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EQUIPO ______
EJERCICIO CINÉTICA ENZIMÁTICA 1 2012
Se realizo la purificación de la lactato deshidrogenasa de músculo esquelético de bovino, se guardaron las fracciones de cada uno de los
pasos de purificación. A cada una de las fracciones se les midió la actividad de la LDH en el sentido de piruvato a lactato con la
consecuente oxidación del NADH. El medio de reacción tuvo un volumen final de 1 mL. En algunos casos se tuvo que realizar dilución de
la muestra para medir la actividad. En la tabla se presentan los datos de absorbencia, las fracciones ensayadas y las diluciones que se
hicieron para determinar la actividad.
Tabla 1. Registro de absorbencias respecto al tiempo de reacción de de la LDH de las diferentes fracciones de la purificación de la enzima
Tiempo
F0
F1
F2
F3
F4
FPA
FPB
FPC
(min)
1:75
1:100
1:120
1:250
1:140
1:10
1:700
1:100
0.5
1.105
1.073
1.132
1.055
1.03
0.954
1.179
1.156
1
0.995
0.968
1.047
0.964
0.869
0.759
1.1
1.148
1.5
0.89
0.851
0.955
0.863
0.702
0.558
1.01
1.134
2
0.775
0.73
0.856
0.759
0.522
0.368
0.918
1.122
2.5
0.655
0.61
0.755
0.65
0.35
0.2
0.823
1.111
3
0.54
0.47
0.652
0.547
0.202
0.088
0.726
1.097
3.5
0.426
0.37
0.55
0.442
0.08
0.034
0.628
1.082
4
0.322
0.262
0.452
0.342
0.005
0.530
1.069
4.5
0.228
0.164
0.357
0.252
0.45
1.055
5
0.15
0.082
0.268
0.17
0.368
1.04
RESUELVE:
A. Realiza las gráficas de absorbancia vs tiempo de reacción (min).
B. Encuentra en tus gráficas las tres fases características. Después de analizar la gráfica, tomar solo la porción lineal de la curva (fase
2) y obtener la pendiente de la curva.
C. Completar la Tabla 2.
 Para calcular la actividad total de la enzima se realizan los siguientes tres pasos:
1. Utilizar la pendiente de la curva y sustituir los valores en la siguiente ecuación
 Abs 
m

min 

Actividad 
 mmol min 1 mL1
 M 1 cm 1 * b cm 


Donde:
m: es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min
: es el coeficiente de extinción molecular para el NADH, 6.22 x 103 M-1 cm-1.
b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm
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2. Si se considera la cantidad de enzima añadida en la celda de reacción y su dilución la actividad enzimática de la enzima en la
solución sin diluir sería:
Actividad 
Actividad * volumen reacción * Factor de dilución
 mmol min 1 mL1
volumen añadido de enzima
3. En vista de que se tienen diferentes fracciones de un proceso de purificación de proteínas, se tienen volúmenes distintos de
cada fracción entonces hay que multiplicar el valor obtenido en el paso anterior por el volumen de la fracción lo cual nos da la
Actividad total en mmol min -1.

Para obtener el valor de la actividad específica se divide la actividad total dada en nmol min-1 entre la proteína total de la fracción
(mg), así las unidades de la actividad específica son mmol min-1mg-1.

Mientras que el valor de grado de pureza también llamado veces de purificación se obtiene al dividir la actividad enzimática
específica de la fracción entre la actividad específica de la fracción inicial en este caso la F1. Se espera que conforme se pierdan
proteínas contaminantes el grado de pureza se vaya incrementando.

Para la obtención del rendimiento en cada paso de purificación se considera que la actividad total recuperada en la fracción
inicial es el 100%, así que se divide la actividad total obtenida después del paso de purificación que corresponda entre la
actividad total obtenida antes de empezar a purificar en este caso la F0 y se multiplica el resultado por 100.
Tabla 2. Rendimiento y pureza durante el proceso de purificación de la LDH de bovino.
Fracción
Volumen
Concentración Proteína total
Actividad
(mL)
(mg/mL)
en la fracción
total
(mg)
(molmin-1)
F0
F1
F2
F3
F4
FPA
FPB
FPC
Actividad
Pureza o
enzimática
veces de
específica
purificación
(mmol min-1mg-1)
1
Rendimiento
100
2