Download Tabla 5: Efectos de etanol al 2% en la respuesta del cerco del grillo.

LABORATORIO OCHO: NEUROMODULACIÓN
RESUMEN
En este laboratorio, podrás:
1. aprender a extraer agentes neuromoduladores de productos comunes;
2. probar cómo estos agentes afectan los patrones de espigas neuronales; e
3. investigar cómo diferentes clases de neuromoduladores afectan a varias
poblaciones de neuronas en el grillo.
OBJETIVOS
Antes de realizar esta práctico debieras conocer:
 la anatomía básica del grillo
 cómo los neuromoduladores afectan una sinapsis
 cómo la expresión diferencial de receptores puede alterar la capacidad de
respuesta neuronal
Después de hacer esta práctico debieras ser capaz de:
 explicar los conceptos de neurofarmacología y neuromodulación
 describir cómo el alcohol, el glutamato y la nicotina afectna las tasas de
disparo neuronal
 diseñar un experimento para probar cómo una sustancia puede afectar al
sistema nervioso
MATERIALES
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SpikerBox con adaptador de cable de audio
Computador con Audacity instalado
Grillos
Agua con hielo o acceso a un congelador
Tijeras de disección
Mondadientes
Placa de petri de 3"
Cartón corrugado (cortado para encajar en la placa de petri)
Pipetas de plástico
H20 destilada, NaCl, bicarbonato de sodio, glutamato monosódico, etanol,
tabaco
Jeringas de 1 cc (1 mL)
INTRODUCCIÓN
Acerca de Anuradha Rao
Este experimento está dedicado a Anuradha Rao, una
neurocientífica que estudió farmacología y disfrutado de la
difusión educacional. Su generoso fondo conmemorativo
permitió a Backyard Brains presentar experimentos y
prototipos en la Conferencia de la Sociedad para la
Neurociencia en 2010 en San Diego, CA.
En este experimento se probará el efecto de compuestos neuroactivos en
neuronas del sistema nervioso central. Obtener fármacos que afectan las
neuronas puede ser bastante difícil, ya que suelen ser muy peligrosos (como
batracotoxinas de ranas venenosas o tetradotoxinas del pez globo fugu, ambos
bloqueadores de canales de sodio) o son drogas de abuso (como la cocaína,
que permite que la dopamina permanezca en la sinapsis más tiempo de lo
normal).
Además, la barrera hematoencefálica (BHE)
impide la difusión pasiva de muchas
sustancias hacia el cerebro. La BHE se
compone de células endoteliales del
cerebro que se colocan muy apegadas
alrededor de todos los capilares, con
uniones estrechas y una resistencia
eléctrica superior a la normal (2000 Ω/cm2
en contraste a la habitual, 5 a 10 Ω/cm 2).
Imagen de la BHE cortesía de
Esta barrera asegura la función del
Wikipedia
cerebro en los vertebrados y los insectos
mediante el mantenimiento de la integridad
iónica en el interior del cerebro. Evita que muchas sustancias tóxicas penetren al
cerebro, protege a las neuronas del cerebro neurotransmisores en circulación,
como la noradrenalina, y restringe la difusión de objetos tales como bacterias o
moléculas hidrofílicas en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Incluso los iones K+
son excluidos. Eso sí, la barrera permite la difusión de moléculas hidrofóbicas
pequeñas (O2, algunas hormonas) y presentas células especializadas para
transportar activamente algunos productos metabólicos tales como la glucosa a
través de la BHE con proteínas específicas. La consecuencia práctica de la BHE
en nuestros experimentos es que sólo ciertos fármacos con características
específicas se pueden utilizar para influir en las neuronas. Esto hace además
que el diseño de fármacos para el tratamiento de la función cerebral sea muy
difícil para las compañías farmacéuticas.
A pesar de esto, nosotros sí tenemos acceso a algunos compuestos
neuroactivos que podemos utilizar en nuestros insectos: nicotina, glutamato
monosódico y etanol.
La nicotina proviene de la planta del tabaco. El tabaco
desarrolló la nicotina para evitar que los insectos se
comieran sus hojas. La nicotina es un poderoso agonista
del receptor de la acetilcolina; amplifica el efecto de la
acetilcolina (ACh) que se une a sus receptores en la
sinapsis, provocando que la neurona dispare más (debido a la mayor afluencia
de iones de sodio).
Mientras que la nicotina es una droga que actúa sobre los receptores a los que
los neurotransmisores se unen, el glutamato monosódico es un neurotransmisor
en sí mismo. Una vez disuelto en agua, se convierte en iones de sodio cargados
positivamente e iones de glutamato con carga negativa. El glutamato es
normalmente parte de la vía metabólica de la glucólisis (descomposición del
azúcar) y está prontamente disponible en los
alimentos que comes.
De hecho, más del 80% de las sinapsis en tu
cerebro usan glutamato, ya que éste es un
neurotransmisor excitador. ¿Crees que el
glutamato sea excitatorio en un insecto también?
El etanol es un fármaco que también es un agonista de la neurotransmisión, sin
embargo actúa para aumentar el efecto de canales que unen GABA. A diferencia
de los receptores de acetilcolina, la estimulación de los canales de GABA a
menudo conduce a la inhibición de potenciales de acción. En otras palabras, la
estimulación de un canal de GABA hará que una neurona dispare más lento. La
estimulación de las neuronas humanas con etanol puede reducir esta velocidad,
¿Pasará lo mismo en un insecto?
PROCEDIMIENTO
Ejercicio 1: Preparación de las soluciones Neuroactivas
Solución Salina: Prepara una simple solución salina mediante la combinación
de 1,5 g de sal de mesa (NaCl) y 1,25 g de bicarbonato de sodio en 250 mL de
agua destilada.
Nicotina: Para preparar tu solución de nicotina, toma un cigarrillo o cigarro
pequeño, quita todas las hojas de tabaco trituradas, y colócalas en un recipiente
pequeño (un frasco de pastillas, por ejemplo). Llene el recipiente con solución
salina, coloca la tapa, agita la mezcla y deja reposar un par de días para extraer
la nicotina. Con el tiempo la solución debe tornarse de color café amarillento. Si
estás en educación media, el profesor puede tener ya preparada esta solución.
Glutamato: para preparar tu solución de glutamato, vas a utilizar el aditivo
alimentario llamado glutamato monosódico (GMS). Puedes encontrarlo en una
tienda de comestibles de importación de Asia, ya que el GMS es un potenciador
del sabor en las comidas asiáticas. Llena un frasco de pastillas a una cuarta
parte con los cristales de sal de GMS, llena el resto de la botella con solución
salina, y agita bien para disolver el GMS. Ten en cuenta que no todo el GMS se
disolverá, ya que estás haciendo una solución saturada.
Alcohol etílico: Mezcla 196 mL de solución salina con 4 mL de etanol para
hacer una solución de EtOH al 2%. Toma 12,5 mL de tu solución de EtOH al
2%, y añádele 87,5 mL de solución salina para hacer una solución de EtOH al
0,25%.
Ejercicio 2: Preparación del ganglio del cerco del Grillo
Para este ejercicio, vas a utilizar mediciones del sistema del cerco del grillo para
determinar el efecto de una droga en los patrones y tasas de espigas.
Nota: Este experimento requiere sacrificar grillos
1. Coloca el grillo en un congelador durante 5 minutos. Cuando el grillo ha
dejado de moverse y está anestesiado, colócalo en tu mesón de laboratorio.
Ten cuidado y limita el tiempo que los grillos pasan en el congelador, ya que
son más sensibles al frío que las cucarachas utilizadas anteriormente. Si 5
minutos no son suficientes, ponlos de nuevo en el congelador y chequéalos
cada minuto.
2. Con las tijeras de disección, decapita el grillo en la unión entre la cabeza y el
tórax. Coloca un poco de vaselina en el corte.
3. Coloca el grillo en una placa de Petri con un pequeño trozo de cartón
colocado en el fondo. El cartón te permitirá mantener el grillo con los
electrodos del SpikerBox en su lugar, como también aplicar líquidos a la
preparación de una manera limpia.
4. Inserta el electrodo de registro del SpikerBox a través del abdomen del grillo
en el ganglio del cerco. El ganglio del cerco es el ganglio más posterior en el
cordón nervioso ventral (CNV). Trata de colocar el electrodo en el centro del
ganglio. Inserta el electrodo de tierra en el tórax, donde la cabeza solía estar.
Ahora, usando una jeringa pequeña (se pueden comprar en una farmacia),
inyecta unas gotas de solución salina en el abdomen del grillo.
5. Estimula el cerco del grillo con un mondadientes, o soplando. Esto debiera
generar un patrón fuerte de espigas y, posiblemente, un retorcimiento
estereotípico del abdomen.
6. Enciende tu SpikerBox y abre Audacity. Conecta tu SpikerBox a tu
computador y comienza a grabar. Conecta tu SpikerBox al computador,
enciéndelo, y abre Audacity. Ajusta el eje Y de la grabación de modo de
maximizar las espigas observadas. Ajusta el eje X (utilizando la herramienta
de lupa que aparece en la barra de menú) para que puedas diferenciar
ráfagas directamente relacionadas con la estimulación del ganglio del cerco.
7. Si no observas movimiento o espigas en respuesta a la estimulación, ten
paciencia. El CNV del grillo debe calentarse a una temperatura óptima para la
grabación, y esto puede tardar algunos minutos. En este período de tiempo, la
actividad medida desde el ganglio del cerco puede parecer bastante baja. Si
después de 5 minutos de calentamiento, sigues sin poder observar espigas,
ajusta los electrodos y repite la estimulación. Si no puedes observar espigas
luego de unos minutos de estimulación, es posible que necesites usar un grillo
nuevo. Una vez que establezcas registros consistentes, estás listo para
comenzar a observar el patrón de activación normal del ganglio del cerco del
grillo.
Ejercicio 3: Respuesta de Control del Cerco
1. Ahora procederás a estimular el cerco del grillo soplando por su lado
derecho o izquierdo. Empieza a grabar en Audacity.
2. Ya que una función del sistema del cerco es diferenciar la direccionalidad de
un estímulo como el viento, debieras poder ver diferencias en la respuesta al
soplar de un lado o el otro. Utilizando la Tabla 1, anota la duración del
estímulo (soplido) y el lado dede donde se dio este estímulo (derecha o
izquierda). Repite esto dos veces por cada lado del grillo.
3. Detén la grabación en Audacity.
4. Usando los tiempos registrados en la Tabla 1, resalta las respuestas a la
estimulación del cerco. Amplifica cada una de la traza resaltadas en EfectoAmplificación en la barra de menú. No amplifiques toda la grabación, sólo las
respuestas del cerco.
5. En la Tabla 1, haz un diagrama del patrón de espigas de cada trazo y da una
breve descripción de los movimientos generados en respuesta a la
estimulación.
Tabla 1. Respuestas de Control del Cerco
Traza
Tiempo
(Duración)
Izquierda/Derecha
Patrón y Breve
Descripción del
Movimiento
1
2
3
4
Ejercicio 4: Probando Compuestos Neuroactivos
1. Comenzando con la solución de nicotina, pondrás a prueba el efecto de
agentes farmacológicos en la respuesta del cerco del grillo. Utilizando una pipeta
de plástico, elimina cualquier exceso de solución salina del electrodo de registro.
Comienza a grabar con Audacity.
2. Ahora, usando la jeringa pequeña, inyecta unas gotas de solución de
nicotina en el abdomen del grillo.
3. Después de un minuto (para que la solución llegue al ganglio del cerco),
estimula el cerco como lo hiciste en el ejercicio 3. Esto puede tomar varios
intentos. Registra en la Tabla 2 el tiempo de dos estímulos del cerco exitosos, de
la derecha e izquierda. Detén la grabación.
4. Utilizando el mismo procedimiento que en el ejercicio 3, amplía y dibuja los
trazos de tus estímulos. Incluye una breve descripción de los movimientos que
parecieran haber sido generados en respuesta a la estimulación.
Tabla 2: Efectos de la nicotina sobre la respuesta del cerco del grillo.
Traza
Tiempo
(Duración)
Patrón y Breve Descripción del Movimiento
Lado
Izquierdo 1
Lado
Izquierdo 2
Lado
Derecho 1
Lado
Derecho 2
5. Después terminar con la solución de nicotina, lava el electrodo de registro
con solución salina.
6. Repite los pasos 1-5 con las soluciones de glutamato y el etanol, teniendo
cuidado de lavar con solución salina posibles soluciones residuales entre los
ensayos. Anota tus resultados en las tablas 3-5 a continuación.
Tabla 3: Efectos de glutamato en la respuesta del cerco del grillo.
Traza
Tiempo
(Duración)
Patrón y Breve Descripción del Movimiento
Lado
Izquierdo 1
Lado
Izquierdo 2
Lado
Derecho 1
Lado
Derecho 2
Tabla 4: Efectos de etanol al 0,25% en la respuesta del cerco del grillo.
Traza
Lado
Izquierdo 1
Lado
Izquierdo 2
Lado
Derecho 1
Lado
Derecho 2
Tiempo
(Duración)
Patrón y Breve Descripción del Movimiento
Tabla 5: Efectos de etanol al 2% en la respuesta del cerco del grillo.
Trace
Lado
Izquierdo 1
Lado
Izquierdo 2
Lado
Derecho 1
Lado
Derecho 2
Tiempo
(Duración)
Patrón y Breve Descripción del Movimiento
PREGUNTAS DE DISCUSIÓN
1. Basándote en tus resultados, ¿cuáles agentes farmacológicos llevaron a un
aumento en la actividad del cerco? Este efecto, ¿fue consistente a ambos lados
del grillo? Explica.
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2. Basándote en tus resultados, ¿cuáles agentes farmacológicos llevaron a una
disminución en la actividad del cerco? Este efecto, ¿fue consistente a ambos
lados del grillo? Explica.
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3. Observaste algún efecto en la duración de la respuesta del cerco frente a
algún agente farmacológico? Si fue así, ¿cuáles? ¿Por qué sería?
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4. Describe una diferencia significativa en el patrón de espigas observado entre
los registros de control y una condición experimental. ¿Qué podrían reflejar
estas diferencias?
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5. ¿Hubo alguna diferencia en los movimientos observados entre el control y las
condiciones experimentales? ¿Qué podría explicar esto?
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