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Datos Generales
Nombre del Detección molecular de comunidades microbiológicas en agua de consumo
humano en el municipio de Sincelejo-sucre (Colombia)
Proyecto
Semillero
BIOMEDICAS
Área del
Proyecto
Ciencias Biológicas y del Mar
Subárea del
Biología General
Proyecto
Tipo de
Proyecto
Proyecto de Investigación
Subtipo de
Proyecto
Investigación en Curso
Grado
10
Programa
Académico
Biología
Email
pedro.blanco@unisucre.edu.co
Teléfono
3006685357
Nodo
Sucre
Integrantes :
Este proyecto no tiene integrantes
Instituciones a las que pertenece :
[8922003239-UNIVERSIDAD DE SUCRE]
Datos Específicos del Proyecto
Introducción
En los últimos años ha aumentado el número de brotes infecciosos relacionados con el agua,
renovando así el interés en los microorganismos (bacterias, virus, protozoos y helmintos) que
puedan considerarse como una amenaza a la salud pública. Cabe resaltar que la mayoría de las
infecciones de origen hídrico están relacionadas con microorganismos emergentes y
reemergentes, estas infecciones tienen una distribución mundial y se pueden encontrar tanto en
países desarrollados como en países en desarrollo. El aumento de estos microorganismos se
deben a múltiples factores como lo son los cambios drásticos en el ambiente y en la población
(Galván, a. 2013). En diversos estudios realizados, se han encontrado múltiples especies de
microorganismos de distintos géneros, siendo protozoarios del género Giardia spp. y
Cryptosporidium spp los de mayor importancia en salud pública, debido a que poseen una
estructura quística que los protege de las condiciones ambientales, los hace resistente a la
desecación, a la carencia de nutrientes, escasez de oxígeno, a la respuesta inmune del huésped y
a los procesos de desinfección en plantas de tratamiento de aguas (Alarcón 2005). En el agua
también se pueden encontrar una gran variedad de bacterias como lo son Salmonella, Vibrio y
Shigella, las cuales pueden llegar a producir desde una gastroenteritis aguda hasta una fiebre
tifoidea. Muchas veces la detección e identificación de estos microrganismos, en especial los
protozoario, se hacen difíciles por los costos de las técnicas empleadas; por esta razón las
técnicas moleculares se convierten en una alternativa por su alta sensibilidad y especificidad, y
el relativo bajo costo.
Planteamiento del Problema
El agua se caracteriza por ser indispensable para la vida, por lo tanto se hace necesario poner a
disposición de los consumidores un abastecimiento seguro y satisfactorio, disminuyendo los
riesgos por agentes biológicos (bacterias, virus y protozoarios), para esto se utilizan plantas de
tratamiento con las cuales se busca eliminar todos aquellos agentes patógenos que puedan
causar alguna enfermedad a aquellas personas que la consuma. Aunque el agua sea tratada,
algunos de estos microorganismos pueden resistir los procesos químicos empleados en la
desinfección del agua, además que durante su distribución esta también puede contaminarse
antes de llegar al grifo de sus consumidores, a través depósitos de servicios, conexiones
cruzadas o reparaciones incorrectas . En el agua pueden existir diversos microorganismos que
pueden llegar a considerarse como una amenaza a la salud pública; los virus entéricos, bacterias
y protozoarios son los principales causantes de brotes de enfermedad diarreica aguda (EDA),
hepatitis A, meningitis aséptica, entre otras, alrededor del mundo (Espigares M., 2006).El
principal riesgo para la salud humana relacionada con el agua lo constituye la transmisión de
enfermedades infecciosas asociada a la contaminación microbiana derivada de las heces tanto
del hombre como de animales. (Marshall et al 1997). A nivel mundial se han reportado más de
700 millones de casos de enfermedad diarreica aguda en niños menores de cinco años
(Gutiérrez M.F. et al., 2005). En Colombia para el departamento de Sucre el sistema de
vigilancia en salud pública (SIVIGILA), ha notificado casos relacionados con enfermedades
transmitidas por alimentos o agua (ETA) en los últimos años. En este departamento, el
municipio de Sincelejo es uno de los que se encuentra entre los municipios que consumen agua
con bajo riesgo de contraer enfermedades, sin embargo este es uno de los que más casos ha
reportado al Sivigila por ETA. En el año 2014 se reportaron 130 casos por ETA, en el 2015 para
Sincelejo se ha reportado 157 casos y en lo que va corrido del año 2016 se han reportado 12
casos por ETA. Por lo tanto, teniendo en cuenta que las enfermedades trasmitidas por alimentos
o agua en Colombia representan un problema de salud pública, y que en el departamento de
Sucre no se han reportado trabajos sobre el papel que tiene el agua como fuente de trasmisión de
enfermedades infecciosas producidas por microorganismos patógenos, por lo que surge la
siguiente pregunta problema, ¿está el agua de consumo humano del municipio de Sincelejo libre
de microorganismos patógenos?
Objetivo General
Detectar, mediante técnicas moleculares, comunidades microbiológicas en agua utilizada para el
consumo humano en el municipio de Sincelejo-Sucre(Colombia)
Objetivo Específicos
Amplificar, mediante PCR, un segmento génico de bacterias y protozoarios en muestras de agua
de consumo del municipio de Sincelejo. Identificar las especies de microrganismo encontrados
en las muestras de agua, mediante secuenciación.
Referente Teórico
Los virus, bacterias y protozoos causan principalmente gastroenteritis y 50% de estos casos
están relacionados con el consumo de agua contaminada por heces tanto humanas como de
animales y se atribuyen a microorganismos específicos o toxinas generadas por ellos. Los
principales mecanismos en la transmisión son la ingestión de agua contaminada, el contacto y la
re contaminación del agua por una mala higiene doméstica. Entre los protozoarios patógenos,
los que presentan mayor importancia en cuanto a la calidad del agua para diversos usos (agua
para consumo humano, agua para recreación y agua para irrigación de vegetales frescos de
consumo directo) son la Giardia sp. Y el Cryptosporidium sp, Toxoplasma gondii, Cyclospora
cayetanensis, Blastocystis hominis (solarte et al 2006). Entre las bacterias causantes de
enfermedades por trasmisión hídrica se encuentra Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia
coli, Campylobacter spp., Vibrio cholera, principalmente, aunque existe una diversidad de estos
microorganismos que pululan el agua de consumo humano. Los genes ribosomales se han
convertido en secuencias blanco ampliamente utilizadas para la determinación de la diversidad
de microorganismos .Para el estudio de comunidades de bacterias y protozoarios existen
técnicas como la PCR que a través de la utilización de cebadores permite la detección del
genoma de varias especies. Para el estudio de filogenia de procariotas es utilizado la secuencia
del gen ribosomal 16s RNA debido a que presenta una secuencia conservada entre todos estos
microrganismo debido a que, está presente en casi todas las bacterias y en ocasiones existe
como una familia multigenica o como operones; su función a lo largo del tiempo no ha
cambiado, sin embargo pequeños cambios de su secuencia al azar son considerados una medida
más precisa del tiempo (evolución); y su tamaño de 1500 pb indica que es lo suficientemente
grande para muchos propósitos( janda et al 2007). Por otra parte, los cebadores eucariotas 18S
rRNA se han aplicado en muchos estudios de investigación de las comunidades del medio
ambiente ya que presentan zonas altamente conservadas y se caracteriza por ser, uno de los
componentes básicos de todas las células eucariotas, es el homólogo nuclear eucariota de ARN
ribosómico 16S en procariotas y mitocondrias, las secuencias de genes 18s rRNA son fáciles de
acceso debido a regiones flanqueantes muy conservadas que permiten el uso de cebadores
universales, y su disposición repetitiva dentro del genoma proporciona cantidades excesivas de
ADN molde para la PCR, incluso en los organismos más pequeños.
Metodología
TOMA DE MUESTRAS Se realizaran muestreos aleatorios en 79 viviendas distribuidas en las
nueve comunas de Sincelejo. Las colectas se realizaran en horas de la mañana y se realizara una
encuesta con el fin de relacionar la presencia de microorganismos con algunos factores. Las
muestras serán tomadas a partir de los diferentes recipientes de almacenamiento de la vivienda
seleccionada. Se tomara un volumen de 100 ml en frascos estériles, serán trasladadas al
laboratorio y procesadas el mismo día de su recolección. PROCESAMIENTO DE LA
MUESTRA De los 100ml de agua colectados de las casas, se dividirán en dos tubos para
someter a dos procesos distintos para la obtención del material genético, como se describe a
continuación. FILTRACIÓN: Las muestras (50 ml) serán filtradas a través de filtros de nitrato
de celulosa de 0.45 µm, a partir del cual se realizará la extracción de ADN.
CENTRIFUGACIÓN: Las muestras (50 ml) serán centrifugadas a 7600 rpm durante 20
minutos, se descartará el sobrenadante y el pellet obtenido, se resuspenderá en BPS 1X para su
posterior extracción de ADN. EXTRACCIÓN DE ADN Se utilizará el protocolo para la
extracción de ADN de agua elaborado por el departamento de ciencias ambientales de la
universidad de Toledo, basado en el método de Fenol/Cloroformo 50-50-50. PCR: Para la
detección del genoma se utilizara la técnica molecular PCR, siguiendo el protocolo descrito por
tekere et al (2011) para detectar el genoma de bacterias a partir del gen RNA 16s utilizando los
cebadores 27f.1 (5?AGRGTTTGATCMTGGCTCAG 3?) y 1492R
(5?GGTTACCTTGTTACGACTT 3?) y para la detección del genoma de protozoarios a partir
del gen 18s se utilizara el protocolo descrito por chanan et a( 2015)utilizando los cebadores PSSU-342f (5?CTTTCGATGGTAGTGTATTGGACTAC-3?) y Medlin B
(5?TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC 3?).Los productos obtenidos se analizaran en un gel
de agarosa al 1.5 % durante 30 minutos a 90 voltios.
Resultados
Estandarización del protocolo de PCR seleccionado. Recolección de muestras y amplificación
del segmento génico de bacterias 16sRNA sin resultados positivos, hasta el momento.
Conclusiones
Hasta el momento las muestras colectadas no se obtuvo resultados positivos para bacterias, lo
cual puede estar relacionado con el adecuada limpieza de los tanques de almacenamiento, sin
embargo no se descarta la presencia de protozoarios en la muestras procesadas ya que no se ha
hecho la amplificación del segmento génico 18s´RNA por PCR de estos.
Bibliografía
Memory Tekere, Adéle Lötter, Jana Olivier, Nelia Jonker, and Stephanus Venter. 2011.
Metagenomic analysis of bacterial diversity of Siloam hot water spring, Limpopo, South Africa.
African Journal of Biotechnology Vol. 10(78), pp. 18005-18012. Salah Shanan, Hadi Abd,
Magdi Bayoumi, Amir Saeed, and Gunnar Sandström. 2015. Prevalence of Protozoa Species in
Drinking and Environmental Water Sources in Sudan. BioMed Research International Volume
2015, Article ID 345619, 5 pages. Gutierrez M.F., Delfina U., Matiz A., Puello M., Mercado
M., Parra M., Ajami N. 2005. comportamiento de la diarrea causada por virus y bacterias en
regiones cercanas a la zona ecuatorial. Colomb. Med; Supl. (3): 6-14. J. Michael Janda, and
Sharon L. Abbott.(2007). 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Identi?cation in the
Diagnostic Laboratory: Pluses, Perils, and Pitfalls. Journal of clinical microbiology, vol 45(9),
p. 2761?2764