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TEMA 4 VARIACIÓN GENÉTICA EN POBLACIONES
21 de agosto 2015
Dra. Jiménez
DEFINICIÓN Y ESTRUCTURA DE UN GEN.
ESQUEMA DE UN GEN CL ÁSICO:
Un gen es una secuencia en el ADN
genómico, en el ARNm no se habla
de gen, lleva la secuencia
complementaria pero no un gen.
Un gen en el ADN genómico tiene
intrones y exones.
Donde se inicia la traducción no es necesariamente donde inicia el exón 1. Puede ser antes o después o
incluso hay casos donde el la traducción inicia en el exón 2, en estos casos el exón 1 seria todo un exón
no traducido, sin embargo al ser un exón, aunque este no traducido este si va al ARN.
El sitio de inicio de la transcripción puede ser distinto del sitio de inicio de la traducción.
LA REGIÓN PROMOTORA
La región promotora siempre esta en la región 5'UTR, esa región tiene un tamaño aproximado entre las
22 y 70 pares de bases, estas regiones se han conocido como las cajas TATA, son regiones ricas en Timina
y Adenina. Entre la A-T hay 2 puentes de hidrogeno, por lo que se requieren menos energía para romperse
que las uniones G-C que tienen 3 puentes de hidrogeno.
Tiene cierta “lógica” que estas sean las regiones promotoras, “porque al requerirse menos energía es por
estos sitios donde se rompe la doble banda, queda en banda simple e ingresan por estos sitios la maquinaria
replicadora”.
Son regiones ricas en A-T, sin embargo no significa que no haya G-C. Los porcentajes en el resto del gen
de T-A-C-G son variables. El final del gen no suele coincidir en cuanto su secuencia, sin embargo se
reconoce algunas regiones ricas en Adeninas.
Existe únicamente un codón de iniciación pero hay 3 codones de finalización.
1
REACCIÓN EN CADA DE LA POLIMERASA
(PCRpolymerase chain reaction).
La PCR debe su especificidad a la cadena de –primers-, por
lo que antes de utilizar un primer se debe revisar, no todos
los que están en la literatura sirven.
-la profesora da el ejemplo de 7 primers que le envió un investigador para ADN mitocobdrial de miopatías
mitocondriales que codificaron también para el bulbo olfatorio entonces ella ya no podía utilizar esos
primers y debía hacer los propios, ya que no eran específicos y se pierde la gracia de la PCREl objetivo es amplificar millones de copias de una región de interés, por lo que se debe conocer esta
región.
La PCR es una reacción exponencial de 2N, donde 2 es el mínimo de copias que se tienen por ciclos, y N
es el número de ciclos. La media es de 30 ciclos, por lo que: 22 = 4, y 230 = 1 073 741 824. Ese seria el número
de copias que se tienen, parte del éxito de la PCR se basa en esto.
Se requiere de:







Una reacción enzimática, con la enzima ADN polimerasa termo resistente clásica, conocida
como TAC polimerasa, esta no es la única enzima que se utiliza también existen, PFUs que son de
otra bacteria aislada, que tienen una tasa de error muy bajas incluso más bajas que las TAC
polimerasa. ( tasa de error de la Tac polimerasa 10-10 y tasa de error de las PFUs 10-12)
Dos primers: el “forward” y el “reverse”. Se necesitan de los 2 primers, uno en cada hebra.
El sustrato, en este caso el sustrato es en nucleótidos ( y las bases A-T-G-C).
Co-factores, que es un ion que facilita la acción de la enzima como por ej: cloruro de Mg.
Temperatura; la cual debe ser especifica para cada reacción y esta dada por el termociclador.
pH, se le da con un buffer y suele ser un pH básico, que viene ya de la casa comercial.
Agua, al ser un medio acuoso
Hay criterios a nivel de laboratorio para que los primers sean los adecuados, es un poco empírico, se
puede hacer correr una PCR en un software (como Primer3) sin embargo los resultados se pueden alterar
con solo cambiar las condiciones propias, con solo cambiar la marca del tubo este puede contener en las
paredes internas alguna sustancia que inhiba la PCR. Por eso es que se deben poner controles internos a
nivel de laboratorio.
La temperatura; la PCR consiste en ciclos de diferente pasos:
1) se tiene el primer paso de desnaturalización, donde las dos cadenas van a separarse rompiendo
los puentes de hidrogeno, en este caso se tienen temperaturas altas, ( el ADN aguanta
temperaturas altas, no es como una proteína), en el ADN cuando se dice desnaturalizar se refiere
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a romper los puentes de Hidrogeno, y tener la estructura primaria a nivel lineal y esta es reversible.
Esta temperatura va de 90-95°C por un periodo corto de al menos 5 minutos, puede ser de un solo
minuto.
2) luego está el segundo paso que es de acoplamiento, donde los primers específicos van a unirse
a su región complementaria en las cadenas y se van a unir por puentes de hidrogeno, esta
temperatura es específica para cada primen según su cadena, y va de 50 -60°C, se debe mantener
estas temperaturas porque entre más baja se encuentre menos específica y entre más se suba más
astringente ( más difícil) se vuelve. Por lo que es importante mantenerla.
3) el tercer paso es la temperatura es elongación, que suele ser 72°C a esta temperatura la TAC
polimerasa trabaja más eficientemente es su temperatura optima de actividad.
**Cuando se pasa por estas 3 temperaturas se cumple un ciclo.
**La unión de los primers se da en la temperatura de acoplamiento.
** es reversible por enlaces no covalentes de puentes de hidrogeno
**a 72° se unen cada nucleótido
** Por cada ciclo se va dividiendo de forma exponencial, para el tercer ciclo se tienen 8… para el 4to 16 copias… y así de esa forma
se da la replicación exponencial hasta los millones en el ciclo 30.
Cuando se termina la PCR se de “revisar” y se realiza una electroforesis para poder cuantificar la PCR, se
ocupa un mecanismo para ver el material amplificado.
Recordar que la electroforesis es un mecanismo de separación. Pueden ser proteínas, carbohidratos y en
este caso material genético, separarlo en carga y tamaño.
Carga negativa del ADN por los grupos fosfatos, entonces se le coloca un Ánodo para que migren.
Cátodo; los cationes “van” a ese electrodo. El cátodo es negativo (cationes positivos, cátodo
negativo).
Ánodo; los aniones “van” a ese electrodo. El ánodo es positivo (aniones negativos, ánodo positivo).
Por tamaño actúan por velocidad, los más pesados se quedan más lentos y los más livianos van más rápido
en una matriz de agarosa que a 37 grados este sólida, con un reactivo que nos permita ver el ADN el ADN
no fluorese no tiene color, por lo que se requiere de un reactivo para poder visualizarlo, el más clásico es
el bromuro de etidio. Ese reactivo se une covalentemente con el ADN y migra con el además este si es
fluorescente. El bromuro es potencialmente mutagenico.
OTROS TIPOS DE PCR.
PCR anidada: son aquellas que se realizan sobre otra PCR por lo que se vuelven muy específicas.
PCR multiplex: se utilizan varios primers en la misma PCR.
PCR tiempo real.
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Genéticamente cerca del 70% de las mutaciones son deleciones de un exón ( se pierde el exón), y no son
aleatorias o separadas son deleciones de exones continuos, a estos sitios donde ocurren las deleciones se
les conoce como -hot spot- porque se concentran las deleciones, hay hot spot entre los exones 45-52 y
otro entre los 15-16-17, es donde se pierden la mayoría.
Ejemplo del Sd de Bartter
-En este caso únicamente se amplifica el exón 14. Ya que es acá donde se da el cambio de una Adenina
por una Guanina, y esto es lo que cambia la proteína. Es una mutación autosómica recesiva, que solo ha
sido descrita en un trabajo de Costa Rica. Se han estudiado más de 50 familias y se han encontrado más
del 75% de mutaciones en este gen.
SECUENCIACIÓN
Se realiza una secuenciación de Sanger, Sanger es el investigador que propuso la secuenciación por
químicos, y se ganó 2 premios nobel por secuenciar una proteína y por secuenciar un gen.
Es la clásica del país, sin embargo hay otros tipos como la Pirosecuenciación* y las de última generación.
La química de cada técnica es distinta. (*No estoy seguro que se llame así)
SECUENCIACIÓN DE SAN GER:
se conoce como una terminación de cadena porque se utiliza un nucleótido modificado en el 3' de la
ribosa tiene una modificación que frena la cadena en lugar de un OH en el 3' tiene un hidrogeno. (En el
segundo hidrogeno es donde se realiza el cambio de una ribosa a una desoxyribosa) Este hidrogeno
(desoxy nucleótido tri fosfato) impide el enlace fosfodiester impidiendo que se pegue el siguiente
nucleótido. Además a estos se les puede agregar un fluorocromo que no afecta la polimerización y permite
una fluorescencia captable e identificable.
Antes de hacer la secuenciación se debe realizar una PCR para aumentar el número de copias luego se
realiza una reacción de secuenciación.
REACCIÓN DE SECUENCIACIÓN
Es como una PCR con un solo primer que proporciona el 3' que permite la elongación, y luego incorpora
bases como si fuera una PCR sin embargo donde se encuentra el desoxy (Hidrogeno sin el OH) no se
puede continuar, si en lugar del desoxy se une un nucleótido normal se vuelve a generar el 3' y continua
la secuenciación.
La reacción de secuenciación tiene un límite, ya que depende de que siempre sea un nucleótido normal
el que se une cuando es un “desoxy nucleotido” no puede continuar, al inicio hay más probabilidades de
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que se una un nucleótido normal a como se avanza se disminuye esta posibilidad y cuando “salga” el
desoxy se frena.
El fluorocromo permite generar fluorescencia para una posterior identificación
El principio general de la PCR es la elongación que inicia con un Primer en la 3, que se realiza antes de
hacer la secuenciación, posterior a esta se realiza una reacción de secuenciación es como una PCR pero
con solo un primer que corta a nivel de 3´ y luego se incorporan pares de bases como si fue una PCR.
Se una la guanina o una desoxiguanina (nucleótido sin el OH), que impide seguir la secuenciación y si
además tiene un flourocromo se va a presentar una fluorescencia.
En la cadena se forman fragmentos de todos los tamaños, que son separables mediante una electroforesis
automatizada y específica, la diferencia entre cada fragmento es una base, la sensibilidad de los equipos
es detectar diferencias de una base. En un gel de agarosa se pueden observar diferencias de 20 pares de
bases.
Cada uno tiene un fluorocromo y cada fragmento se separa poco a poco. Antes se hacía separando en
cuatro tubos, en uno se colocaba la adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y adeninadesoxi,
en el otro los mismos cuatros primeros y timinadesoxi, sin embargo la interpretación era muy subjetiva
y además la elaboración del gel era muy laboriosa. Actualmente esto es automatizado, con un software
se detectan las secuencias y genera un electroferograma, que es una base y con respecto a la altura indica
si es un hemocigoto o un heterocigoto y las bases emiten colores diferentes.
Este sistema consiste en dos electrodos y la muestra migra a través de un capilar hacia el ánodo. Se corre
una muestra por capilar. Tiene una celda de detección, que tiene una cámara con un láser que emite
energía para que la muestra pueda tener fluorescencia.
Ejemplo de un electroferograma, cada pico corresponde a una base que se traduce a un archivo de texto
donde se puede observar una secuencia primaria.
El equipo pone una N cuando la base no se
logra identificar, ya que percibe varias bases. En
algunas ocasiones las ADN polimerasa pueden
equivocarse in vitro e in vivo, (esto lo vamos a
entender en la clase de mutaciones inestables),
esta lo que hacen es quedarse decodificando
una misma secuencia por la cantidad de
repeticiones que tiene la cadena.
Es importante tener algún conocimiento de las bases que quiero secuenciar.
Lo que se busca es tener la secuencia primaria de interés, para compararla con la secuencia de referencia
y buscar las similitudes y diferencias que tienen.
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En las bases de Datos se encuentran algunas de las mutaciones características que causan una
enfermedad.
Un heterocigoto se observa como
en la figura, en la parte B se
observan dos picos de diferentes
colores (C) y (T) en el mismo
nucleótido, esto es porque le llegan
al mismo momento y en la misma
secuencia dos pares de bases. Es
importante por ejemplo para casos
de
enfermedades
autosómicas
recesivas, ya que en este caso el
paciente sería portador.
Hay criterios de calidad para valorar
si los picos observados son
significativos, por ejemplo: si uno de los picos es curvo y pequeño se considera no significativo.
NOMENCLATURA IUPAC PARA LAS BASES MIXTAS:
 N: cualquiera de las 4
 Y: citosina o timina
 M: citosina y / adenina
Cosas que no puedo ver en las secuenciaciones:
 Cromosoma al que pertenece la secuencia.
 Contaminación
 Deleciones muy grandes o heterocigotas.
HEMICIGOSIS
Es la condición en la que un gen presenta una sola copia en un organismo diploide, por ejemplo los hombres
tienen homocigosis del cromosoma X.
En una enfermedad autosómica recesiva tanto los hemicigoticos como el heterocigoto, se verían
afectados. Se le realiza el análisis de los padres biológicos para determinar si es hemicigoto o homocigoto,
ya que si el niño es un homocigoto, el padre sería heterocigoto y la madre heterocigoto, a excepción de
que se una mutación de novo que tiene una probabilidad de ser menor al 1%.
Si el niño tiene una deleción o sea un hemicigoto, el padre sería normal y la madre sería portadora, si se
documenta como homocigoto o heterocigoto es que no se identificaron a los padres.
SEGÚN EL CONSENTIMIENTO INFORMADO NO SE REALIZAN PRUEBAS DE PATERNIDAD.
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STRs :
Son repeticiones normales en el genoma, se repite una secuencia varias veces de forma normal, estas
son heredadas de generación en generación, los STRs estables son las que se utilizan para la
identificación de una persona, estas además tienen correlación con sus progenitores por lo que se utiliza
para pruebas de paternidad. Tienen un nombre con un número que los identifica. Cada uno tiene tamaño
diferente, se llaman alelos.
Actualmente se analizan 36 STRs, que tienen una nomenclatura característica: D # (localización)
APLICACIONES CLÍNICAS:
 Estudio de quimerismo: luego de un
trasplante de médula donde se requiere
evaluar las quimeras para valorar cuanto
ADN del receptor y del donador se
encuentran presentes. Se tienen valores
específicos para cada día post trasplante
por lo que esto es parte del protocolo.
Se toma una muestra del receptor y se
compara con muestras posteriores, que
se toman en días diferentes según sea el
protocolo, además también se toma una
muestra del donador.
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PCR Y SECUENCIACIÓN
El valor máximo de pares de bases que se pueden secuenciar son: 650 pares de bases. Hay exones que
tienen muchos pares de bases como el Wilson, que tiene que partirse en varias partes para que pueda ser
secuenciado. Sin embargo la mayoría de los exones tienen 250 pares de bases,
 Si queremos ver una mutación puntual, deleciones, translocaciones, si es heterocigoto u
homocigoto se puede realizar una secuenciación.
 Si queremos ver alteraciones en el cariotipo NO podemos realizar secuenciaciones.
Algunas enfermedades que tienen mutaciones puntuales como la Fibrosis Quística, por lo que se puede
solicitar este examen para poder realizar el diagnóstico; sin embargo en la Distrofia de Duchenne el 70%
de las mutaciones no son puntuales, sino que son pérdidas de exones, no se puede utilizar la
secuenciación, por lo que se utiliza el Multiplex, que es la amplificación de toda la región. Esto es
importante para saber cual examen tengo que pedir.
Otras enfermedades para las que se utiliza la secuenciación:





Drepanocitosis ( Proteína S)
Fibrosis Quística que tiene 1100 mutaciones puntuales
Enfermedad de Wilson
Hiperplasia suprarrenal congénita
Enfermedad de Jarabe de Arce
La mayoría son autosómicas recesiva y q en un solo gen se pueden buscar mutaciones puntuales
Ejemplo de secuenciación:
Cuando se presenta una mutación en el exón 3 del gen MPZ, productor de una metaloproteinasa, se asocia
a la Enfermedad Charcot-Marie-Tooth, que es una neuropatía periférica, autosómica dominante ligada
al X, y esporádica. Hay varios tipos de estas, según el gen afectado. .
Para valorar si los cambios en una secuencia son patológicos o no, se hace un Blast de Datos, que alinea
la secuencia obtenida con la referencia, se comparan los porcentajes de igualdad, por ejemplo: se ve que
el TAT cambia por TCT. Y resulta que ese es el cambio en el aminoácido que se ha descrito para la
enfermedad de Charcot Marie Tooth. Aunque este cambio se asocia con heterocigosis, como el trastorno
es autosómico dominante, el sujeto está enfermo.
El gen ATP7B está relacionado con la enfermedad de Wilson. El gen CFTR está relacionado con fibrosis
quística
*Se enumeran tanto los aminoácidos como los nucleótidos, estos se asignan de acuerdo a HGMD, en los
reportes oficiales se realizan por medio de esta base de Datos*
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Reporte de Laboratorio debe tener:
 Datos demográficos básicos: qué edad tiene, etc.
 ¿Qué metodología se utilizó? Si se secuencia todo el gen o solo un exón, si se secuencia o se hace
PCR, etc.
 Resultados obtenidos. Si son cuantitativos (número de copias) o cualitativos (nombre de la
mutación)
 Interpretación. Si la mutación es patológica y a qué enfermedad se asocia.
 Limitantes. Si solo se hizo un exón dado y no el resto del gen. Contaminantes. Baja sensibilidad o
especificidad. Criterios de calidad.
*tomado de la transcri del año pasado
NOMENCLATURA:
*Es muy importante leerse el artículo*
En el gen hay que dar coordenadas que se dan según el inicio de la transcripción y de la traducción. Por
ejemplo ATG es el primero A: 1, T:2 y G:3, en las proteínas se identifica P. (aminoácido que debía de estar,
# y el aminoácido por el que se cambió). Se puede usar la nomenclatura de una letra o de tres, que no se
tienen que aprender.
Ejemplo: De Barter P.W634X, X: codón de stop, el lugar de ser triptofano, es un codón de stop, por lo que
no codifica para ningún aminoácido.
Cuando se trata de nucleótidos:




ADN genómico (g), tiene intrones.
ARN genómico ( r )
ADN mitocondrial (m)
ADN complementario (c), este se obtiene por una retrotranscripción de un ARN, o sea es una
“copia” del ADN.
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Con respecto a la figura adjunta, A del exón 1, es el
nucleótido 1, luego 2 y 3. (revisar el artículo)
Con respecto a los intrones, se utilizan numeraciones
con base a los exones que lo delimitan, siempre
tomando en cuenta que para un nucleótido cualquiera
del intrón el signo + ó - depende de si se encuentra más
cerca del exón uno o el exón 2. Además siempre se
antecede de IVS.
Ejemplo: los cercanos al exón 1 son +, los cercanos al
exón 2 negativos.
La dra mencionó que tenemos que entender y saber bien
este cuadro:
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EJEMPLO:
Condón 7 asociado con drepanocitosis esta se detecta en el tamizaje neonatal, es autosómica recesiva y
es una mutación puntual por lo que se puede secuenciar. GAG
GTA, se produce la hemiglobina S
(homocigoto), esta es la causante de la anemia de las células falciformes, si se da otro cambio como
GAG
AAG se obtiene la hemoglobina C y si el cambio es GAG
TAG se produce una B- Talasemia.
Esto se puede detectar por secuenciación.
Tarea: entender la nomenclatura de la tabla 1 y bajar la secuenciación en ww.ensembl.org
Santiago Rodríguez
Nathalia Sandí Ovares
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