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Sistema de Detección y Prevención IQ2000TM YHV/GAV
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Sistema de Detección y Prevención
IQ2000TM YHV/GAV
Yellow Head Virus/Gill Associated Virus
(YHV/GAV)
Virus de la Cabeza Amarilla/Virus Asociado
al Hepatopáncreas (YHV/GAV)
Para uso exclusivo In-Vitro
Material incluido, no contagioso.
Manual Instructivo
* Patent Pending for R.O.C., U.S.A., Japan, P.R.C., Thailand, and Europe
Manufacturer:
Farming IntelliGene Tech. Corp.
NO.2-1, 7th Rd., Taichung Industry Park, Taichung 407, Taiwan
TEL: 886-4-23580768 FAX: 886-4-23580769
E-mail: dahang@ms9.hinet.net http://www.iq2000kit.com
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Contenido
I.
Introducción
II.
Componentes del sistema
1.
Solución de extracción de ARN
2.
Kit de amplificación de secuencias especificas de YHV/GAV
III.
Equipo y reactivos requeridos
IV.
Límite de detección y sensibilidad
V.
Preparación de Muestra y extracción de ARN
1.
Procedimiento de extracción de ARN
2.
Disolución de ARN
VI.
Protocolo de reacción del kit de amplificación
1.
Preparación de reactivos
2.
Condición de reacción
3.
Procedimiento de reacción
VII.
Electroforesis
1.
Preparación del Gel de Agarosa
2.
Electroforesis
3.
Gel colorante y análisis de datos
VIII.
Diagnostico
IX.
Solución de problemas
X.
Referencias
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I. Introducción
El virus de la cabeza amarilla (YHV) fue descubierto por primera vez en
Tailandia en 1992 en crías de camarón Tigre (Penaeus monodon), se pensó y
hoy es sabido que causó pérdidas masivas en la costa Este del Golfo de
Tailandia a principios de 1991(Flegel et al. 1995). Esta enfermedad afecta
desde juveniles hasta crías sub-adultas y usualmente se caracteriza por una
coloración pálida ó amarillenta del céfalo-tórax y hepatopáncreas, y un nado
errático del animal cerca de las orillas del estanque. El virus asociado al
hepatopáncreas (GAV), se asemeja morfológicamente al YHV, se ha reportado
también en Penaeus monodon en Australia, y ha sido asociado con brotes
esporádicos de la enfermedad desde 1996 (Spann et al. 1997).
La detección de YHV/GAV del IQ2000TM y el sistema de tipos para
camarones peneidos es un sistema de biología molecular comercializado para
la detección directa de éstos dos virus similares. Puede detectar y diferenciar el
prototipo de estos dos virus y dar resultados semi-cuantitativos y además del
sistema de control interno. El conocimiento sobre la naturaleza del YHV y GAV
y sus secuencias de ARN, en el cual se basó el sistema, fue desarrollado
originalmente por CSIRO, Australia, y BIOTEC, Tailandia. Se firmó un acuerdo
de licencia en 2001 entre Farming IntelliGene y CSIRO/BIOTEC para
comercializar ésta tecnología y fabricar el sistema de detección (YHV/GAV)
De acuerdo a los recientes resultados de investigaciones, otros virus
YHV/GAV relacionados se han encontrado en algunos países de Asia. Debido
a la carencia de información de secuencias, IQ2000TM el sistema de detección
y tipeo puede no ser capaz de detectar éstos virus YHV/GAV relacionados. El
impacto y severidad de estos virus en granjas de camarón y su relación con
YHV/GAV está aún bajo investigación.
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II. Componentes del Sistema
1. Solución de Extracción de RNA (200 reacciones/kit)
100 mL/btl
Almacenamiento a 4 ºC
DEPC ddH2O
100 mL/btl
Almacenamiento a -20 ºC
2. Kit de amplificación de secuencia específica de YHV/GAV (200
reacciones/kit)
Almacenamiento a -20 ºC
-
4 viales
Premezcla RT-PCR
420 μL/vial
Incluye: Buffer de reacción, dNTPs y primers específicos de YHV/GAV
-
Premezcla de PCR Anidado
4 viales
840 μL/vial
Incluye: Buffer de reacción, dNTPs y primers específicos de YHV/GAV
-
1 vial
YHV P(+) estándar
100 μL/vial
104 copias/μL de plásmidos contienen la secuencia parcial de YHV
-
tRNA de levadura (40 ng/μL)
1 vial
500 μL/vial
-
IQ enzima ADN polimerasa (2U/μL) 1 vial
360 μL/vial
-
Mezcla de enzima RT
1 vial
120 μL/vial
-
Tinte de carga 6X
1 vial
1500 μL/vial
-
Marcador de peso molecular
1 vial
100 μL/vial
848 bp, 630 bp y 333 bp
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III.
Equipo y reactivos requeridos pero no incluidos
1. Termociclador con bloque para tubos de muestras de 0.2 mL de anchura
2. Microcentrífuga de alta velocidad (12000 rpm, d=5 a 8 cm)
3. Aparato para electroforesis
4. Transiluminador UV
5. Mezclador vortex
6. Block para calentamiento
7. Micropipeta
8. Sistema para foto digital ó cámara Polaroid
9. Cloroformo
10. Etanol al 95%
11. Bromuro de Etidio
12. Buffer de electroforesis TAE ó TBE
13. Agarosa
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IV.
Sensibilidad y Límite de detección
Este sistema de detección generará diferentes límites y niveles de
sensibilidad de acuerdo a las diferentes fuentes de las muestras probadas.
La siguiente tabla enlista algunas muestras comunes probadas. Basado en
el conocimiento de la distribución viral en el camarón, las branquias son
altamente recomendadas para las pruebas en camarones juveniles y
adultos.
Espécimen
Cantidad de
Limite de
Equivalente de
prueba
detección
sensibilidad
(copias/reacción)
Plásmido ADN de
2 copias/μL
2
YHV/GAV
RNA transcrito In
2 copias/ μL
plásmido estándar
20 copias
20
vitro
20 copias/ μL RNA
transcrito In vitro
< PL 12
10 PL´s
20
500 copias/PL
PL 12 a PL 20
5 PL´s
20
1000 copias/PL
camarón
Branquias >PL 20
Todas las
20
2000 copias/muestra
a 5g de camarón
branquias
Branquias de
2 a 3 piezas
20
2000 copias/muestra
Media pieza
20
2000 copias/muestra
camarón 5g a
crías
Branquias de crías
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En base a la tabla de arriba, los usuarios deben saber que una prueba
“negativa” indica que el espécimen no está infectado ó que el nivel de infección
es mas bajo que el límite de detección. Todos los resultados de prueba
enlistados en la tabla fueron probados de acuerdo a
procedimientos y
reactivos estándar descritos en éste manual. No garantizamos las extracciones
de RNA mediante otros productos manufacturados.
V.
Preparación de la muestra y extracción de RNA
1. Procedimiento de extracción de RNA
2. Para el pesado de la muestra seguir el PROTOCOLO PARA EXTRACCION DE
DNA Y RNA (LASA-EDR-IT-01-00)
a. Coloque la muestra en un tubo de 1.5 mL con 500 μL de solución de
extracción de RNA.
b. Triture la muestra en el tubo con un moledor desechable, deje a
temperatura ambiente por 5 min.
c. Agregue 100 μL de CHCl3 y aplique vortex 20 seg. . Déjelo a
temperatura ambiente por 3 min. ,
luego centrifugue a 12000g
(12000 rpm r = 6cm) por 15 min.
d. Transfiera 200 μL de la fase acuosa clara de arriba a un nuevo tubo
de 0.5 mL conteniendo 200 μL de 2-propanol (Isopropanol).
e. Aplique un vortex breve, centrifuge a 12000g por 10 min., luego
decante el isopropanol.
f. Lave el pellet con 0.5 mL de etanol al 75%, luego centrifugue por 5
min. a 7500g (9000 rpm r = 6 cm) para recobrar el RNA del pellet,
luego decante el etanol y seque el pellet.
g. Disuelva el pellet con ddH2O DEPC.
3. Disolución de RNA
a. La concentración de RNA es diferente, dependiendo de las distintas
fuentes de la muestra, por lo tanto la concentración de debe ser
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ajustada disolviendo el pellet con el RNA en un volumen diferente de
ddH2O DEPC.
FUENTE DE LA MUESTRA
VOLUMEN
PL
500 μL
Branquias
200 μL
b. Por favor afine el volumen de ddH2O DEPC de acuerdo a la
eficiencia de recuperación real.
VI.
Protocolo de amplificación
Las siguientes condiciones de amplificación aplican para tubos de 0.2 mL
de anchura ó placa de 96 pozos.
1. Preparación de los reactivos:
a. Mezcla de reacción RT-PCR: 8 µL/reacción
Mezcle lo siguiente:
Premezcla RT-PCR
7.0 µL
IQ Enzima ADN polimerasa (2U/µL)
0.5 µL
Mezcla de Enzima RT
0.5 µL
b. Mezcla de reacción de PCR anidado : 15 µL/reacción
Mezcle lo siguiente:
Premezcla de PCR anidado
IQ Enzima ADN polimerasa (2U/ µL)
14 µL
1 µL
2. Condiciones de reacción (Uni-IQ Descripción de RT-PCR):
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a. Descripción de la reacción RT-PCR:
42ºC – 30 min.; 94 ºC – 2 min.; Enseguida
94ºC – 20 seg.; 62ºC – 20 seg.; 72ºC – 30 seg., repita 15 ciclos, luego
72ºC – 30 seg.; 20ºC – 30 seg.; al final del ciclo.
b. Descripción de reacción de PCR anidado:
94ºC – 20 seg.; 62ºC – 20 seg.; 72ºC – 30 seg., repita 30 ciclos, luego
72ºC – 30 seg.; 20ºC – 30 seg.; al final del ciclo.
3. Procedimiento de reacción:
a. Prepare las mezclas de reacción RT-PCR y PCR anidado requeridas de
acuerdo al número de muestras. Para cada preparación de mezcla de
reacción, el usuario necesita también llevar un conteo de 3 estándares
positivos (103, 102 y 101) y 1 control negativo (ddH2O ó tRNA de
levadura)
b. Pipetee 8 µL de mezcla de reacción RT-PCR en cada tubo de reacción
de 0.2 mL con su respectiva etiqueta.
c. Agregue 2 µL de RNA muestra extraída ó estándar* en cada mezcla de
reacción.
d. Realice la reacción RT-PCR
e. Agregue 15 µL de mezcla de reacción PCR anidado a cada tubo,
después de haber completado la reacción RT-PCR.
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f. Realice la reacción de PCR anidado.
g. Después de completar la reacción de PCR anidado, agregue 5 µL de
tinte de carga 6X a cada tubo de reacción y mezcle bien.
h. Después de mezclar, la muestra está lista para electroforesis.
* Un estándar de 10 copias/µL es muy recomendable para cada experimento,
para monitorear la sensibilidad de las reacciones. También recomendamos
tRNA de levadura para ser usado como diluyente para estándares positivos.
Bajo ésta condición, el estándar puede ser mantenido a -20ºC por una
semana.
VII.
Electroforesis
1. Preparación del gel de agarosa
a. Primero, decida el buffer de electroforesis entre TAE y TBE. Luego,
diluya el buffer a una concentración 1X para procesar la electroforesis y
producir el gel de agarosa. Note que el buffer para procesar la
electroforesis y producir el gel debe ser del mismo.
b. Se recomienda un gel de agarosa al 2% para la electroforesis. Para
preparar el gel al 2%, agregue 2 gr. de agarosa a una botella ó frasco de
boca ancha con 100 mL de buffer.
c. Caliente la mezcla hasta volverse hialina sin ninguna partícula de gel. El
calentamiento se puede hacer usando un mechero de gas ó placa de
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calentamiento, incluso puede usarse un horno de microondas. Para
evitar el derramamiento, se recomienda un contenedor más grande (el
doble del volumen de la solución).
d. Dejar enfriar el gel a temperatura ambiente, hasta que llegue alrededor
de los 50ºC y lentamente vacíe el gel en la caja para geles. El volumen
del gel varía dependiendo del tamaño de la caja. La altura del gel de
agarosa solamente tiene que estar por encima del fondo del peine del
gel de 0.3 a 0.5 cm., y se sugiere que el ancho sea menor de 0.8 cm.
e. Cuidadosamente remueva el peine plástico y tapaderas de ambos lados
de la caja, cuando el gel esté completamente coagulado. El gel está ya
listo para electroforesis. El gel terminado no debe ser expuesto a
temperatura ambiente por más de 4 horas.
2. Electroforesis
a. Coloque el gel de agarosa coagulado dentro de la caja. El ADN de peso
molecular caminará hacia delante (+), ya que el ADN está cargado
negativamente.
b. Agregue buffer de electroforesis a 1X dentro de la caja, hasta que
ligeramente cubra el gel.
c. Cargue 5 µL del producto de PCR a cada pozo. La mezcla se irá al
fondo del pozo, por que su densidad es más alta que el buffer. Este paso
debe manejarse cuidadosamente para evitar contaminación.
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d. Se requiere un marcador de ADN para cada electroforesis. Se
recomienda alrededor de 5 µL de marcador de ADN. El marcador de
peso molecular sirve como referencia para saber el tamaño del producto
de PCR.
e. Cuando todas las muestras sean cargadas, conecte la corriente de la
caja del gel antes de encenderla. Se recomienda un voltaje constante
entre 100V- 150V en la electroforesis.
f. El tinte de carga del kit contiene 2 colorantes: EL azul de bromo fenol da
un color azul subido; el cyanol de xileno da un color azul suave. Cuando
el azul oscuro se aproxima de ½ a 2/3 del gel, detenga la electroforesis.
Luego remueva el gel de la caja para proceder con la tinción con
bromuro de etidio.
g. Para evitar contaminación, no use de nuevo el buffer de electroforesis, a
menos que se usen varios geles ese mismo día. Cuando termine la
electroforesis, lave la caja del gel con bastante agua.
3. Tinción del gel y ensayo de datos
a. El Bromuro de Etidio (EtBr), generalmente se prepara para un stock de
10 mg/mL. ésta solución debe ser almacenada en un frasco ámbar, ya
que el EtBr es un químico que se degrada si es expuesto a la luz. Note
que el EtBr es carcinógeno, se recomienda el uso de traje protector,
guantes y lentes.
b. Diluya la solución stock 10 mg/mL 20,000 veces (Ej. Agregue 5 µL de la
solución stock a 100 mL de agua destilada para preparar la solución de
tinción).
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c. Vacíe la solución de tinción en una bandeja de plástico ó bolsa de cierre
con el gel de electroforesis terminado. La solución debe cubrir todo el
gel.
d. Sacuda ligeramente a temperatura ambiente por 10 min. Luego, destiña
el gel en otra bandeja de plástico con agua destilada por otros 10 min.
para eliminar residuos.
e. Coloque el gel en un transiluminador UV para leer el resultado final.
VIII. Diagnóstico
1. Los estándares y muestras positivas mostrarán los siguientes patrones
en el gel:
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Carril 1: YHV P (+) estándar, 2000 copias/reacción
Carril 2: YHV P (+) estándar, 200 copias/reacción
Carril 3: YHV P (+) estándar, 20 copias/reacción
Carril 4: GAV P (+) estándar, 2000 copias/reacción
Carril 5: GAV P (+) estándar, 200 copias/reacción
Carril 6: GAV P (+) estándar, 20 copias/reacción
Carril 7: Muestra con infección severa por YHV
Carril 8: Muestra con infección ligera por YHV
Carril 9: Muestra con infección severa por GAV
Carril 10: Muestra con infección ligera por GAV
Carril 11: Muestra negativa de YHV/GAV
Carril M: Marcador de peso molecular, 848 pb, 630 pb, 333 pb
2. Las muestras negativas mostrarán solamente una banda a las 680 pb, el
cual es un producto de un gen de mantenimiento, mRNA de ß-actina de
camarón peneido.
3. Procedimiento de diagnóstico:
a. Banda formada a las 277 pb y/o 777 pb: YHV P (+)
b. Banda formada a las 406 pb y/o 777 pb: GAV P (+)
c. Banda formada solamente a las 680 pb: N (-)
4. Cada experimento requiere controles positivos y negativos. Si el
estándar positivo de 103 no produjo una banda en las 277 ó 406 pb,
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significa que hubo una falla en la reacción RT ó PCR ó el estándar
positivo se degradó. Por otro lado, si el resultado del control negativo
muestra una banda a las 277 ó 406 pb, significa que se ha contaminado
la muestra.
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IX. Solución de problemas
Problema o síntoma
Posibles causas
1. EtBr Degradado
Banda tenue o Ninguna
banda después de la
coloración
2. No prendió la luz UV
3. Fondo demasiado
fuerte
4. El gel de agarosa es
demasiado grueso
El estándar positivo
muestra bandas
normales, pero no se
muestra el marcador
molecular
El marcador muestra
bandas normales, pero
el P (+) no tiene banda.
Muestra banda alta P(+)
(103), pero la baja
positiva no tiene banda.
El Control negativo (-),
muestra una banda
positiva.
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El marcador fue
degradado o tiene baja
carga.
Recomendaciones
1. Preparar nuevo EtBr
o extender el tiempo
de coloración
2. Checar el
transiluminador de
UV
3. Remojar el gel en
agua limpia a 4°C
por otros 30 minutos
4. Checar si el espesor
del gel. Si es más de
0,8 cm, preparar un
gel más delgado y
ejecutar la
electroforesis.
Cambiar el marcador, o
incrementar el volumen
de carga.
1. Comprobar la bitácora
de preparación de la
2. La enzima no fue
mezcla de reactivos y el
agregada.
perfil del ciclo de PCR.
3. P (+) fue degradada.
2. Agregar enzima.
3. Preparar nueva P (+).
1. P (+) fue degradado.
1. Preparar nuevos P (+)
2. La disolución P (+) se 2. Preparar nuevos P (+)
hizo mediante el uso de usando tRNA como
H2O en lugar de la del
diluyente.
tRNA.
3. Sustituir los
3. Los estándares 103
estándares 103
fueron degradada.
4. Compruebe la fecha
4. Baja actividad de la
de caducidad y
enzima.
condiciones de
almacenamiento
de la enzima, o sustituir
enzima.
1. Contaminación micro
1. Desmontar la pipeta y
pipeta.
hacerle limpieza, se
2. Contaminación del
recomienda el uso de
reactivo.
aerosoles libres de
3. Contaminación del
punta. Se recomienda
1. PCR fallado
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Lab.
Muestra bandeo de
control normal P(+) y
N (-), pero la muestra
conocida infectada no
muestra banda
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1. Extracción de ARN
fallida.
2. Mala calidad de ARN
o concentración muy
alta de ARN.
3. Inhibidor de PCR.
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utilizar una pipeta
diferente para el
procedimiento de PCR.
2. Reemplazar el
reactivo
3. Consulte con Farming
Intelligene para la
limpieza del equipo.
1. Checar el
procedimiento de
extracción de
ARN.
2. Checar el rango
de OD 260/280,
normalmente éste
rango debe ser
de 1.8 a 2.0.
3. El estándar
espiga de la
reacción de PCR
10³ P(+).
para un paralelo.
Si la primera es
con10³
mostrando una
banda normal,
entonces la
inhibición esta
fuera de lugar.
Si es con 10³ y
no tiene banda,
entonces hay
inhibición.
4. Los usuarios
necesitan
preparar otra
extracción de
ARN.
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X. Referencias
1. E. Cesar B. Nadala Jr, Lourdes M. Tapay, Philip C. Loh (1997). Yellowhead virus: a rhabdovirus-like pathogen of penaeid shrimp. Dis Aquat
Org Vol. 31: 141-146.
2. Chainarong Wongteerasupaya, Wansika Tongchuea, Vichai Boonsaeng,
Sakol Panyim, Anchalee Tassanakajon, Boonsirm Withyachumnarnkul, T.
W. Flegel (1997). Detection of Yellow-head virus (YHV) of Penaeus
Monodon by RT-PCR amplification. Dis Aquat Org 31: 181-186.
3. Jeff A. Cowley, Christine M. Dimmock, Chainarong Wongteerasupaya,
Vichai Boonsaeng, Sakol Panyim, Peter J. Walker (1999). Yellow head
virus from Thailand and gill associated virus from Australia are closely
related but distinct prawn viruses. Dis Aquat Org 36: 153-157.
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