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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 01 Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) Detección del Virus de la Mionecrosis Infecciosa. Para uso exclusivo In-Vitro Material incluido, no contagioso. Manual Instructivo Manufacturer: Farming IntelliGene Tech. Corp. NO.2-1, 7th Rd., Taichung Industry Park, Taichung 407, Taiwan TEL: 886-4-23580768 FAX: 886-4-23580769 E-mail: dahang@ms9.hinet.net http://www.iq2000kit.com ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 1de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 Contenido I. Introducción II. Componentes del sistema Extracción de los reactivos de ADN kit de amplificación de IHHNV III. Equipo y reactivos requeridos IV. Detección y sensibilidad V. Preparación de Muestra y extracción de ADN Procedimiento de extracción de ADN, DTAB-CTAB ADN extraído por Buffer de Lisis Disolución de ADN VI. Protocolo de reacción del kit de amplificación Preparación de reacción Condición de reactivo Procedimiento de reacción VII. Electroforesis Preparación del Gel de Agarosa Electroforesis Gel colorante y contenido de datos VIII. Diagnostico IX. Solución de problemas X. Referencias ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 2 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 2de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 I. Introducción El Virus de la Mionecrosis Infecciosa (IMNV), tuvo su primera aparición en el Estado de Piauí, Brasil, en septiembre de 2002. Y no fue sino hasta febrero de 2004, que el Dr. Donald V. Lightner, de la Universidad de Arizona, US, confirmó oficialmente el descubrimiento del nuevo virus. El descubrimiento tardío y la falta de información sobre su patología causaron severos daños a la industria camaronícola brasileña. En 2003, la pérdida en producción fue estimada alrededor de $20 millones USD en cultivos de L. vannamei, un inesperado impacto para el sector. El “Virus Zombi”, un apodo dado por los granjeros, es de aún origen desconocido. El virus presenta ARN en su genoma y pertenece a la familia Totiviridae. Los síntomas típicos son necrosis del abdomen y céfalo-tórax, pérdida en el volumen del hepatopáncreas, pérdida de transparencia y coloración alrededor de la cola, una apariencia de camarón cocido, etc. La mortalidad puede ocurrir en cualquier ciclo de la vida del camarón, y la tasa se puede incrementar cuando el camarón pasa de los 6 grs., la cual coincide con el alto consumo en su ración de comida, causando grandes pérdidas en recursos y alimento. La ruta de transmisión del IMNV está aún bajo investigación, y la causa real de la muerte es también un misterio. En cooperación con el equipo de investigación guiado por el Dr. Donald V. Lightner, Farming IntelliGene Tech Corp., han credo un sistema de detección altamente preciso para IMNV, un nuevo producto en la detección viral IQ2000TM. Ha heredado todas las características de las series IQ2000TM, tales como un control interno y diseño semi-cuantitativo. El primer diseño elimina la posibilidad de falsos negativos, y el segundo mide el grado de infección. ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 3 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 3de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 II. Componentes del Sistema ٭Premezcla RT-PCR 1. 4 viales 420 μL/vial Incluye: Buffer de reacción, dNTPs y primers específicos de IMNV ٭Premezcla de PCR Anidado 2. 4 viales 840 μL/vial Incluye: Buffer de reacción, dNTPs y primers específicos de IMNV ٭Plásmido Control P(+) 3. 1 vial 100 μL/vial Incluye: 104 copias/μL de plásmidos con una secuencia parcial de IMNV 4. ٭tRNA de levadura (40 ng/μL) 1 vial 500 μL/vial 5. ٭IQ enzima ADN polimerasa (2U/μL) 1 vial 360 μL/vial 6. ٭Mezcla de enzima RT 1 vial 120 μL/vial 7. ☼ Tinte de carga 6X 1 vial 1500 μL/vial 8. ☼ Marcador de peso molecular 1 vial 100 μL/vial 9. ٭ 10. ♦ Solución de extracción de ARN DEPC ddH2O 100 mL/frasco 100 mL/frasco Instrucciones de Almacenamiento: ☼ Almacenar a temperatura ambiente ♦ Almacenar a 4ºC ٭Almacenar a -20ºC ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 4 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 4de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 III. Equipo y reactivos requeridos (no incluidos) 1. Termociclador 2. Micro centrífuga de alta velocidad (12000 rpm, d=5 a 8 cm) 3. Aparato de electroforesis 4. Transluminador UV 5. Mezclador Vortex 6. Termo block 7. Micro pipeta 8. Cámara Polaroid o sistema de foto digital. 9. Cloroformo 10. Etanol al 95% 11. Bromuro de Etidio 12. Buffer de electroforesis TAE o TBE 13. Agarosa 14. Isopropanol (2-propanol) ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 5 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 5de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 IV. Limite de detección y sensibilidad Este sistema de detección genera diferentes límites de detección y niveles de sensibilidad de acuerdo a las diferentes fuentes de la muestra sometida a prueba. En el cuadro siguiente se muestra la lista analizada. La siguiente tabla lista algunas muestras comunes. Basado en el conocimiento de la distribución viral en el camarón, se recomiendan muestras de músculo y hepatopáncreas de juveniles y adultos para su escaneo. ESPECIMEN Plasmido de CANTIDAD LIMITE DE EQUIVALENTE DE LA DETECCIÓN DE PRUEBA (COPIAS/REACCION) SENSIBILIDAD 2 copias/ ul de 2 copias 2 ADN IMNV muestra de plásmido 20 copias/µL RNA transcrito 20 copias 20 in vitro RNA transcrito in vitro <PL 12 10 PL´s 20 500 copias/ PL PL 12 a PL 20 5 PL´s 20 1000 copias/PL de >PL 20 a 5 10 a 20 20 2000 gr. piezas Hepatopáncreas ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso copias/muestra 6 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 6de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 Hepatopáncreas 2a3 de 5 gr. a crias piezas Hepatopáncreas Media de crias pieza 20 2000 copias/muestra 20 2000 copias/muestra En base al cuadro anterior, los usuarios tienen que saber que un resultado "negativo" de la prueba indica que la muestra estaba o no infectadas o que el nivel de infectados era Inferior al límite de detección. V. Preparación de muestra y extracción de ARN 1. Procedimiento de extracción de RNA 1.1 Para el pesado de la muestra seguir el PROTOCOLO PARA EXTRACCION DE DNA Y RNA (LASA-EDR-IT-01-00) Coloque la muestra en un tubo de 1.5 mL con 500 μL de solución de extracción de RNA. 1.2. Triture la muestra en el tubo con un moledor desechable, deje a temperatura ambiente por 5 min. 1.3. Agregue 100 μL de CHCl3 y aplique vortex 20 seg. . Déjelo a temperatura ambiente por 3 min. , luego centrifugue a 12000g (12000 rpm r = 6cm) por 15 min. 1.4. Transfiera 200 μL de la fase acuosa clara de arriba a un nuevo tubo de 0.5 mL conteniendo 200 μL de 2-propanol (Isopropanol). 1.5. Aplique un vortex breve, centrifuge a 12000g por 10 min., luego decante el isopropanol. 1.6. Lave el pellet con 0.5 mL de etanol al 75%, luego centrifugue por 5 min. a 7500g (9000 rpm r = 6 cm) para recobrar el RNA del pellet, luego decante el etanol y seque el pellet. 1.7. Disuelva el pellet con ddH2O DEPC. ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 7 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 7de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 2. Disolución de RNA La concentración de RNA es diferente, dependiendo de las distintas fuentes de la muestra, por lo tanto la concentración de debe ser ajustada disolviendo el pellet con el RNA en un volumen diferente de ddH2O DEPC. FUENTE DE LA MUESTRA VI. VOLUMEN PL 500 μL Branquias 200 μL Protocolo de reacción del kit de amplificación Las siguientes condiciones de amplificación aplican para tubos de 0.2 mL de anchura ó placa de 96 pozos. 1. Condiciones de reacción (Uni-IQ Descripción de RT-PCR): a. Descripción de la reacción RT-PCR: 42ºC – 30 min.; 94 ºC – 2 min.; Enseguida 94ºC – 20 seg.; 62ºC – 20 seg.; 72ºC – 30 seg., repita 15 ciclos, luego 72ºC – 30 seg.; 20ºC – 30 seg.; al final del ciclo. b. Descripción de reacción de PCR anidado: 94ºC – 20 seg.; 62ºC – 20 seg.; 72ºC – 30 seg., repita 30 ciclos, luego 72ºC – 30 seg.; 20ºC – 30 seg.; al final del ciclo. 2. Preparación de los reactivos: ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 8 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 8de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 a. Mezcla de reacción RT-PCR: 8 µL/reacción Mezcle lo siguiente: Premezcla RT-PCR 7.0 µL IQ Enzima ADN polimerasa (2U/µL) 0.5 µL Mezcla de Enzima RT 0.5 µL b. Mezcla de reacción de PCR anidado : 15 µL/reacción Mezcle lo siguiente: Premezcla de PCR anidado 14 µL IQ Enzima ADN polimerasa (2U/ µL) 1 µL 3. Procedimiento de reacción: Pipetee 8 µL de mezcla de reacción RT-PCR en cada tubo de reacción de 0.2 mL con su respectiva etiqueta. Agregue 2 µL de RNA muestra extraída ó estándar* en cada mezcla de reacción. Realice la reacción RT-PCR Agregue 15 µL de mezcla de reacción PCR anidado a cada tubo, después de haber completado la reacción RT-PCR. Realice la reacción de PCR anidado. ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 9 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 9de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 Después de completar la reacción de PCR anidado, agregue 5 µL de tinte de carga 6X a cada tubo de reacción y mezcle bien. Después de mezclar, la muestra está lista para electroforesis. * Un estándar de 10 copias/µL es muy recomendable para cada experimento, para monitorear la sensibilidad de las reacciones. También recomendamos tRNA de levadura para ser usado como diluyente para estándares positivos. Bajo ésta condición, el estándar puede ser mantenido a -20ºC por una semana. VII. Electroforesis 1. Preparación del gel de agarosa Primero, decida el buffer de electroforesis entre TAE y TBE. Luego, diluya el buffer a una concentración 1X para procesar la electroforesis y producir el gel de agarosa. Note que el buffer para procesar la electroforesis y producir el gel debe ser del mismo. Se recomienda un gel de agarosa al 2% para la electroforesis. Para preparar el gel al 2%, agregue 2 gr. de agarosa a una botella ó frasco de boca ancha con 100 mL de buffer. ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 10 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 10de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 Caliente la mezcla hasta volverse hialina sin ninguna partícula de gel. El calentamiento se puede hacer usando un mechero de gas ó placa de calentamiento, incluso puede usarse un horno de microondas. Para evitar el derramamiento, se recomienda un contenedor más grande (el doble del volumen de la solución). Dejar enfriar el gel a temperatura ambiente, hasta que llegue alrededor de los 50ºC y lentamente vacíe el gel en la caja para geles. El volumen del gel varía dependiendo del tamaño de la caja. La altura del gel de agarosa solamente tiene que estar por encima del fondo del peine del gel de 0.3 a 0.5 cm., y se sugiere que el ancho sea menor de 0.8 cm. Cuidadosamente remueva el peine plástico y tapaderas de ambos lados de la caja, cuando el gel esté completamente coagulado. El gel está ya listo para electroforesis. El gel terminado no debe ser expuesto a temperatura ambiente por más de 4 horas. 2. Electroforesis Coloque el gel de agarosa coagulado dentro de la caja. El ADN de peso molecular caminará hacia delante (+), ya que el ADN está cargado negativamente. Agregue buffer de electroforesis a 1X dentro de la caja, hasta que cubra ligeramente el gel. Cargue 5 µL del producto de PCR a cada pozo. La mezcla se irá al fondo del pozo, por que su densidad es más alta que el buffer. Este paso debe manejarse cuidadosamente para evitar contaminación. ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 11 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 11de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 Se requiere un marcador de ADN para cada electroforesis. Se recomienda alrededor de 5 µL de marcador de ADN. El marcador de peso molecular sirve como referencia para saber el tamaño del producto de PCR. Cuando todas las muestras sean cargadas, conecte la corriente de la caja del gel antes de encenderla. Se recomienda un voltaje constante entre 100V- 150V en la electroforesis (NO CORRA LA MUESTRA A MAS DE 150 VOLTS). El tinte de carga del kit contiene 2 colorantes: EL azul de bromo fenol da un color azul subido; el cyanol de xileno da un color azul suave. Cuando el azul oscuro se aproxima de ½ a 2/3 del gel, detenga la electroforesis. Luego remueva el gel de la caja para proceder con la tinción con bromuro de etidio. Para evitar contaminación, no use de nuevo el buffer de electroforesis, a menos que se usen varios geles ese mismo día. Cuando termine la electroforesis, lave la caja del gel con bastante agua. 3. Tinción del gel e Interpretación de datos El Bromuro de Etidio (EtBr), generalmente se prepara para un stock de 10 mg/mL. ésta solución debe ser almacenada en un frasco ámbar, ya que el EtBr es un químico que se degrada si es expuesto a la luz. Note que el EtBr es un carcinógeno conocido, se recomienda el uso de traje protector, guantes y lentes. ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 12 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 12de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 Diluya la solución stock 10 mg/mL 20,000 veces (Ej. Agregue 5 µL de la solución stock a 100 mL de agua destilada para preparar la solución de tinción). Vacíe la solución de tinción en una bandeja de plástico ó bolsa de cierre con el gel de electroforesis terminado. La solución debe cubrir todo el gel. Deje a temperatura ambiente por 10 min. Luego, destiña el gel en otra bandeja de plástico con agua destilada por otros 10 min. para eliminar residuos. Coloque el gel en un transiluminador UV para leer el resultado final. VIII. Diagnóstico 1. Los estándares y muestras positivas mostrarán los siguientes patrones en el gel: ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 13 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 13de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 Carril 1: Plásmido de ADN estándar IMNV, 2000 copias/reacción Carril 2: Plásmido de ADN estándar IMNV, 200 copias/reacción Carril 3: Plásmido de ADN estándar IMNV, 20 copias/reacción Carril 4: Control Negativo (tARN de Levadura ó ddH2O) Carril 5: Muestra con infección severa por IMNV Carril 6: Muestra con infección ligera por IMNV Carril 7: Muestra negativa de IMNV Carril M: Marcador de peso molecular, 848 pb, 630 pb, 333 pb 2. Las muestras negativas mostrarán solamente una banda a las 680 pb, el cual es un producto de un control interno, mARN para ß-actina de camarón peneido. 3. Procedimiento de diagnóstico: a. Banda formada a las 255 pb y 510 pb: Severa IMNV P (+) b. Banda formada solamente a las 255 pb: Ligera IMNVN P (+) 4. Cada experimento requiere controles positivos y negativos. Si el control de ADN plásmido de 101 no produjo una banda en las 255 pb, significa que la reacción de PCR ha fallado ó la sensibilidad del sistema no está por arriba del estándar. Por otro lado, si el resultado del control negativo muestra una banda a las 255 pb, significa que se ha contaminado la muestra. IX. Solución de problemas ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 14 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 14de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 Problema o síntoma Posibles causas Recomendaciones 1. EtBr Degradadas Banda tenue o Ninguna banda después de la coloración 2. No prende la luz UV 3. Fondo demasiado fuerte 4. El gel de agarosa es demasiado grueso El estándar positivo muestra bandas normales, pero no mostrar el marcador El marcador fue degradado o tiene baja carga. 1. RT y/o PCR fallado El marcador muestra bandas normales, pero p(+) no tiene banda. Muestra banda alta P(+) (103), pero la baja positiva no tiene banda. El Control negativo (-) muestra banda positiva ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 2. La enzima no fue agregada. 3. P(+) fue degradada. 1. P (+) fue degradado. 2. El estándar 104 fue degradado. 3. Baja actividad de la enzima. 1. Contaminación micro pipeta. 2. Contaminación del reactivo. 3. Contaminación Lab. 15 APROBADO POR: Responsable de área 1. Preparar nuevo EtBr o extender el tiempo de coloración 2. Checar la tabla de UV 3. Remojar el gel en agua limpia a 4°C por otros 30 minutos 4. Checar si el espesor del gel es más de 0,8cm. Preparar un gel más delgado y ejecutar la electroforesis. Cambiar el marcador, o incrementar el volumen de carga. 1. Comprobar el registro de preparación de la mezcla de reactivos y el perfil del ciclo de PCR. 2. Agregar enzima. 3. Preparar nueva P(+). 1. Preparar nuevas P (+) 2. Sustituir 104 estándar 3. Compruebe la fecha de caducidad y condiciones de almacenamiento de la enzima, o sustituir enzima. 1. Desmontar la pipeta y hacerle limpieza, se recomienda el uso de aerosoles libres de punta. Se recomienda utilizar una pipeta diferente para el procedimiento de PCR. Producto de pipeteado 2. Usar reactivos abiertos, una vez más INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 15de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 Muestra control de banda normal P(+) y N (-), pero la muestra conocida no tiene banda. ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 1. Extracción de ARN fallida. 2. Mala calidad de ARN o concentración muy alta de ADN. 3. Inhibidor de PCR. 16 APROBADO POR: Responsable de área 3. Consulte con Farming Intelligene para la limpieza del equipo. 1. Checar el procedimiento de extracción de ARN. 2. Checar el rango de OD 260/280, normalmente esta ración debe ser de 1.6 a 1.8. 3. Reacción de PCR Spike 10³ P(+)estándar para un paralelo. Si la primera es con10³ mostrando una banda normal. Entonces la inhibición esta fuera de lugar. Si con P (+)10³ no tiene banda, entonces hay inhibición. 4. Los usuarios necesitan preparar otra extracción de ARN. INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 16de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 17 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 17de 18 INSTITUTO TECNOLÓGICO DE SONORA Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM IMNV LASA-POP-PD-02-0 00 X. Referencias: 1. Lightner, D. V., Pantoja, C. R., Poulos, B. T., Tang, K.F.J., Redman, R.M., Andreas, T., Bonami, J. R. “Infectious Myonecrosis (IMN): A new virus disease of L. vannamei”. World Aquaculture Society 2004. Honolulu, Hawaii, USA (March 2004): 353, Abstract. Aquaculture 2004 Abstract on CD-ROM. 2. Nunes, Alberto J. P., Cunha Martins, Pedro Carlos, y Vasconcelos Gesteira Tereza Cristina. “Carcinicultura Ameacada: Productores sofreí com as mortalidades decurrentes do virus da Mionecrose Infecciosa (IMNV)”. Panorama de Acuicultura May/June: 2004. ELABORADO, REVISADO Y ACTUALIZADO POR: Dueño del Proceso 18 APROBADO POR: Responsable de área INICIO DE VIGENCIA: 22 de Junio de 2009 PÁGINA: Página 18de 18