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Respuesta inmune a la infección por ETEC en ratones Balb/c inmunizados con Peptido CFA/I Yolanda López Vidal lvidal@unam.mx Facultad de Medicina, UNAM PRINCIPALES SINTOMAS CLINICOS GRUPO DIARREA EIEC 1025 EPEC 605 ETEC EHEC % DIARREA/VÓMITO % DIARREA/SANGRE % 95.8 45 4.2 0 0 96 24 3.8 1 0.2 5825 97.1 123 2.7 12 0.2 250 95.8 8 3 3 12 Escherichia coli enterotoxigénica • Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) es una causa importante de diarrea infantil aguda en todo el mundo, especialmente en países en desarrollo y los turistas que los visitan. • La colonización del intestino delgado por ETEC es un requisito indispensable para causar diarrea. • La adherencia a la mucosa intestinal por ETEC está mediada por factores de colonización o fimbrias (CFAs) y son un factor importante de virulencia. FACTORES DE VIRULENCIA EN ETEC • Los factores de colonización de ETEC están clasificados en 4 familias (CFA/I, II, III y IV). • Los CFAs interactúan con diversos componentes celulares (sitios de unión) en el intestino delgado. • En la familia CFA/I existen determinantes antigénicas iguales como el epítopo lineal común (CLE). EPITOPOS DE CFA/I POTENCIALES PARA LINFOCITOS T 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 CFA/I sequence T-cell epitopes (Cassels, 1997) R R * I-A Regions. Sette MHC Motifs T cell Motif-Rothbard-Taylor AMPHI Regions-AMPHI 70 4 Intensity Plot-AMPHI 2.25 0 -1.01 Faucher PliskaHydrophobicity 5 0 Alpha-Helix Plot-AMPHI 5 0 310 Helix Plot-AMPHI PEPTIDO POTENCIAL DE CFA/I PARA LINFOCITOS T 33 > Y 40 S P A S K T F 45 E S Y R V 51 M T Q V H T C * CFA/I. Peptide sequence T cell epitope (Cassels, 1997) R R 2.25 * I-A Regions-Sette MHC Motifs T cell Motif- Rothbard-Taylor AMPHI Regions AMPHI 70 -1.01 4 0 Intensity Plot- AMPHI Fausher Pliska-Hydrophobicity 5 Alpha Helix Plot-AMPHI 0 5 310 Helix Plot-AMPHI 0 VACUNAS DE ETEC • Aunque la enfermedad causada por ETEC tiene gran relevancia existe una vacuna efectiva, basada en bacterias completas. • En intentos por crear una vacuna se administró CLE por vía intranasal para protección contra la infección por ETEC en ratón. • La subunidad B de la toxina del cólera (CTB), Cry1Ac se demostró que son potentes adyuvantes en mucosas. OBJETIVOS • Evaluar la respuesta inmune inducida por CLE con CTB ó Cry1A contra la infección por ETEC en un modelo murino. • Determinar la respuesta inmune humoral y proliferación celular de linfocitos T en diferentes tejidos (bazo, ganglios linfáticos cervicales e inguinales y Placas de Peyer), y el perfil de citocinas. • Determinar la configuracion CLE de ETEC en condiciones fisiológicas. Metodología experimental Inmunizar 0, 7, y 28 días vía intranasal Control con PBS Control con CTB o Cry1A Inmunizados con péptido Inmunizados con péptido + CTB o Cry 1Ac Reto con ETEC 6 x 108 UFC/ml Excreción de ETEC Evaluación durante 7 días posteriores al reto Comportamiento de los ratones Presencia de diarrea Hemaglutinación Sacrificio y obtención de Bazo, ganglios linfáticos cervicales, inguinales y placas de Peyer Ajuste de células y viabilidad Proliferación celular PHA CLE Determinación de IL-4, IL-10, INF-γ por CF CTB o Cry1Ac CLE + CTB o Cry1Ac Estudio de subpoblaciones linfocitarias (CD4, CD8) por CF Ultrastructura de CLE en CFA/I de E. coli enterotoxigénica Día Grupo Presencia de ETEC en heces 0 Todos los grupos - 0 1 Todos los grupos +++ +++ ++ ++ + 0 1 1 1 0 0 1 0 0 Control 3 CLE CTB CLE + CTB Control 4 CLE CTB CLE + CTB - Diarrea Antiicuerpos contra el peptido (Abs) 2 1 0 CTB CTB + Cry Cry Adyuvantes IgA e IgG sérica contra el ECL en CFA/I de ETEC de los sueros de ratones inmunizados con el péptido (50g/ml), y los adyuvantes CTB /or Cry. 2 1 0 1 5 25 50 Péptido (g/ml) Respuesta proliferativa de las células NLC de ratón inmunizado intranasal con Cry (50g/ml) y el péptido (50g/ml) y PBS. 44 3 2 1 0 NLP NLC Bazo Respuesta proliferativa de NLC y células de bazo de ratones inmunizados vía intranasal con Cry (50g/mL) and peptide (50g/ml). Las células fueron estimuladas in vitro péptido (1g/mL), Cry (1g/mL) y and Con A (5g/mL) 2 1 0 1 5 10 25 50 CFA/I Con A Péptido (g/ml) Respuesta proliferativa en células de placas de Peyer’s de ratón infectado con ETEC expresa CFA/I y ratones con (PBS) . Células cultivadas in vitro con varias concentraciones del péptido, CFA/I (1 g/mL) y Con A (5g/mL). 8 6 4 2 0 1 5 25 CFA/I Con A Péptido (g/ml) Respuesta proliferativa de células de bazo de ratones infectados con ETEC expresa CFA/I y ratones controles (PBS) . Las células cultivadas in vitro con varias concentraciones de péptido de CFA/I (1 g/mL) y Con A (5g/mL). 30 Control CLE CTB CLE + CTB % Response 20 10 0 Spleen PP CD4+ Spleen PP CD8+ T Lymphocytes Control CLE CLN Spleen 60 CTB CLE + CTB IL-4 IL-10 Cytokines INF-g PP CLN ILN Spleen PP CLN ILN PP 0 ILN 20 Spleen % Response 40 Elipticity per residue x 10-3 80 B eta sheet 60 40 20 0 -20 -40 190 210 230 wavelength (nm) 250 Conclusiones • La vacuna contra la infección por ETEC compuesta por CLE+CTB o Cry induce mayor proliferación de linfocitos T. • Una importante respuesta de IL-4 e IL-10 se obtuvo en todos los órganos estudiados en el grupo vacunado con CLE+CTB, o Cry. • La producción de citocinas Th2 en los ratones y la presencia de títulos altos de IgA e IgG inmunizado con CLE+CTB ó Cry, sugiere el desarrollo de una respuesta humoral protectora. • El péptido CLE tiene un estructura secundaria de hoja β. • En condiciones fisiológicas (pH 7.4 y 37 C) el péptido CLE se agrega formando estructuras triméricas.