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GE02: Genética molecular organización, regulación y Dr. Sequeira
manipulación
Genética molecular organización, regulación y manipulación
Dr. Sequiera
Viernes 7 de agosto. 1pm
Organización del genoma
Esta clase es sobre la organización del genoma, es decir, como se organizan las bases nitrogenadas,
los nucleótidos, las secuencias en los genomas. Un genoma es todo el material genético de una
célula (todo el ADN por célula o por organismo) y que es característico para esa especie.
Entonces la pregunta es: ¿cómo está organizado el genoma, se encuentran las bases en patrones o
distribuido al azar? Distribuido al azar significa que cada uno de los cuatro nucleótidos tenga la
misma probabilidad de estar en una posición, es decir en la primera posición cualquiera de los cuatro
nucleótidos tiene un 0,25 de probabilidad de estar, en la siguiente posición cualquiera 0,25 y así
por los 1000 millones de pares de bases. En caso de un patrón entonces ya esa probabilidad no
seria 0,25 porque si todos los genomas empezaran con AG y es necesario que iniciaran con AG,
entonces ya ahí no hay una probabilidad de 0,25 sino que es un patrón. Los nucleótidos
generalmente no están distribuidos al azar, sino que presenta un patrón es decir una secuencia
reconocida.
Entonces, con el proyecto genoma humano, en cual comenzó en 1990 y terminó en el 2003. Este
proyecto trae una serie de datos, información y fenómenos con respecto al genoma que en realidad
no fueron nuevos en el momento en el que se finalizó el proyecto debido a que a lo largo del proceso
de secuenciación del ser humano se secuenciaron muchos otros genomas de organismos modelos
utilizados en investigación. Por esto cuando se publicó la secuencia del genoma humano ya se
conocían el genoma del ratón y otros organismo, en los cuales se había visto un patrón especifico a
lo largo de diferentes grupos filogenéticos.
Entonces cuando se tiene la secuencia del genoma humano se obtiene esto:
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Figura 1. Organización del genoma humano y su distribución de secuencias.
Entonces en la distribución de secuencias en el genoma las secuencias que codifican para proteínas
representan solo un 1,5 % del genoma, esto lleva a la pregunta de ¿qué hace todo lo demás?,
durante mucho tiempo al resto del genoma se le llamo ADN basura pero actualmente se sabe que
tiene función.
En la caracterización de la secuencias del genoma humano solo 1,5 % codifica para proteínas del
resto una gran mayoría está compuesto por ADN repetitivo. El ADN repetitivo tiene diferentes
orígenes, pero se puede simplificar como orígenes virales, es decir, genomas virales que fueron
integrados al genoma humano, que perdieron sus características virales y que se mantuvieron ahí.
Entre estos tenemos secuencias como:




LINE’s (elementos intercalados largos) que se derivan de retrotrasnposones.
SNE’s (elementos intercalados cortos) que derivan de transposones
Retrotransposones LTR (long terminal repeats , repeticiones terminales largas)
Transpososnes ADN
Otras secuenciias repetitivas


Secuencias repetitivas simples
Duplicacion de segmentos
Esto representa casi un 50% del genoma humano derivado de secuencias ancestrales virales. Todo
eso es en esencia ADN repetitivo, sin embargo, existen otras secuencias que también son ADN
repetitivo por ejemplo secuencias repetidas simples, duplicaciones de segmentos, heterocromatina
miscelánea (el termino misceláneo se refiere a de diferente origen o tipo, gran parte de la
heterocromatina es ADN repetitivo). Por esto tenemos que el genoma humano puede estar
compuesto hasta en un 78% de secuencias repetitivas.
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Tambien el genoma incluye la heterocromatina miscelánea, que es una heterocromatina que está
conformada por diversos tipos de secuencias; secuencias únicas misceláneas e intrones.
Los porcentajes respecto a la distribución del genoma varia un poco dependiendo de la literatura
utilizada. En la figura uno la gráfica de la izquierda es un poco más reciente que la otra y toma en
cuenta ADN regulatorio, genes para ARN´s no codificantes entre otros, pero si se comparan ambas
en términos generales son muy similares. Es evidente que a lo largo del tiempo se debe dar una
diferenciación porque se van produciendo funciones nuevas de secuencias nuevas entonces se
actualiza.
Ese más del 50% del ADN de origen viral a lo largo de la historia evolutiva perdió sus características
virales, es decir, si eran transposones o retrotrasnpososnes ya no se comportan como tal en la
secuencia, sus características se perdieron y se mantuvieron silenciados en el genoma. Sin embargo
cuando se tuvieron los primeros datos del genoma humano se debe replantear el dogma central de
la biología. Debido a esto se fundó el proyecto ENCODE (por su nombre es enciclopedia de
elementos de ADN) que lo que pretende es caracterizar funcionalmente todas las secuencias que
hay en el genoma. Este proyecto se inició en el 2003 y los primeros resultados se publicaron el en
2006-07 según los cuales cerca del 93% del genoma se trascribe, es decir, si tenemos solo un 1,5%
que es ADN codificante (menor al 5 o 2,5% depende de los estudios), que hace todo lo demás que
se transcribe. EN un segundo reporte del 2013 se determina la función para en 80% de este 93, que
muchas veces es teórico (por bioinformática), pero se debe todavía corroborar experimentalmente.
La mayoría de este 80% tiene su función en los procesos de regulación, por esto se creé que es la
regulación la que determina la complejidad de los seres biológicos (antes se creía que la complejidad
está determinada por el número de genes). Hace un par de meses de presentó una comparación
entre el genoma del ratón y el del ser humano, los dos genomas tiene la misma cantidad de pares
de bases, de genes y los genes son básicamente idénticos y una secuencia con una similitud de un
95%; entonces se considera que la regulación es la que da la diferencia entre las dos especies.
ADN repetitivo
Es la gran mayoría del genoma (hasta un 68%) y se define como una secuencia de ADN que se repite
en bloque variable. Cuando la misma secuencia se repite una y otra vez sin interrupciones (seguidas)
se les denomina repeticiones en tándem. También hay secuencias que se repiten y tiene
interrupciones. En muchos casos las secuencias repetitivas están dispersas en a lo largo de todo el
genoma.
El ADN repetitivo es muy importante para distintos análisis, estudios de variabilidad genética,
ejemplo los estudios de paternidad se basan en estas secuencias entonces se usan para saber si una
molécula de ADN viene de otra molécula de ADN.
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ADN repetitivo
Moderedamiente
repetitivo
Altamente repetitivo
ADN Satelite
Repeticiones en
Tandem
Genes de copias
multiples
Mini-satelites
Genes rARN
Retrotransposones
Intercalados
Micro-satelites
VTNRs
STRs
SINEs
LINES
Alu
LT
Figura 2. Clasificación del ADN repetitivo.
Clasificación del ADN repetitivo
La diferencia entre el ADN altamente repetitivo y el medianamente repetitivo es solo el número de
repeticiones.
Los genes en copias múltiples son genes que a lo largo de la evolución se han ido duplicando de
forma que en el genoma tenemos regiones con muchos genes, por ejemplo los genes de ARN
ribosomal. Nucléolo: es una parte del núcleo de células eucariotas (punto físico de la célula); en la
cual, se aglomera ADN que tiene los genes de ARN Ribosomal. Su importancia es debido a la
producción de proteínas en los ribosomas. Aproximadamente son 400 genes distribuidos en 5
cromosomas en closters de genes (genes que se agrupan o están juntos uno detrás del otro).
1. Altamente repetitivo-ADN satelitico
Se llama ADN satelitico porque en diferentes estudios para determinar la composición de los
genomas se encontraban en los primeros análisis dos picos o bandas distintas con electroforesis,
entonces se formaba un pico o banda principal y un pico o banda más pequeña que correspondía al
ADN altamente repetitivo y por eso se le llamo ADN satelitico.
El ADN altamente repetitivo se encuentra básicamente en el centrómero (región con más secuencias
repetitivas, relacionado a que tiene que estar altamente compactado) y regiones pericentromericas
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(a cada lado del centrómero). Además en los telómeros (los cuales son secuencias altamente
repetitivas, que permitían la formación de los cuartetos g) y subtelómericas.
Los cuartetos g eran las repeticiones que llevaban a conformaciones especiales que son una especie
de nudos que protegían los telómeros.
2. ADN medianamente repetitivo

Microsatelite (STR)
Son secuencias repetitivas de ADN; en dónde; los bloques tienen entre 5-10 pares de bases que se
repiten en tándem.
Los números de pares de bases varían dependiendo de la literatura, pero son importantes los que
se encuentran en la transcripción. (En la imagen de la presentación vienen otros valores).
STR: short time repeats
VNTR: variable time repeats
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
Minisatelites (VNTR)
Son secuencias repetitivas de ADN; en dónde; los bloques tienen
entre 10-100 pares de bases que se repiten en tándem.

SINE’s
Son secuencias de origen transposónico. Son elementos nucleares
intercalados que se conforma por menos de 500 pares de bases que
se encuentran dispersos en el genoma (se pueden encontrar hasta
500000 veces).

LINE’s
Son de origen retrotransposonico. Son elementos nucleares
intercalados que se conforma por menos de 6000 pares de bases que
se encuentran dispersos en el genoma (se pueden encontrar hasta
850000 veces).
Transposones y retrotransposones
Son llamados genes saltarines.
Transposones:
Es una secuencia de origen viral que colonizó una genoma, se introdujo en el genoma y puede ser
transcribirle y traducible y lleva a la síntesis de una proteína. Esta proteína puede cortar la secuencia
e insertarla en otro sitio. En el caso de que este gen se inserte en otro gen puede producir una
mutación y silenciar el gen.
Retrotransposones:
Esta secuencia es transcrita, traducida y lleva a la síntesis de una proteína pero esta proteína no
actúa a nivel de ADN sino que es una transcriptasa reversa, es decir, utiliza ARN como molde para
la síntesis de ADN. Utiliza el ARN que le dio origen y sintetiza una hebra de ADN y la otra hebra de
ADN y esto eventualmente este llevado a otra parte del genoma e insertado. Pasa lo mismo que con
el transposon entrando en medio de genes eliminado o alterando función.
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Pseudogenes
Se define como un gen falso, que se asocia al gen al cual se
dio origen. Surgió por medio de la duplicación génica que
se desencadeno por un proceso mutacional en donde un
gen se duplicó generando 2 copias de un mismo gen; en
donde, al haber un gen funcional, el otro gen esté a la libre
y acumula mutaciones hasta ser no funcional.
Tener dos genes del mismo tipo puede traer problemas e
incluso asociarse con enfermedades. AL tener dos genes
uno mantiene la función en tanto que el otro puede ir
acumulando mutaciones debido a que no presenta una
presión de selección (presión por que se mantenga igual o
cambie a variantes positivas). Se creee que este gen se
silencdia y es un gen que no tiene función. Sin embargo
actualmente se sabe que estos genes tienen algún tipo de
función reguladora pero está en estudio.
Se cree que esta es la forma en la que aparecen las familias génicas, es decir, genes que están
relacionados por función pero son variables. Son genes o familias generadas por duplicación que
podemos diferenciar a lo largo del tiempo.
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Algunas generalidades del genoma humano
El profesor leyó toda la información del cuadro y dijo que era variable lo que decía en el mismo y
que era importante. Las últimas tres no son importantes.
Regulación de la expresión génica
Los genomas se expresan, los genes se expresan independientemente que sean para proteínas o
sea ADN no codificante y esta expresión es regulada. La regulación implica control y un gen debe
ser controlado porque la expresión de los genes se adapta a las necesidades de las células, entonces
cualquier señal intrínseca o extrínseca que determine un cambio en las necesidades de la célula
puede llevar a cambios en la expresión de los genes. Cuando se habla de cambios de regulación nos
referimos a señales que le “dicen” a la célula necesito esto, necesito menos de esto, necesito que
este proceso termine o se inicie. Entonces regulación implica control, implica adaptar las
condiciones de un sistema dependiendo de las características de este sistema.
La regulación es sumamente importante porque es lo que le permite a la célula sobrevivir, responder
y adaptarse. Para ejemplificar la importancia de la regulación: una neurona, una célula de musculo
esquelético y un linfocito de un solo individuo tiene el mismo genoma pero lo que define sus
diferencias es la regulación de genes. También a lo largo del desarrollo tenemos las células madre
pluripotencial es una célula no diferenciada que puede dar origen a cualquier líneas celulares. Estas
células tienen un genoma y necesitan de la expresión de factores pluripotenciales para mantenerse
en este estado y a lo largo del desarrollo reciben una serie de señales distintas y llevar a patrones
de expresión de genes distintos y esto en última estancia nos lleva a una muy amplia variedad de
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células que tiene un gripo de genes que se expresan en todas y otro grupo de genes que se expresan
específicamente.
La expresión génica
Figura de repaso de la semana anterior. Es una imagen importante.
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Regulación de la Expresión Génica
Los procesos que suceden en la célula son regulables en todos los niveles, desde la transcripción
hasta la proteína activa, los cuales son:
 Control transcripcional
o Este es el punto de control más importante de la regulación génica y es
principalmente al inicio de la transcripción.
 Control de procesamiento de ARN.
o Ejemplo del splicing alternativo
 Control del transporte y de la localización del ARN
o Ejemplo los ARN que salen del citoplasma son llevados al ribosoma pero en
muchísimos casos los ARNs se agrupan con otras proteínas en lo que se llaman
complejos ribonucleicos y van a sitios específicos de la célula a ser traducidos en
este sitio donde se ocupa una alta concentración de esta proteína por ejemplo en
el botón sináptico.
 Control de la degradación del ARNm
 Control de translocación
 Control de la actividad proteica
Es frecuente en la célula que se transcriban muchos genes pero el ARN sea degradado de una vez
porque la célula no necesita la proteína en ese momento pero cuando se active una señal puede
usar ese ARN que se encuentra en formación constante.
Regulación transcripcional: sitios de reconocimiento en promotor y FT’s
FT: factores de transcripción.
A nivel de la transcripción se debe tomar en cuenta lo de los territorios cromosómicos, entonces
para que suceda el proceso de transcripción los genes tienen que ser llevados a las fábricas de
transcripción desde sus puntos específicos en los territorios cromosómicos.
A nivel del inicio de la transcripción esta es regulada por factores de transcripción entonces algunos
FT llegan al núcleo y otros son más bien sacados del núcleo, y todo esto depende del ambiente de
cromatina en el que se encuentre. Esto se va a tratar en la clase de epigenética. Se da un estímulo
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para la expresión de un gen entonces se activa una serie de FT que se van a unir al promotor. El
promotor es más complejo de lo que se ha discutido con anterioridad porque presenta un montón
de sitios de reconocimiento para los diversos FT y a fin de cuentas el resultado final en la activación
o el silenciamiento de los genes va a depender de quienes se están pegando a que sitio de
reconocimiento. Por lo tanto lo importante es la combinación de los FT y no tanto de un u otro FT;
estos define si se expresa y el grado de expresión del mismo. Entonces a nivel de inicio lo importante
es la combinación de FT, un mismo FT puede ser activador o silenciador dependiendo de los otros
FT. El complejo de preiniciación siempre está ahí, lo que varían son los FT y depende de la
combinación de los mismo depende el efecto final que van a generar. Aumenta o disminuyen
afinidad, especificidad o eficiencia.
Figura básica para el examen.
EJEMPLO: CREB y los elementos CRE según TRED. CREB reconoce CRE pareo una secuencia no es
específica.
CREB proteína de unión al elemento de respuesta del AMPciclico. Entonces CREB es una FT que
reconoce una secuencia en el ADN CRE. Esta secuencia en el ADN CRE no es especifica (única) hasta
el momento existen 41 secuencias reportadas a las cuales se puede unir el CREB. Esto tiene un efecto
sobre el inicio de la transcripción esto porque si la secuencia es más o menos específica entonces el
FT puede interactuar de forma más o menos específica con otros FT. Esto tiene una relevancia
funcional pero también a nivel genómico. La importancia genómica es que pueden existir distintas
secuencia relacionadas lo que permite que la presión de selección para que estas secuencias surgan
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a lo largo del genoma sea menor, entonces básicamente el mismo factor de transcripción puede
regular a más genes porque se puede unir a distintas secuencias. Por ejemplo el CRE regula 150
genes activándolos o inactivándolos.
Otros elementos en cis
 Potenciadores y silenciadores:
Un elemento en cis se define como secuencias
presentes en el ADN. Todas las secuencias de
reconocimiento de promotores se encuentran en
cis. Además de secuencias promotoras, existe los
potenciadores y los silenciadores. Mientras tanto
los elementos en trans son los que se le unen al
ADN, como por ejemplo las proteínas que
reconocen los promotores.
Los potenciadores y silenciadores son secuencias
de ADN que existen corriente arriba o corriente
abajo de la secuencia que se va a transcribir, estas
secuencias pueden estar muy alejadas o muy
cercanas a la secuencia que se va a transcribir.
En el caso de los potenciadores, al ser reconocidos
por una proteína van a tener un efecto activador de la transcripción. Como lo dice su nombre, los
silenciadores al ser reconocidos por una proteína se encargan de silenciar la expresión.
El mecanismo de acción de los potenciadores y los silenciadores tiene varias hipótesis. La más
aceptada dice que los potenciadores actúan formando asas (loops). Al formar estas asas, las
proteínas que reconocen a estas secuencias pueden interactuar físicamente con la maquinaria de
transcripción. Otras hipótesis hablan de que las proteínas que se unen a los potenciadores o
silenciadores se unen y se deslizan hasta llegar a los sitios de transcripción.
Para que se puede formar el asa existen proteínas que la estabilizan. Dicha configuración se obtiene
en las fabricas de transcripción.
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 Aisladores:
También son elementos en cis las cuales como lo dice
su nombre aíslan. Esto lo hacen por el siguiente
mecanismo: supongamos que un mismo potenciador
puede actuar sobre varias maquinarias de
transcripción, por lo tanto sería un potenciador poco
específico. El aislador se va a encargar de darle la
especificidad para que no actúe sobre determinada
maquinaria. Esto lo logran con cambios a nivel del
plegamiento de la cromatina. Este efecto se puede
dar sobre potenciadores o silenciadores.
 Elementos trans:
Activador: proteína que reconoce al potenciador
Represor: son las proteínas que reconocen al silenciador
Promotores alternativos:
Un promotor es la secuencia reconocida
por la maquinaria de transcripción. Es
importante destacar que la cantidad de
promotores por gen son variables, por lo
que dependiendo de la ubicación de cada
promotor se van a transcribir diferentes
secuencias del mismo gen. Al no
secuenciarse el gen completo se van
producir fragmentos de ARNm que
producen proteínas truncadas.
Las proteínas normalmente a la hora de
ejercer su función forman complejos. Estos están formados por dímeros o heterómeros de la
proteína. Las proteínas truncadas van a pasar a ser parte de dichos complejos por lo que van a ser
funcionales. Estos promotores son regulados por sitios de unión a factores de transcripción
distintos, esto permite que se regule la transcripción de secuencias del gen de manera diferencial,
permitiendo la formación de proteínas truncadas distintas en una misma célula o entre células. El
fin último de dicho proceso es producir proteínas truncadas distintas dependiendo de los factores
de transcripción, lo cual genera que la función de los complejos proteicos sea distinta.
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Se ha observado que los humanos y los ratones comparten gran
parte del genoma. 95% de similitud. Muchas de las diferencias
que se han visto corresponden a los sitios de unión para factores
de transcripción. Se ha documentado que la mitad de los sitios
de reconocimiento son distintos, y de la mitad que son iguales el
acomodo es distinto. En la figura se observan tales diferencias.
Regulación postranscripcional:
Splicing alternativo:
Este proceso ocurre simultáneo al
splicing. Por lo tanto luego de eliminar los
intrones (splicing) se pueden eliminar
ciertos exones (splicing alternativo). Esto
permite producir proteínas distintas. A
pesar de alterar el número de exones, el
orden de los mismos no puede variar.
La regulación de este proceso es muy
compleja. En ella el spliceosoma utiliza
elementos U y más de 300 proteínas, las
cuales reconocen los límites exón-intrón.
Dependiendo de la fuerza de la secuencia
de ARN de este límite determina cortar el exón. La fuerza de de la secuencia de ARN se determina
por: la complementariedad de la secuencia con los elementos U, la arquitectura (tamaño) de los
exones e intrones, la fosforilación de la cola de la ARN polimerasa y factores unidos a la ARN
polimerasa, sitios de unión reguladores activadores o inactivadores, estructuras secundarias del
ARN mensajero, estructura de la cromatina y los micro ARN. Como se puede ver es un proceso muy
complejo en donde influyen gran cantidad de factores y como fin último permiten que el exón se
elimine.
MicroARN:
Son parte del ARN no codificante, son pequeños de 24 nucleótidos, producidos por más de mil
genes, regulan la expresión génica y el 60% de los genes en mamíferos son regulados por ellos.
Se producen de varias maneras:
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

A partir de genes individuales
Intrones no destruidos
Mecanismo de acción:
Cuando se produce por genes individuales se va a transcribir a partir de una secuencia de más de
1000pB. Al formarse el transcrito, éste presenta autocomplementariedad (se hibrida consigo
misma) y forma una horquilla.
Esa horquilla es reconocida por gran cantidad de proteínas entre ellas la proteína Drosha. Estas
proteínas cuentan ciertos nucléotidos y cortan produciendo un precursor de microARN que se va
al citoplasma.
El precursor microARN es de doble hebra por estar en horquilla, esa doble hebra en el citoplasma
es reconocida por un nuevo complejo que genera un corte al otro lado de la estructura hasta que
queda 24 nucléotidos. Este nuevo ARN es reconocido por proteínas como al Argonauta (AGO),
posterior a ello se elimina una de las hebras. Cuando solo queda una hebra, las proteínas usan la
hebra que queda para escanear otros ARN, si esa hebra es complementaria absoluta a un ARN
mensajero se marca para degradación. Mediante dicho mecanismo permite el silenciamiento de la
expresión de genes.
Esa complementariedad absoluta se da en la región semilla la cual es del nucleótido 1 al 8 en el
sentido 5-3 prima. La degradación se lleva a cabo mediante el reclutamiento de proteínas las cuales
quitan la capucha o la cola poli A.
Si la complementariedad no es absoluta ocurre regulación a nivel de la traducción, se recluta un
complejo que hace “algo” en la traducción, se cree que no permite el acoplamiento del ribosoma, o
que cuando se inicia la traducción se suelte el ribosoma, o que se degrade la proteína mientras se
forma.
Tradicionalmente los microARN son reguladores negativos. Sin embargo como se ve en la figura
los microARN pueden ser potenciadores o silenciadores. Además el reconocimiento puede ser a
nivel de ADN, actuando epigenéticamente. Además como se ve en la figura puede ser que active la
traducción.
Todo esto depende de con que complejo se junte.
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Regulación postraduccional:
Este es el último tipo de regulación, el cual ocurre en el
momento en que la cadena de aminoácidos se ha
formado. El ejemplo clásico es con el guardián del
genoma. p53 es un factor de transcripción que se activa
cuando hay daño en el ADN. Se produce
constitutivamente pero inmediatamente es degradada a
través de la MDM2 que le pega una ubiquitina. Con ello
se regula que su expresión sea solo cuando se necesita
salvar al genoma. Cuando hay daño se inhibe la MDM2
por lo que no hay ubiquitinación. Además de ello se
activan quinasas que potencian más su función. Como fin
último el p53 permite reparar el ADN, detener el ciclo
celular y si el daño es irreparable, apoptosis.
Moraleja: “A fin de cuentas , cada proceso puee ser regulado a varios niveles” PhD. Sequiera.
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Manipulación del ADN: algunas técnicas de análisis
PCR:
La reacción en cadena de la polimerasa permite replicar cierto segmento del ADN. Para este método
ello se utilizan primers, nucléotidos, cofactores.
Pasos:
1. Desnaturalización (95 C ): el ADN se separa
2. Hibridación: a (60 C): se unen los primers para determinar la secuencia que se quiere
replicar.
3. Elongación (72 C) : durante este proceso la polimerasa reconoce el grupo OH y replica
utilizando la hebra molde.
4. Repetición del proceso (apox 30 ciclos)
Para su análisis se separan los fragmentos de ADN mediante una electroforesis en geles de agarosa.
Muchas veces la PCR es el primer paso para el análisis genético, pero en algunos casos nos permite
hacer un diagnóstico como en deleciones, en donde si existiera la deleción se observaría un
fragmento de menor tamaño en la electroforesis.
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Análisis de restricción:
En el análisis de restricción se utilizan las enzimas de restricción, las cuales son endonucleasas que
reconocen secuencias específicas y generan un corte. Esto permite reconocer mutaciones en
hotspots (sitios de alta tasa de mutación).
Al interpretar una prueba de estas, en el caso de que exista una mutación la enzima de restricción
al estar diseñada para cortar la secuencia normal, no va a realizar el corte. Por lo tanto se va a
conservar la secuencia del tamaño original la cual se puede observar mediante una electroforesis.
Secuenciación
Esta técnica implica equipos de alta tecnología. Permite establecer la secuencia exacta del ADN
analizado. Para ello se amplifica una secuencia molde, agregando dinucleótidos con cloróforos.
Estos dinucléotidos al ser didesoxinucleótidos no presentan grupo hidroxilo por lo que la ARN
polimerasa no puede continuar la secuenciación y se produce un segmento específico. Esto ocurre
miles de veces y por probabilidades se van a producir segmentos de todos los tamaños.
Posteriormente dichos segmentos van a ser analizados e identificados por medios de los cloróforos.
Entonces por ejemplo si la máquina detecta un cloróforo azul en la posición 30, lo traduce como
que existe una citosina en la posición 30, así sucesivamente. Al final se genera una gradiente de
diferente tamaño que el aparato al a codificar a partir de una electroforesis. Esta técnica es el
estándar de oro y sirve en muchísimos análisis.
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PCR en Tiempo Real:
Esta técnica permite estudiar niveles de ARNm , con lo que mide expresión. Se utiliza en
enfermedades donde no haya silenciamiento total, sino que existen alteraciones de la expresión.
Para ello primero se usa una transcriptasa reversa que pasa el ARNm a ADNc.. Luego el ADNc se
cuantifica en tiempo real.
Para cuantificarlo se utilizan dos técnicas:


Sybr Green: es una molécula que
se une al ADNc cuando está en
doble hebra y al unirse florece. Se
mide la fluorescencia
Taqman: la sonda se pone en el
centro de la secuencia de ADNc,
esta sonda tiene una molécula que
florece y un secuestrados
(Quencher). Cuando las dos
moléculas están juntas el
secuestrador no deja que la otra
molécula brille. al darse el PCR se
degrada la sonda y se separan las
molécula y la que es fluorescente,
brilla.
Microarreglos
Son microchips con pozos que tiene ADN o ADNc conocido. Se depositan secuencias en los pozos.
En el caso que ocurra la hibirdación, al conocer el ADN de los pozos se puede conocer la secuencia
que se depositó en el mismo.
Knock out génico y condicional:
Permite silenciar genes y así estudiar su función

Génico: se genera una secuencia que posee a la vez secuencias marcadoras y silenciadoras,
se introduce en el gen del ratón y con ello se apaga el gen. El problema con ello es que se
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inactiva el gen desde las células embrionarias, y esto puede silenciar o interferir con genes
necesarios en el crecimiento.

Condicional: en la primera generación de ratones, el gen CRE /recombinasa, se introduce en
un ratón, este gen se encuentra en forma silenciada. Tenemos otro ratón que se le inserta
una secuencia LosP a los lados del gen que queremos silenciar. Se cruzan las cepas y el
nuevo ratón expresa la recombinasa y el LosP, La recombinasa está silenciada en ese ratón.
En determinado momento se activa dicha recombinasa. La recombinasa activada va a
silenciar la expresión del gen delimitado por el LosP. Esta técnica permite controlar el
momento y la célula específica que se va a silenciar..
Vectores virales:
Se utilizan virus para transportar el ADN que queremos integrar
en el genoma del animal. Los virus por naturaleza inyectan los
genes que se quieren sobreexpresar o silenciar.
ARN de interferencia:
Se inyecta un microARN el cual como se vio anteriormente silencia ARNm específico.
Ojalá se entienda, cualquier crítica me la dicen. Guiarse con las figuras.
Daniela Ruepert y Juan Diego Salazar
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