Download Activacion de linfocitos T

Fundamentos de Inmunología Básica y Clínica
Iván Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Sepúlveda C.,
Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C.
Editorial Universidad de Talca, 2002
Capítulo 10
ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS
Javier Puente P.
1. Introducción
2. Activación de los linfocitos T
2.1. Relación estructura-función del
complejo TCR
2.2. Secuencias de activación en el
TCR-CD3 y cadenas j
2.3. Proteínas tirosina quinasas en
la activación de los LT
2.4. Proteínas adaptadoras en la activación de los linfocitos
2.5. Modelo general de activación de
los LT
3. Activación de los linfocitos B
3.1. Secuencias de activación en el
BCR y sub-unidades asociadas
3.2. Modelo general de activación de
los LB
4. Activación de las células NK
4.1. Modelo de activación de las células NK
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RESUMEN
El reconocimiento de los antígenos por parte de los receptores específicos de los linfocitos
B y T, BCR y TCR respectivamente, es el evento que inicia la etapa de activación. El TCR (_`),
une específicamente al antígeno peptídico procesado ligado a las moléculas de MHC (clase I o
II). El heterodímero _` de localización mayoritariamente extracelular, está asociado en forma no
covalente a un complejo de proteínas de membrana denominado CD3-c cuyos componentes
están localizados mayoritariamente en el extremo citoplasmático. Participan en la unión además
los co-receptores CD4 o CD8, que se unen a determinantes no polimórficos de los MHC clase II
y clase I respectivamente. Una de las principales características estructurales de los componentes
del complejo CD3-c es la presencia de secuencias aminoacídicas que contienen residuos de
tirosina (ITAM) que pueden ser fosforilados por PTK. Esta acción de las PTK ocurre sólo bajo
las condiciones de la interacción TCR, y estructuras asociadas, con el antígeno. Las secuencias
ITAM están presentes en todas las sub-unidades del complejo CD3-c y estando fosforiladas
pueden interactuar con otras secuencias aminoacídicas del tipo SH2 presentes en diversas PTK
citoplasmáticas como Zap-70, lo que permite una masiva fosforilación de proteínas adaptadoras
citosólicas y de membrana y de enzimas. Las enzimas fosforiladas se activan y en estas condiciones fosforilan a otros sustratos celulares propagando la señal, proceso que se encarga de asociar
el fenómeno de membrana con el citosol y el núcleo celular generando los cambios característicos en la expresión génica. Una de las proteínas activadas por fosforilación es la fosfolipasa Ca1
o Ca2 que permite la generación de los segundos mensajeros IP3, Ca2+, DAG y la posterior activación de determinadas PK-C; estos primeros eventos son fundamentales para la respuesta
proliferativa y efectora del respectivo LT. Otra interacción importante ocurre entre CD28 (LT) :
B7.1, B7.2 (CPA); esta interacción aporta una segunda señal prácticamente obligatoria para una
óptima activación de los LT.
El BCR, estructuralmente una Ig de membrana de localización principalmente en el extremo extracelular, se encuentra asociado a sub-unidades (Ig_, Ig`) que poseen secuencias ITAM.
La interacción del antígeno con el BCR y estructuras asociadas, que también poseen este tipo de
secuencias permite el traspaso de la señal hacia el interior celular. Para ello como en el caso del
TCR, el LB posee PTK unidas a membrana y citosólicas como la p72syk que pueden interactuar
con los dominios ITAM fosforilados a través de las secuencias SH2 y otro tipo de quinasas como
la PI-3 quinasa que puede interactuar con las secuencias del tipo SH2 y SH3. Participan también
proteínas adaptadoras citosólicas que permiten agrupar una gran diversidad de proteínas y enzimas
en la superficie celular. Una de las enzimas activadas por fosforilación unida a una proteína
adaptadora, es la FL-Ca que cataliza la hidrólisis del PIP2, la generación de los segundos mensajeros y la activación de la PK-C y calcineurina en forma similar a los LT. Estos eventos iniciales
permiten la activación de otras señales que actúan a nivel del núcleo celular promoviendo los
cambios en la expresión genética típicos de este tipo de linfocitos.
La activación de las células NK, tanto la ADCC como la citotoxicidad natural, ocurre a
través de la interacción de receptores como FcaIIIR (CD16) con la fracción Fc de inmunoglobulinas
o de los receptores NCR con sus ligandos, resulta también en una propagación de la señal a través
de dominios ITAM fosforilados. En las células NK se han descrito también PTK de la familia src
y syk y proteínas adaptadoras de membrana y citosólicas. La activación de los receptores CD16
y NCR, ambos asociados a sub-unidades de tipo c y DAP12 presentan fosforilación de secuencias ITAM y la generación de los mismos segundos mensajeros ya señalados. La descripción de
un gran conjunto de receptores de inhibición, de la familia de las inmunoglobulinas (KIR) y
lectinas (CD94-NKG2A) que reconocen segmentos conservados de los complejos MHC-I, representan uno de los aspectos fundamentales del control de su funcionalidad.
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1.
INTRODUCCIÓN
como tanto el BCR y TCR en conjunto con sus
moléculas asociadas, que no poseen actividad
enzimática transmiten una señal hacia el interior celular; cómo diversas enzimas proteína
quinasas, bajo las determinadas condiciones de
la interacción del antígeno con su receptor, son
capaces de interaccionar con los extremos
citosólicos de las sub-unidades de las moléculas asociadas y activarse fosforilando una serie
de sustratos de membrana e intracelulares, especialmente enzimas y proteínas adaptadoras,
que finalmente van a permitir la comunicación
con el núcleo celular.
Los linfocitos B y T tienen receptores
oligoméricos antigénicos que reconocen fundamentalmente distintas formas de los antígenos. Los
LB para protección de patógenos extracelulares;
sus receptores típicamente reconocen formas nativas o desnaturadas de proteínas y carbohidratos
ya sea solubles, particuladas o unidas a células.
En contraste los LT protegen contra patógenos
intracelulares, el TCR reconoce péptidos
antigénicos proteolíticamente procesados (8-15
residuos) unidos a moléculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) de la célula
presentadora de antígenos (CPA). Sin embargo,
la transducción de señales que resulta de la
interacción de cada receptor con su antígeno son
muy similares.
Las células NK, pertenecientes a la respuesta inmunológica innata, pueden también reconocer ligandos. Por ejemplo el receptor CD16
(RFcaIII) de las células NK une al fragmento Fc
de inmunoglobulina G, y de esta forma las células
se activan utilizando mecanismos bioquímicos similares a los de los LB y LT.
Los tres grandes sistemas de integración de
los organismos pluricelulares complejos son los
sistemas: endocrino, nervioso e inmunológico,
cada uno de ellos responde a una variedad de señales o mensajes característicos. Sin embargo,
los mecanismos bioquímico-moleculares
involucrados son universales; en este caso los receptores de membrana (BCR y TCR), al
interaccionar con el antígeno y el receptor CD16
de las células NK al interactuar con su ligando,
activan vías mediadas por proteína quinasas,
quinasas de lípidos, proteínas adaptadoras de
membrana y citosólicas permitiendo la hidrólisis
del fosfolípido de membrana fosfatidil-inositol
(PIP2) a través de una isoenzima de la fosfolipasa
C y la generación de los segundos mensajeros,
inositol-trisfosfato (IP3), diacilglicerol (DAG) y
Los linfocitos B y T, pertenecientes a la respuesta inmunológica específica, tienen la capacidad de reconocer y discriminar, entre una vasta
diversidad de estructuras, a aquellas que son
agentes extraños para el organismo vertebrado,
especialmente de carácter infeccioso. Para llevar a cabo estas funciones poseen receptores altamente específicos en su superficie para el reconocimiento de los antígenos: el receptor de
antígenos de los linfocitos B (BCR) y el receptor de antígenos de los linfocitos T (TCR). Cada
precursor linfocitario reordena exclusivamente
sus genes únicos para estos receptores y los
linfocitos maduros permanecen en estado
quiescente en la ausencia de antígeno. El contacto del antígeno específico con estos linfocitos
induce en éstas células un estado denominado
activación, que implica su expansión en número, y en el caso de los LB la producción de
anticuerpos y de los LT la adquisición de funciones efectoras tales como citotoxicidad y secreción de mediadores de la respuesta inmune
denominadas citoquinas.
Además del receptor específico, intervienen
otras moléculas de superficie denominadas co-receptores, moléculas de adhesión, receptores de moléculas co-estimuladoras; participando no solamente en la estabilización de la interacción
antígeno-receptor, sino también en la generación
de las señales bioquímicas características del proceso de activación o de inhibición de los linfocitos.
La especificidad de esta respuesta está influida
también por la localización de los mediadores participantes en zonas lipídicas específicas de la membrana plasmática.
Aun cuando entonces, la respuesta a un
antígeno es comúnmente denominada activación, este término refleja toda la complejidad
del proceso, que abarca desde la generación de
las primeras señales bioquímicas, transducción
de señales y la producción de segundos mensajeros, hasta cambios en la expresión genética y
la morfología y funcionalidad de los linfocitos.
En el presente capítulo se analizarán aquellos
aspectos estructurales de los receptores y demás moléculas accesorias involucradas en el
contacto con el antígeno respectivo y cómo esta
situación inicia la serie de eventos bioquímicos
que se encargan de la inter-comunicación entre
un fenómeno de membrana con el citosol y núcleo celular. Para ello es indispensable aclarar
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Ca2+. Estos son también segundos mensajeros de
la acción de hormonas y de factores de crecimiento (sistema endocrino) y neurotrasmisores (sistema nervioso).
estimuladoras como CD28 (CTLA-4), ICOS,
CD40L, 4-1BB, OX40; muchas de éstas son inducidas post-contacto con la CPA y moléculas de
adhesión como CD2, CD5 y LFA-1 (figura 10-2).
Este evento de unión entonces le permite, durante
el desarrollo de las células T, entrar a selección
positiva o bien a apoptosis, entrar al ciclo celular,
producir citoquinas o adquirir una función efectora
citolítica. Por lo tanto, todas las responsabilidades de las células T están radicadas en su TCR y
en las estructuras accesorias. La interacción estable entre el TCR y el antígeno presentado ha sido
denominada también “sinapsis inmunológica”, que
implica tanto la interacción como la propagación
de una señal hacia el interior de la célula.
2. ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T
2.1. Relación estructura-función del complejo TCR. El inmuno-receptor TCR es un
oligómero complejo compuesto de los productos de seis genes (figura 10-1) (ver capítulo 7),
todos ellos requeridos para una eficiente expresión en la membrana plasmática. Las cadenas _
y ` forman la sub-unidad de unión al ligando,
responsable del reconocimiento de un péptido
antigénico unido a moléculas de los complejos
mayores de histocompatibilidad clase I o clase
II de la célula presentadora, propagándose una
respuesta que implica una interacción cooperativa entre el TCR, el complejo CD3 y las sub-unidades c (que pueden existir como dímeros o
heterodímeros). Tanto el receptor como diversas
proteínas que participan en la activación de los
LT, se encuentran ubicadas en zonas lipídicas
específicas de la membrana plasmática (ZLE),
denominadas también GEM (micro-dominios
enriquecidos en glico-lípidos), cuya composición
bioquímica es diferente a la del resto de la membrana. Estos dominios están enriquecidos en
colesterol y esfingolípidos y pueden ser experimentalmente visualizados en la célula y purificados para su estudio in vitro.
Figura 10-2. Representación esquemática de algunas de las
interacciones moleculares que ocurren durante el reconocimiento antigénico en la interfase de un LT y una CPA. En
este caso es un LT CD4, en el que las moléculas CD40L y
CTLA-4 son inducidas por el contacto con la CPA, las restantes moléculas de superficie del LT son constitutivas.
Figura 10-1. Estructura de los receptores de los linfocitos T, B y NK. TCR, BCR, FcaIIIR (CD16), NKp46 (NCR) y de los
receptores de inhibición CD94/NKG2A y KIR2DL4 y de sus sub-unidades. El número de las sub-unidades y sus asociaciones
puede variar de acuerdo a la función celular. Las líneas interconectoras representan puentes disúlfuro. Los rectángulos negros
representan secuencias ITAM (motivos o secuencias de activación basados en tirosina del inmuno-receptor) y los rectángulos
achurados, secuencias ITIM (motivos o secuencias de inhibición basados en tirosina del inmuno-receptor).
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2.2. Secuencias de activación en el TCR-CD3 y
cadenas c. Como se puede apreciar de la figura
10-1, las sub-unidades _ y `, responsables de la
unión al antígeno, tienen una estructura
mayoritariamente extra-citoplasmática, lo que
avala muy bién la función de unión. Sin embargo,
ya a nivel estructural es posible descartarles una
función importante en cuanto a la transducción de
la señal, encontrándose por lo tanto ambas funciones en forma separada. La función de
transducción de señales la cumplen el complejo
CD3 y las sub-unidades c, que tienen una parte
importante de su estructura en la zona
citoplasmática, especialmente las sub-unidades c.
La relevancia de CD3 y cadenas c ha quedado de
manifiesto al usar mutantes que carecen de algunas de estas sub-unidades con la consecuente alteración en la activación de los LT. Analizando
más detalladamente ahora la estructura primaria
del complejo CD3-c, se pudo determinar que poseen secuencias de consenso en todas las sub-unidades, encontrándose incluso repetidas en las subunidades c. Estas secuencias de consenso que incluyen dos tirosinas son: YXX(L/I)X(7-8)YXX(L/
I), del código de aminoácidos de una letra, siendo
X cualquier aminoácido. Estas secuencias (tabla
10-1), se encuentran en muchas otras proteínas con
características similares a las descritas, no soportan mutaciones y constituyen en la actualidad un
conocimiento clave para el entendimiento de la
activación de los linfocitos. La nomenclatura para
definirlas se basa en que constituyen una secuencia o motivo de activación de reconocimiento del
antígeno, secuencia que posee residuos de tirosina
y leucina (o isoleucina) en posiciones características. En la actualidad se conocen estas secuencias como ITAM (motivo de activación basado en
tirosinas del inmuno-receptor). Un primer hecho
relevante de los ITAM, es que son fosforilados
los residuos de tirosina a consecuencia de la unión
del antígeno específico al TCR, situación que temporalmente ocurre en el orden de unos pocos segundos (5 a 30 s); mutantes en tirosina son inactivos. En segundo lugar ni el TCR ni ninguna de las
sub-unidades hasta ahora analizadas posee una
actividad fosforilante en tirosina, típica de las
enzimas proteínas tirosina quinasas (PTK) por lo
que deben actuar PTKs celulares específicas, siendo el proceso de la fosforilación un evento determinante en la secuencia de activación, pues además de las sub-unidades descritas, se fosforilan,
río abajo, una serie de otras proteínas celulares,
especialmente en residuos de tirosina.
Tabla 10-1. Secuencias ITAM
hc1
YNE LNLGRR E EYDVL
hCD3a
hCD3¡
hCD3a
YQP LKDR EDDQY S HL
YE P 1 RKGQRDLY S GL
YQP L RDRDDAQY S HL
mIg_
mIg`
Y E G L N L D D C S MY E D I
YEGLNYDQTATYED I
2.3. Proteínas tirosina quinasas en la activación
de los LT. Hasta ahora se han descrito tres familias diferentes de proteínas tirosina kinasas (Src,
Syk y Tec) en la activación de los LT. Las PTK no
forman parte del receptor TCR ni de sus sub-unidades asociadas. Dos de las más importantes PTKs
asociadas a este receptor pertenecen a la familia
de proteínas src. La oncoproteína viral v- src fue
la primera PTK descrita; identificándose posteriormente una amplia variedad de enzimas en todo
tipo de organismos que comparten un alto grado
de similitud estructural con esta oncoproteína, incluyendo dominios estructurales y regulatorios.
Estructuralmente las PTK de la familia src consisten de uno o más sitios de acilación en el extremo amino-terminal, requeridos para su localización en la membrana plasmática en la zona lipídica
específica; un dominio único (que define a cada
uno de sus miembros) una homología src SH3,
dominio que tiene una alta afinidad por secuencias aminoacídicas ricas en prolina; una homología
src SH2, dominio con una alta afinidad por secuencias aminoacídicas que contengan tirosinas
fosforiladas; un dominio catalítico, responsable de
la actividad enzimática fosforilante y una secuencia regulatoria en el extremo carboxilo terminal
(figura 10-3a). Las PTK de la familia src que en
forma más consistente aparecen interviniendo en
el proceso de activación de los LT son: la denominada fyn, de 59 kDa, (p59 fyn) posee dos
isoenzimas una presente en el sistema inmune y
otra en cerebro y la de 56 kDa (p56lck) que se expresa exclusivamente en el sistema inmune (figura 10-3a).
Uno de los hechos más importantes en la participación de la p56lck fue la demostración de su
unión no covalente a los dominios citoplasmáticos
de los co-receptores de membrana CD4 o CD8.
Esta directa interacción obviamente sugiere un importante papel de esta enzima en la transducción
de señales mediada por el TCR y numerosas evi-
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cia el plegamiento de la proteína lo que le impide
su acción catalítica. Para mantener esta situación,
existen por un lado una PTK, la Csk, que se encarga de mantener siempre fosforilado ese sitio
regulador y una fosfoproteína fosfatasa específica para residuos de tirosina fosforilados, la CD45.
Esta enzima provoca la hidrólisis de ese residuo
de fosfotirosina y la transforma en una PTK activa. La enzima CD45 se encuentra ampliamente
distribuida en el sistema inmune.
La PTK p59fyn también puede encontrarse
asociada directamente al TCR-CD3-c, específicamente se la ha encontrado asociada en forma no
covalente a las sub-unidades c y componentes
del CD3. Presenta también un rápido y transiente
aumento en su actividad en respuesta a la
estimulación del TCR y células mutantes en esta
quinasa presentan una significativa reducción en
el proceso de activación y proliferación celular lo
que sugiere un importante papel de esta enzima
en la transducción de señales en el linfocito.
El descubrimiento de otras PTK fuertemente asociadas al TCR sólo de células T estimuladas, abrió la posibilidad de la existencia de una
asociación rápida y transiente de proteínas de la
membrana con proteínas citosólicas. La PTK asociada a la sub-unidad c, resultó ser una proteína
de 70 kDa, por lo que fue denominada ZAP-70
(proteína asociada a la sub-unidad zeta de 70 kDa).
También se le ha encontrado asociada a sub-unidades CD3 y se encuentra expresada exclusivamente en células T y células NK. Nuevamente sus
propiedades se explican muy bien por su estructura, es una enzima citosólica, que presenta dos
homologías SH2 hacia el extremo amino-terminal de la proteína y un dominio catalítico con actividad de tirosina quinasa (figura 10-3a). La enzima ZAP-70 es altamente homóloga a la PTK
syk de 72 kDa muy abundante en los linfocitos B
y células mieloides, enzima que puede asociarse
al BCR postulándose la función de nexo entre los
procesos de membrana y citosólico/nucleares en
ese tipo de linfocitos. Tanto Zap-70 como syk pertenecen a la familia de PTK syk. La Zap-70 es
expresada a lo largo de todo el desarrollo de los
linfocitos T, en cambio la syk aparece ligada más
al desarrollo temprano de los linfocitos, siendo su
expresión mucho menor en los linfocitos T maduros. Ambas PTK tienen, a través de sus dominios
SH2, una alta afinidad por las secuencias ITAM
fosforiladas. Más recientemente se ha incorporado una nueva familia de PTK: Tec, cuyos principales representantes son Tec, Ikt y Txk; si bien se
Figura 10-3. Dominios estructurales de proteínas que participan en transducción de señales en los linfocitos. A) Dominios estructurales de dos familias de PTK que participan en
la activación de los linfocitos T y B. Desde el extremo amino
hacia el C terminal: U, dominio único; M, modificación por
ácido mirístico; SH3 y SH2 homologías src 3 y 2, respectivamente; K, dominio quinásico; R, dominio regulado; Y, residuo
de tirosina. Los sitios con residuos de tirosina fosforilables del
N al C terminal pueden ser hasta tres: Y en sitio inter-dominios (SH2 y K) fosforilada, permite asociación a otras proteínas; Y fosforilada en sitio catalítico (K) estimula su actividad
e Y fosforilada en el sitio regulador R, bloquea su actividad.
B) Dominios estructurales de proteínas adaptadoras de membrana y citosólicas: LAT, Grb2 y SLP-76; TM, dominio transmembrana; PY, dominio fosforilado en tirosina; PPPP, dominio rico en prolina.
dencias experimentales así lo confirman: células
T en respuesta al antígeno específico responden
con un rápido y transiente aumento en la actividad de esta enzima; ratones mutantes en esta enzima, presentan un profundo defecto en el desarrollo de las células T, estudios in vitro con la
línea celular T Jurkat mutante en esta PTK demuestran que prácticamente no se produce el proceso de activación en respuesta a los estímulos
correspondientes. Otra característica extraordinariamente interesante de la p56lck también reside en
su estructura. Como se puede apreciar de la figura
10-3a, la enzima posee una homología SH2 y un
extremo regulador C-terminal en que un residuo
de tirosina puede encontrarse fosforilado y de hecho esa situación es la observada en el estado de
reposo no estimulado. De esta forma se encuentra
en la misma estructura proteica la posibilidad de
interacción entre una secuencia SH2 y una secuencia que posee una tirosina fosforilable; el hecho
de encontrarse fosforilada trae como consecuen-
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ha informado un cierto grado de redundancia en
su funcionalidad utilizando ratones transgénicos,
su principal función en la activación es la
fosforilación de la FL-Ca y por lo tanto en el control de los niveles de Ca2+.
la activación y maduración. Especialmente relevantes son las mutaciones en las cisteinas que sufren palmitoilación, en este caso LAT no puede
ubicarse en la ZLE; aún cuando no se altera su
capacidad de unirse a la membrana, pierde su propiedad de ser fosforilada y de participar como un
regulador en la transducción de señales iniciada
por el TCR. Ratones carentes del gen LAT, LAT-/, sufren una completa alteración en la maduración
de los timocitos. La proteína adaptadora SLP-76
(proteína fosforilable de los leucocitos y que posee dominios SH2, es una proteína citosólica 76
kDa), específica de las células del sistema
hematopoyético; se encuentra en los linfocitos T,
células NK, monocitos y megacariocitos, pero no
en los linfocitos B. De acuerdo a su estructura
posee dominios ricos en prolina, P-Y y SH2, lo
que le permite una amplia capacidad de interacción
con otras proteínas. Una vez fosforilada se puede
unir a las proteínas adaptadoras vav, Gads y a la
PTK Ikt de la familia Tec. Al igual que en el caso
de LAT, ratones mutantes en SLP-76 por
recombinación homóloga, provocan una completa ausencia de LT en la periferia, el resultado es
mas severo que la carencia de otras proteínas
adaptadoras o de cualquiera de las PTK antes
mencionadas, poniendo en evidencia la importancia de esta proteína adaptadora en los linfocitos T.
Como se ha podido apreciar, hasta este punto se han descrito proteínas participantes en el proceso de activación de los linfocitos que de una u
otra manera están ubicadas en la membrana
plasmática, ya sea como proteínas integrales de
ésta o bien asociadas a las sub-unidades o coreceptores. Las preguntas que surgen entonces son
¿cómo se comunican estas estructuras con el
citosol y con el núcleo celular?, ¿Si bien existen
enzimas proteína quinasas, cómo éstas
interaccionan con sus sustratos citosólicos?, ¿Qué
evento les indica a los sustratos proteicos
citosólicos que se asocien en un momento determinado a la membrana y eventualmente se modifiquen por fosforilación?. El siguiente modelo de
activación de los LT permitirá responder algunas
de estas interrogantes.
2.4. Proteínas adaptadoras en la activación de
los linfocitos. El conocimiento de otro conjunto
de proteínas, denominadas proteínas adaptadoras,
en la activación de los linfocitos ha permitido una
comprensión mayor de este fenómeno. Las proteínas adaptadoras se caracterizan por carecer de
actividad catalítica, al menos hasta ahora conocida, y por tener la propiedad de dirigir interacciones
específicas proteína-proteína y proteína-lípido. Se
ha demostrado la participación coordinada de este
tipo de proteínas en conjunto con los demás eventos bioquímicos del proceso de activación de los
linfocitos. Algunos de las proteínas adaptadoras
más relevantes para los LT aparecen en la figura
10-3b; se pueden apreciar algunos de los dominios estructurales que median las interacciones
moleculares, además de los dominios SH2 y SH3
ya señalados, aparecen otros como PY (sitio
fosforilable en tirosina) y PPPP (sitio rico en
prolina). Las proteínas adaptadoras pueden ser ya
sea de membrana o citosólicas, dos de las más representativas de cada una de éstas son las proteínas LAT y SLP-76. La proteína adaptadora de
membrana LAT, descrita inicialmente en células
Jurkat y luego en linfocitos T, células NK plaquetas
y monocitos, pero no en los linfocitos B, representa el nexo de activación de los linfocitos T entre los eventos mediados por el TCR y las PTK
iniciales, permitiendo explicar como una gran variedad de proteínas y enzimas se pueden asociar a
la membrana plasmática. LAT es una proteína de
membrana, posee un sitio transmembrana que le
permite esta localización; posee además dos residuos de cisteina cercanos al sitio transmembrana.
Estos residuos pueden ser modificados por
palmitoilación lo que le permite a LAT, bajo esas
condiciones, ubicarse específicamente en el área
de las ZLE. Como posee además residuos de
tirosina fosforilables (P-Y), una vez fosforilados
estos sitios pueden interactuar con proteínas que
posean segmentos SH2 y reclutarlas a la membrana plasmática. Esto ocurre con las enzimas
fosfolipasa C (FL-C a1), fosfatidil-inositol-3quinasa (PI3-quinasa) y las proteínas adaptadoras
Grb2, Gads y SLP-76, entre otras. Tanto células
mutantes en LAT, ya sea en tirosina, cisteína, o
deficientes en su expresión, sufren trastornos en
2.5 Modelo general de activación de los LT.
Manteniendo presente a la activación de los
linfocitos como un proceso altamente complejo,
podemos con los elementos proteicos estructurales y enzimáticos señalados visualizar un modelo
simple de la activación de los LT como el de la
figura 10-4 (a, b). La figura 10-4a indica la situa-
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ción basal, previa a la interacción con el antígeno.
Indudablemente la especificidad de la respuesta
está dada por el reconocimiento por parte del TCR
del péptido antigénico presentado por el MHC de
la célula presentadora. Producida esta situación
(Figura 10-4b), quedan los co-receptores CD4 o
CD8 dependiendo del tipo de LT, topográficamente
en posición de interactuar con la misma molécula
de MHC pero en una región diferente a la de unión
al TCR. Es decir CD4 o CD8 también pueden unirse al MHC, a un segmento no polimórfico, pero
ese evento ocurre solamente en esta altamente restringida condición. Bajo estas condiciones la
p56lck, unida al co-receptor puede quedar ahora
muy próxima a los diversos ITAM de las sub-unidades CD3-c, produciéndose la fosforilación masiva de estas secuencias. De este modo las moléculas co-receptoras, CD4/CD8, hacen a los
péptidos antigénicos unidos a las moléculas de
MHC, activadores mucho más eficientes de las
células T comparados a los ligandos que se unen
directamente al TCR. Esta función de fosforilación
también la pueden efectuar la PTK p59 fyn ,
postulándose en este caso una activación de la
enzima
mediada
por
los
cambios
conformacionales siguientes a la interacción del
TCR con el antígeno. Una vez generados ITAM
fosforilados, puede entrar ahora en acción una PTK
como la ZAP-70, pues se satisfacen los requerimientos para una interacción efectiva, es decir la
presencia de homologías SH2 (ZAP-70) y de secuencias fosforiladas en tirosina (ITAM de las subunidades CD3c). Estando ahora unida, puede a su
vez ser fosforilada por las PTK de membrana ya
mencionadas y de esta forma activarse y fosforilar
otros sustratos celulares propagando la respuesta
o bien por el hecho de estar fosforilada crear nuevos sitios de reclutamiento de proteínas que posean secuencias SH2. Enzimas como la ZAP-70
pueden actuar de una manera pivotal, dependiendo del estado del linfocito; en reposo, ubicada en
el citosol; en estado activado, ligada a la membrana permitiendo, en conjunto con otras enzimas
activadas, el traspaso de la información hacia el
interior celular.
La localización de múltiples proteínas en la
zona lipídica específica durante la activación de
los linfocitos aparece como un requerimiento
crucial. La presencia masiva en esta zona, durante la activación, de la proteína adaptadora LAT,
permite que sea fosforilada por Zap-70, lo que a
su vez permite la asociación con diversas proteínas adaptadoras y con enzimas explicando de paso
Figura 10-4. Mecanismo básico de activación de los LT. a)
Tipos celulares participantes: LT que posee el complejo TCRCD3-c, co-receptores CD4 o CD8, CD45 y enzimas proteína
quinasas PTK intracelulares. La CPA, que posee la molécula
de MHC (clase I o II) y el péptido antigénico. b) Interacción
entre el péptido antigénico presentado y el TCR que inicia la
serie de eventos de asociación, activación y fosforilación en
que participan múltiples proteínas celulares como PTK, PKC, fosfo-proteína fosfatasas, proteínas que poseen ITAM, proteínas adaptadoras, que culmina con la generación de segundos mensajeros y traspaso de la información al núcleo celular.
El color azul de la membrana indica la zona lipídica específica
(ZLE). Los rectángulos negros de las sub-unidades del TCR
corresponden a los segmentos ITAM, figura 10-4 a y b, los
círculos plomos adyacentes a las secuencias ITAM y también
encontrados en otras proteínas, corresponden a la fosforilación
de esos segmentos (figura 10-4b); en el caso de las enzimas y
proteínas paritcipantes, los cuadrados verdes corresponden a
dominios SH3, y los óvalos amarillos a dominios SH2.
la acumulación de éstas a nivel de la membrana
plasmática de los LT. Entre las proteínas asociadas están las isoenzimas de la fosfolipasa C (FLC) del tipo a1 o a2, la PI3-quinasa y la proteína
adaptadora Grb2 que inicia la vía de activación de
ras. El desdoblamiento del PIP 2 (fosfatidilinositol[4,5]bisfosfato), formando los productos
IP3 (inositol[1,4,5]trisfosfato) y DAG (diacil-gli-
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cerol) por parte de la FL-C es un hecho ampliamente descrito en la literatura, este tipo de enzimas
puede ser activado ya sea por proteínas de tipo G,
la isoenzima FL-C`; o por fosforilación en residuos de tirosina, como es el caso de las isoenzimas
FL-Ca. En el proceso de activación de los LT se
ha observado hasta ahora, la participación solamente de isoenzimas del tipo Ca. Un análisis muy
somero de la estructura de estas últimas, nos revela además de la existencia de secuencias que
pueden ser fosforiladas, la existencia de secuencias tipo SH2, que le permiten por lo tanto
interactuar con secuencias fosforiladas (en este
caso de LAT), y de esta manera formar parte de la
vía de activación. La FL-Ca1 en estas condiciones es activada por fosforilación a través de la PTK
Ikt. La FL-Ca1 cataliza la hidrólisis del fosfolípido
de membrana PIP2 generando los segundos mensajeros IP3 y DAG. Estos segundos mensajeros,
inducidos a partir del TCR, son los responsables
del muy rápido y persistente aumento en el Ca2+
citosólico y de la activación de la enzima pivotal
proteína quinasa C de la cual existen más de una
docena de isoenzimas, siendo las más importantes en los LT justamente las dependientes de Ca2+
y DAG (isoenzimas _ y `). Las PK-C activadas
pueden actuar fosforilando, en serina/treonina, una
serie de sustratos proteicos propagando de este
modo la señal. La enzima PI 3-quinasa, también
se asocia a LAT fosforilado, y genera a partir del
del PIP 2 el producto PIP 3 (fosfatidilinositol[3,4,5]trisfosfato) que es un activador de la PKCc, reforzando el papel de estas isoenzimas. El
aumento del Ca2+ intracelular y activación de la
PK-C son eventos claves en la respuesta tanto de
los linfocitos T y B. La elevación del Ca 2+
intracelular además de activar directamente a
enzimas, conduce a la interacción de este metal
bivalente con la proteína moduladora dependiente de calcio, denominada calmodulina; el complejo calmodulina calcio produce por interacción
proteína:proteína la activación de diversas
enzimas, entre éstas la calcineurina, una
fosfoproteína-fosfatasa (serina/treonina) que
desfosforila al factor de activación de la transcripción (NFAT) citosólico, que bajo estas condiciones ingresa al núcleo y participa en la expresión
del gen para IL-2, citoquina vital en el proceso de
activación de los LT. Esta vía es inhibida por el
fármaco ciclosporina A (CsA), fármaco que se une
a proteínas citosólicas (ciclofilinas), siendo este
complejo el inhibidor de la fosfatasa calcineurina,
impidiendo de esta manera el traspaso de la infor-
mación e inhibiendo por lo tanto el proceso de
activación de los LT. Este es uno de los pocos ejemplos directos que muestran la conexión entre la
membrana y el núcleo celular.
La participación de la proteína ras, que se
sabe inicia una vía importante en la activación de
los LT, es insensible a la acción de CsA. La proteína ras (21 kDa) es una de las típicas proteínas
que unen nucleótidos de guanina, GDP en el estado inactivo y GTP en el estado activo. La
estimulación del TCR induce una marcada y rápida activación de ras que se manifiesta por su estado de unión a GTP. Esta activación se inicia a
través de la interacción de Grb2 con LAT
fosforilado, Grb2 puede interactuar con otras proteínas adaptadoras y con proteínas intercambiadoras de guanina (Sos) que permiten la unión
de GTP a ras. Ras-GTP activa a la Raf-quinasa
con la cual se inicia la activación secuencial de
la cascada de las MAP-quinasas, vía también fundamental en la activación de los LT. La proteína
adaptadora SLP-76 es también fosforilada por
Zap-70, puede interactuar con otras proteínas
como la PTK Ikt y con Gads. La Ikt en esa posición activa a la FL-Ca por fosforilación y Gads,
actuando como puente, le permite interactuar con
LAT. Como se puede apreciar entonces estas proteínas, LAT y SLP-76, actúan como andamios
temporales que pueden reclutar una gran cantidad de proteínas en la superficie celular permitiéndoles activarse a través de la interacción proteína-proteína o a través de la fosforilación y de
esta forma engranar toda la maquinaria
bioquímica requerida en la transducción de señales.
Como resultado del proceso anterior, se activan diferentes vías: catalizadas por diversas familias de PTK, isoenzimas de PK-C, MAPkinasas, calcineurina; lo que trae como consecuencia: a) cambios en el citoesqueleto, polimerización
de actina y la reorientación del MTOC hacia la
zona de contacto inter-celular; b) la activación de
diversos factores transcripcionales que permiten
la síntesis de citoquinas, proteínas citotóxicas,
entre otras, necesarias para la funcionalidad de los
LT CD4 y CD8.
La transducción de señales es un proceso rápido, su término en este caso se encuentra asociado a la activación de mecanismos de desfosforilación efectuadas por fosfatasas específicas
(fosfotirosina fosfatasas). Nuevamente aquí se ha
descrito un papel importante de CD45, esta enzima puede aparecer, en determinados períodos, in-
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mAbs anti-TCR y simultáneamente con mAbs
anti-CD28, produce una estimulación de la proliferación celular debido, fundamentalmente, a
la síntesis y secreción de IL-2; produciéndose
también la síntesis y secreción de otras numerosas citoquinas. Otro aspecto relevante en la
estimulación de CD28 es su potenciación en la
generación de las zonas lipídicas específicas, lo
que resultaría en una mayor concentración de las
proteínas participantes en la activación de los
linfocitos. La importancia de B7 como coestimulador ha quedado además de manifiesto en
numerosos sistemas experimentales in vivo, un
ejemplo demostrado por varios grupos lo constituye el trasplante de células tumorales no
inmunogénicas, que se transforma en
inmunogénicas al transfectarlas con el gen de B7.
Si bien el mecanismo de acción mediado por
CD28 no es del todo conocido, implica la
fosforilación de su dominio citoplasmático en la
secuencia YXXM, por quinasas de la familia src
activadas por la interacción del TCR con el
antígeno. Esta secuencia bajo estas condiciones
puede asociarse con diversas enzimas como la
PI3-quinasa, ras y la activación de la vía de las
MAP-quinasas.
La glicoproteína CTLA-4 es altamente
homóloga a CD28, ambas se unen a los mismos
ligandos, pero CTLA-4 presenta algunas diferencias: a) une a los ligandos CD80 y CD86 con
mucho mayor afinidad que CD28, aproximadamente 10 veces mayor, b) transmite una señal de
inhibición al interior celular. La regulación de la
expresión de CTLA-4 es un asunto crucial para
ejercer sus efectos supresores, los LT en reposo
no lo expresan y sólo comienza a aparecer una
vez que éstos se han activado. El extremo
citoplasmático de esta glicoproteína, contiene la
secuencia YXXM que puede ser fosforilada por
las quinasas de la familia src; una vez fosforilado
puede interactuar específicamente con
fosfoproteína fosfatasas como la SHP-2, la cual
bajo estas condiciones se activa y cataliza la
desfosforilación de las quinasas (src, syk, tec) y
fosfoproteínas (LAT, SLP-76) requeridas para la
transducción de señales de los LT. Al interactuar
por lo tanto el TCR y CTLA-4, ocurriría el comienzo de la activación celular de los LT, se
fosforila CTLA-4, estimulando la reacción de
desfosforilación (por su asociación a fosfatasas)
y la terminación de la respuesta. Actualmente,
existe un amplio estudio de la utilización
farmacológica de este efecto, utilizando proteí-
cluida o excluida de las zonas lipídicas específicas; pudiendo actuar como agente desfosforilante
que va finalizando el proceso de activación. De
acuerdo a lo anterior, CD45 participaría inicialmente desfosforilando el sitio regulador de la p56lck
y posteriormente sería excluida de las ZLE. Existen muchas familias de fosfatasas, una de éstas
denominada SHP (fosfatasa que contiene dominios SH2), de la cual hay una gran variedad: SHP1, 2, etc. Este tipo de enzimas tiene la importante
propiedad de reconocer a las PTK activadas a medida que aumenta su grado de auto-fosforilación,
y por ende de activación, pueden unirse a éstas a
través de los dominios SH2, desfosforilando a la
PTK y por lo tanto volviéndola al nivel basal. Este
tipo de mecanismos es uno de los principales frenos de la activación de los linfocitos.
2.6. Las dos señales necesarias para la activación de los LT. Como los LT CD4 controlan la
activación de los LB, macrófagos y, en algunos
casos la activación de los LT CD8, su propia activación por parte del antígeno, puede representar
uno de los eventos más importantes en la iniciación de la inmunidad adquirida. Desde hace ya
varias décadas atrás, se sabía que la estimulación
antígeno específica no era suficiente para llevar a
cabo la expansión clonal de los LT. Posteriormente se demostró la presencia de una interacción coestimuladora antígeno-independiente encargada
de aportar la necesaria segunda señal. Esta segunda señal, por lo tanto, no es dependiente del TCR
y se ha denominado señal co-estimuladora pues,
siendo esencial, no induce por sí misma respuesta
alguna en los LT. La interacción del TCR con el
antígeno solamente, sin las señales coestimuladoras accesorias puede llevar a la muerte
del linfocito o a anergia, un estado en el que la
célula no puede ser activada, aun cuando reciba
todas las señales requeridas. Por lo tanto entonces
el encuentro con el antígeno puede conducir a dos
respuestas bien diferentes: proliferación y adquisición de funciones efectoras o inactivación y
muerte celular.
Entre las moléculas responsables de ejercer
esta co-estimulación aportadas por la CPA, se encuentran entre muchas otras, la proteína B7 (B7.1,
B7.2 o CD80, CD86) (figura 10-2), siendo CD28
el receptor en los LT. La molécula de CD28 tiene una MM de 44 kDa, es un homodímero expresado en la mayoría de los LT, virtualmente en
todos los LT CD4 y aproximadamente en el 50%
de los LT CD8. La estimulación de los LT con
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resultado ser muy similar al de los LT, y como
veremos más adelante, al de las células NK. El
BCR al igual que el TCR, cumple muchas funciones, permite la expansión proliferativa y diferenciación de las células preB en células B maduras
y sirve también como receptor para internar
antígenos y presentarlos a los LT CD4 ayudadores.
Estructuralmente el BCR está compuesto de una
molécula de Ig asociada no covalentemente con
dos moléculas accesorias Ig-_ (CD79a) e Ig-`
(CD79b), las que se encuentran como
heterodímeros unidos por puentes disúlfuro (figura
10-1 y 10-5a). Las inmunoglobulinas de membrana difieren de las secretadas en cuanto a que se
encuentran integradas a la membrana plasmática,
con dominios extracelular, trans-membrana y
citoplasmático; este último puede ser muy corto,
tan sólo de unos pocos aminoácidos (en general
de 3 a 35/40 residuos). Aunque es factible la expresión de todos los tipos de inmunoglobulinas
como parte del BCR, son solamente mIgM y mIgD
los que se encuentran con mayor frecuencia
(aproximadamente 90%) sobre la superficie del
linfocito. En el caso de la mIgM, las sub-unidades Ig_ e Ig`, poseen 61 y 48 residuos de
aminoácidos citoplasmáticos respectivamente. El
análisis de la estructura primaria de estas sub-unidades permitió apreciar que cada una de éstas poseen una copia de los dominios ITAM, abriendo
la posibilidad de la participación de PTK ya sea
de membrana o solubles en la transmisión de la
señal bioquímica al interior celular. Mutaciones
en ambas tirosinas de los ITAM resultan en la total inactivación de los LB. Además del receptor,
participan en la interacción co-receptores, CD19/
CD21, moléculas de adhesión y moléculas de superficie celular que pueden también participar en
la transducción de señales (CD40). Se encuentran
también en la superficie de las células B, moléculas que promueven la inhibición, como CD22 y
FcaRIIB1. Los co-receptores como CD19/CD21
en los LB, son de particular interés en el contexto
de la transducción de señales mediada por el receptor antigénico, puesto que contribuyen directamente a la formación del complejo entre el receptor y el antígeno, aumentando por lo tanto la
sensibilidad de la interacción (figura 10-5a).
nas análogas a CTLA-4, que compitan con B7
de la CPA, como fármacos inmunosupresores.
El proceso de activación de los LT, incluyendo al TCR, co-receptores moléculas de adhesión
y receptores de co-estimulación; abarca un primer
evento constituido por la fosforilación de proteinas
en residuos de tirosina y la generación de los segundos mensajeros IP3, Ca2+ y DAG. Esto constituye el traspaso de una señal o la transducción de
señales desde el exterior al interior celular y que
inicia a las vías bioquímicas ya señaladas, culminando con los típicos cambios en la expresión
genética y cambios morfológicos y funcionales.
El bloqueo de cualquiera de estas vías ya sea por
inhibidores específicos o mutaciones que las
inactiven, provoca una significativa disminución
a anulación de la respuesta. Por otra parte, agentes que imiten los efectos de los segundos mensajeros como son los ésteres de forbol (estimuladores
de la PK-C) e ionóforos de calcio (que favorecen
el ingreso de Ca2+ al interior celular), reproducen
muchos de los efectos río abajo, iniciados por el
antígeno en contacto con el TCR. Además, existen evidencias aportadas por la patología
inmunológica, en muchos casos de inmunodeficiencias combinadas severas (SCID) se ha observado que el factor deficitario corresponde a una
de las proteínas o enzimas de las vías bioquímicas
señaladas; el caso más conocido es la deficiencia
de la enzima Zap-70.
Finalmente, dada la importancia de las PTK
en diversos procesos tanto normales como patológicos, existe en la actualidad una rama importante de la farmacología dedicada a la interrupción de la transducción de señales a través de esta
vía, diseñando inhibidores específicos de estas
PTK que puedan ser utilizados como fármacos.
En el caso del sistema inmune, las PTK que intervienen en el proceso de activación se expresan en
forma prácticamente exclusiva en los linfocitos,
lo que permitiría bloquear selectivamente su acción actuando como inmunosupresores.
3. ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS B
3.1. Secuencias de activación en el BCR y subunidades asociadas. Aún cuando la información
sobre el mecanismo de activación de los linfocitos
B está aun lejos de ser completa; el conocimiento
creciente de la estructura del receptor de antígenos
de las células B (BCR) y de sus sub-unidades asociadas ha ido dando paso a un mecanismo que ha
3.2. Modelo general de activación de los LB. A
continuación se analizará cómo la unión de un ligando específico (antígeno) al receptor BCR, desencadena una compleja serie de eventos
bioquímicos que permitirán el desarrollo de la res-
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