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Diagnóstico de Rabia.
VERONICA YUNG PEREDO
SECCION RABIA
INSTITUTO DE SALUD PUBLICA DE CHILE
RABIA
La Rabia es una zoonosis milenaria de alta importancia en
salud pública a nivel mundial, por su amplia distribución y
propagación entre reservorios de animales. Produce una
encefalitis fatal en los seres humanos y en otros
mamíferos.
Período de incubación
EL PERIODO DE LA INCUBACION DEPENDE DE VARIOS FACTORES:
- SITIO DE LA MORDIDA
- CANTIDAD DE VIRUS INOCULADO
- EDAD DEL HUESPED
- ANTECEDENTES GENETICOS
- ESTADO INMUNITARIO
- CEPA VIRAL IMPLICADA
- GRAVEDAD DE LAS HERIDAS
Rabia en Chile
1950
1960
Rabia urbana
Endémica
1962
1972
1982
Disminución
de casos
1984
Silencio
epidemiológico
Caso humano V1
Instauración de un programa
de control y prevención de la rabia
en el país
1- Reducir la población canina
2- Inmunizar masivamente a los perros
3- Aumentar la cobertura del diagnóstico de rabia
Rabia en Chile
1985
Casos
Murciélagos
insectívoros
1990
1996
2007
2013
Caso perro y gato
V4
Caso rabia
Se implementa
humano
caracterización viral
Caso humano V4
Ultimo caso perro V1
1997
Situación de la Rabia en Chile
En los últimos años la situación epidemiológica de la
Rabia se presenta como una endemia en murciélagos
insectívoros con un promedio de 80 a 100 casos
positivos anuales, lo que implica que estos quirópteros
son un riesgo real en la trasmisión de la rabia para el
hombre y los animales.
Virus de la rabia
•Neurotrópico
•Reproducción citoplasmática
•Virus RNA envueltos en forma de bala, que suele medir
75x180nm
•Sobrevive a 4ºC durante semanas, y a – 70 ºC durante años
•Muere rápidamente por la radiación ultra violeta o a la luz
solar, por solventes lipídicos, tripsina, detergentes y por un
Ph extremo
- RNA simple hebra, negativo, no segmentado
-5 genes que codifican para las proteínas estructurales del virus
VIRUS RABICO
Composición molecular y clasificación.
Posee 2 unidades estructurales:
1.-Envoltura bilipídica derivada de la célula huésped cubierta de espículas
o proyecciones de trímeros de proteína G que reconocen y se unen a los
receptores acetilcolina de la célula
•La proteína G es responsable para reconocimiento de receptores y fusión.
•La proteína G es el único antígeno que induce anticuerpos virus-neutralizantes
VIRUS RABICO
2.- Complejo ribonuclecapside (RNP)
Estructura helicoidal compuesta por el ARN viral, asociado a las
proteínas N nucleocápside, L ( RNA polimerasa) y P (fosfoproteína cofactor
de la polimerasa)
La proteína N proporciona protección para el ARN y puede regular
el balance entre la transcripción y replicación
Clasificación
Orden Mononegavirales
Familia Rhabdoviridae
Género: Lyssavirus
A las especies del género Lyssavirus inicialmente se las conocía como
serotipos, actualmente como genotipos:
1. Virus de la rabia (RABV) (Rabia clásica)
distribuido en Continente Americano
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Murciélago de Lagos (LBV) 1956
Mokola (MOKV) 1968
Duvenhage de murciélago (DUVV) 1970
Lyssavirus tipo 1 de murciélagos europeos (EBLV-1) 1992
Lyssavirus tipo 2 de murciélagos europeos (EBLV-2) 1995
Lyssavirus de murciélagos australianos (ABLV) 1996
4 Nuevos genotipos del genero Lyssavirus descritos en
Eurasia
8.
9.
Asia Central
Aravan 1991
Khujand Central 2001
Irkut 2002
11. Virus de murciélago occidental caucásico
(WCBV) 2002
10.
ICTV = International Committee on Taxonomy of Viruses (www.ictvonline.org/)
Rusia
Diagnóstico de Rabia
Permite definir la conducta clínica a seguir con las personas
expuestas.
Es una herramienta fundamental para la toma de
decisiones en el programa control de focos y de
prevención.
Aporta los antecedentes de la situación epidemiológica de
la enfermedad.
ALGORITMO DIAGNOSTICO DE INFECCION POR VIRUS RABICO
MUESTRA (CEREBRO)
IFD
NEGATIVO
INDETERMINADO
POSITIVO
INFORME
INOCULACION
RATONES
INFORME
NEGATIVO
POSITIVO
INFORME
INFORME
Sueros: Titulación de anticuerpos antirrábicos
INOCULACION
RATONES
IDENTIFICACION
ANTIGENICA Y/O GENETICA
Detección de Antígeno viral.
Técnica de Inmunofluorescencia Directa (IFD) Técnica rápida de alta
sensibilidad y especificidad.
Aislamiento de virus rábico. Permite realizar el aislamiento y
confirmación de IFD ( 21 días)
Tipificación viral. Anticuerpos monoclonales y secuenciamiento
genético del virus rábico. Identificar variantes virales circulantes
Determinación de anticuerpos antirrábicos :
Inhibición de focos fluorescentes RIFFT. Cuantificación de anticuerpos
neutralizantes.
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
Antígeno viral
2.- Detección de Anticuerpos Antirrábicos
Inhibición de focos fluorescentes RIFFT. Cuantificación de anticuerpos
neutralizantes.
Sueros
LCR
Titulación de Anticuerpos RIFFT
INFORME
-Desde el año 2005 la Sección Rabia del Instituto de Salud Pública
participa en el test de proficiencia realizado por la Agencia Nacional de
Seguridad Sanitaria (ANSES,Francia) con la aprobación de este test,
siendo el primer laboratorio de América Latina en ser autorizado para
realizar esta determinación a las mascotas que ingresan a la comunidad
europea.
-Desde el año 2011 la sección rabia del ISP participa en una
prueba de interlaboratorios en las técnicas de IFD y tipificación
viral por secuenciamiento genético, con resultados satisfactorios.
Identificación de la variante viral
Tipificación Antigénica: Anticuerpos monoclonales
Tipificación Genética: Secuenciamiento genético
Tipificación Antigénica de virus rábico
Panel de 8 Anticuerpos monoclonales que reaccionan con epitopes
específicos de la nucleoproteína.
Las variantes antigénicas definidas dentro del genotipo 1 han permitido
determinar que existe una asociación específica de la variante con el reservorio
natural del virus.
Panel de Identificación de Anticuerpos Monoclonales
C1
C4
C9
C10
C12
C15
C18
C19
AgV
CVS/ERA
+
+
+
+
+
+
+
+
Lab.
Perro/Man
+
+
+
+
+
+
-
+
V 1
Perro
+
+
-
+
+
+
-
+
V 2
Vampiro
-
+
+
+
+
-
-
+
V 3
T.brasiliensis
-
+
+
+
+
-
-
-
V 4
Vampiro
-
+
V
+
+
V
-
V
V 5
L. cinereus
v
+
+
+
+
-
-
-
V 6
Zorro
+
+
+
-
+
+
-
+
V 7
Zorrillo
-
+
+
+
+
+
+
+
V 8
T.bras. Mex.
+
+
+
+
+
-
-
-
V9
CARACTERIZACION ANTIGENICA
1977-1990
Variante
Antigénica
1977
1981
1983
1
1P
1P
1B
4
1B
1985
13Tb
1G
1986
2P
1G
5Tb
1987
1988
13Tb
1C
1P
1Tb
1989
2Tb
1990
Total
1P
4
8Tb
1P
50
NT
3
1Mch
Tb: Tadarida brasiliensis, Mch: Myotis chiloensis, G: Gato, P: Perro, B: Bovino
1
CARACTERIZACION ANTIGENICA
1991-1999
Variante
Antigénica
1993
1996
1997
1998
1999
2000
2001
Total
6Tb
44Tb
1H
9Tb
1P
1G
9Tb
31Tb
54Tb
24Tb
182
6
4Lc
4Lc
1Lc
3Lb
12
NT
3Hm
1Hm
1G
5Hm
10
1Mch
1
4
3
1991
1Tb
1992
1Tb
NT: not typified, Tb: Tadarida brasiliensis, Lc: Lasiurus cinereus, Mch: Myotis chiloensis, G: Gato, P: Perro
CARACTERIZACION ANTIGENICA
2002-2012
Variante
Antigénica
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
Total
90Tb
1Mch
100Tb
73 Tb
1P
1G
70Tb
42Tb
51Tb
80Tb
74Tb
822
3Lc
2Lb
1Lc
9Lc
1Lb
6Lc
40
3Hm
2Hm
19
1Mch
7
4
96Tb
68Tb
74Tb
1Mch
6
2Lc
2Lc
2Lb
1Lc
3Lc
2Lb
3Lc
1 Lc
2Lc
NT
5Hm
1Tb
1Hm
1Hm
1Hm
3 Hm
2Hm
3
1Mch
1Mch
1Mch
1Mch
1Mch
8
9
1Mch
2 Tb
1Mch
1Mch
2
2Tb
4
NT: not typified, Tb: Tadarida brasiliensis, Lc: Lasiurus cinereus, Mch: Myotis chiloensis, G: Gato, P: Perro
Tipificación de virus rábico
•Tipificación Genética:
Secuenciamiento de gen
de la nucleoproteína para determinar la variabilidad genética
de los virus según reservorio.
Caracterización Genética
•
•
•
•
•
•
Extracción de RNA de tejido infectado
Transcripción reversa del RNA
Amplificación del DNAc por Reacción de Polimerasa en Cadena
Purificación del DNA
Secuenciación de DNA por PCR (320 pb, hoy 1500pb)
Análisis de las secuencias por programas computacionales
Como determinar la relación genética de los virus ?
Construcción de árboles filogenéticos
La definición de las variantes genéticas
permite realizar estudios de filogenia,
filogeografía y de epidemiología molecular
de la enfermedad.
eblvfr32
duv320
Desmodus rotundus Canada
Tadarida brasiliensis Brasil
Vampiro Peru
91
66
Histiotus sp.Chile
Cat Chile
Domestic
animals Chile
73
87
97
93
Myotis sp. Chile
Myotis sp. california
Myotis evotis
Lasiurus borealis Texas
Lasiurus cinereus USA
Lasiurus sp. Chile
Insectivourus bat Canada
97
87
0.1
Tadarida brasiliensis Chile
Tadarida brasiliensis USA
Tadarida brasiliensis Canada
Genetic and antigenic typing of rabies virus in Chile. Yung V, Favi M, Fernández J. Arch Virol. 2002 Nov; 147(11):2197-205.
Typing of the rabies virus in Chile, 2002–2008
Yung V., Favi M. Fernandez J. Epidemiol. Infect. 2012
Tb-2519_AV4
AY233427 Tb Arg.
Tb-732_AV4
Tb-1123_AV4
Tb-373_AV4
Tb-398_AV4
Ct-2427_AV4
Tadarida brasiliensis
Tb-789_AV4
Dg-2426_AV4
Dec;140(12):2157-62.
Tb-534_AV4
Tb-2701_AV4
Tb-610_AV4
Tb-3049_AV4
Tb-2899_AV9
Tb-815_AV4
Tb-188_AV4
AY233428 Tb Arg.
Tb-3190_AV4
Tb-1107_AV9
Tb-780_AV4
94 Tb-101_AV4
Tb-992_AV4
Tb-1275_AV4
87
Tb-131_AV4
Tb-26_AV4
50
EF377701 Colombia
Hematofagous bats
AB201803
AB297635
73
AF045166
AF394876
Tadarida brasiliensis North America
AY959947
AY170236
DQ416111
AB297658
64
AY233449 Argentina
99
Mch-2544_AV3
Myotis chiloensis
Mch-1110_AV8
Mch-2821_AV3
Mch-421_AV8
Mch-2672_AV3
Mch-462_AV3
Mch-3171_AV4
EF377703 I Brasil
AY233448 Argentina
81
DQ416123 Mexico.
Hm-860_NT
Hm-2106_NT
Tb-1980_NT
85
Hm-908_NT
Histiotus sp
Hm-419_NT
Hm-462_NT
Hm-1465_NT
Hm-880_NT
Hm-592_NT
Hm-2386_NT
94
EF377705 Colombia
98
AY039224 Texas
DQ416120 Mexico
Tb1952_AV9
AF351845 USA
AF394883 Texas
AB297653 Brazil
99
AF351844 USA
Lc-03_AV6
Lb-1193_AV6
Lasiurus sp.
Lc-2125_AV6
Lc-2665_AV6
Lc-1252_AV6
Lc-3043_AV6
Lc-299_AV6
88Lc-2593_AV6
Lc-543_AV6
Lc-804_AV6
Lc-1320_AV6
Lb-679_AV6
Lb-198_AV6
Lb-3215_AV6
94
AY233401 Lc-1236_AV6
AY340785
AgV1-AgV2
AY233423
EBLV
DUVV
0.05
12-41 Tb
12-78 Tb
TIPIFICACION GENETICA. VIRUS RÁBICO. 2012
12-1256 Tb
SECCION RABIA. SUBDEPARTAMENTO GENETICA MOLECULAR
12-1430 Tb
12-1142 Tb
12-260 Tb
12-1107 Tb
Tadarida brasiliensis
12-494 Tb
92 12-642 Tb
12-165 Tb
12-437 Tb
12-527
Tb
100
12-1150 Tb
12-393 Tb
12-394 Tb
56
Tb30 JF826130
88 12-136 Hm
Histiotus macrotus
100
12-966 Hm
Hm860 HQ341793
12-729 Lc
Lc1564 HQ341795
100
Lb287 HQ341794
100
12-510 Lc
Lasiurus sp.
12-1480 Lc
12-220 Lc
12-478 Tb
100
12-702 Lc
12-1428 Lb
12-772 Mch Myotis chiloensis
69
My258 HQ341796
Genotipo 1
U22848 DUVV
U22845 EBL
0,05
Velasco-Villa A et al. J. Clin. Microbiol. 2006;44:1697-1710
Análisis filogenéticos
Revelan complejos patrones epidemiológicos caracterizados por la presencia
de ciclos endémicos y diversos patrones de interacción interespecie.
Herramienta útil en estudios epidemiológicos más completos y cuando no
es posible establecer la identificación antigénica del virus.
En Chile permitió :
Identificar 4 variantes genéticas involucradas en ciclos de circulación viral
independientes.
Confirmar la aparición de una nueva variante viral circulando en
murciélagos Histiotus sp. con un nuevo patrón antigénico para el virus
rábico.
Tipos de Muestras para enviar al laboratorio
Muestras Animales
-Murciélagos sospechosos encontrados dentro de habitaciones o
en la vía publica de día
-Animales mordedores que mueran en el período de
observación.
-Animales sospechosos sacrificados por decisión de la autoridad
sanitaria.
-Porcentaje de captura de animales domésticos sin dueño o
vagabundos
-Sistema de vigilancia de quirópteros y otras especies silvestres
suceptibles
Sueros mascotas que ingresan a comunidad europea
INSTRUCCIONES PARA ENVIO DE MUESTRAS PARA DIAGNOSTICO DE RABIA
1.Envío de muestras desde regiones
1.1.- Cabezas de animales
Cada muestra debe ser envasada en una bolsa plástica gruesa
Identificar la muestra (bolsa) con el número correspondiente al formulario de antecedentes.
El antecedente debe venir protegido en otra bolsa plástica aparte de la muestra
Idealmente congelar a -20 ºC antes de enviar, si no es posible refrigerar a 4ºC.
Enviar las muestras en caja aislante con unidades refrigerantes
1.2.- Murciélagos
Cada murciélago debe ser envasado en una bolsa plástica gruesa (cada uno en una bolsa)
Identificar la muestra (bolsa) con el número correspondiente al formulario de antecedentes.
El antecedente debe venir protegido en otra bolsa plástica aparte de la muestra.
Enviar las muestras en caja aislante con unidades refrigerantes
1.3.- Roedores
Los roedores deberán ser enviados solamente en caso de personas mordidas
Identificar la caja con el remitente.
Las cajas debe ser enviadas a domicilio pagado, a la siguiente dirección:
INSTITUTO DE SALUD PUBLICA DE CHILE
SECCIÓN RABIA
MARATHON Nº 1000
ÑUÑOA
SANTIAGO – CHILE
2.Envío de muestras desde la Region Metropolitana
Las muestras son recepcionadas directamente en la Sección Rabia del Instituto de Salud Pública de Lunes a Jueves de
8,30 a 17,30 hrs. Viernes de 8,30 a 16.30 hrs. Fuera de este horario son recepcionadas en porteria.
La Sección Rabia no realiza Eutanasia.
El animal debe ingresar eutanasiado.
En caso de animales vagos mordedores (perros o gatos) estos seran eutanasiados por la SEREMI de Salud.
Entregar los antecedentes del caso en la secretaria de la Sección Rabia.
Diagnóstico de rabia en humanos.
Muestras antemortem (anticuerpos, antígeno y ácidos nucleídos)
Muestra
Condiciones de
envío
Técnica
Detección
Frecuencia
Suero
Refrigerada 4ºC
RIFFT
Anticuerpos
2 veces por semana
LCR
Refrigerada 4ºC
RIFFT
Anticuerpos
2 veces por semana
RT-PCR Nested
Ácidos nucleicos
Saliva
Congelada-20ºC
RT-PCR Nested
Ácidos nucleicos
diariamente por 3
días
Biopsia
nuca
Congelada-20ºC
IFD RT-PCR
Nested
Antígeno
1 vez por semana
Ácidos nucleicos
Muestras postmorten (antígeno y ácidos nucleídos)
Corteza cerebral
Cuerpo calloso
Cerebelo
Médula espinal
Caso de Rabia Humana
1996
-Afectó a un niño de 7 años
-Sin antecedentes de mordeduras o contacto con animales
sospechosos
-Ingreso 13 febrero 1996
-Fallece 26 de Febrero 1996
Resultados de Laboratorio
o MUESTRA
Título de Ac.( IFI)
o Suero 1 (11 días )
o Suero 2 (25 días)
o LCR
(25 días)
1:625
1:15.625
1: 125
o
o
o
o
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
N.Corteza cerebral
N. Cuerpo calloso
N. Cerebelo
Muestra de piel
Inmunofluorescencia
Directa
La caracterización antigénica con anticuerpos monoclonales se
identificó como variante 4 (origen Tadarida brasiliensis)
realizada por el INPPAZ en el mes de mayo de 1996.
Caso Rabia Humana 2013
Día 17-07-2013 ( CABT)
-Varón de 25 años, sano mientras transitaba en moto mordido en la pierna derecha por varios perros callejeros
en la comuna de Quilpue.
-Recibe la primera atención en Clínica Los Carreras recibiendo 1ª dosis de vacuna antirrábica y suero
antitetánico, no recibe las restantes programadas.
Día 29-07-2013
-Comienza con cefalea intensa y fotofobia que cede con paracetamol
Día 03-08-2013
-Posterior al alta comienza a presentar síndrome confusional, dificultad para levantarse y caminar, persistencia de la
cefalea y desorientación temporo- espacial además de afasia de expresión y tetraparesia fláccida.
-Evaluación por neurólogo sospecha Encefalomielitis Aguda Diseminada solicita traslado y se deriva a UCI del HGF
Día 04-08-2013: APACHE II Admisión 22 puntos
-Ingresa febril, hipertenso sin falla respiratoria, pupilas isocoricas reactivas con signos meníngeos + rigidez de
nuca y con agitación sicomotora.
-Por deterioro de conciencia es intubado e inmediatamente de ello presenta una crisis convulsiva que se repite en
la madrugada del día de admisión.
-Al examen neurológico de admisión: apertura ocular espontanea, reflejos foto motor abolido, óculo cefálico +,
hipertonía bilateral con reflejos osteotendineos exaltados , plantares indiferentes y rigidez de nuca.
DIAGNOSTICO DE ADMISION
MENINGOENCEFALITIS A LCR CLARO.
Panel estudio LCR
EXAMEN
05-08-13 07-08-13
HSV I
HSV II
PCR V2V
Enterovirus
Neisseria Men
Negativo
Srteptoccocus Pneumoniae Negativo
Haemophilus
Influenza
Negativo
VDRL LCR
Negativo
ADA LCR
5,8U/L(NL)
Negativo
08-08-1
Negativo
Negativo
Negativo
09-08-13
Negativo
Caso Rabia Humana 2013
Resultados de laboratorio
Fecha toma muestra
Tipo Muestra
RIFFT (UI)
IFD
RT-PCR
04/08/2013
LCR
0,5
06/08/2013
SUERO
31,7
06/08/2013
LCR
2,5
07/08/2013
Biopsia de piel
12/08/2013
SUERO
53,27
12/08/2013
LCR
3,62
9-10-11 y 12-08-2013
Saliva (4 mtras)
negativo
negativo
13/08/2013
Biopsia de piel
negativo
negativo
15/08/2013
SUERO
70,2
15/08/2013
LCR
4,5
15/08/2013
Biopsia de piel
15-08-2013 (3 mtras)
Saliva (3 mtras)
negativo
17-08-2013 (3 mtras)
Saliva (3 mtras)
negativo
21/08/2013
LCR
21/08/2013
Biopsia de Piel
21/08/2013
Saliva (3)
23/08/2013
SUERO
10,7
10/09/2013
SUERO
3,31
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
0,36
negativo
negativo
negativo
negativo
negativo
Niveles de anticuerpos anti virus rábico en LCR y Suero por días de
hospitalizacion.
80
10
9
70
8
50
6
5
40
4
30
3
20
2
10
1
AC (UI) en Suero
Días de hospitalización
AC (UI) en LCR
19 (23-08)
18
17 (21-08)
16
15
14
13
12
11 (15-08)
10
9
8 (12-08)
7
6
5
4
3
2 (06-08)
0
1
0
AC (UI) en LCR
7
0 (04-08)
AC (UI) en Suero
60
Resultados CDC
26/08/2013
-Anticuerpos neutralizantes para virus rábico fueron detectados en 3
muestras de LCR, por la técnica de Inhibición de focos fluorescentes
(RIFFT).
-Anticuerpos IgG e IgM fueron detectados en 3 muestras de LCR, por la
técnica de Inmunofluorescencia.
Lo cual es consistente con infección por virus rábico, ya había sido
diagnosticado por ISP.
No se detectó antígeno rábico por Inmunofluorescencia Directa ni acido
nucleico de virus rábico por hemi-nested RT-PCR en biopsia de nuca.
No se detectó amplicones específicos en muestras de saliva por nested
RT-PCR con múltiples partidores, hasta la fecha.
Conclusiones
La existencia de casos de rabia en murciélagos constituye un
riesgo real de rabia en humanos y animales domésticos.
Esta enfermedad debe ser incluida en el diagnóstico
diferencial de las encefalitis aguda.
La especie Tadarida brasiliensis es el reservorio mas importante en
Chile, aun cuando existen otras especies de murciélagos involucrados.
El patrón epidemiológico de la rabia en Chile, se caracteriza
por una endemia en murciélagos.