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I. FENÓMENOS DE TRANSPORTE EN FERMENTACIÓN SUMERGIDA PARA OBTENER ENZIMA α-AMILASA BACTERIANA Lena Prieto Contreras1*, Renata Grebechova 2 y Luz Mary Figueroa3 1,2,3 Universidad de La Salle. Bogotá, Colombia. Dirección: Calle 10 # 2 – 70 Tel. 3535360, Ext. 2553 1* lprieto@lasalle.edu.co RESUMEN En esta investigación se evaluó la fermentación sumergida para obtener enzima αamilasa con la cepa de Bacillus subtilis ATCC 21556 en un biorreactor New Brunswick modelo BioFlo 110, con 3 L de medio de cultivo que contenía lactosa como sustrato y con adición permanente de 1 L/min de oxígeno. En estas condiciones, se hallaron los fenómenos de transporte desarrollados, así: coeficiente de transferencia de película entre la pared del biorreactor y el medio de 1,71 W/K.m2 para un calor generado de 0,2413 W; coeficiente de transferencia de masa de 4,24 x 10-4 m/s; y una potencia disipada con aireación de 0,1936 W; para un rendimiento de 0,060 kg de enzima/3L de medio de cultivo. Palabras claves: Bacillus subtilis, enzima α-amilasa, fenómenos de transporte I. INTRODUCCIÓN Los fenómenos de transporte definen los comportamientos de una fermentación sumergida para proponer nuevos volúmenes de producción a nivel industrial. Entre los criterios de producción utilizados con mayor éxito están: potencia por unidad de volumen, tiempo de mezcla, coeficiente volumétrico de transferencia de masa y velocidad de la punta del impulsor. Por ello, la aplicación de estos criterios requiere un profundo conocimiento del proceso y la forma de obtención del producto. Por consiguiente, el objetivo de esta investigación fue: determinar el comportamiento de la fermentación desde los fenómenos de transporte: consumo de potencia, calor transferido y oxígeno disipado en la operación durante el proceso de producción y aislamiento de la enzima α-amilasa con B. subtilis ATCC 21556. Además, se obtendrá conocimiento sobre los principios de ingeniería de la fermentación sumergida que compone el proceso de Biotecnología para su aplicación a nivel industrial (Scragg 2000), y será un aporte en este campo importante hoy en día en la industria de los alimentos. Es así como, se destacan algunos estudios sobre el efecto de la utilización de la enzima α-amilasa en la industria de alimentos y su efecto sobre los carbohidratos, en la Universidad de Buenos Aires (Pilosof y Barthlomai 2002); también se investiga el efecto de involucrar esta enzima en alimentos con sorgo, en Venezuela (Plata et al. 2004); y obtención de dextrinas a partir de arracacha mediante el empleo de αamilasa, en la Universidad Católica de Santa María en Perú (Oporto y Zuzunaga 2002). Además de lo anterior, se han realizado investigaciones sobre fermentaciones para la obtención de enzimas con destino a diferentes procesos industriales, como: optimización de la producción de α-amilasa que se utiliza en la industria textil para el ablandamiento de tejidos, utilizando un subproducto de la industria láctea como es el suero ácido de queso y la harina de amaranto como aporte fundamental de factores de crecimiento del microorganismo (Ferreyra et al. 2005); y en la industria alimentaria, se ha investigado sobre la adición de α-amilasa y gluten vital en diferentes tipos de harina trigo para la elaboración de pan de molde (Acosta et al. 2004). En Colombia, se investigó la producción de la α-amilasa con células libres y con células inmovilizadas de Thermus sp. (Poutou et al. 1996). Por otra parte, se está investigando la producción y caracterización de α-amilasa obtenida de cepas nativas de Bacillus sp., por ejemplo, una cepa nativa se aisló de una mina aurífera (Montoya y López 2001, Vanegas et al. 2001). En la Universidad De La Salle, se tiene la línea de Investigación en Biotecnología de Enzimas, y se han realizado varias investigaciones sobre la producción de enzimas obtenidas a partir de microorganismos (pectinasa y amilasa). Grebechova y Prieto (2003a) evaluaron dos cepas (ATCC 21556 y La Salle) de B. subtilis para la obtención de α-amilasa y concluyeron que la cepa ATCC 21556 produce significativamente más cantidad de enzima que la cepa La Salle. Grebechova y Prieto (2003b) evaluaron la actividad amilolítica de la α-amilasa producida por la bacteria B. subtilis ATCC 21556. Grebechova y Prieto (2004) optimizaron los parámetros para fermentación sumergida a pequeña escala (250 mL de medio de cultivo) empleando B. subtilis ATCC 21556. Por último, se destaca mostrar con los fenómenos de transporte de la fermentación sumergida para obtener enzima α-amilasa, las características reológicas del medio de cultivo, la velocidad de agitación, el flujo de aire para evaluar los números de potencia y de Reynolds, el calor requerido para favorecer el clima de crecimiento de los microorganismos que producen los productos de interés, la diferencia de temperatura entre el biorreactor y el medio ambiente, el área disponible para transferencia de calor, las cantidades de oxígeno que permiten el crecimiento de los microorganismos a través del metabolismo que desarrollan, la oxidación de la fuente de carbono y su transformación en productos que establecen una demanda de oxígeno que es esencial satisfacer a través de la aireación durante la realización de la fermentación en el biorreactor. II. MATERIALES Y MÉTODOS. Se partió con los resultados del mejor medio líquido experimental (E-1) de la investigación de “Biotecnología de las enzimas microbianas pectinasa y amilasa” (Grebechova y Prieto 2004), que contiene: lactosa 6%, extracto de levadura 1%, extracto de maní 1% y sales 1,252%; y se realizó la fermentación sumergida con la cepa B. subtilis ATCC 21556 en un biorreactor New Brunswick modelo BioFlo 110, con volúmenes de 3 L por triplicado, a las condiciones estudiadas de: temperatura 37 oC, pH 6,0 - 6,5 y agitación entre 170 a 200 rpm (Grebechova y Prieto 2004). Inicialmente se pesaron los componentes del medio líquido y se preparó 3 L de volumen. Después, se alistó el inóculo con 300 mL del medio de cultivo líquido y la cepa de B. subtilis ATCC 21556 en estado de esporulación, es decir, a las 24 horas de su incubación a 37 oC. Se inoculó el medio de cultivo en el biorreactor para comenzar la fermentación durante 72 horas. A las fermentaciones realizadas se halló las cantidades de: sustrato, biomasa, producto, nutrientes, y energía empleada, para calcular los balances de materia y de energía durante la multiplicación bacteriana. Con los cálculos balances de materia y de energía, se determinaron los fenómenos de transporte que comprenden: la potencia durante la agitación, los coeficientes de transferencia de masa o de oxígeno que se utilizó, y de transferencia de calor que actuó en la fermentación sumergida. Para hallar estos valores, se hallaron los valores de viscosidades del medio de cultivo (viscosímetro de caída de una esfera de acero inoxidable marca Gilmont k esfera líquido t caida ), densidades (picnómetro), caudales de oxígeno (1 L/min se empleó y se leyó constantemente en el rotámetro del biorreactor), velocidades de agitación, y temperaturas cada 8 h durante la fermentación; y por último, se midió las características físicas del biorreactor New Brunswick BioFlo 110, como diámetro del vaso, diámetro del agitador y área de la chaqueta de calentamiento. 2.1 Potencia de agitación. Para la cuantificación, se determinaron características principales del biorreactor como: diámetro, tipo de impulsor, número de impulsores, distancia entre impulsores, número de paleta por impulsor, diámetro del impulsor, longitud del eje de rotación, número de deflectores y ancho de los deflectores. Además, se cuantificó el volúmen del medio líquido y la altura del mismo en el biorreactor. 2.2 Transferencia de calor. Para evaluar esta parte, se hallaron: el área de transferencia de calor disponible por la camisa del biorreactor, el calor generado por el cultivo, el oxígeno consumido, el calor generado por la agitación del medio, el calor entregado al medio por la dispersión del aire, el diámetro de la manguera que lleva el aire, el flujo de aire, la densidad del aire y el calor total generado en el biorreactor. 2.3 Transferencia de masa. Para este componente de los fenómenos de transporte, se hallaron durante el desarrollo de la fermentación sumergida: el caudal de aire para definir la velocidad superficial del gas, el diámetro de las burbujas de aire, el área de la superficie de separación gas-líquido por unidad de volumen de dispersión, el coeficiente de transferencia de masa y el coeficiente volumétrico de transferencia de masa. III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La fermentación sumergida para la obtención de la enzima α-amilasa a partir del crecimiento de la bacteria B. subtilis ATCC 21556 en el medio líquido E-1, produjo 0,060 kg de enzima/3 L de medio de cultivo; este rendimiento se estableció por medio de balance de materia. La fermentación se desarrolló en un biorreactor New Brunswick BioFlo 110, el cual cuenta con 2 impulsores y 6 paletas en cada impulsor, estos se encuentran separados 13 cm; además, tiene 4 deflectores de 2 cm de ancho cada uno. Los fenómenos de transporte presentados durante la fermentación se presentan a continuación. 3. 1 Potencia de agitación. El biorreactor cuenta con un agitador de impulsores de turbina doble: una en la base y otra en la zona media. Este agitador dispersa el calor y el oxígeno en el medio líquido, por esto, la velocidad del mismo es importante evaluarla así como su consumo de potencia. El caudal de aire fue de 1 L/min y se leyó constantemente en el rotámetro del biorreactor. Las ecuaciones que se emplearon en los cálculos de potencia están propuestas en Doran (1998) y Duarte (1995). El volumen del medio fue de 0,0039 m3, donde se originó un número de Reynolds de 7170,63 y como este número es > 1000, por consiguiente, el factor de potencia fue de 5,7 (Duarte 1995) para el impulsor de turbina con 4 deflectores. También, se encontró la potencia disipada por el impulsor en el líquido sin gasear que fue de 0,101 W pues no se presentaron vórtices durante la agitación; y la potencia disipada en el líquido gaseado fue de 0,1936 W con un número de aireación de 0,029, para la agitación del biorreactor a 180 rpm. 3.2 Transferencia de calor. La fermentación sumergida recibió calor por medio de la camisa que envuelve al biorreactor, la cual se calienta eléctricamente, sus medidas son: 0,62 m de largo y 0,18 m de ancho. El área de transferencia de calor fue de 0,09 m2, calculada con el diámetro del biorreactor y la altura del medio líquido. El calor generado por el cultivo de bacterias fue de -0,021 W, las cuales consumieron 1,55x10-5 mol/L.s de oxígeno. El calor generado por la agitación del medio de cultivo fue de 0,1936 W para cada litro por minuto. Otro calor cuantificado fue el entregado al medio por la dispersión del aire de 0,026 W, donde se consideró que el aire ingresa por una manguera de 5/16 de pulgada de diámetro con una velocidad de 0,338 m/s. La pérdida de presión de las burbujas de aire en el biorreactor para la altura del medio (0,164 m) fue de 0,233 lbf/in2. Por consiguiente, el calor total generado en el biorreactor fue de 0,2413 W. Todas las condiciones anteriores definieron un coeficiente de transferencia de calor de 1,71 kW/m2.K entre el medio y la superficie interna del biorreactor encamisado y, esto mostró que el calor generado fue suficiente y no se requiere área adicional pues el área de transferencia disponible en la camisa fue de 0,09 m2 > 1,76 x 10-5 m2 requeridos. 3.3 Transferencia de masa. Para los cálculos de la transferencia de oxígeno en el medio de la fermentación sumergida, se hallaron: la velocidad superficial de 7,06x10-4 m/s; la retención de gas de 0,0046 con un diámetro de burbujas de aire de 3,65x10-3 m; la separación gas-líquido por unidad de volumen de dispersión de 7,56 m-1. Todas las características mencionadas determinaron un coeficiente de transferencia de masa de 4,24x10-4 m/s y un coeficiente volumétrico de transferencia de masa de 3,65x10-3 s-1. Los valores anteriores se establecieron por medio de la aplicación de los diversos modelos matemáticos propuestos por investigadores como: Nagata, McCabe, Smith, Van’t Riet, Nagai, Humphrey, Ackley, Calderbank y Moo-Young (Prieto y Grebechova 2006, Doran 1998, Duarte 1995); los cuales explicaron los fenómenos de transporte presentados en una fermentación sumergida de 3 L de volumen de medio de cultivo líquido, y que satisfacieron los requerimientos del microorganismo B. subtilis ATCC 21556 para pasar a través de la biosíntesis del sustrato de lactosa a la enzima α-amilasa como producto principal. Finalmente, se recomiendan los siguientes factores geométricos del biorreactor empleado: diámetro del impulsor/diámetro del biorreactor=1/3; ancho de deflectores/diámetro del biorreactor=1/9; altura entre la base y el primer impulsor/altura entre impulsores=1; y número de deflectores=4; para revisar los cambios que se presenten en fermentaciones sumergidas de volúmenes mayores de producción. IV. CONCLUSIONES Los fenómenos de transporte evaluados en la fermentación sumergida estudiada para producir enzima α- amilasa, se proponen en el caso de pasar a fermentaciones con volúmenes más grandes, tanto de planta piloto como industriales, donde se busca relacionar estos fenómenos en los diversos tamaños de producción. Es así como, se establece que el coeficiente de transferencia de calor varíe proporcionalmente al cuadrado del diámetro del biorreactor, y que el coeficiente de transferencia de masa varíe proporcionalmente al cubo del diámetro (Quintero, 1981), por lo cual se propone las siguientes relaciones, respectivamente: Otra relación propuesta por investigadores, es la potencia disipada por unidad de volumen proporcional al volumen del fermentador (Duarte, 1995), para el caudal de 1 L/min de aire en la fermentación estudiada se encontró una relación de potencia-volúmen 0,0645, puesto que se espera que a mayor volumen de la fermentación la potencia de trabajo del agitador disminuye (Quintero, 1981); por lo tanto, la otra relación propuesta es: Los coeficientes de transferencia de calor en fermentaciones se recomiendan entre 3 y 5 kW/m2.K, y en la investigación se determinó un coeficiente de transferencia de calor de 1,71 kW/m2.K, valor cercano al límite inferior (Quintero 1981, Scragg 2000). Entonces, es conveniente para nuevos volúmenes evaluar estos parámetros propuestos de los fenómenos de transporte y así establecer más criterios para cambiar a nuevas escalas de producción (Mukesh, 2002). V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Acosta et al. (2004). Efectos de la variedad de trigo, α-amilasa y gluten vital para el proceso de panificación en la molinera de México, Celaya, Gto. Instituto Tecnológico de Celaya, Depto. de Ing. Bioquímica. Presentado al VI Congreso de Ciencia de los Alimentos en México, En: ww.respyn.uanl.mx/especiales/ ee-62004/resumenes_juany/18.htm - 11k fecha de consulta: Febrero 10 de 2006. Doran, P. (1998). Principios de ingeniería de los bioprocesos. Editorial Acribia S.A. España, 1 – 468p. Duarte, A. (1995). Introducción a la Ingeniería Bioquímica. Universidad Nacional de Colombia, Instituto de Biotecnología. Santafé de Bogotá, 263 - 290p. Ferreyra et al. (2005). Influencia del amaranto en la producción de αamilasa usando Bacillus subtilis 3411. 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Al Doctor Camilo Rozo Decano de la Facultad de Ingeniería de Alimentos, y a la Doctora Estrella Cárdenas Coordinadora de Investigación; por sus valiosas colaboraciones y aportes.