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VIII Congreso Virtual Hispanoamericano
de Anatomía Patológica — Octubre de 2006
Amaya Ojer Gambart
David Guerero Setas
Rosa Guarch Troyas (*)
Critina Bértolo
Ana Mancha Oraá
Mercedes Murillo
Lourdes Serrano Bermejo
Yolanda Laplaza Jiménez (*)
Juan M. Casas Fernández (**)
Belén Lloveras Rubio (***)
Ana Puras Gil (*)
Centro de Investigación Biomédica
Servicio Navarro de Salud
Pamplona, Navarra, España
(*) Anatomía Patológica
Hospital Virgen del Camino
Pamplona, Navarra, España
(**) Medicina Interna
Hospital de Navarra
Pamplona, Navarra, España
(***) Instituto Catalán de
Oncología Barcelona, Cataluña,
España
Correspondencia:
Amaya Ojer Gambart
Centro de Investigación Biomédica
C/Irunlarrea 3. 31008 Pamplona.
Navarra, España
http://conganat.cs.urjc.es
Patología Molecular
Metilación del gen RAS Association Domain Family 1A
(Rassf1-A) en cáncer de cérvix
El cáncer de cérvix está asociado a la presencia de virus del papiloma humano (VPH). El gen Rassf1-A codifica para una proteína implicada en la
regulación de la proliferación celular y de la apoptosis. Se ha descrito la
metilación de dicho gen en cáncer. Se analiza en una muestra de 21 casos la
hipermetilación del promotor del gen Rassf1-A en relación con la presencia
de VPH, la progresión tumoral y el grado histológico. La hipermetilación
de Rassf1-A es frecuente en cáncer de cérvix y no se asocia a VPH, estadio
tumoral o grado histológico.
Palabras clave: Cáncer de cérvix; virus del papiloma humano; metilación;
Rassf1-A
Cervical cancer is correlated to human papillomavirus (HPV). Rassf1-A
gene is involved in cell proliferation and apoptosis. The methylation of this
gene has been described in cancer. We analyse the associations between
hypermethylation of Rassf1-A gene, HPV, stage and histologic grade in 21
patients with cervical cancer. This alteration is frequent in cervical cancer,
and is not associated with HPV,tumor stage and histologic grade.
Keywords: Cervical cancer; human papillomavirus; methylation; Rassf1-A
Telf: +34 848 422 186
Fax: +34 848 422 200
E-mail: amayaojer@hotmail.com
INTRODUCCIÓN
El virus del papiloma de alto riesgo (VPH-AR) está presente en un porcentaje superior al 95 % de los casos de
cáncer de cérvix, en los que VPH-16 y VPH-18 constituyen los tipos más frecuentes (1). La metilación del
ADN es, junto con la estructura de la cromatina, un factor que regula la expresión de genes, y tiene lugar en
las citosinas de secuencias 5’CG3’, de 500 a 5000 bases
de tamaño presentes en la mitad de los genes humanos
aproximadamente Dichas secuencias son denominadas
islas CpG. La metilación provoca en cáncer el silenciamiento de la expresión de genes, como los implicados en
la adhesión celular (2).
El gen RAS Association Domain Family 1A (Rassf1A) codifica para una proteína que pertenece a la familia
de efectores de RAS y que está implicada en los mecanismos de regulación de la proliferación celular y la
apoptosis (3), así como en los mecanismos de adhesión
y migración celular (4).
Se valora la posible asociación entre la metilación del
gen, la progresión tumoral y la presencia del virus de
VPH.
PACIENTES Y MÉTODOS
Se considera una población de 21 casos con cáncer de
cérvix escamoso (squamous cervical cancer, SCC). El
28.6 % (6 pacientes), 38.1 % (8 pacientes) y 33.3 % (7
pacientes) de los casos se diagnostican como carcinoma
in situ, carcinoma intraepitelial de grado III (CIN III) y
carcinoma infiltrante (Fig.1). El tipaje del virus se realiza
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mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la técnica Reverse Line Blot (RLB), descrita previamente (5), que permite determinar además del
tipo la coexistencia de varios tipos virales en la misma
muestra. Se emplean los cebadores GP5+/6+ con sondas
para los tipos de AR (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56, 58, 59, 66 y 68) y BR (6, 11, 26, 34, 40, 42, 43, 44,
53, 54, 55, 57, 61, 70, 71/ CP8061, 72, 73, 81/CP83104,
82/MM4, 82/IS39, 83/MM7, 84/MM8) y revelado mediante quimioluminiscencia (Fig. 2).
La técnica para el estudio de metilación del gen Rassf1A es la PCR específica de metilación (Methylationspecific PCR, MS-PCR), que consiste en una PCR
para síntesis de fragmento de secuencia desmetilada y metilada a partir de ADN modificado mediante bisulfito sódico (6). Las secuencias de los cebadores empleados fueron, para la reacción desmetilada 5’-TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG-3’ (cebador
sentido) y 5’-CAAACCCCACAAACTAAAAACAA-3’
(cebador antisentido); para la reacción metilada: 5’GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3’ (cebador sentido) y
5’-AACCCCGCGAACTAAAAACGA-3’ (cebador antisentido), que permiten analizar la isla CpG presente en
el promotor del gen (Fig.3). Las comparaciones en las
distribuciones de las variables se realizaron mediante el
test γ 2 o el test exacto de Fisher, mediante el programa
estadístico SPSS (versión 16.0, Inc., Chicago, USA), ,
considerando un nivel de confianza del 95 %.
El porcentaje obtenido para la hipermetilación del promotor en nuestro grupo de estudio de SCC es superior
al descrito previamente (12). Tal y como ha sido descrito por este grupo no se asocia con la presencia de
VPH. Sin embargo este resultado contradice la hipótesis
de la tendencia de asociación inversa entre la presencia
de VPH y la hipermetilación del gen Rassf1-A, descrita
por el grupo de Kuzmin y cols. en SCC (13). Todos los
casos infiltrantes presentan hipermetilación del promotor, y ello sugiere que la hipermetilación del promotor
tiende a asociarse con la progresión tumoral, aunque sin
valor de probabilidad asociada. Un estudio con un grupo
más numeroso permitiría valorar esta hipótesis.
La asociación entre un mayor porcentaje de metilación
y el grado histológico desfavorable ha sido descrita en
cáncer de colon (14), y en cáncer de próstata (15), pero
no se ha demostrado en el presente estudio en el que
la metilación distribuida igualmente en todos los grados
histológicos.
REFERENCIAS
RESULTADOS
El 100 % de las muestras son positivas para la presencia del virus VPH-16, que no coexiste con ningún otro
tipo viral en ningún caso. Un porcentaje del 23.8 % de
los casos presentan hipermetilación del promotor del gen
Rassf1-A, y esta alteración no se asocia con el grado histológico (p=0.388) y con el diagnóstico, ya que los porcentajes de metilación son similares en los casos CIS, en
CINIII, y en los carcinomas infiltrantes (p= 0.621).
DISCUSIÓN
La hipermetilación del gen supresor Rassf1-A ha sido
una alteración descrita en numerosos tipos tumorales,
como pulmón (7), mama (8), y cáncer de ovario (9), con
una clara implicación en el control del ciclo celular (10).
Esta alteración epigenética está presente en SCC, pero
con una menor frecuencia que en adenocarcinomas de
cérvix, tal y como se ha descrito recientemente (11).
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ICONOGRAFÍA
Figura 1.- Carcinoma cervical: neoplasia intraepitelial (Fig. 1.1.) e infiltrante (Fig. 1.2.), (H&E, 100x).
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Figura 2.- Miniblotter empleado para la técnica de Reverse-Line-Blot (izquierda) y resultado de hibridación de los
casos, dispuestos horizontalmente, con las sondas de AR y BR dispuestas verticalmente(derecha).
Figura 3.- Imagen de gel de agarosa 2,5 % con resultados de técnica de MS-PCR para el gen Rassf1-a.
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