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Células madre: Mito y
Realidad
Agustín G Zapata
Departamento de Biología Celular
Facultad de Biología
Universidad Complutense de Madrid
Terapia Celular
Capacidad de sustituir/renovar
tejidos alterados con progenitores de
la misma o distinta estirpe
- Igual estirpe (Trasplante HSCs)
- Distinta estirpe (poco o ningún éxito)
porque DESCONOCEMOS
Los mecanismos que regulan la biología de
las células madre utilizadas y, en especial,
Los mecanismos que regulan
su diferenciación en
condiciones de bioseguridad
Generación de hESC
(Thomson et al 1998
Science 282, 1145)
Células Totipotentes
Células Indiferenciadas con capacidad de
autorrenovación (capacidad de una célula para
mantener su identidad tras división) y bajo
determinadas condiciones de diferenciar a cualquier
tipo celular especializado
Embrionarias:
Células stem embrionarias:
Las más multipotentes; provienen de un
embrión fecundado del que se extraen en un
estadio de pocas células (muchos congelados).
Células germinales primordiales:
Menor totipotencia; provienen de fetos abortados
de 8 semanas de gestación.
Fetales
Progenitores presentes en los tejidos durante desarrollo
Adultas:
Presentes en todos los tejidos; difíciles de aislar y
caracterizar fenotípicamente; crecimiento mucho mas difícil
en cultivo; no “problemas éticos”.
Mecanismos reguladores
de las ESCs
•
•
Rutas de señalización
• Lif – gp130 – Stat 3
• BMP – TGFβ – Smad
• MAPK – ERK
• Wnt (?)
Factores de transcripción
Stat 3
E-ras
c-myc
•
•
•
•
Oct 3/4
Klf 4
Sox 2
β- catenina
Nanog
Organización de la cromatina.
Factores epigenéticos
Represores génicos (genes
Polycomb)
ARNs no codificantes
Factores que afectan el
comportamiento de hESCs
Mantienen status Inducen diferenciación
ESC
ESC
Morfógenos de la SF
Morfógenos
TGFβ
BMP2, BMP4, BMP7
Activina, Nodal, TFGβ,
GDF3
Growth Factors
FGF2, FGF4, PDGF +
SIP
Wnt
sobre todo efectos en
proliferación ESC
Redes Reguladoras
Transcripcionales de ESCs
Core Oct4
Core Myc
Oct4, Sox2*,
Nanog
+
Smad1, Stat 3,
Tfc3
(vías de BMP,
LIF y Wnt)
(señales
extracelulares
afectan
directamente
al core)
C-myc, n-myc,
E2f1, Zfx,
Rex1, Ronin
Bloqueo de la diferenciación de
ESc murinas
• Nanog, Oct 4, Sox 2, bloqueadores generales
• Nanog regula niveles de Oct4 y Sox 2
• Oct 4 bloquea específicamente diferenciación a
trofectodermo
• Esrrb, Tbx 3, Tcl1 bloquean específicamente diferenciación
del epiblasto
Endodermo
extraembrionario
(Gata 6, Gata 4)
Trofectodermo (Cdx 2,
Eomes, Hand 1)
Nanog
Oct 4, Sox
2, Nanog
Nanog, Sox 2,
Esrrb, Tbx 3, TcL 1
ESCs
Epiblasto
Otx 2
Pitx 2
Sox 18
Otros
Citocl 1, Cebpa, Esx 1, Fos, Jun,
Usf 1, Kif 7, Sox 9, Snail 1
Mesodermo
Endodermo
Cresta Neural
Ivanova et al (2006)
Nature 442, 533
Problemas con la
diferenciación de ESCs
• La eficacia de la diferenciación
disminuye en cada estadio; primero
se generan progenitores intermedios
difíciles de expandir
• La mayoría de las céls diferenciadas
de ESCs no son totalmente
maduras, generándose una
población final heterogénea donde
solo un pequeño % corresponde al
tipo celular deseado
NECESARIO,
• Mejorar la eficacia de la
diferenciación
• Diseñar métodos reproducibles,
incluidos aquellos para aislar las
poblaciones deseadas
Problemas utilización
ESCs
• Condiciones “humanas” o
“humanizadas”. Medios
estándar sintéticos.
Condiciones GMP.
RESUELTO
• Condiciones de
preservación adecuadas.
RESUELTO
• Inmunogenicidad 
Transferencia nuclear
RESUELTO ??
• Bioseguridad: Estabilidad /
Transformación neoplásica
Claves de la Transferencia nuclear en oocitos
humanos (Tachibana et al 2013 Cell 153, 1)
•Sincrónicación ciclo núcleo
donante/citoplasma huésped :
Rápida rotura EN y condensación cromosomas ; eliminación TF y epigenéticos
somáticos y sustitución por
mols embrionarias
(Alteraciones sincronización
bloquean desarrollo embrión)
•Mecanismos standard
activación oocitos
(ionomicina, 6-DMAP) insuficientes, necesaria electroporación suplementaria
•“Calidad” oocitos (genoma
donante)
A) Fb 2N donantes núcleos; B) ICM obtenidos con protocolos no-óptimos; C)
Husos en oocitos nucleados; D) Husos en oocitos enucleados + cafeina; E)
ICM obtenida con protolos óptimos; F) hESC de TF
¿Porque los problemas con la transferencia
nuclear en humanos?
•Factores que convierten un programa genético adulto en el del
nuevo embrión son desconocidos
• No activación genes embrionarios bloquea el desarrollo
(embriones no pasan de 8 células o si llegan a blastocisto las hESC
son inestables)
•Protocolos utilizados basados en modelos murinos, mejor los de
primates
•Eliminación núcleo del oocito afecta negativamente la
reprogramación del núcleo somático trasferido (Núcleos somáticos
trasferidos a oocitos nucleados desarrollan blastocistos y hESC
poliploides)
¿Por qué pueden aparecer tumores tras
inyección de progenitores pluripotentes?
• Presencia de células indiferenciadas tras
diferenciación de hESCs
• Redes genes responsables de
pluripotencia también implicados en
oncogénesis
• Inestabilidad genómica de hESCs podría
afectar su diferenciación y la
funcionalidad de las céls diferenciadas
• Casi la mitad de los genes que muestran
alteraciones genéticas en hESC están
funcionalmente relacionados con
oncogenes
• PSC que muestran defectos en
reparación ADN y paradas de ciclo no
todas mueren, una minoría continúa
proliferando y acumulan alteraciones
genéticas que pueden representar
ventajas selectivas
¿Por qué pueden aparecer
tumores tras inyección de
progenitores pluripotentes?. II
Necesario:
• Eliminación selectiva de las céls
indiferenciadas y mutadas
• Mejora en la caracterización de
teratomas y teratocarcinomas para
impedir su formación
Necesidad monitorizar antes
aplicación clínica
Células madre pluripotentes
inducidas (iPSCs)
Jaenisch & Young ’08 Cell 132, 567
Protocolo Reprogramación
• Fibroblastos adultos (ratón, humano)
transducción viral (lenti/retro) OCT4,
Sox2, c-myc, Klf4 (tb sin c-myc) por lo
menos 12 d
• Seleccionadas por activación gen Fbx15
(target de Oct4) (iPSC incompletamente
reprog):
- Forman teratomas, no quimeras
- Pluripotencia requiere expresión
continua de Oct4 y Sox2 (Oct4 y Nanog
endógenos no expresados, promotores
metilados)
• Seleccionadas por activación Oct4/Nanog
endógenos (totalmente reprog):
- Expresión génica y configuración
cromatina
- Pluripotencia dependiente de Oct/Nanog
endógenos, promotores hipometilados
- Crom X reactivado
- Producen quimeras y generan embriones
- Expresan marcadores pluripotentes: Alk
Pasa, SSEA-1
De Sommer & Mostoslavsky 2010
Cell Research & Therapy 1, 26
Problemas con iPS
• Baja eficacia de reprogramación (1 cada
1000 cels) (Eficacia 30%)
• La mera expresión de marcadores no
“iguala” las iPS con ESC
• No sabemos como evaluar las iPS
humanas
• Cualquier técnica de reprog genera
riesgo de mutaciones o cambios
epigenéticos (evaluación genómica de
cada clón)
• La reprog inhibe las rutas de supresión
de tumores y activa oncogenes
• Las céls reprogramadas están en
situación de estrés extremo
• Ratones generados con iPS (sin usar cmyc) tiene una vida media menor
• Desconocemos muchos aspectos de los
mecs de reprogramación
Semejanzas y diferencias entre ESCs, iPSCs
y ESC-TN (derivadas de la misma línea
somática y de óvulos de la misma mujer)
-30% iPSCs no anomalías cromosómicas (eficacia
razonable; no siempre hay alteraciones durante
reprogramación)
- Metilaciones en ESC-TN más parecidas a las de ESCs
que a iPSCs. iPSCs tienen patrones metilación más
alterados
-Falta de metilaciones produce alteraciones
trascripcionales en las iPSC. ESCs-NT más parecidas a
ESCs pero también tienen
iPSCs y Terapia Celular
• Problemas de bioseguridad (Controles
exhaustivos), sin embargo:
- Univ Kyoto ensayos con pacientes de
Parkinson en 3 años
- Centro Riken en Kobe pacientes con
maculopatías de edad, fase I
• Utilidades no vinculadas a capacidad
pluripotente:
- Análisis de pluripotencia y senescencia
celular
- Patogenia enfermedades sin modelos
- Origen y progresión de enfermedades
(genes implicados)
- Screening fármacos
- Vehículos celulares para Terapias de
reemplazamiento génico y celular
De Nicholas & Kriegstein 2010
Nature 463, 1031
Células mesenquimales (MSC)
• In vivo en G0, más abundantes en hueso que en
BM y tb en adiposo, cordón, FL, PB y pulmón.
Relacionadas con pericitos
• No expresan marcadores hematopoiéticos
(CD14- CD34-CD45-) pero sí mol de adhesión
(CD 73+ CD 90+ CD 105+ CD 166+) y otros
marcadores: CD29, CD44, CD49a-f, CD51,
CD106, CD133, CD271 (loNGFR), Stro-1,
SSEA1, 4, 3G5), Nestina, PDGFRα, β (este
fenotipo corresponde a las MSC aisladas de los
cultivos no a las células puestas a cultivar;
cultivo cambia fenotipo y otras propiedades)
• Expresan R para: IL1, IL3, IL4, IL6, IL7, IL15,
IFNγ, TNFα, CCR1, CCR7, CXCR4, CXCR5,
CXCR6, TLR1, 3, 4, 5
Propiedades Inmunológicas de
MSC se utilizan en el tratamiento
de distintas patologías
• MSC regulan todas las etapas de la
respuesta inmune:
- Diferenciación DC inmaduras y función
de DC maduras
- Proliferación céls T y B
- Supresión actividad céls efectoras, TH1
y TH17
- Activación céls reguladoras, TH2 y Treg
- Efectos sobre NKs ???
• Mols. Implicadas: HPF, PGE2, TGFβ,
IDO, ON, IL10, BMP4, Galactinas ???
• Eficaces en alogenia
• Propiedades no constitutivas,
dependientes ambiente (IFNγ)
• Utilización en Autoinmunidad y GvHD
MSC producen células del linaje
mesodérmico ????
Benayahu et al ’09 Annals Anat 191, 2
La investigación sobre céls
stem ha proporcionado
importantes avances acerca de
-Mecanismos Reguladores de la
Diferenciación y reprogramación
-iPSCs , excelente modelos
experimentales para estudiar la
patogénesis de enfermedades
mono- y multigénicas (Parkinson,
Schizophrenia, ALS, distrofias,
Fanconi, etc..) y screening de
librerias de drogas
-MSCs son células inmunoreguladores y anti-inflamatorias
(GvH disease, BM engraftment,
Inflamation, Cicatrización)
Alternativas a la Terapia
Cellular
• Generar subunidades funcionales
(mas funcionales que morfológicas)
- Auto-organización de estructuras
epiteliales intestinales, gástricas y de
colon (organoides) a partir de céls
aisladas endodérmicas Lgr 5+,
hESCs o iPSCs
- Otros tejidos más complejos:
hipofisis, tejido retiniano or cortical
y epitelio de la glándula mamaria
• Ingenieria Tisular
Ensamblar poblaciones celulares
dispersas en biomateriales o
matrices naturales descelularizadas
Ingenieria Tisular
Órganos descelurizados y
sus matrices reconstituidos
con céls madre (mejor
tejidos huecos que órganos
sólidos con muchas
células)
•Control preciso grado de descelurización
(adhesión céls madre o rechazo
inmunológico)
•Elección céls madre (mejor varios tipos
derivados de iPSCs)
•Números de células necesarias muy alto e
integridad vasculatura clave
•Eliminación adecuada del detergente que
genera toxicidad celular
Futuro:
•Cultivos 3D de progenitores en scaffolds
•Si no se puede sustituir un órgano restituir
las partes dañadas
Creación de yemas hepáticas a partir de iPSCs
(Takebe et al 2013 Nature 499, 481)
Creación yemas
hepáticas
humanas (4 mm)
tridimensionales,
vascularizadas a
partir de mezclas
de hepatocitos
(provenientes de
iPSCs), MSC y
HUVACs que
recuerdan hígados
fetales
Trasplantadas en
distintas zonas
ratones producen
proteínas hepáticas humanas sin desarrollo de tumores o teratomas a los 6
meses
Problemas a resolver:
Yemas son muy pequeñas (3-4 millones céls y un hígado un
billón) y necesitan irrigarse; podrían injertarse en hígados y
dejar que fueran creciendo (ver costo económico)
Otros órganos derivados de endodermo (páncreas, pulmón)
podrían ser generados también por este método aunque la
heterogeneidad celular es mayor que en hígado
Cualquier Terapia
Celular debe ser en
último término
superior en eficacia y
seguridad a
cualquier Terapia
basada en fármacos
http://www.closerlookatstemcells.org
(nuevas stem cell therapies)