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Biorreconocimiento de las adhesinas de Escherichia coli K88 hacia
glicoproteínas y neoglicanos de origen porcino
Ramos-Clamont, M. G., Sarabia-Sainz, A., y Vázquez-Moreno, L*
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C. Carretera a la Victoria Km
0.6 Hermosillo, Sonora. Coordinación de Ciencia de los Alimentos. Tel/fax 662 280 00
58. e-mail * lvazquez@ciad.mx
Resumen
Escherichia coli
(E. coli) K88 provoca diarreas en lechones causando grandes
perdidas a la porcicultura. El primer paso de la infección, es el biorreconocimiento
entre las adhesinas bacterianas y los oligosacáridos de los glicoconjugados
localizados en las mucinas y las membranas celulares del intestino. Para prevenir la
infección se estudian estrategias que impiden esta unión. Una de ellas es utilizar
glicoproteínas y/o neoglicanos cuyos oligosacáridos serán reconocidos como
receptores de las adhesinas bacterianas, bloqueando los sitios de unión de la bacteria
al intestino. Se estudió la interacción de las adhesinas de E. coli K88 con los
oligosacáridos de las inmunoglobulinas porcinas (Igs) ó de la albúmina porcina glicada
(APG) con lactosa (neoglicano). Las proteínas de suero porcino se aislaron y
purificaron por cromatografía de interacción hidrofóbica y de afinidad. La APG se glicó
con lactosa (1:200) por 30 min a temperaturas de 60 a 120 °C generando neoglicanos.
La interacción adhesina-oligosacárido se detectó in vitro mediante ensayos de
manchas cuantificándose en un analizador de imágenes. Los oligosacáridos de la IgG
y de la IgM no interaccionaron con la adhesina, mientras que los de la IgA y la APG si.
Por ello, éstas últimas tienen potencial profiláctico en diarreas de lechones.
Abstract
Diarrhea caused by Escherichia coli (E. coli) K88 infections in piglets is the major
cause of economic losses in swine industry. Biorecognition of E. coli K88 adhesins to
host intestinal oligosaccharides is a prerequisite for the initiation of infection. Blocking
these adhesins by suitable carbohydrates or their analogs (glycoproteins or
neoglycans) for prevention of intestinal bacterial adhesion is the aim of prophylaxis for
such diseases. In this study, E. coli K88 adhesin interactions with immunoglobulins
(Igs) oligosaccharides and porcine glycated albumin (PGA) with lactose (neoglycans of
PGA) were tested. Immunoglobulins and albumin were isolated from porcine serum by
1
hydrophobic interaction chromatography and purified by affinity chromatography. For
neoglycan production, PGA was modified by glycation with lactose (1:200) heated at 60
to 120 °C for 30 min. In vitro adhesin-oligosaccharide interaction was detected by Dot
Blot and quantified by Image Analysis. Only IgA oligosaccharides and glycated PGA
interacts with K88 adhesin, while IgG and IgM sugars neither were nor recognized.
Consequently IgA and PGA proteins have potential use in the prophylaxis of piglet
diarrhea
Introducción
Las diarreas de origen infeccioso son uno de los padecimientos más frecuentes
en cerdos neonatos y recién destetados. Preferentemente atacan a los lechones más
débiles y pueden contagiar al resto de la camada. Es por ello que no prevenirlas o no
tratarlas cuando aparecen, conduce, en la mayoría de los casos, a la muerte de los
animales. Si ésta no ocurre, los lechones quedan débiles, enfermizos y con dificultad
para salir adelante de forma rentable. Uno de los agentes etiológicos más comunes
que ataca a los lechones del Hemisferio Norte es la Escherichia coli enterotoxigénica,
particularmente aquella que expresa fimbrias del tipo K88. Generalmente este tipo de
padecimientos se tratan con antibióticos. Sin embargo, en la actualidad se requiere
prevenir la enfermedad más que tratarla, entre otras cosas porque el abuso de
antibióticos promueve la resistencia bacteriana y deja residuos tóxicos en los
alimentos.
Una de las líneas de investigación para la prevención de diarreas es la
glicoterapia. Esta estrategia pretende impedir el primer paso del proceso infectivo de
algunos microorganismos que consiste en la unión de las bacterias a las células del
huésped. En el caso de E. coli K88 esta unión se lleva a cabo por medio del
biorreconocimiento entre de adhesinas, localizadas en la punta de sus fimbrias y los
carbohidratos (oligosacáridos) unidos a proteínas o a lípidos en la superficie de las
membranas celulares del intestino. La E. coli K88 reconoce principalmente
oligosacáridos que contienen galactosa, entre ellos, aquellos que cuentan con N acetil
lactosaminas en su estructura. Una vez que ocurre el reconocimiento, la bacteria se
adhiere y es capaz de infectar a la célula provocando la enfermedad.
Estas
observaciones llevaron a diversos científicos a proponer el uso de oligosacáridos libres
o en forma de glicoconjugados para inhibir la adhesión de las bacterias a las células
huésped (Sharon, 2005).
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Entre
las
proteínas
más
abundantes
del
suero
se
encuentran
las
inmunoglobulinas (IgA, IgG e IgM) y la albúmina. Las primeras son glicoproteínas que
contienen estructuras oligosacáridas que pueden interaccionar con lectinas y
posiblemente con adhesinas bacterianas. Por otro lado, la albúmina es la proteína más
abundante del suero y es una de las proteínas que puede modificarse por la adición de
carbohidratos mediante la reacción de Maillard, como lo prueba la glicación que ocurre
en los pacientes con diabetes. Mediante esta modificación puede también
establecerse un biorreconocimiento adhesina-carbohidrato. De esta manera se
podrían aprovechar las proteínas de la sangre porcina, que regularmente se desechan
causando contaminación. Es por ello que este trabajo consistió en la separación y
purificación de inmunoglobulinas y albúmina porcinas, la posterior modificación de la
albúmina con lactosa para convertirla en neoglicanos y la determinación del
reconocimiento de estas moléculas porcinas por la adhesina de E. coli K88. Lo anterior
con el fin deensayarr cuales de estos compuestos tienen un potencial uso terapéutico
en la prevención de diarreas de lechones.
Materiales y Métodos
Muestra
La sangre porcina se obtuvo en la ciudad de Hermosillo Sonora, de la línea de
sacrificio de una planta Tipo Inspección Federal, el cual contaba con sistema de
Análisis de Riesgos, de Identificación y Control de Puntos Críticos (HACCP)
implementado. Se realizaron 10 muestreos de 10 L de sangre, provenientes de 5
animales sanos. Las muestras se trasladaron al Laboratorio de Bioquímica de
Proteínas del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. (CIAD), en
recipientes estériles, en hieleras. El suero se obtuvo por decantación, previa
coagulación natural de la sangre a 25 °C. Posteriormente se centrífugo a 10,000 rpm
para desgrasarlo y se congeló a – 40 °C hasta su uso (Ramos-Clamont et al., 2003).
Aislamiento y purificación de albúmina e inmunoglobulinas
Para la separación de albúmina e inmunoglobulinas (Igs) porcinas se utilizó la
cromatografía de interacción hidrofóbica. Se sintetizó una matriz de agarosa altamente
acetilada (Sefarosa HA), según el procedimiento descrito por Vázquez-Moreno et al.
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(1992). El proceso cromátografico se realizó según Ramos-Clamont et al. (2006).
Brevemente la albúmina fue obtenida en la fracción de lavado, utilizando como fase
móvil Na2SO4 0.5 M, MOPS 10 mM, pH 7.6, mientras que las Igs se aislaron en la
fracción de elución con MOPS 10 mM, pH 7.2. Para la purificación de albúmina la
fracción de lavado se aplicó a una columna de Sefarosa-Cibacron azul (BioRad, CA,
USA), mientras que para la purificación de cada tipo de inmunoglobulina, se utilizó,
para cada caso, matrices de Sefarosa acopladas con Anti-IgA, Anti-IgG o Anti-IgM
(Ramos-Clamont, 2003). La pureza de las fracciones proteicas se confirmó por SDSPAGE según Laemmli (1970) y por inmunodetección con Western Blot según Towbin
et al. (1979).
Glicación de albúmina
Para la glicación de la albúmina se mezclaron soluciones de albumina: lactosa
a razón molar de 1:200 según la metodología propuesta por Boratynski y Ranska
(2002), posteriormente se liofilizaron y se sometieron a temperaturas de 60, 80, 100 y
120 °C durante 30 min. Después de dializarlas contra agua las muestras se liofilizaron
nuevamente y se caracterizaron por SDS PAGE.
Cultivo y marcaje de bacterias
La cepa de E. coli K88 se incubó durante 36 h a 37 ºC con agitación (Lab-line
Instruments, USA) a 100 rpm. Posteriormente se centrifugó a 13, 000 g y se lavó 3
veces con solución balanceada de Hanks, se ajustó el contenido de bacterias a una
concentración aproximada de 2 x 109 UFC/mL y se marcó con biotina (Ruhl et al.,
1996). La interacción con las adhesinas bacteriales se determinó mediante un ensayo
de manchas (Dot Blot) inmovilizando las glicoproteínas y los neoglicanos en tiras de
nitrocelulosa. Se utilizó como control negativo albúmina sin glicar y como control
positivo, mucinas aisladas de intestinos de lechón. Para revelar la interacción se usó
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el sistema avidina-peroxidasa, y para cuantificarla, las machas se registraron en un
analizador de imágenes Veradoc de BioRad (Ca, USA).
Resultados y Discusión
El aislamiento de albúmina e inmunoglobulinas se hizo mediante cromatografía
de interacción hidrofóbica. La figura 1A muestra el cromatograma típico en el que la
fracción de lavado (pico 1) constituyó la albúmina y la de elución (pico 2) las
inmunoglobulinas. La figura 1B representa el patrón electroforético de la fracción de
lavado, se observa una banda mayoritaria correspondiente a la masa molecular de la
albúmina porcina (Pastoret et al., 1998) y otras minoritarias que posteriormente fueron
eliminadas al purificar esta fracción con una matriz de Sefarosa-Cibacron azul.
En la fracción de elución (pico 2) de la cromatografía de interacción hidrofóbica
se aisló a las inmunoglobulinas A, G y M del suero porcino (IgA, IgG e IgM,
respectivamente). En la figura 1C se observa el patrón electroforético típico de las Igs
representado por una banda a 55 kDa, a las cadenas pesadas y una de 25 kDa,
correspondiente a las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas. Para purificar a cada
una de las Igs, esta fracción se aplicó a columnas cromatográficas empacadas con
matrices de Anti-IgA-Sefarosa, Anti-IgG Sefarosa o Anti-IgM Sefarosa. La pureza de
las glicoproteínas (IgA, IgG, IgM) y de la albúmina, se determinó mediante SDS-PAGE
e inmunodetección (Datos no mostrados).
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Figura 1. Aislamiento de albúmina e inmunoglobulinas porcinas por cromatografía de
interacción hidrofóbica. A. Cromatograma típico, pico 1, fracción de lavado, pico 2,
fracción de elución. B. Patrón electroforético de la fracción de lavado, C. Patrón
electroforético de la fracción de elución.
Para la obtención de los neoglicanos de albúmina, se llevó a cabo una glicación
en fase sólida utilizando concentraciones molares de albúmina:lactosa 1:200. Se
escogió a este disacárido debido a la especificidad de la adhesina K88 por galactosas
y lactosamina. La figura 2 muestra el SDS-PAGE al 8% de los diferentes tratamientos
de glicación. La adición de lactosa a la albúmina provocó un aumento en la masa de la
proteína que se vió reflejado en los patrones electroforéticos de los neoglicanos, como
puede observarse en los carriles correspondientes a la glicación de albúmina a 60, 80,
100 y 120 °C (carriles 3, 4, 5 y 6, respectivamente). Los tratamientos a 100 y 120 °C
fueron los más efectivos en cuanto a la cantidad de lactosas añadidas a la albúmina.
Sin embargo, esto deberá comprobarse por una técnica más exacta, por ejemplo la
espectroscopia de masas.
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Figura 2. SDS-PAGE al 8% de los neoglicanos obtenidos por la glicación de albúmina
con lactosa. Carril 1, control negativo, albúmina porcina sin glicar (APsG); carril 2,
APsG calentada; carril 3 AP glicada (APG) a 60 ° C; carril 4 APG a 80 °C; carril 5 APG
a 100 °C; carril 6 APG a 120 °C; carril 7, estándares de masa molecular.
Una vez purificadas las glicoproteínas (IgA, IgG e IgM) y sintetizados los
neoglicanos de albúmina, fueron inmovilizados en tiras de nitrocelulosa a diferentes
concentraciones y puestos en contacto con la E. coli K88 biotinilada. Posteriormente
se reveló la interacción con el sistema avidina-peroxidasa. De las glicoproteínas
purificadas y analizadas únicamente los oligosacáridos de la IgA interaccionaron con la
adhesina de la E. coli K88. Lo anterior puede deberse a que la IgA de cerdo contenga
estructuras galactosiladas tal como la IgA humana (Mattu et al., 1994). Por lo que
respecta a los neoglicanos, todos, excepto aquellos generados a 120 °C, mostraron
interacción con la adhesina. Posiblemente la reacción a 120 °C procedió más alla de la
formación de la base de Schift, formando aductos de la reacción de Mailllard que no
pudieron ser reconocidos por la adhesina.
La figura 3 muestra el análisis de imagen para la interacción con de la adhesina
de E. coli K88 con las diferentes muestras. Podemos observar que la interacción con
los carbohidratos de la IgA ocurrió únicamente a concertaciones de 1 y 0.5 μg,
mientras que la interacción con la lactosa de la APG a 60 °C ocurrió hasta
concentraciones de 0.12 μg. Se puede observar además que para que la interacción
in vitro de APG a 60 °C sea idéntica a la que se establece con las mucinas de lechón
(receptor natural del patógeno) se requiere aumentar la concentración del neoglicano
al doble. Otra posibilidad sería aumentar el número de lactosas unidas a la APG. Estos
resultados en conjunto indican que de las glicoproteínas y neoglicanos estudiados, la
APG a 60 ° C tiene el mayor potencial tiene para prevenir la adhesión de la E. coli K88.
Sin embargo, se requiere de estudios complementarios para probarlo.
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Figura 3. Interacción de las adhesinas de Escherichia coli K88 con los carbohidratos
de las glicoproteínas y neoglicanos porcinos
Referencias
•
Boratynski, J., Banska, U. 2002.Archivum Immunologiac et Therapiae
Experimentalis. 50: 61-66.
•
Butler, J.E. y Brown, W.R. 1994. Vet. Immunol. Immunopath. 43: 5.12.
•
Laemmli, U.K. 1970. Nature. 227: 680-685.
•
Pastoret, P.P., Griebel, P., Bazin, H. y Govaerts, A. 1998. Immunology of the
pig en Hanbook of vertebrate immunology. Academic Press USA. 373-419.
•
Ramos Clamont Montfort G. 2003. Tesis Doctorado. CIAD.
•
Ramos-Clamont, M.G., Candia-Plata, M.C., Guzman Zamudio R., VazquezMoreno, L. 2006. Journal of Chromatography A 1122: 28–34.
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Sharon, N. 2005. Biochemica et Biophysica Acta 50: 1-11.
•
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•
Vázquez Moreno, L., Porath, J., Schluter, S.F. y Marcalonis, J.J. 1992.
Com.
Biochem. Physiol 103B (3): 563-568.
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