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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
Curso: FISIOLOGÍA GENERAL 2010
Laboratorio No. 3
Canales con Inactivación
Introducción.
En este trabajo práctico trabajaremos con la simulación de canales activados por voltaje y
que presentan inactivación, como modelo de los canales de sodio de los nervios. Estos
canales tienen simetría cuádruple, como los canales tetraméricos de potasio, pero están
constituidos por una sola molécula de proteína con cuatro dominios similares. Los canales
de sodio son dependientes del voltaje y se comportan como si tuvieran tres sensores de
potencial, una compuerta de activación y una compuerta de inactivación. Cuando la
célula está en reposo el potencial intracelular es negativo y los tres sensores de potencial
están en estado de reposo, la compuerta de activación está cerrada y la compuerta de
inactivación está abierta. Si la célula se despolariza, es decir el potencial intracelular se
hace menos negativo, cero o positivo, los sensores de potencial cambian al estado activo. Si
los tres sensores están en estado activo la compuerta de activación se abre y el canal
conduce iones sodio. Basta que uno de los tres sensores pase al estado de reposo para que la
compuerta de activación se cierre. La compuerta de inactivación es independiente del
potencial y puede bloquear el paso de los iones sólo cuando la compuerta de activación está
abierta. Si la compuerta de inactivación se cierra el canal deja de conducir y entra en el
estado inactivado.
Si m es la probabilidad de encontrar un sensor de potencial en estado activo, y h la
probabilidad de encontrar la compuerta de inactivación abierta, entonces la probabilidad de
encontrar el canal abierto, P, es m3h.
La intensidad de la corriente llevada por una membrana con N canales de conductancia g y
potencial de inversión Vi cuando se aplica un potencial V es:
i (t ,V )  Ngm3h(V  Vi )
(1)
La intensidad de la corriente es función de V y del tiempo porque m y h son funciones del
tiempo y de V. La cinética de los sensores de potencial de estos canales simulados es
similar a la cinética de apertura y cierre de los canales activados por voltaje que vimos en el
primer trabajo práctico. La probabilidad por unidad de tiempo que un sensor en reposo pase
al estado activo es , y la probabilidad por unidad de tiempo que un sensor activo pase al
estado de reposo es . Ambas constantes son funciones del potencial eléctrico intracelular..
La ecuación diferencial que relaciona la probabilidad de encontrar un sensor en estado
activo, m, con las constantes m y  m es:
dm
   m m   m (1  m)
dt
En estado estacionario, la probabilidad m es constante y la llamamos m.
(2)
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 3
m() 
2
m
m  m
(3)
Las constantes m y  m son funciones del potencial eléctrico de modo que m es cercano a
cero para el potencial de reposo y crece hasta 1 al despolarizar la membrana.
m( ) 
1
1  e ( zm F / RT )(V V0 m )
(4)
Donde zm es la carga transportada por un sensor de potencial y V0m el potencial al cual la
probabilidad de encontrar el sensor en estado activo es 0.5. Los experimentos destinados a
estudiar la cinética de los canales se hacen provocando cambios bruscos de voltaje, lo que
cambia las constantes m y  m y estudiando el curso temporal de la corriente llevada por la
membrana. Éste depende del curso temporal de m y de h, según la ecuación 1: El curso
temporal de m es éste
m(t )  m()  (m(0)  m()e t /  m
(5)
Donde m es la constante de tiempo:
1
m 
m  m
(6)
La ecuación diferencial para la probabilidad, h, de encontrar abierta la compuerta de
inactivación es ésta:
dh
   h h   h (1  h)
dt
(7)
Donde  h es la probabilidad por unidad de tiempo que un canal se inactive y h es la
probabilidad por unidad de tiempo que el canal salga del estado inactivado. Es importante
notar que el hecho que se requiera que los canales estén abiertos para que la inactivación
tenga lugar, le confiere a este proceso una dependencia del potencial aparente: la
inactivación está acoplada a la activación y esta última depende del voltaje. Por lo tanto, en
este modelo, las constantes h y  h son dependientes del voltaje. El curso temporal de h
durante un experimento de relajación es:
h(t )  h()  (h(0)  h())e t / h
(8)
Donde h es la constante de tiempo:
h 
1
h  h
(9)
Fisiología General 2010. Trabajo Práctico No. 3
3
Al potencial de reposo, P es cercana a cero porque m es cercano a cero. Al despolarizar la
membrana m aumenta rápidamente y la compuerta de activación se abre. Luego la
compuerta de inactivación se cierra, los canales se inactivan, h se hace cero. En
consecuencia, estos canales se abren sólo durante un corto tiempo. Cuando la membrana se
repolariza m regresa a cero, la compuerta de activación se cierra, h regresa a 1.
Los canales de sodio presentan inactivación, proceso que juega un papel muy importante en
la generación y propagación de potenciales de acción. Cuando los canales de sodio se
abren permiten la entrada de sodio a la célula y esta corriente de entrada despolarizan la
célula. Una vez que la célula se despolariza, los canales se inactivan, la corriente de entrada
sodio se termina y la membrana se repolariza debido a la corriente de fuga más la llevada
por los canales de potasio que se abren con la despolarización, y el potencial de acción se
termina.
Membranas con un solo canal.
El esquema cinético que representa el funcionamiento de los sensores de potencial m de
nuestros canales que se inactivan es éste:



(Esquema 1)



Donde xm representa el número de compuertas m en estado activo. Las probabilidades por
unidad de tiempo de cada uno de los pasos de izquierda a derecha son respectivamente 3m
2m, m. Para los pasos de derecha a izquierda las probabilidades por unidad de tiempo son
respectivamente m, 2m y 3m. Estando en el estado 3m la compuerta de activación se abre
y los canales conducen iones. Estando la compuerta de activación abierta se puede cerrar la
compuerta de inactivación. Inmediatamente después de la despolarización el canal transita
por los diferentes estados y visita brevemente el estado abierto 3m con la compuerta h
abierta. Esta figura ilustra el funcionamiento del canal partiendo de un estado inicial en que
los tres sensores de potencial están en reposo y la compuerta de inactivación abierta.
0m
1m
2m
3m
Los tres primeros trazos: m1, m2 y m3, muestran el curso temporal del estado de cada uno
de los sensores de potencial,: R = reposo A= activo, partiendo con todos en reposo. El trazo
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h muestra el estado de la compuerta de inactivación: C = cerrada , A= abierta. El trazo A/C
muestra el estado de conducción del canal: C = cerrado o inactivado, A= abierto. Desde el
tiempo cero hasta 24 ms el canal está cerrado. Desde los 24 ms hasta los 31 ms el canal
está abierto y desde los 31 ms en adelante el canal está inactivado.
Corrientes de compuerta.
Los sensores de potencial son partes del canal que tienen carga eléctrica positiva y se
mueven impulsados por la diferencia de potencial establecida a través de la membrana. En
reposo el potencial eléctrico intracelular es negativo por los que los sensores están en el
lado citoplamático de la membrana, estado de reposo. Cuando la membrana se despolariza,
los sensores se mueven hacia la cara extracelular de la membrana, estado activo. Este
movimiento de cargas eléctricas se puede observar como una corriente eléctrica y se llama
gating current. Cada vez que se mueve un sensor desde el estado de reposo al activo causa
un impulso de corriente de salida. Cada vez que se mueve desde el estado activo al estado
de reposo causa un impulso de corriente de entrada. La integral de la corriente llevada por
el impulso es la carga eléctrica transportada por el sensor de potencial. La carga trasportada
por cada sensor es ze0 conde z es el número de cargas elementales transportadas y e0 es la
carga elemental (1.6 10-19 coulomb).. La figura muestra la relación entre el estado de un
sensor de potencial y los impulsos de corriente de compuerta, ig.
La gating currents se pueden medir en membranas con muchos canales. En este caso los
impulsos individuales de corriente se suman dando origen a un registro continuo. La
corriente de compuerta ig(t) es igual al número de compuertas m que cambian de estado en
cada unidad de tiempo multiplicado la carga transportada por cada sensor. El sentido es
positivo para las transiciones de reposo a activo y negativo para las transiciones de activo a
reposo.
ig (t )  3 Nze0
dm
dt
(10)
Donde N es el número de canales presentes en la membrana y 3 es el número de sensores
por canal. Los experimentos en membranas con muchos canales destinados a estudiar las
gating currents se hacen provocando cambios bruscos de voltaje, lo que cambia las
constantes m y  m y estudiando el curso temporal de la corriente llevada por la membrana
ig(t).
Si se hace un experimento en que m(0) = 0, el curso temporal de m(t) es:

m(t )  m() 1  e t / m

(11)
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Y la gating current para la membrana con N canales será:
ig (t )  3 Nze0
m( )
m
e t /  m
(12)
La intensidad de la corriente a tiempo cero depende de la cantidad de carga que se moviliza
y de la constante de tiempo. Cuanto más rápido sea el proceso mayor será la amplitud de la
corriente de compuerta. En una membrana con 104 canales con sensores de potencial que
lleven tres cargas cada uno y con una constante de tiempo de 1 ms, la amplitud de la
corriente de compuerta es 1.44 10-11 amperes, o 14 pA. Si la conductancia de los canales es
de 10 pA y se aplica una diferencia de potencial de 10 mV la corriente iónica será de 109
amperes, o 1000 pA. Este cálculo nos demuestra que se debe bloquear la corriente iónica
para poder revelar las gating currents.
La integral de la corriente de compuerta, entre tiempo cero e infinito es la carga total
transportada por todas las compuertas, Q:


0
0
Q   ig (t )dt  3 Nze0 
dm
dt
dt

Q  3Nze0  dm  3Nze0 (m  m0 )
0
(13)
Si se hace un experimento en que m(0) = 0 y m = 1, la carga transportada por las gating
currents para la membrana con N canales será:
Q  3Nze0
(14)
Si se hace un experimento en que m(0) = 1 y m = 0, la integral de la corriente, Q, es en
este caso -3Nze0.
Relajación de la corriente.
Los experimentos en membranas con muchos canales, destinados a estudiar la cinética de
los canales, se hacen provocando cambios bruscos de voltaje, lo que cambia las constantes
m y  m y estudiando el curso temporal de la corriente llevada por la membrana, i(t):
i(t ,V )  NgP(t ,V )(V  Vi )
(15)
donde P(t,V) =
que es la probabilidad de encontrar la compuerta de activación abierta,
3
m y la compuerta de inactivación abierta, h.
El curso temporal de P se puede calcular conociendo el curso temporal de m, ecuación 5 y
el de h, ecuación 8.
m 3h
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Funcionamiento de los programas simuladores.
En este trabajo usaremos tres programas de simulación que funcionan bajo Excel.
CanalesI4.xls, CanalesIg.xls y CanalesIn.xls.
Experimentos con canal único.
CanalesiI4.xls es similar al programa usado en el trabajo práctico de los canales de
tetraméricos.
Este programa funciona con macros y se deben aceptar al momento de abrir el
programa.
La hoja se recalcula al apretar la tecla F9, no se recalcula automáticamente.
Algunas celdas pueden estar protegidas u ocultas.
Como los canales de esta simulación se abren por un tiempo corto solamente en respuesta a
una despolarización, es necesario hacer los experimentos cambiando el potencial eléctrico.
Esto se hace estableciendo un potencial previo durante un período llamado prepulso.
Finalizado el prepulso, se empieza el período llamado pulso.
El programa calcula las constantes m y m a partir del voltaje presente en la celda B2,
usando ecuaciones de la misma forma de las usadas para los canales tetraméricos. El estado
inicial de los tres sensores de potencial m1, m2, y m3 es reposo y el de la compuerta de
inactivación es abierto.
El estado sucesivo de los sensores se determina mediante números al azar usando el mismo
procedimiento empleado en los trabajos prácticos anteriores. Si el sensor está en reposo y el
número al azar es menor que mt el sensor se declara activo; si no, queda en reposo. El
procedimiento es el similar para el sensor en estado activo: si el número al azar es menor
que  mt el sensor pasa al estado de reposo; si no, queda activo. En la celda B5 está t.
El procedimiento se repite para los tres sensores m durante 5000 intervalos t y los
resultados quedan en las columnas B, C, y D, a partir de la fila 11. Sensor en reposo = 0,
activo = 1. El procedimiento es similar para la compuerta h y el estado de esta compuerta
se anota en la columna E, a partir de la celda E11. El estado del canal, se anota en la
columna F y es el producto del contenido de las celdas BCDE.
La corriente iónica se anota en la columna J, calculada del estado del canal, la conductancia
unitaria y la diferencia entre el potencial de la membrana y el potencial de inversión de la
corriente, más el ruido instrumental. El curso temporal de la corriente, del estado de los
sensores de potencial y de la compuerta de inactivación se muestra en forma gráfica. Los
trazos m1, m2 y m3 muestran el estado de los sensores: abajo en reposo y arriba en estado
activo. El trazo h muestra el estado de la compuerta de inactivación, abajo cerrada y arriba
abierta. El trazo A/C muestra el estado de conducción del canal: abajo cerrado o inactivado
y arriba abierto.
La corriente promedio durante los 5000 intervalos de tiempo queda en la celda C7, la
corriente del canal abierto la encuentra en la celda D7, el tiempo que el canal estuvo
abierto en la celda E7, el tiempo que el canal permaneció abierto en la celda E7, el tiempo
cerrado + inactivado en la celda F7, el número de veces que el canal se abrió en la celda
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G7, y el tiempo que tarda el canal en abrirse por primera vez en la celda H7 (primera
latencia).
En las columnas K, L y M se anota los cambios de estado de los sensores de potencial y en
la columna N la suma de las columnas K, L y M. Los trazos 1, 2 y 3 muestran los
impulsos de corriente causado por las transiciones de los sensores de potencial y el trazo 
la suma de los impulsos de los tres sensores..
Recolección de resultados.
Para hacer una simulación defina el potencial en la celda B2 y luego toque la tecla F9.
Haga simulaciones cubriendo el intervalo de voltajes entre -30 y 80 mV. Observe el
funcionamiento de las compuertas m y h. Observe que los eventos abiertos se terminan ya
sea por el cierre de una compuerta m o el cierre de la compuerta h.
El Macro Ctrl s hace 25 simulaciones y anota los promedios en las celdas C8 a H8.
El macro Ctrl. t transfiere los valores de las celdas B6 a H8 de la hoja Simulador a las
celdas A2 a G8 de la hoja Resultados.
Con los resultados recolectados haga estos gráficos
 La corriente del canal abierto en función del voltaje.
Determine el potencial de inversión de la corriente, Vi, y la conductancia unitaria
del canal, g. Estos datos los usará más adelante.
 El promedio de la corriente en función del voltaje.
 El tiempo que el canal está abierto a diferentes voltajes.
 La duración de la primera latencia en función del voltaje.
Experimentos en membranas con muchos canales.
Gating currents.
CanalesIg.xls es el programa Excel para las simulaciones corrientes de compuerta.
Este programa funciona con macros y se deben aceptar al momento de abrir el
programa.
La hoja se recalcula al apretar la tecla F9, no se recalcula automáticamente.
Algunas celdas pueden estar protegidas u ocultas.
Funcionamiento del programa.
El programa calcula el curso temporal del estado de cada una de los tres sensores de
potencial, de acuerdo con el potencial definido en B2, el estado inicial definido en B5 y el
intervalo de tiempo definido en B6. El resultado para cada sensor queda en las columnas B,
C y D. La columna E contiene las variaciones en el número de sensores en estado activo en
cada intervalo de tiempo, para cada simulación. La columna F contiene la suma de estas
variaciones a medida que el proceso se repite, simulando una membrana con muchos
canales. El gráfico muestra el número de sensores que ha pasado del estado de reposo al
activo en cada intervalo de tiempo.
 Para hacer una simulación defina el potencial y use el Macro Ctrl. s
 Para borrar el resultado y use el Macro Ctrl. x.
 Para promediar 10 repeticiones use el Macro Ctrl. S.
 Para simular una membrana con 1000 canales use el Macro Ctrl. d.
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
8
Para transferir los datos al a hoja Corriente de compuertas use el macro Ctrl. t.
En la columna C de la hoja Corriente de compuertas está el curso temporal de la corriente
de compuerta expresada en femto amperes ( 10-15 A). La columna D contiene una función
exponencial calculada según los parámetros de las celdas D6 y D7, corriente inicial y
constante de tiempo respectivamente. La columna E contiene las diferencias al cuadrado
entre los resultados experimentales y la función exponencial. Use Solver para buscar los
parámetros que minimicen la suma de cuadrados que está en la celda E8. La celda D8
contiene Q, la integral de la corriente, en femtocoulomb.
Recolección de datos.
Haga simulaciones a diferentes voltajes para obtener datos de Q y la constante de tiempo en
función del voltaje.
Empiece con V = -10 y estado inicial = 0 y delta t = 0.5 ms.. Aumente el voltaje de 10 en
10 mV hasta encontrar un máximo de Q. Cambie a un delta de 0.1 ms a medida que el
proceso se hace más rápido para obtener buenos ajustes exponenciales.
Explore potenciales menores que -10mV, hasta -60 mV. Cambie el estado inicial de los
sensores a 1, para potenciales a los que no se registra corriente cuando el estado inicial es
cero.
Construya una tabla de tres columnas, V, m() y m. Los datos de esta tabla los usará en el
próximo programa.
Corrientes iónicas.
CanalesIn.xls es el programa Excel para las simulaciones de corrientes macroscópicas.
Este programa funciona con macros y se deben aceptar al momento de abrir el
programa.
La hoja se recalcula al apretar la tecla F9, no se recalcula automáticamente.
Algunas celdas pueden estar protegidas u ocultas.
Este programa contiene cuatro hojas de cálculo: Simulador, Análisis del ruido, Corriente
iónica y Resultados.
Copie en las celdas F3 y F4 de la hoja la hoja Análisis del ruido los valores de Vi y g
determinados por los experimentos con canal único.
Copie la tabla de m() y m, determinada en los experimentos de gating currents, en la hoja
Corriente iónica.
En la hoja Simulador:
La celda B2 contiene el potencial de la membrana
La celda B4 el intervalo de tiempo apara la simulación.
La celda B5 el estado inicial de los sensores y la compuerta de inactivación.



Para hacer una simulación defina el potencial en B2 y use el Macro Ctrl. s
Para borrar el resultado use el Macro Ctrl. x.
Para promediar 10 repeticiones use el Macro Ctrl. S.
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

9
Para simular una membrana con N canales use el Macro Ctrl. d.
Para transferir los datos a las hojas Análisis del ruido y Corriente iónica use el
macro Ctrl. t.
En la columna J se anota la corriente en pA para cada iteración. Columna L contiene el
promedio de la corriente para el caso de 1 o 10 repeticiones en una membrana con 1 canal,
o la corriente total para el caso de una simulación de una membrana con muchos canales.
La columna M la varianza de la corriente.
Haga su primera simulación a V = 90 mV, delta t = 0.5 ms y condición inicial = 0. Simule
una membrana con N canales usando el macro Ctrl. d. Un vez que la simulación termine
transfiera los datos a las hojas de los ajustes usando el macro Ctrl. t.
Determinación del número de canales, la corriente unitaria y la probabilidad máxima
de encontrar los canales abiertos.
La Hoja Análisis del ruido está preparada para buscar usando Solver los parámetros de la
parábola que describe la varianza de la corriente en función de la corriente promedio. La
celda a minimizar es la D8, ajustando los parámetros a, b y c de la parábola y = ax2 + bx +
c.
Una vez encontrada la parábola el programa calcula la corriente unitaria, i, y el número
de canales, N. Ver ecuación 26 de la Guia 1
A partir de la corriente unitaria y conociendo el potencial de la membrana, V, y el
potencial de inversión de la corriente, Vi, puede calcular la conductancia unitaria del canal,
g, a partir de la corriente unitaria.
Calcule la fracción de canales que estuvo abierto en el pico la corriente, P(max), dividiendo
el valor máximo registrado de la corriente por el producto de la corriente unitaria y el
número de canales.
Estudio de la inactivación.
La Hoja Corriente iónica está preparada para buscar usando Solver los parámetros que
describen el curso temporal de la corriente, ecuaciones 1, 5 y 8. Para un experimento en que
las acondiciones iniciales son m = 0, h = 1 y condición final h = 0 la ecuación 1 queda así,
introduciendo las ecuaciones 5 y 8.


i (t )  Ng m()(1  e t /  m ) e t /  h (V  Vi )
3
De los resultados de los experimentos anteriores ya sabemos Vi, N, g, más m() y m para
el voltaje V. Sólo falta encontrar h usando Solver ajustando la celda C7 para encontrar el
mínimo para la celda D8.
Los resultados de las dos hojas de ajustes se pueden transferir a la hoja Resultados usando
el macro Ctrl. R.

Repita el experimento a diferentes potenciales para encontrar cómo cambia h en
función del voltaje.