
LTB
(Nhe I/Xba I)
393pb aprox
Xho I
(Nhe I/Xba I)
Nhe I
BamHI
Avidina
PJAH2
pnirB
PJAH2
3831 pb
T4 ligasa
FLAG
Nhe I
PJAH2
shdA
Amp r
ΔShdA-α
BamHI
EXTERIOR
ME
ME
Col EI
COOH
PERIPLASMA
ShdA-ϐ
25
RESULTADOS
26
Mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Se obtuvieron las
secuencias de los plásmidos que contienen a la Avidina completa pJAH2 y al
dominio mínimo de Avidina pJAH3.
Secuencia de las regiones de Avidina completa y mínima.
Fig 1. Secuenciación del producto obtenido a partir PCR, de la Avidina con
el dominio completo y el dominio mínimo de Avidina.
27
Evaluación de la expresión de las proteínas de fusión den
Salmonella mediante Western-blot.
E. coli y de
Para evaluar la expresión de las proteínas, en E.Coli y Salmonella entérica serovar
Typhimurium SL3261, se extrajeron proteínas totales de las cepas bacterianas
inducidas en condiciones microareofilicas y se separaron por SDS-PAGE al 12%.
Se detecto por la técnica de Western-blot, empleando el anticuerpo anti-FLAG
biotinilado. La banda correspondiente al plásmido pENP-01 tiene un peso
correspondiente a 38.64 kDa, pJAH2 peso correspondiente a 53.16 , y el pJAH3
peso correspondiente a 41.04. Fig. 2
Evaluación de la expresión de las proteínas de fusión que contienen a la
bandera FLAG (incluyendo el dominio de unión a biotina) mediante Western
Blot.
Fig. 2. Detección translocación por la bandera molecular FLAG por Wb. Utilizando el anticuerpo
anti-FLAG biotinilado (1:100), y como segundo anticuerpo Streptavidina HPR(1:100), se detecto la
unión a FLAG en proteínas totales de salmonella.
Con esto comprobamos que hay translocación a la superficie de ambos
plásmidos el que contiene el dominio mínimo y el que contiene el dominio
completo de Avidina.
28
Evaluación de la expresión de las proteínas de fusión en la superficie de E.
coli y Salmonella mediante inmunofluorescencia indirecta (IFA).
Una vez comprobado que las cepas bacterianas producen la proteína de interés,
es necesario demostrar que la proteína pasa a superficie bacteriana, para
corroborar que el sistema excreción y el autotransportador funcionan translocando
eficientemente a la proteína heteróloga.
Se realizo una Inmunofluorescencia indirecta con cultivos en condiciones
microaerofilicas de Salmonella y E. coli., las bacterias se incubaron con anticuerpo
primario anti-FLAG biotinilado y Streptavidina FITC para E. coli y Anti-mouse FITC
para Salmonella.
Los resultados muestran que salmonella porta el plásmido de interés AVIDINA y
lo expresa en la superficie mediante la expresión el péptido FLAG y sus controles
negativos no lo hacen.
Los controles fueron pENP 01 control positivo y pnirB LTB NANP β-ShdA el control
negativo.
29
Translocación de FLAG a la superficie.
Fig. 3. Detección de la bandera molecular FLAG por inmunofluorescencia indirecta, utilizando
anticuerpos, Primer anticuerpo monoclonal anti-FLAG biotinilado (1:100), y Segundo anticuerpo
Streptavidina FITC (1:100). Con un cultivo de 12 hrs. en E. coli. Muestra la translocación de FLAG
a la superficie. Control negativo pnirB LTB ShdA, control Positivo pENP 01, pJAH-2 plásmido con
la Avidina completa. pJAH-3 plásmido con el dominio mínimo de Avidina.
Los resultados indican que tiene una mejor translocación a la superficie la
Avidina completa que solo el dominio mínimo, por lo cual se decide trabajar
con el dominio completo que es el plásmido pJAH2.
30
Evaluación de la expresión de las proteínas de fusión en la superficie de E.
coli mediante citometría de flujo.
Cuando se comparan los histogramas de las cepas pENP01 control positivo,
pnirB LTB NANP b-ShdA el control negativo y las cepas pJAH2 y pJAH3, en el
pJAH2 se observan 2 poblaciones y esto podría ser por que una expresa el
péptido FLAG y otra no lo hace, esto puede estar relacionado con la viabilidad. Y
la cepa con el plásmido pJAH3 que no expreso el péptido podría ser por que
necesite mayor tiempo de incubación en el medio de crecimiento microaerofilico.
Detección de la bandera Molecular FLAG por Citometría de Flujo.
Fig. 4. Detección de la bandera molecular FLAG por Citometría de Flujo, utilizando anticuerpos,
Primer anticuerpo anti-FLAG biotinilado (1:100), y Segundo anticuerpo Streptavidina FITC (1:100).
Con un cultivo de 12 hrs. en E. coli. Control negativo pnirB LTB ShdA, control Positivo pENP 01,
pJAH2 plásmido con la Avidina completa, pJAH3 plásmido con el dominio mínimo de Avidina.
Por lo que con estos resultados y la inmunofluorescencia anterior se decide
utilizar solo la cepa que contiene el plásmido pJAH2, el cual lleva a la
Avidina completa.
31
Ya comprobado que el sistema transloca a la bandera molecular Flag en la
superficie de E.Coli, es necesario demostrar que también lo hace en Salmonella,
para ello se realizo una inmunofluorescencia indirecta con cultivos inducidos en
condiciones microaerofilicas, en distintos tiempos para evaluar el mejor tiempo de
translocación a la superficie. Las bacterias se incubaron con el anticuerpo primario
anti-Flag biotinilado 1:100 y el secundario Streptavidina FITC 1:50
Evaluación de la translocación de Flag y Avidina en Salmonella entérica
serovar Typhimurium SL3261.
Fig 5. Expresión de FLAG a distintas Horas en Salmonella enterica serovar Typhimurium SL 3261,
Primer anti-Flag
biotinilado 1:100 y el secundario Streptavidina FITC 1:50
Translocación de FLAG en la superficie de Salmonella enterica serovar Typhimurium SL 3261.
Control negativo pnirB LTB ShdA, control Positivo pENP 01, P-2 plásmido con la Avidina
completa.
32
Cultivo estacionario de 48 hrs con anticuerpo anti-Flag (1:100) y Segundo anticuerpo anti-mouse
FITC (1:100)
Se comprobó que el sistema tiene una mejor expresión de Flag a las 48 hrs.
por lo cual es tiene una mejor translocación y es mas eficiente a este tiempo.
Con los distintos anticuerpos anti-Flag Biotinilado y sin Biotinilar
33
Discusión de resultados.
Muchos patógenos tienen acceso al huésped por el transito de las mucosas en las
primeras etapas de la infección, por lo que la generación de una respuesta
inmune eficiente a este nivel es de gran importancia e interés.
Existen diferentes estrategias para liberar o exponer el antígeno a nivel de
mucosas, entre las cuales se encuentra el uso de acarreadores bacterianos,
como la utilización de
Salmonella spp., como acarreador de epitopos
heterólogos con fines de vacuna ha permitido la generación de una respuesta
hacia el patógeno mismo, así como una respuesta al antígeno heterólogo (Medina
y Guzmán 2001).
Al igual que Shigella, Salmonella estimula el sistema inmune innato tiende a ser
inmunogenica además puede ser administrada en las mucosas para generar una
amplia respuesta inmune humoral y celular (Levine y Sztein, 2004).
Todas aquellas proteínas que son secretadas también se exponen al sistema
inmune del huésped por lo que representan buenos candidatos para vacunas.
Se diseño un sistema de expresión en Salmonella que permite la expresión de la
Avidita en la superficie bacteriana mediante el autotransportador ShdA.
Fue necesario considerar a la secuencia señal de trafico de la subunidad B de la
toxina termolábil (LTB) de E.coli , con la finalidad de asegurar la translocación de
la proteína de fusión hacia el periplasma de la bacteria y hacia la membrana
externa.
Esta secuencia Sec dominante ha sido ampliamente usada por nuestro equipo de
trabajo (Ruiz-Pérez F, 2002). El promotor de la nitrato reductasa (nirB), el cual es
inducible en anaerobiosis y en condiciones microaerofilicas (Chatfield, 1992),
permitió la expresión de la avidita en condiciones microaerofilicas.
Para evaluar la funcionalidad del sistema de expresión, fue necesario detectar la
presencia de la avidita completa (pJAH 2 y pJAH 3), usando la bandera molecualr
FLAG, con técnicas de SDS-PAGE y Western-blot, con extractos totales de DH5a
y Salmonella enterica serovar Typhimurium SL3261.
Un aspecto importante a evaluar en el sistema fue la translocación de la Avidina
completa y la Avidina mínima (pJAH 2 y pJAH 3) hacia la superficie bacteriana a
través del autotransportador ShdA, para ello se realizaron ensayos d
inmunofluorescencia indirecta (IIF) y citometria de flujo.
Los resultados demuestran que la proteína de fusión que contiene a la Avidina
completa (pJAH 2), que contiene a la bandera molecular FLAG es translocada
eficientemente hacia la superficie bacteriana mediante el autotransportador ShdA,
comparado con la proteína de fusión que contiene el dominio mínimo de Avidina
(pJAH 3) que no transloca tan eficiente a la proteína de fusión FLAG.
34
La cepa de E.coli que corresponde al plásmido que contiene a la Avidina
completa (pJAH 2), fue transformada en Salmonella y realizar ensayos de
inminofluorescencia indirecta para evaluar la translocación de la proteína de fusión
FLAG, obteniendo una translocación eficiente de la proteína de fusión y de la
Avidina completa.
35
Conclusiones.
Los resultados presentados demuestran que el sistema de
autotransportador ShdA de Salmonella entérica serovar Typhimurium es
capaz de translocar a la superficie a la Avidina.
Se necesita de un tiempo mas prolongado de incubación para prender el
promotor nirB que se enciende en condiciones de stress. Y así tener una
mejor translocación a la superficie de FLAG y por lo tanto de Avidina. Esto
en condiciones microaerofilicas.
Los resultados demuestran que el sistema también es funcional el E. coli
con un mayor tiempo de incubación en condiciones microaerofilicas.
36
Perspectivas
•
Evaluar la respuesta humoral generada a nivel de mucosas en ratones
vacunados con el acarreador universal.
•
Comparar la respuesta inmune con el acarreador universal contra la
respuesta del antígeno nativo.
•
Evaluar la respuesta inmune con el acarreador universal utilizando
adyuvante y sin adyuvante.
37
CRONOGRAMA
CUATRIMESTRE
1 2 3 4 5
ACTIVIDAD
CONSTRUCCION DEL CANDIDATO A CEPA VACUNAL EN
E.coli
EVALUACIÓN DE LA EXPRESION Y ESTABILIDAD DEL
CANDIDATO VACUNAL IN VITRO EN E.coli
CONSTRUCCION DEL CANDIDATO A CEPA VACUNAL EN EN
Salmonella enterica serovar Typhimurium
EVALUACIÓN DE LA EXPRESION Y ESTABILIDAD DEL
CANDIDATO VACUNAL IN VITRO EN Salmonella enterica
serovar Typhimurium
RECOPILACION DE RESULTADOS Y ESCRITURA DE TESIS
38
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