Download estudios de poblaciones y subpoblaciones linfocitarias por cmf

ESTUDIOS DE POBLACIONES Y
SUBPOBLACIONES
LINFOCITARIAS POR CMF
Dra. Mónica Saracco
Instituto de
Investigaciones
Biomédicas en Retrovirus y
SIDA (ex CNRS)
Aplicaciones Clínicas
• Analisis de subpoblaciones Linfocitarias
Inmunodeficiencias congénitas
Inmunodeficiencias Adquiridas (HIV,farmacológica)
• Oncohematología: Fenotipos de leucemias y linfomas, EMR.
• Transplantes:
Transplantes Cross Match, reconstitución, inmunosupresión,
• Recuento de celulas progenitoras
• Análisis de Ciclo Celular y ploidías en tumores.
• Recuento de reticulocitos.
reticulocitos
• Activaciones plaquetarias.
• Apoptosis
• Sorting: Separaciónes célulares
Morfología y Citometría
LINFOCITOS T
LINFOCITOS B
CÉLULAS NK
CITOQUINAS
Ciclo de multiplicación
El virus utiliza la molécula CD4 para entrar a la célula.
Inserta su información genética y utiliza la maquinaria genética celular para
multiplicarse y diseminar a otras células.
LAS CÉLULAS SUSCEPTIBLES PERTENECEN AL SISTEMA
INMUNOLÓGICO
Desrregulación Inmune
• Alteraciones funcionales de células
CD4
• Cambios en el Inmunofenotipo de
células HIV infectadas.
• Disminución progresiva de
Linfocitos T CD4+
Pruebas de laboratorio
Diagnóstico: Detección de anticuerpos
ELISA Y WESTERN BLOT (WB)
Cuando un ELISA es positivo debe confirmarse por WB
Anticuerpos
CD4
2 A 6 SEMANAS
Virus
Pruebas de laboratorio
Paciente HIV positivo:
• Carga viral en sangre
• Recuento de linfocitos TCD4
(ambos sirven para decisiones terapéuticas)
• Estudios de resistencia al tratamiento
CD4
Virus
Requerimientos en
Laboratorios
• Bioseguridad para el
procesamiento de muestras
• Contador hematológico
• Citómetro de flujo
• Equipos para lisis automática (no
indispensable)
FACS Count
PIMA
FACSCanto II
FACSCalibur
BD
TM
FACSAria
Cell Sorter :
Nuevo Concepto
Recolección de las Muestras
• Tubos Vacutainer, con K3EDTA, 5ml de
sangre
• Temperatura Ambiente
• Procesamiento dentro de las 48hs de la
extracción
• Marcación 50 ul de sangre con 5ul MoAb,
incubación 15 minutos
• Lisado de Glóbulos Rojos
CONCEPTO DE
CUANTIFICACIÓN
• Medición de células presentes en el
organismo normalmente, cuyo valor
relativo y/o absoluto tendrá suma
importancia para la toma de decisiones
diagnósticas y/o terapéuticas
Metodologías
• Plataforma Única
• Puede utilizar uno o dos
tubos de marcación
• Gate en Linfocitos o
CD45 vs. SSC
• Utiliza Beads (10000)
permite realizar el cálculo
matemático de valor
absoluto
• Plataforma Doble
• Puede utilizar uno o dos
tubos de marcación
• Gate en Linfocitos o
CD45 vs. SSC
• Siempre debe realizarse
el Hemograma para
poder informar los
valores absolutos
Subpoblaciones Linfocitarias
CMF
• Selección de eventos
R1
LINFOCITOS T (CD3+) vs.
LINFOCITOS B (CD19+)
LINFOCITOS T (CD3+) vs.
CELULAS NK
Análisis de 3 colores
R1
Density Dot Plot
Los colores informan la
frecuencia de los eventos
Contour Plot
Identificación de las
poblaciones mediante
líneas de contorno
Recomendaciones de la CDC
• Plataforma Única
• Doble Plataforma con gate en CD45
• Repetición de por lo menos un MoAb
• Controles Internos de Calidad
• Controles Externos de Calidad
• Coherencia interna de los resultados
Porcentaje y Variabilidad en los
Resultados
• Gate de Linfocitos Recuperación 95%,
Pureza >90% (mínima 85%)
• La suma de CD3/CD4 y CD3/CD8
variabilidad +/- 5% máximo <10%
• Las muestras con aumento de Linfocitos
(Τγδ) presentan la mayor variabilidad
• La sumatoria de poblaciones B, T, NK
deberá estar entre el 95%-105% (mínimo
90%-110%)
OBTENCIÓN DE BUENOS
RESULTADOS
• CD3 menor de 50%
• CD3/CD4 + CD3/CD8
menor o mayor a
valores de CD3
• Evaluar estado de la
muestra
• Evaluar metodología de
marcación y de lisis
• Evaluar presencia de
dobles positivas o dobles
negativas
• Continuar estudio con
CD19/ CD56+/16+
VALORES DE REFERENCIA
• VALORES EN ADULTOS
SEXO, EDAD
• VALORES PEDIATRICOS desde
el nacimiento a los12 años
Control de Calidad I
• Empleo de ensayos validados y
estandarizados para obtener resultados
reproducibles intra e inter-ensayo
• Manuales de procedimientos (GLP):
procedimientos escritos para uso universal
en los distintos laboratorios integrantes de
la Red
CONTROLES DE CALIDAD II
• INTERNOS
• Flow-check CMF
• 4CL para Contador
Hematológico
• Frecuencia: 3 veces
por semana
• EXTERNOS
• Q-ASI Program
(Canadiense)
• NE-QAS (Reino Unido)
• CAP (USA)
• GRCF (ArgentinaUruguay)
• Frecuencia: 4 anuales
PLATAFORMA ÚNICA
• Menos Tubos
• Encarece el estudio
• Mayor objetividad en
la medición
• Menor
reproducibilidad
• Utilización de un solo
equipo
DOBLE PLATAFORMA
• Requiere Hemograma • Mas Económico
• Requiere CMF
• Controles para ambos
equipos
• N° de Tubos depende
del protocolo utilizado
• Mayor
reproducibilidad
PROTOCOLOS DE ANÁLISIS
• Región Morfológica
FSC vs. SSC
• TRI-Test
CD8/CD4/CD3
• Región en base a
MoAb (CD45) vs,
SSC
• CD3/CD4/CD45
• CD3/CD8/CD45
• Multi-Chek
CD3/CD8/CD45/CD4
COMPARACIÓN DE CMF Y
SOFTWARE
CMF
SOFT
CD4
CD8
CD19
CD56
898 (662-1042)
437 (298-670)
234 (175-323)
187 (148-299)
1375 (1057-1724)
883 (654-1122)
408 (315-601)
229 (157-341)
195 (143-302)
CL45
1367 (1080-1691)
894 (677-1076)
413 (307-623)
236 (164-330)
182 (154-280)
CLTT
1327 (1058-1658)
837 (650-1076)
420 (312-625)
BD
SP
BD
DP
CD3
1361 (1038-1717)
TEST ESTADÍSTICO
• Los valores de correlación (Rho de
Spearman) entre los distintos métodos
para todos los tipos celulares oscilaron
entre 0.902 y 0.987
Muchas Gracias