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Electroforesis
Se denomina electroforesis a la técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en disolución
cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se trata de una técnica fundamentalmente analítica,
aunque también se puede realizar con fines preparativos.
Cada molécula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rápidamente una velocidad constante al
equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) con la resistencia al avance (fuerza de
fricción o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.
La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en
papel o en acetato de celulosa), a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en
disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta
medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.
Gel de agarosa
Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar). Se disuelve en
caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad.
Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando
por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán
mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del
lugar de partida.
La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su
peso molecular. Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán
calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema.
En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las
bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se
visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de
DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.
La carga eléctrica de una molécula de DNA depende de sus grupos fosfato, y el número de éstos es igual
al doble del número de pares de bases. La forma de todas las moléculas de DNA es esencialmente la
misma. En consecuencia, resulta que la movilidad en electroforesis depende exclusivamente de la
longitud de la molécula (medida habitualmente como número de pares de bases, pb): la electroforesis
separa los fragmentos de DNA de acuerdo con su longitud en pb. De forma similar al caso de proteínas
en SDS-PAGE, se suelen aplicar patrones en uno de los pocillos para hacer una curva de calibrado de
tamaños.
El avance del frente de electroforesis se observa gracias a colorantes como azul de bromofenol y xileno
cianol, añadidos a la muestra.
Cuando los fragmentos de ácido nucleico analizados son de tamaño muy pequeño se utilizan geles de
poliacrilamida, o de mezclas de agarosa y poliacrilamida cuando el tamaño es intermedio.
Revelado
Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolución del colorante y se espera a
que aquél se impregne y así el colorante se una a las moléculas separadas en el gel. Tras lavar el gel
para eliminar el exceso de tinción no unida específicamente, se observa, fotografía o cuantifica mediante
densitometría.