Download “Plasticidad sináptica induce cambios en la metilación y la unión de

Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela de Ingeniería en Biotecnología
“Plasticidad sináptica induce cambios en la metilación y la unión de la
proteína MeCP2 al promotor del gen para reelina, en hipocampo de
ratas”.
Proyecto de tesis presentado como parte de los requisitos para optar
al título de Ingeniero en Biotecnología.
Director de tesis: Dr. Pablo Muñoz Carvajal.
Departamento de Neurociencias, Facultad de Ciencias.
Centro Interdisciplinario de Neurociencia de Valparaíso.
Universidad de Valparaíso.
Co-director de tesis: Dr. Álvaro Ardiles Araya.
Centro Interdisciplinario de Neurociencia de Valparaíso.
Universidad de Valparaíso.
Oriana Marcela Ramírez Herrera.
Viña del Mar, Chile.
2014.
Facultad de Ciencias Biológicas
Ingeniería en Biotecnología
"Plasticidad sináptica induce cambios en la metilación y la unión de la
proteína MeCP2 al promotor del gen para reelina, en hipocampo de ratas”
Oriana Marcela Ramírez Herrera
Este trabajo fue elaborado bajo la supervisión de los directores de Tesis; Dr. Pablo
Muñoz Carvajal y Dr. Álvaro Ardiles Araya, en el laboratorio de Neurociencia del Centro
Interdisciplinario de Neurociencia de la Universidad de Valparaíso, Valparaíso, siendo
además aprobado por los miembros de la Comisión de evaluación.
_____________________
_____________________
Dr. Pablo Muñoz Carvajal
Dr. Álvaro Ardiles Araya
Director de Tesis
______________________
Co-director de tesis
Dr. Marco Álvarez Santana
Comisión de Tesis
______________________
Dr. Gian Carlo de Ferrari Valentini
Comisión de Tesis
______________________
Dra. María Isabel Oliver
Directora Ingeniería en Biotecnología
Viña del Mar, Chile, 2014.
1
Dedicado a mi querida familia y a mis grandes amigos, en especial
a María Valeria, a quien siempre llevaré conmigo.
2
AGRADECIMIENTOS
Quisiera expresar mi más profundo y sincero agradecimiento a todas las personas
que han colaborado durante mi etapa de formación académica, en especial a mis
directores de tesis; al Dr. Pablo Muñoz y al Dr. Álvaro Ardiles, por darme la oportunidad
de ingresar a su laboratorio, enseñarme parte de sus conocimientos y experiencia, por
el apoyo, orientación, comprensión, paciencia, buena voluntad y sobre todo por la gran
calidad humana, humildad y cercanía que a ambos caracteriza. Estoy muy agradecida
de tener la oportunidad de conocerlos, construir lazos de amistad y cariño, haciendo de
ésta etapa una experiencia enriquecedora en todo aspecto para mí.
A mi familia y mis grandes amigos por su incondicional amor y apoyo, por
ayudarme en todo lo que significa estudiar una carrera a cuestas de un gran esfuerzo
emocional y económico, por confiar en mí y darme las herramientas necesarias para
creer y seguir adelante a pesar de todas las dificultades que aparecen en el camino.
A cada una de las personas que me ha acompañado y ha aportado con su buena
disposición en mi etapa de formación académica, de todo corazón, infinitas gracias.
3
ÍNDICE DE MATERIAS
1.
Memoria y plasticidad sináptica. .........................................................................10
2.
Regulación epigenética en memoria y plasticidad sináptica. ...........................15
3.
Rol de la proteína MeCP2 en mecanismos de plasticidad sináptica. ................16
4.
Reelina, función e importancia en mecanismo de plasticidad sináptica. .........22
5.
Mecanismos epigenéticos en regulación de reelina. .........................................26
HIPÓTESIS ...................................................................................................................28
Objetivo General .........................................................................................................28
Objetivos específicos .................................................................................................28
METODOLOGÍA ...........................................................................................................30
1.
Preparación de rebanadas de hipocampo. .........................................................30
2.
Registro electrofisiológico en rebanadas de hipocampo. .................................30
3.
Respuestas sinápticas. ........................................................................................31
4.
Protocolo de estimulación para inducir LTP. .....................................................31
5.
Microdisecciones de hipocampo (Área CA1)......................................................31
6.
Extracción de ADN genómico. .............................................................................32
7.
Modificación de ADN genómico por bisulfito de sodio. ....................................33
8.
qPCR específico para metilación (MSP) para gen de Reelina. ..........................35
9.
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). .........................................................37
10. Cuantificación de la expresión de RELN mediante RT-PCR en tiempo real. ....40
PLAN DE TRABAJO ....................................................................................................41
4
RESULTADOS ESPERADOS Y DISCUSION ..............................................................42
1.
Inducción de potenciación a largo plazo en rebanadas de hipocampo de rata.
............................................................................................................................. .....42
2.
Cambios en el estado de metilación en el gen de RELN durante potenciación a
largo plazo (LTP). ........................................................................................................45
3.
Determinación de la unión de la proteína MeCP2 a la región promotora de
RELN durante LTP.......................................................................................................48
4.
Cuantificación de la expresión de RELN durante LTP. ......................................51
CONCLUSIONES Y PROYECCIONES.........................................................................52
ANEXO .........................................................................................................................54
REFERENCIAS ............................................................................................................56
5
RESUMEN
Se ha considerado que la regulación génica a través de mecanismos epigenéticos
tiene una importante función en la formación de plasticidad sináptica (PS) y memoria a
largo plazo (MLP) (Levenson y Sweatt, 2005). La evidencia sugiere que el estado de
metilación
de
algunos
promotores
de
genes
pasan
por
ciclos
dinámicos
(metilación/desmetilación) en la regulación de la transcripción, inducidos por actividad
neuronal (Kangaspeska et al., 2008; Métivier et al., 2008). En neuronas, las
metilaciones presentes en genes como el de reelina (RELN) son reconocidas por la
proteína MeCP2, un miembro de la familia de proteínas de unión a sitios metil-CpGs,
produciendo inhibición o activación de la transcripción, dependiendo de su interacción
con factores co-represores o co-activadores respectivamente (Chahrour et al., 2008;
Cohen et al., 2010).
Debido a lo anterior, este estudio tiene como objetivo evaluar si el gen de RELN
está sujeto a cambios en su estado de metilación durante el curso temporal de la
potenciación a largo plazo (LTP). Se espera obtener una disminución del estado de
metilación en la región promotora del gen para RELN, en respuesta a la potenciación a
largo plazo y con ello una disminución de la unión de la proteína MeCP2 a dicha región.
Para estudiar el estado de metilación de este gen, en rebanadas de hipocampo se
establecerá una condición control y una tetanizada (LTP), en donde se modificará su
ADN genómico con bisulfito, se evaluarán los cambios mediante la técnica de qPCR
sensible a metilación, se determinará la unión de proteína MeCP2 a la región promotora
del gen de RELN mediante la técnica de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), y por
último, se cuantificará la expresión de RELN mediante la técnica de qRT-PCR.
6
Summary
Regulation of gene expression through epigenetic mechanisms has an important
role in both the formation of synaptic plasticity (PS) and long-term memory (LTM).
Evidence suggests that the methylation status of some genes goes through dynamic
cycles (methylation / demethylation) in the regulation of transcription induced neuronal
activity. In neurons, the presence of methylation in genes such as reelin (RELN), are
recognized by the MeCP2 protein, a member of the family of methyl-CpG of binding
proteins, resulting in the inhibition or activation of gene transcription by interacting either
with co –repressors or co-activators.
Due to the above, this study aims to assess whether the RELN gene may undergo
acute changes in their methylation status during different stages of long-term
potentiation (LTP). It is expected to obtain a decrease in RELN methylation status, in
response to long-term potentiation and thus a decrease MeCP2 binding to the promoter
region.
An assessment of the genomic DNA changes by methyl- sensitive PCR, a bisulfitebased technique, will be used to study the methylation status of the RELN gene in both
control and tetanized (LTP) hippocampal slices. Finally, we will use chromatin
immunoprecipitation (ChIP), to test MeCP2 binding to the promoter region of the gene,
and we will quantify expression of RELN by the technique of qRT-PCR.
7
INTRODUCCIÓN
La totalidad de la información genética presente en cada organismo se encuentra
representada por una o varias copias de la molécula de ácido desoxirribonucleico
(ADN), lo que se conoce como el genoma de un organismo.
En eucariontes, el ADN se encuentra en el núcleo celular formando parte de un
complejo macromolecular denominado cromatina, en donde segmentos pequeños de
ADN se enrollan alrededor de un octámero de proteínas, llamadas histonas, las cuales
se encuentran conformando la estructura fundamental de la cromatina y que finalmente
le permite adquirir la conformación compacta al ADN, un nucleosoma. Esta
conformación deja inaccesible la mayoría de las secuencias nucleotídicas para que
interactúen con una serie de factores y maquinaria celular, que dan lugar a la
transcripción y en consecuencia, a la expresión génica. No obstante, la cromatina es
una estructura dinámica, que constantemente pasa por estadíos de mayor o menor
compactación, para así permitir la transcripción génica (Sultan y Day, 2011).
Existen cambios asociados a esta organización estructural, que no implican
alteraciones en la secuencia de ADN, es decir, existen una serie de modificaciones
post-traduccionales en las proteínas nucleares asociadas, que producen de manera
directa cambios heredables en la estructura de la cromatina, y de manera indirecta,
alteraciones duraderas en los patrones de expresión. El estudio de estas interacciones
y cambios heredables en la expresión génica, que no están codificados en la secuencia
de ADN, se le conoce como Epigenética (Levenson y Sweatt, 2005).
El genoma se encuentra marcado en sitios específicos, ya sea por la adición de
grupos metilos a citosinas en los islotes CpG presentes en la secuencia de ADN, o bien
modificaciones en proteínas que ayudan al empaquetamiento de la cromatina hacia una
forma condensada. Estos mecanismos conocidos como metilación del ADN y
modificación de histonas, respectivamente, predominan en la regulación epigenética, y
han sido bien caracterizados en algunas áreas de investigación, como biomedicina,
biología del desarrollo, cáncer, etc., existiendo otras áreas en donde es necesario
investigar aún más sobre este tipo de regulación, como lo es en neurociencia.
8
Existe evidencia que indica que la regulación de la estructura de la cromatina y de
la metilación del ADN, son la base para el almacenamiento de información durante el
desarrollo, la formación de memorias conductuales, actividad y plasticidad sináptica en
el sistema nervioso central (SNC) adulto (Day y Sweatt, 2010; Levenson y Sweatt,
2005; Levenson et al., 2006; Miller y Sweatt, 2007; Sultan y Day, 2011).
La regulación epigenética en neuronas adultas ocurre en respuesta a entradas
sinápticas y/o a estímulos externos. Estos estímulos provocan cambios como:
acetilación de histonas, metilación, fosforilación y ubiquitilación, dando como resultado
cambios en la expresión génica neuronal y como consecuencia en la función de ésta
(Levenson y Sweatt, 2005).
9
1. Memoria y plasticidad sináptica.
La memoria presente en el cerebro mamífero se caracteriza por presentar dos
fases temporales diferentes: memoria a corto plazo, la cual tiene una duración de
algunos minutos hasta un par de horas, y la memoria a largo plazo, que puede persistir
por días, semanas e incluso años. Una de las características que presenta la memoria a
corto plazo, es que sólo necesita de algunas modificaciones covalentes de las proteínas
preexistentes, en cambio, la memoria a largo plazo requiere la síntesis de nuevas
moléculas de ARN mensajero y proteínas como reelina (RELN), y el factor neurotrófico
del cerebro (Bdnf) implicadas en la inducción de la plasticidad sináptica y memoria
(Grayson et al., 2006; Huang et al., 1996; Martinowich et al., 2003; Miller y Sweatt,
2007).
En mamíferos, la estructura encefálica implicada en la consolidación de la
memoria espacial, contextual, y recuperación de otras formas de memoria es el
hipocampo (Sultan y Day, 2011). Esta estructura se caracteriza por presentar una capa
principal de neuronas densamente empaquetadas en forma de una C invertida, la capa
de las células piramidales, en la cual se distinguen principalmente 2 regiones, CA1 y
CA3. Dentro de estas regiones existe un circuito trisináptico (Andersen, 1960), en el
cual el flujo de información proveniente de la corteza entorrinal ingresa a través de la
vía perforante haciendo contacto con las dendritas de las células granulares del giro
dentado (DG), en donde sus axones (fibras musgosas) se proyectan y tienen contacto
con las neuronas piramidales de la región CA3. Estas neuronas piramidales a su vez,
proyectan sus axones (colaterales de Schaffer) hacia las células piramidales de la
región CA1, allí sus dendritas forman una banda gruesa (stratum radiatum) y reciben la
sinapsis de las colaterales de Schaffer (Purves, 2004) (Figura 1). La disposición de las
neuronas en el hipocampo permite diseccionarlo de tal forma, que la mayor parte de los
circuitos relevantes quedan intactos, por lo que las proyecciones de las regiones CA1 y
CA3 han sido bastante utilizadas para estudiar fenómenos involucrados en memoria y
aprendizaje, como lo es la plasticidad sináptica (Huang y Kandel, 2005).
La plasticidad sináptica (PS) puede ser definida como los cambios estructurales y
funcionales que ocurren en la sinapsis en respuesta a la actividad neuronal, siendo
10
considerada el sustrato celular de la memoria (Lamprecht y LeDoux, 2004). Un tipo de
plasticidad sináptica que ha sido estudiada en el hipocampo, y que es el principal
interés de este estudio, es la potenciación a largo plazo (LTP: Long Term Potentiation).
A partir de la estimulación eléctrica de las colaterales de Schaffer, se generan
potenciales postsinápticos excitatorios (PPSE) en las células piramidales de CA1. De
acuerdo a la frecuencia de estimulación en las colaterales Schaffer, es decir, si se
estimulan sólo dos o tres veces por minuto, la magnitud de los PPSE en las neuronas
de CA1 es constante y se mantiene por un determinado tiempo. Si ocurre una sucesión
breve de estímulos de alta frecuencia (HFS) en los mismos axones, se puede observar
un aumento prolongado en la amplitud de los PPSE (Purves, 2004), produciéndose lo
que se conoce como la potenciación a largo plazo (LTP) (Figura 2), la cual puede
persistir por algunas horas in vitro y por semanas e incluso meses in vivo (Cooke y
Bliss, 2006).
Figura 1. Diagrama de un corte sagital de hipocampo de un roedor. El diagrama muestra las
principales capas de neuronas piramidales en forma de C invertida distinguiéndose las regiones CA1 y
CA3, las vías excitadoras y conexiones sinápticas. El hipocampo tiene sus principales proyecciones
aferentes desde la corteza entorrinal a través de la vía perforante que hace contacto con las dendritas de
las células granulares del giro dentado, ahí sus axones (fibras musgosas) se proyectan y tienen contacto
con las neuronas piramidales de la región CA3. Estas neuronas proyectan sus axones (colaterales de
Schaffer) hacia las células piramidales de la región CA1 sus dendritas forman una banda gruesa (stratum
radiatum), recibiendo la sinapsis de las colaterales de Schaffer. (Figura extraída de Purves, 2004).
11
Figura 2. Potenciación a largo plazo de las sinapsis de las colaterales de Schaffer-CA1. Gráfica de
la fase temporal de los cambios de amplitud de los Potenciales Post-sinápticos Excitatorios (PPSE) con
respecto al porcentaje basal, producidos por la estimulación en las colaterales de Schaffer. Si se realiza
un estímulo de baja frecuencia, la magnitud de los PPSE en las neuronas de CA1 es constante y se
mantiene por un determinado tiempo (1). Si ocurre una sucesión breve de estímulos de alta frecuencia
(HFS) en los mismos axones, se puede observar un aumento prolongado en la amplitud de los PPSE
produciéndose lo que se conoce como la potenciación a largo plazo (LTP) (2), la cual puede persistir por
algunas horas in vitro y por semanas e incluso meses in vivo.
La LTP se caracteriza por presentar dos fases de temporalidad: la fase temprana
(E-LTP: Early - Long Term Potentiation), la cual tiene una duración de minutos y
solamente implica la modificación de proteínas preexistentes; y la fase tardía (L-LTP:
Late – Long Term Potentiation) que puede persistir desde horas a días, requiriendo la
activación de proteínas quinasas, transcripción génica y síntesis de nuevas proteínas
(Huang et al., 1996; Kullmann y Lamsa, 2007). Los mecanismos moleculares que
subyacen a la comunicación (transmisión) sináptica en las neuronas piramidales de
CA3 y CA1, requieren la activación de receptores ionotrópicos de glutamato, AMPAR
(ácido
alfamino-3-hidroxi-5-metilisoxanozol-4-propinoico)
y
NMDAR
(N-metil
D
12
aspartato). Ambos tipos de receptores se unen a glutamato, pero en condiciones de
reposo el receptor NMDA es bloqueado por magnesio (Mg+2). Debido a que este
bloqueo es dependiente de voltaje, cuando ocurre la despolarización de la membrana
de la neurona postsináptica inducida por los receptores AMPA, produce que el receptor
NMDA se libere del bloqueo por Mg+2, permitiendo la entrada de calcio (Ca+2) (Cooke y
Bliss, 2006; Kullmann y Lamsa, 2007; Malenka y Bear, 2004; Shors y Matzel,1997). Una
vez que ingresa calcio interactúa con una proteína llamada calmodulina, produciéndose
la activación de las vías de señalización dependiente de CaMKII (Calcio-calmodulina
proteína quinasa II) y la dependiente de AMPc (Adenosinmonofosfato cíclico). Se ha
demostrado que ambas vías de señalización participan en el mantenimiento de la LTP,
así como también están presentes en la memoria y el aprendizaje (Cooke y Bliss,
2006). Al accionase la vía de señalización de las adenilato ciclasas por
Ca+2/calmodulina, se produce la activación de la proteína dependiente de AMPc, la
proteína quinasa A (PKA) (Bliss y Cooke, 2011; Malenka y Bear, 2004). Esta quinasa
produce el accionar de la proteína activada por mitógenos (MAPK), iniciándose así una
cascada de señalización hacia el núcleo celular que indirectamente termina en la
fosforilación y activación de CREB (cAMP–responsive element binding protein). CREB
es un factor de transcripción que al unirse a zonas de regulación del ADN cercanas al
sitio del inicio de la transcripción recluta complejos enzimáticos sobre regiones
promotoras que promueven el desenrollamiento de éste, resultando en el inicio de la
transcripción génica y expresión de variadas proteínas implicadas en potenciación a
largo plazo, memoria y aprendizaje (Figura 3) (Cooke y Bliss, 2006; Hardingham et al.,
2001).
13
Figura 3. Mecanismos de señalización intracelular que median la potenciación a largo plazo (LTP).
La sinapsis localizada entre las colaterales de Schaffer y las células piramidales de CA1 están mediadas
por quinasas activadas por la entrada de calcio a través del receptor NMDA, el cual interactúa con
calmodulina (izquierda) la que a su vez activa a CaMKII, ésta una vez activa puede causar alteraciones
en la transmisión sináptica mediante modificaciones en los receptores de glutamato post-sinápticos. Por
otra parte, las adenilato ciclasas son activadas por Ca +2/calmodulina, accionando con ello la proteína
quinasa dependiente de AMPc (PKA). Esta proteína quinasa inicia una cascada de señalizaciones hacia
el núcleo celular, resultando en una serie de cambios en la transcripción y eventual expresión de
proteínas involucradas en cambios duraderos que median la potenciación a largo plazo (LTP). (Figura
extraída de Cooke y Bliss, 2006).
14
2. Regulación epigenética en memoria y plasticidad sináptica.
Uno de los mecanismos epigenéticos recientemente reportado como contribuyente
en la regulación de memoria y plasticidad sináptica en el sistema nervioso central
adulto, es la metilación del ADN (Levenson y Sweatt, 2005). Este mecanismo consiste
en la transferencia covalente de un grupo metilo (-CH3) a la posición 5 del anillo de
pirimidina de los residuos de citosina (C) catalizada por una familia de 4 enzimas
conocidas como ADN metiltransferasas (DNMTs), las cuales incorporan esta metilación
a las citosinas que están seguidas inmediatamente por un residuo de guanina (G)
(5´CpG´3) (Rakyan et al., 2001). En humanos, aproximadamente el 70% de los
dinucleótidos CpG existentes en el genoma se encuentran metilados (Bird, 2002) con la
excepción de regiones cortas de CpG no metiladas y organizadas en grupo, conocidas
como islas CpG (Levenson y Sweatt, 2005; Suzuki y Bird, 2008). Estas islas son
blancos potenciales para el proceso de metilación y generalmente se encuentran cerca
de regiones reguladoras de genes, como lo son los promotores. La evidencia sugiere
que existen ciclos dinámicos de metilación/desmetilación durante la regulación de la
transcripción en la región promotora de algunos genes presentes en células humanas
(Kangaspeska et al., 2008).
El patrón de metilación del ADN en mamíferos es mantenido a través de la
replicación por la acción de la enzima metiltransferasa 1 (DNMT1). Después de la
replicación, las dos moléculas hijas de ADN de doble hebra contienen un patrón CpG
hemimetilado, el cual es reconocido por DNMT1 y convertido en un patrón metilado
completo. DNMT2 al parecer tiene una función en el control epigenético de la actividad
del centrómero y DNMT3A y 3B han sido descritas como las “metiltransferasas de
novo”, debido a que su función es transferir un grupo metilo en substratos no metilados
y hemimetilados (Bird, 2002; Day y Sweatt, 2010; Kangaspeska et al., 2008; Métivier et
al., 2008; Rakyan et al., 2001). La acción de estas enzimas es fundamental en el
mantenimiento de la metilación del ADN, sobre todo a nivel neuronal, para un control
adecuado en la expresión de génica (Feng et al., 2010).
15
A partir de estudios realizados en hipocampo de ratones inhibiendo la actividad de
las DNMTs, se demostró que se altera el estado de metilación en genes que codifican
para proteínas como RELN y el factor neurotrófico derivado del cerebro (Bdnf), ambas
implicadas en la inducción de la plasticidad sináptica en el cerebro adulto. Además,
producto de esta inhibición de DNMTs, se produce el bloqueo de la LTP en las sinapsis
de las colaterales de Schaffer-piramidales de CA1 (Levenson et al., 2006). Por otra
parte, estudios sobre condicionamiento al miedo (un tipo de memoria aversiva) en el
hipocampo de rata, han evidenciado una asociación con metilación y silenciamiento
transcripcional del gen para la proteína fosfatasa 1 (PP1), además de la desmetilación y
consecuente activación transcripcional del gen para RELN (Miller y Sweatt, 2007).
La interacción de este mecanismo con regiones reguladoras está mediada por una
familia de proteínas de unión a sitios CpGs metilados (MBPs) (Bird, 2002; Jaenisch y
Bird, 2003; Roth et al., 2010; Uchida et al., 2009), dentro de las cuales la primera
proteína que fue descubierta y mayormente estudiada por su relación con desordenes
en el neuro-desarrollo, es la proteína de unión a CpG metilados 2 (MeCP2). Esta
proteína a través de su dominio de unión a ADN metilado (MBD) se une a sitios CpGs
metilados y parcialmente metilados que generalmente están rio arriba de regiones
promotoras (Chen et al., 2003; Martinowich et al., 2003). Una vez unida a estos sitios,
su dominio de represión transcripcional ubicado en la región C-terminal (TRD) (Figura
4A) ayuda a reclutar histonas deacetilasas (HDACs) mediante el co-represor mSin3A
(Jones et al., 1998). En conjunto, estos eventos producen la compactación de la
cromatina limitando la accesibilidad de la maquinaria transcripcional y en consecuencia
a supresión de la transcripción génica (Adkins y Georgel, 2011; Chen et al., 2003;
Martinowich et al., 2003) (Figura 4B).
3. Rol de la proteína MeCP2 en mecanismos de plasticidad sináptica.
MeCP2 es una proteína que se encuentra de manera abundante en todo el
organismo de mamíferos, aunque se han encontrado niveles considerablemente más
altos en el sistema nervioso central adulto (Zhou et al., 2006). La principal función de
16
esta proteína aún no está clara, sin embargo, se le atribuye relación en la comunicación
entre neuronas maduras, ya que los genes que podría regular están implicados en el
mantenimiento de las sinapsis y plasticidad sináptica (Nan et al., 1997). Debido a que el
gen que codifica esta proteína se encuentra ubicado en la posición 28 del brazo largo
(q) del cromosoma X (Xq28), en estudios realizados en pacientes con síndrome de Rett
(RTT), un trastorno del desarrollo neurológico dominante ligado al cromosoma X (Amir
et al., 2000), se descubrió que aproximadamente el 90% de los casos de este síndrome
presenta mutaciones en la proteína MeCP2. Por otra parte, dichas mutaciones también
se encontraron en otros desórdenes neurológicos, como autismo y el síndrome de
Angelman, estableciéndose que esta proteína podría ser fundamental para el desarrollo
neurológico (Adkins y Georgel, 2011; Collins et al., 2004; Van den Veyver y Zoghbi,
2000).
Con respecto a su rol en la regulación génica, estudios realizados en cultivo de
neuronas corticales de ratón, se pudo comprobar la hipótesis de que la asociación entre
la proteína MeCP2 y el ADN metilado presente en la región promotora de Bdnf, reprime
la transcripción génica de éste, en neuronas que permanecen en reposo. Al inducir
despolarización en estas mismas neuronas, MeCP2 se disocia parcialmente del
promotor de Bdnf aumentando la unión del factor de transcripción CREB para activar su
transcripción(Martinowich et al., 2003). Estos estudios sugieren que la actividad
sináptica podría inducir la disociación parcial de la proteína MeCP2 de la región
promotora, permitiendo la transcripción génica (Figura 4B).
No obstante, un estudio realizado en la región hipotalámica replantea la función de
MeCP2 como represor transcripcional, describiéndola como una proteína represora y
activadora a la vez (Chahrour et al., 2008). Para explorar el mecanismo molecular que
subyace al síndrome de Rett, se analizaron los patrones de expresión de ARNm
proveniente de ratones deficientes de MeCP2 (null-Mecp2) y de ratones que la sobreexpresan (Tg-MECP2). Del total de genes analizados, el 85% resultan estar activados
en ratones Tg-MECP2 y disminuidos en ratones null-Mecp2, sugiriendo que muchos de
éstos probablemente sean activados por MeCP2. Además de los genes analizados se
seleccionaron 6 y se confirmó que MeCP2 estaba unida a sus promotores,
17
interactuando con el factor de transcripción CREB1. El 15% restante de los genes
evaluados se encuentra disminuido en ratones Tg-MECP2 y aumentado en ratones nullMecp2, lo que podría deberse a que esos genes normalmente sean reprimidos por
MeCP2. En conjunto, todos estos datos indican que MeCP2 regula la expresión de una
amplia variedad génica dependiendo de su interacción con complejos moleculares que
activan o reprimen este proceso, además de quizás tener un rol estructural en la
organización de la cromatina.
Para definir con que interactúa MeCP2 al momento de suprimir o activar genes, en
el estudio de Chahrour y cols., (2008) mediante analisis de inmunoprecipitacion de
cromatina (ChIP) en regiones hipotalámicas verificaron que el factor de transcripcion
CREB está presente en el promotor de un gen activado por MeCP2 y ausente en el
promotor de un gen reprimido por MeCP2 (Figura 5). Adicionalmente, lograron
determinar que los promotores de genes activados por MeCP2 son ricos en islas CpGs
levemente metiladasa diferencia de las regiones promotoras de genes que reprime, las
cuales presentan islas CpGs con una metilacion mucho mas elevada. Por lo tanto, esto
indica que el estado de metilacion de estas zonas podría ser crucial para el accionar de
MeCP2 (Chahrour et al. 2008; Cohen et al. 2010).
Como se señaló anteriormente, la actividad sináptica podría inducir la disociación
de la proteína MeCP2 de la región promotora de Bdnf, permitiendo la transcripción
génica (Martinowich et al., 2003). De acuerdo a esto, tanto MeCP2 como CREB son
fosforilados en respuesta a activación neuronal, sugiriendo que existe una regulación
dinámica de ambos factores, los cuales podrían controlar la expresión génica presente
en procesos desde el desarrollo sináptico postnatal, formación de sinapsis, plasticidad
sináptica, etc., (Cohen et al., 2010) (Figura 6). De hecho, en modelos transgénicos
nulos de MeCP2 se encuentran pocas sinapsis excitatorias en comparación con el
modelo sobre-expresado en donde se encuentran demasiadas, por lo que este proceso
neuronal podría ser mediado por MeCP2 (Chahrour et al., 2008; Chen et al., 2003;
Hardingham et al., 2001; Zhou et al., 2006).
18
A
MeCP2
B
Figura 4. Esquema estructural de MeCP2 y su supuesto mecanismo de acción frente actividad
neuronal. A. Esta proteína contiene dos dominios pertenecientes a la familia de proteínas de unión a
ADN metilado; el dominio MDB, por el cual se une selectivamente a sitios CpGs metilados, y el dominio
represor de la transcripción TRD, con el que interactúa con proteínas asociadas a la cromatina (CAPs) y
reprime la transcripción (Figura extraída de Shin et al., 2013). B. Mecanismo propuesto para explicar la
relación entre metilación del ADN, remodelación de la cromatina y expresión génica frente a actividad
neuronal. La asociación de la proteína MeCP2 con el ADN metilado de la región promotora de Bdnf
(exón IV) reprime la transcripción génica de éste, reclutando un complejo que produce el remodelamiento
de la cromatina para el silenciamiento génico, mientras las neuronas permanecen en reposo. Al inducir
despolarización en estas mismas neuronas, MeCP2 se disocia parcialmente del promotor de Bdnf,
aumentando la unión del factor de transcripción CREB para activar su transcripción (Figura extraída de
Martinowich et al., 2003).
19
A
B
Figura 5. Posible mecanismo de MeCP2 para actuar como activador o represor de la transcripción
en regiones hipotalámicas (ratones). Los sitios CpGs metilados están representados por puntos
azules, MeCP2 se une a estos sitios: A. Recluta el co-represor Sin3A y HDACs, reprimiendo la
transcripción génica. B. Recluta el factor de transcripción CREB1 y co-activadores activando la
transcripción del gen blanco. La interacción de esta proteína con complejos reguladores presentes en
promotores de genes a los que se une, podría determinar su función en la transcripción (Figura extraída
de Chahrour et al., 2008).
20
Figura 6. Posible mecanismo de acción de la proteína MeCP2 frente a actividad neuronal. La
actividad neuronal puede desempeñar un papel fundamental en la determinación de la función
transcripcional de MeCP2. En una neurona en reposo, MeCP2 se encuentra unida a sitios CpGs
metilados (círculos azules) reprimiendo la transcripción. Frente a actividad neuronal se produce la
fosforilación de MeCP2 y puede que; directamente active la expresión génica al reclutar un complejo coactivador y desenrollador de cromatina para que la RNA polimerasa pueda unirse (izquierda), o bien
indirectamente produzca que la cromatina se desenrolle en una región alejada a la zona donde MeCP2
está unida y así se active la transcripción (derecha) (Figura extraída de Cohen et al., 2010).
21
4. Reelina, función e importancia en mecanismo de plasticidad sináptica.
Dentro del grupo de genes que se encuentran reprimidos por MeCP2 y que tienen
un rol importante en el desarrollo del sistema nervioso central, está el gen que codifica
para la proteína RELN (Chahrour et al., 2008). Esta proteína consta de 3460
aminoácidos en humanos, 3461 en ratón y 3462 en rata (Royaux et al.,1997). Se
encuentra conservada en varias especies mamíferas, por lo que al realizar un
alineamiento de esta proteína entre Homo Sapiens, Rattus norvegicus y Mus musculus
resulta una homología de 93.85%, facilitando su estudio en roedores (Fuente:
Alineamiento de RELN para las especies Homo sapiens, Rattus norvegicus y Mus
musculus. http://www.uniprot.org/align/2013021444N1X6YDK8).
RELN
es
una
larga
glicoproteína
de
la
matriz
extracelular
secretada
mayoritariamente por células Cajal Retzius durante el desarrollo del SNC y continúa
siendo secretada en etapa adulta por interneuronas
GABAérgicas
ubicadas
principalmente en la neocorteza, hipocampo, bulbo olfatorio, corteza cerebelar, estriado
y algunas zonas del hipocampo (Figura 7) (Chen et al., 2002; D’Arcangelo et al., 1999;
Fatemi 2005; Guidotti 2000; Herz y Chen 2006; Levenson et al., 2008). En hipocampo
de rata adulta, esta proteína es expresada por interneuronas GABAérgicas del giro
dentado, stratum radiatum del área CA1 y CA3, así como también puede ser
encontrada en el stratum oriens. Estudios recientes sugieren que altos niveles de
expresión de RELN en regiones asociadas a formación de memoria y aprendizaje son
fundamentales para la función sináptica hipocampal, formación de algunos tipos de
memoria y la capacidad cognitiva en mamíferos, modulando el funcionamiento normal
del cerebro durante la etapa adulta (Herz y Chen 2006; Levenson et al., 2008; Weeber
et al., 2002).
22
A
B
Figura 7. Distribución de la expresión de Reelina en el cerebro adulto de roedores. El patrón de
expresión de reelina está representado por círculos amarillos tanto en A. Plano sagital. B. Plano coronal.
Reelina es secretada principalmente por las interneuronas GABAérgicas presentes en zonas como
neocórtex, stratum radiatum de la zona CA1 y CA3, stratum oriens y el giro dentado. También está
presente en células mitrales del bulbo olfatorio, las células granulares de la corteza cerebelar, algunas
áreas del hipotálamo, colículo superior y la corteza piriforme (Pir). (Figura extraída de Herz y Chen,
2006).
23
Durante el desarrollo del sistema nervioso central, RELN cumple un papel
fundamental en la migración neuronal, estructuración y laminación cortical adecuada,
ayudando a la formación del cerebro de una manera ordenada. Cambios en los niveles
de esta proteína o de sus receptores puede causar un mal funcionamiento de la
corticogénesis, además estos mismos cambios han sido asociados a diversos
trastornos neuropsiquiátricos (Hertz y Chen, 2006). De hecho, en el ratón homocigoto
reeler, el cual posee mutaciones en el gen de RELN, ha sido posible observar el
desarrollo del cerebro con múltiples defectos histológicos, incluyendo una inversión de
la estratificación normal del cerebro en donde las neuronas primarias migran a la placa
cortical superficial en lugar de quedarse en las capas más profundas, lo que conduce a
una orientación anormal de cuerpos celulares y fibras nerviosas. Por otra parte, el ratón
heterocigoto reeler, el cual posee aproximadamente un 50% de mRNA y proteína
funcional, presenta alteraciones sinápticas como la disminución de la densidad de
espinas dendríticas en la corteza frontal y de la expresión de GABA y GAD67 (Fatemi,
2005; Gong et al, 2007; Herz y Chen, 2006; Rice y Curran, 2001; Tissir y Goffinet,
2003). Adicionalmente, este mutante posee características similares a las encontradas
en pacientes con esquizofrenia, autismo y trastorno bipolar, consecuente con estudios
realizados en muestras de cerebro post-mortem de pacientes diagnosticados con
dichas enfermedades (exceptuando el trastorno bipolar), en los cuales se registra una
disminución de aproximadamente el 50% tanto del mRNA como de las proteínas RELN
y GAD67, con respecto a sujetos en condiciones no siquiátricas (Grayson et al., 2005,
2006; Guidotti, 2000; Impagnatiello et al., 1998).
Posterior a la etapa del desarrollo cerebral, los niveles de RELN comienzan a
disminuir hasta alcanzar una concentración constante a finales de la infancia (Fatemi,
2005). En mamíferos adultos, pasa a ser secretada por interneuronas GABAérgicas,
encontrándose en gran medida en neocórtex e hipocampo.
La activación de la vía de señalización de RELN comienza con su unión a
receptores de transmembrana; el receptor de lipoproteína de baja densidad (VLDLR) y
el receptor 2 de apolipoproteina E (ApoER2), lo cual produce la fosforilación de la
proteína adaptadora intracelular disabled – 1 (Dab1) y activación de una cascada de
24
señalización intracelular mediada por la familia de quinasas Src (SFKs). Src fosforila las
subunidades de canales NMDAR en los residuos de tirosinas, lo que da como resultado
una potenciación de las respuestas mediadas por receptores glutamatérgicos del tipo
NMDAR y AMPAR (Chen et al., 2005; Qiu et al., 2006). Esta entrada de calcio
intracelular puede activar el factor de transcripción CREB y dar paso a la transcripción
de una serie de genes implicados en plasticidad sináptica (Figura 8) (Herz y Chen,
2006; Rice y Curran, 2001).
Figura 8. Modelo del mecanismo de acción de RELN en la modulación de la plasticidad sináptica.
Reelina se una a sus receptores ApoER2 y/o VLDLR. Ambos receptores están asociados a una vía de
señalización intracelular a través de la proteína Dab1, la cual al ser fosforilada activa una cascada de
señalización a través de la familia de proteínas quinasas Src (SFKs). Src fosforila residuos de tirosina de
las subunidades NMDAR, potenciando así el funcionamiento de estos canales. Además con la entrada de
calcio se activa una vía de señalización en la cual CaMKII fosforila a los receptores AMPAR, resultando
en un aumento de la conductancia y el tráfico en estos receptores. Por lo tanto, RELN es capaz de inducir
el potenciamiento de plasticidad sináptica dependiente de los receptores NMDAR, de la transmisión
sináptica a través de los receptores AMPAR, y participar en la reorganización sináptica (Figura extraída
de Herz y Chen 2006; Levenson et al.,2008).
25
Consistente con esta información, en un estudio realizado en rebanadas de
hipocampo, al superfundir con RELN se observa un incremento significativo en la
potenciación a largo plazo sin afectar la transmisión sináptica basal comparado con las
rebanadas control. Al realizar lo mismo en rebanadas de hipocampo pertenecientes a
ratones knockout para VLDLR y ApoER2, no es posible observar dicho incremento en la
LTP, ya que éstos ratones presentan problemas en los procesos de formación de la
potenciación a largo plazo y memoria, sugiriendo que RELN y sus receptores están
asociados a la función sináptica, la formación de la memoria a largo plazo, y
probablemente son fundamentales para la estabilidad y mantenimiento de las sinapsis
en el sistema nervioso central (Weeber et al., 2002).
5. Mecanismos epigenéticos en regulación de RELN.
Mutaciones presentes en el gen de RELN o alteraciones epigenéticas en su
regulación génica (Chen et al. 2002), han sido descritas en varios desordenes
neuropsiquiátricos
como
esquizofrenia,
autismo,
trastorno
bipolar,
depresión,
lisencefalia, y enfermedad de Alzheimer, dando cuenta de su importante participación
en procesos que van desde la embriogénesis, hasta la formación de distintos procesos
cognitivos superiores presentes a lo largo del desarrollo del sistema nervioso central
(Fatemi, 2005; Gong et al., 2007; Grayson et al., 2005, 2006; Guidotti, 2000; Levenson
et al., 2008; Rogers et al., 2011).
Los mecanismos epigenéticos que regulan la expresión de esta proteína en el
sistema nervioso central adulto, aún son difíciles de establecer. Sin embargo, la
evidencia sugiere que el promotor de RELN podría estar regulado por la metilación del
ADN (Chen et al. 2002; Tremolizzo et al. 2002; Veldic et al., 2005, 2008). Estudios
realizados en la corteza pre frontal (PFC) de ratones tratados con L-metionina (MET),
encontraron un patrón de hipermetilación en el promotor de RELN, además del
incremento de la unión de MeCP2 a éste. Al neutralizar el efecto de MET con valproato
(VPA) (un inhibidor de HDACs), induce la pérdida de la unión de MeCP2 a dicho
promotor, favoreciendo así su transcripción (Dong et al. 2005; Tremolizzo et al. 2002).
26
Por otra parte, en PFC de ratas los niveles de metilación del ADN y acetilación de
histonas en RELN y Bdnf pueden variar al inducir LTP, de hecho se potencia la
desmetilación de ambos promotores (Sui et al., 2012).
En otras zonas del cerebro como el hipocampo, el proceso de metilación del ADN
también es dinámico e inherente al proceso de transcripción, sugiriendo que es un
proceso regulado de forma cíclica, dinámica y reversible en respuesta a la experiencia
en el sistema nervioso central adulto. Además está involucrado directamente en la
consolidación de la memoria a largo plazo, debido a que su formación involucra tanto
un aumento en la metilación de genes supresores de memoria, como la disminución en
genes promotores de la misma (Day y Sweatt, 2010; Guo et al., 2011; Kangaspeska et
al., 2008; Levenson et al., 2006; Miller y Sweatt, 2007; Métivier et al., 2008; Suzuki y
Bird, 2008).
En RELN, este mecanismo epigenético podría estar sujeto a una modulación en
respuesta a estímulos externos y experiencia, es decir, los cambios cíclicos y dinámicos
en el estado de metilación del gen para RELN podrían estar regulados en respuesta a
la potenciación a largo plazo (Kangaspeska et al., 2008; Miller y Sweatt, 2007; Métivier
et al., 2008). Como se mencionó anteriormente, la potenciación a largo plazo presenta
dos fases de temporalidad, una temprana (E-LTP) la cual tiene una duración de minutos
y solamente implica la modificación de proteínas preexistentes, y una fase tardía (LLTP) que puede persistir desde horas a días y requiere de la activación de proteínas
quinasas, transcripción génica y síntesis de nuevas proteínas. Considerando este
argumento, es crucial para este estudio determinar si existe una metilación cíclica y
dinámica en la región promotora de RELN durante las etapas de la LTP, si esto se
relaciona con el aumento o disminución, tanto de la unión de la proteína MeCP2 en
dicha región y como de la expresión de RELN. De esta forma determinar si la LTP tiene
incidencia en la regulación génica de mecanismos que subyacen la memoria y
aprendizaje, planteándose la siguiente hipótesis:
27
HIPÓTESIS
"La plasticidad sináptica induce cambios en el estado de metilación de la región
promotora del gen que codifica para la proteína RELN, lo que produce una disminución
en la unión de la proteína MeCP2, aumentando la expresión de dicho gen”
Objetivo General
Evaluar el estado de la metilación del ADN y la capacidad de la proteína MeCP2
para unirse al gen de RELN, durante las etapas de la LTP, en hipocampo de ratas.
Objetivos específicos
En rebanadas de hipocampo control y tetanizada:
1. Estudiar el estado de metilación del gen de reelina en rebanadas de hipocampo.
•
Extraer ADN genómico de cada una de las áreas microdisectadas.
•
Modificar cada ADN genómico mediante la técnica de modificación por
bisulfito.
•
Detectar cambios en el estado de metilación del gen de Reelina mediante
la técnica de qPCR sensible a metilación.
28
2. Determinar la unión de proteína MeCP2 al gen de RELN, mediante la técnica de
inmunoprecipitación de cromatina (ChIP):
•
Realizar microdisecciones para la preparación de cromatina.
•
Incubar con el anticuerpo de interés, contra la proteína MeCP2 y realizar
la inmunoprecipitación.
•
Posteriormente revertir el entrecruzamiento y purificar el ADN.
•
Realizar qPCR de secuencias específicas del gen de RELN.
3. Cuantificar la expresión del gen de RELN:
•
Extraer ARN total de cada una de las áreas microdisectadas.
•
Analizar la expresión de RELN mediante RT- PCR en tiempo real.
29
METODOLOGÍA
1. Preparación de rebanadas de hipocampo.
La preparación de las rebanadas de hipocampo se llevará a cabo de acuerdo a un
protocolo adaptado desde la metodología descrita por Levenson et al., 2006.
Procedimiento:
•
Los hipocampos de ratas machos Sprague Dawley de aproximadamente 21 días
serán removidos y posicionados rápidamente en una solución salina de disección
(Buffer de disección: sacarosa 212 mM, KCl 5 mM, NaH2PO4 1,23 mM, NaHCO3
26 mM, D-glucosa 10 mM, CaCl22 mM, MgCl2 1 mM y equilibrada con 95% O2/
5% CO2).
•
Se utilizará un vibrátomo para obtener rebanadas de 400µm, y posteriormente
éstas serán transferidas a una solución de fluido cerebroespinal artificial (ACSF:
NaCl 124 mM, KCl 5 mM, NaH2PO4 1.23 Mm, NaHCO3 26 mM, D-glucosa 20
mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1mM, equilibrada también con 95% O2/ 5% CO2).
•
Las rebanadas serán mantenidas a temperatura ambiente aproximadamente por
30 a 45 minutos y luego serán transferidas a la cámara de registro donde se
superfundirán y estabilizarán con ACSF a 32°C por una hora antes de realizar los
registros electrofisiológicos.
2. Registro electrofisiológico en rebanadas de hipocampo.
Para obtener los datos electrofisiológicos se realizará la estimulación de las
rebanadas de hipocampo a partir de lo descrito por Auffret et al., 2010 y Kirkwood et
al.,1996.
30
3. Respuestas sinápticas.
Para inducir las respuestas sinápticas se deberá estimular las fibras colaterales de
Schaffer a partir de pulsos de 0.2 ms de duración aplicados con un electrodo de
estimulación y registrar extracelularmente en la capa dendrítica del área CA1 (stratum
radiatum) (Figura 9). La respuesta basal se obtiene mediante una estimulación de 0.033
Hz cada 30s por 20 min. Todo esto deberá ser realizado antes de la inducción de LTP,
y la intensidad de la corriente deberá evocar una pendiente del potencial de campo
excitatorios post-sinápticos (fEPSP) equivalente a la mitad de la pendiente máxima.
4. Protocolo de estimulación para inducir LTP.
La inducción de LTP se llevará a cabo mediante la aplicación de 4 trenes de
estimulación tetánica de alta frecuencia (TBS: Theta Burst Stimulation) de 100 Hz
aplicados cada 20 s (0,05 Hz). Cada tren de TBS, consiste en 10 tétanos o ráfagas
separados por 200 ms (5 Hz), y cada tétano se compone de 4 pulsos separados por 10
ms (100 Hz) (Figura 10 A).
5. Microdisecciones de hipocampo (Área CA1).
Una vez que transcurra el tiempo necesario (60´, 120´ y 180´) de registro en las
rebanadas con el protocolo de inducción para la LTP (tetanizadas), éstas se congelarán
en hielo seco y posteriormente se aislará el área CA1 mediante microdisección. Por otra
parte, la rebanada clasificada como control también deberá ser congelada y
microdisectada de la forma ya descrita, para efectos de comparación en los
experimentos posteriores.
31
6. Extracción de ADN genómico.
La extracción de ADN genómico se realizará mediante un protocolo proveniente
de un método comercial (Wizard® Genomic DNA Purification Kit).
Procedimiento:
•
Agregar 300 µL de solución de lisis nuclear a un tubo eppendorf y enfriar en
hielo.
•
Agregar 10-20 mg de tejido (microdisección CA1), y homogeneizar por 10 seg.
•
Incubar por 30 min a 65ºC.
•
Agregar 3-5 µL de RNAsa, y mezclar por inversión 3-5 veces. Incubar el tubo a
37ºC por 30 min.
•
Dejar enfriar a temperatura ambiente (RT). Agregar 200 µL de solución de
precipitación de proteínas, vórtex vigorosamente por 20 s. Dejar en hielo por 5
min.
•
Centrifugar 4 min a 14.000xg a 4°C. Remover cuidadosamente el sobrenadante
que contiene el ADN, y transferir a un tubo de 1,5 mL que contiene 600 µL de
isopropanol a -20°C.
•
Mezclar lentamente por inversión. Incubar a -20°C por 1 h.
•
Centrifugar por 1 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Descartar el
sobrenadante cuidadosamente, y agregar al pellet 600 µL de etanol 70%.
•
Mezclar cuidadosamente por inversión.
•
Centrifugar por 1 min a 14.000 x g a RT. Descartar el sobrenadante, y dejar
secar el tubo al aire en un papel absorbente.
•
Agregar 100 µL en una solución para resuspender el ADN (Tampón TE) a 65°C,
e incubar por 1hr. a 65 ºC.
•
Guardar el tubo a 4ºC, y posteriormente medir concentración de DNA.
32
7. Modificación de ADN genómico por bisulfito de sodio.
Esta técnica consiste en la conversión de las citosinas (C) que no están metiladas
en uracilos (U), mediante una reacción de deaminación. Debido a que las citosinas
metiladas (Cm) son resistentes a la reacción, estas permanecen como citosina. A partir
de este fundamento, se pueden diseñar partidores para la reacción de PCR sensible a
metilación (MSP), los cuales pueden discriminar entre las secuencias metiladas y no
metiladas (Roa et al., 2005). Esta técnica se realizará mediante un protocolo adaptado
a partir de lo descrito por Herman et al.,1996; Lubin y Sweatt, 2008; Ma et al., 2009;
Paulin et al., 1998; Roa et al., 2005.
Procedimiento:
Sonicación:
•
Sonicar 20 µg de DNA genómico en 80 µL de agua mediante 3 ciclos de 15 s
cada uno, separados por 15 s, a 50% de potencia.
Soluciones:
•
Se prepará las siguientes soluciones:
•
NaOH 3M: 3 g de NaOH en 25 mL de agua.
•
Na2O5S4 3,9 M/6,24 M Urea (Urea/bisulfito): disolver 3,8 g de bisulfito y 3,8 g de
urea en 5 mL de agua. Fijar pH a 5,0 (con 200 µL NaOH 3M) y completar a 10
mL.
•
Agitar suavemente, y cubrir con papel de aluminio.
•
Hidroquinona 10 mM: disolver 0,275 gr en 25 mL de agua. Diluir 10 veces. Agitar
suavemente y cubrir con papel aluminio.
Desnaturación:
•
Diluir 1 µg del ADN genómico sonicado (dada la tasa de degradación, puede ser
más ADN) en 18 µL de agua, y agregar 2µL de NaOH 3M.
•
Incubar a 42°C por 30 min.
•
Incubar a 90° por 2 min, e inmediatamente agregar 1 vol (20 µL) de agarosa al
2% derretida (low melting).
33
•
Para formar las beads, pipetear esta mezcla en 100 µL de aceite mineral frio (en
hielo).
Conversión con bisulfito:
•
Agregar 208 µL de Urea/bisulfito y 12 µL de hidroquinona (total: 240 µL) a la
mezcla de aceite mineral y beads del paso anterior. Mezclar por inversión, y
cubrir el tubo con papel aluminio.
•
Incubar a 50ºC por 5 h en oscuridad.
Desalado del DNA:
•
Detener la reacción agregando al tubo 1 mL de buffer TE pH 8.0 (10mM Tris-HCl
(pH 8.0), 10 mM EDTA) (Promega®), dejar incubando por 15 min, y centrifugar
por 1 min a 14.000 x g. Repetir este procedimiento 5 veces. Re-suspender los
beads en 50 µL de H2O.
Desulfonación:
•
Agregar a cada tubo 500 µL de 0,2 M NaOH, e incubar por 15 min. Centrifugar a
14.000 x g, y repetir el procedimiento.
•
Spin Down, y agregar 33,3 µL de Acetato de Amonio 5 M pH 7,0. (ó 1/5 de vol
con HCl 1 M).
•
Finalmente, lavar los beads en 1 mL de TE (1 vez por 15 min) y 1 mL de H2O (2
veces por 15 min).
•
Agregar 40 µL de buffer TE pH 8.0 y derretir la agarosa poniendo el tubo a baño
maría en agua recién hervida. Guardar a -20ºC (no hay daño por al menos 1
año). Para medir concentración utilizar 0,5 µL de esta solución.
34
8. qPCR específico para metilación (MSP) para gen de RELN.
El qPCR específico para metilación (MSP) es una técnica muy utilizada para
evaluar el estado de metilación en sitios CpG de un determinado gen. Este ensayo
actúa en base a la modificación por bisulfito, utilizando como templado el ADN
modificado por esta técnica. Para discriminar entre las regiones metiladas y no
metiladas presentes en el promotor del gen para RELN, es necesario realizar 2
reacciones de PCR, una que contenga el par de partidores que reconocerá los sitios
metilados y otra para los sitios no metilados. Los partidores específicos para éste
trabajo
se
diseñaron
a
través
de
un
software
llamado
MethPrimer
(www.urogene.org/methprimer/). Al ingresar al programa se debe introducir en formato
FASTA la secuencia original del promotor del gen de RELN de Rattus norvegicus, el
cual se puede encontrar en la base de datos Transcriptional Regulatory Element
Database (TRED: http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home), número de
acceso 102830. Una vez ingresada la secuencia, éste programa realiza una
modificación por bisulfito in silico, en donde para generar el par de partidores metilados
(M) asume que todas las citosinas se encuentran metiladas (5mC), por lo que no son
convertidas a timina. Posteriormente para generar el par de partidores no metilados (U),
asume que todas las citosinas no están metiladas y las convierte a timina (Li y Dahiya,
2002).
Procedimiento:
El PCR a tiempo real y la normalización de las muestras se realizará de acuerdo a
lo propuesto por Levenson et al., 2006:
Detección ADN metilado:
Brevemente, la detección del ADN metilado en la región promotora del gen de
RELN
se
llevará
a
cabo
utilizando
los
siguientes
primers:
Forward:
5´-
GGTTTAAAGTAATTTCGGGAGTTTC -3´ Reverse: 5´- AACCGCGTACTAAAAAAACGA
-3´. El volumen total de reacción de PCR debe ser de 20 µL, consistiendo de 2 µL de
35
ADN modificado por bisulfito, 10 µL iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad), 1 µL de cada
primer y 6 µL de agua DEPC.
Las reacciones se realizaran en un equipo de PCR en tiempo real utilizando los
siguientes ciclos: 95 °C por 3 min, 40 ciclos de 95 °C por 15 s, 60 °C por 1 min, y
finalmente 77.5 °C por 15 s.
Detección de ADN no metilado:
La detección del ADN no metilado en la región promotora del gen de RELN se
llevará
a
cabo
utilizando
los
TTTAAAGTAATTTTGGGAGTTTTGG
siguientes
-3´,
primers:
Forward:
Reverse:
5´5´-
AAAAACCACATACTAAAAAAACAAA -3´. El volumen de reacción y los ciclos de qPCR
se realizaran según lo descrito anteriormente.
36
9. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP).
ChIP es una técnica muy utilizada para el estudio de las interacciones entre ADN y
sus proteínas asociadas, principalmente ayuda a determinar la localización en el
genoma de éstas proteínas, incluyendo factores de transcripción e histonas, a través
del uso de anticuerpos específicos.
La inmunoprecipitación de cromatina comienza con el entrecruzamiento o “crosslinking” del ADN y sus proteínas asociadas, en donde a una muestra de rebanada de
hipocampo in vivo se le agrega formaldehido para fijar las interacciones ADN - proteína
y proteína - proteína. Posteriormente, a partir de fragmentos obtenidos por sonicación,
se inmunoprecipitan los complejos con los anticuerpos en cuestión (Dahl y Collas, 2008;
Hao et al., 2009).
Las secuencias específicas de ADN que en este caso son para el promotor del
gen de RELN, se amplificaran y normalizaran mediante PCR en tiempo real de acuerdo
a lo propuesto por Hao et al., 2009, para determinar si se encuentran enriquecidas con
la proteína MeCP2. Los partidores específicos para la región promotora del gen de
RELN se pueden diseñar en la base de datos Integrated DNA Technologies (IDT:
https://eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index). Al ingresar al programa se debe
introducir en formato FASTA la secuencia promotora de RELN de Rattus norvegicus
como se indicó anteriormente, obteniéndose como resultado el siguiente set de
partidores:
Forward:
5´-
CCACTCCAGGTGGCAATC-3´,
Reverse:
5´-
CGTGCCCGTACCCTTTC-3’. Ambos han sido elegidos de acuerdo a los parámetros
más favorables para realizar la amplificación.
Procedimiento:
Adaptado de un protocolo de Fast ChIP de acuerdo a lo publicado en Hao et al.,
2009.
Preparación y fijación de cromatina:
•
Rebanada de hipocampo 400 µm de espesor.
•
Microdisección de rebanada usando “Micropunch”.
37
•
Fijar el tejido con formaldehido 1,4% en ACSF por 15 min a temperatura
ambiente en plataforma rotatoria.
Detención de la fijación de cromatina:
•
Agregar un vol. 1/10 de 1,25 M de glicina e incubar en plataforma rotatoria por 5
min.
•
Lavar dos veces con PBS frio.
Sonicación:
•
Mezclar los tejidos con 300 µL de buffer IP con inhibidores de proteasa (ver
anexo).
•
Homogeneizar los tejidos e incubarlos en hielo por 10 min. Sonicar a 50% de
potencia en 10 rondas de 15 pulsos, en un baño de agua/hielo (los pulsos de
sonicación son de 1 s de duración con 1s de intervalo entre ellos). Entre cada
ronda de sonicación las muestras deben ser enfriadas en hielo por 2 min. (Sólo
válido si se utiliza el equipo propuesto, Fisher Scientific 60 Sonic Dismembrator
Waltham MA).
•
Posteriormente, centrifugar las muestras a 10.000 x g por 10 minutos a 4ºC.
•
Transferir 120 µL del sobrenadante (cromatina) a tubos eppendorf de 1,5 mL
nuevos y guardar a -80ºC.
Bolas magnéticas e incubación con el anticuerpo de interés:
Adaptado de un protocolo de microChIP (Dahl & Collas, 2008).
En tubos eppendorf para PCR de 0,2 mL:
•
agregar 10 µL de magna beads Proteína A/G (Magna® ChIP) + 90µL RIPA buffer
(25mM Tris•HCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% Na-Desoxicolato, 0.1%
SDS) y 2.4 µg del anticuerpo de interés.
•
Rotar a 40 x g por 2 h a 4°C.
•
Poner los tubos en el rack magnético y enfriar en hielo.
•
Retirar el buffer RIPA.
38
•
Agregar a cada tubo una alícuota de cromatina y dejar una muestra extra en un
tubo de 1,5 mL para posterior extracción de DNA.
•
Liberar los beads magnéticos dentro de la suspensión y rotar a 40 x g por 2
horas a 4°CInmunoprecipitación.
•
Capturar el complejo + b. magnéticas colocando los tubos en el rack magnético y
retirar la solución.
•
Posteriormente lavar el complejo 3 veces por incubaciones de 4 min en 100 µL
de buffer RIPA y una vez en 100 µL buffer TE (10mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM
EDTA).
Elución complejo DNA-proteína:
Adaptado de un protocolo de sensitive ChIP (Sikes et al., 2010):
•
Para eluir el complejo DNA-proteína, se debe resuspender el complejo en 100 µL
de 100 mM NaHCO3 y vórtex por 15 min a RT.
•
Retornar los tubos al rack magnético y transferir el eluido a nuevos eppendorf
que contienen 4 µL de NaCl 5M.
Reversión del Cross-linking:
•
Revertir a 95 °C por 15 minutos, enfriar los tubos a RT y luego incubar con
proteinasa K (10 µg/mL final) por una hora a 45 °C.
•
Parar la digestión adicionando PMSF (2 mM final).
Cuantificación del enriquecimiento del promotor de RELN mediante qPCR:
Brevemente, 5 µL del ADN ChIP se debe incubar con 1 µL de cada partidor
señalado anteriormente, agregar (hasta completar 25 µL) Qiagen Hot Star Taq
Polymerase Master Mix y amplificar en primera ronda por 15 ciclos de 95°C por 30 s,
57°C por 1 min, and 72°C por 1 min. Posteriormente, 2.5 µL de este producto de PCR
se debe mezclar con los partidores y 10 µL de volumen de reacción de iTaq SYBR
master mix (Bio-Rad) cubierto con 10 µL de aceite mineral. Los ciclos para PCR en
tiempo real son las siguientes: 2 min a 50°C, 10 min a 95°C y 40 ciclos a 95°C por 15 s
y a 60°C por 1 min.
39
10. Cuantificación de la expresión de RELN mediante RT-PCR en tiempo real.
La cuantificación de la expresión de RELN, tanto de las rebanadas tetanizadas
como control, se llevará a cabo mediante un RT-PCR en tiempo real de acuerdo a lo
propuesto por Sui et al., 2012.
Procedimiento:
Extracción de ARN total:
Este proceso se llevará a cabo de acuerdo a lo descrito por Panteri et al., 2006.
Rebanadas de hipocampo, tanto control como tetanizadas, deben ser microdisectada el
área CA1 e inmediatamente procesada para la extracción de ARN total a partir del kit
comercial SV Total RNA Isolation System (Promega), siguiendo las instrucciones del
fabricante. La concentración del ARN se pude determinar mediante espectrofotometría
a 260 nm.
RT-PCR en tiempo real:
La expresión de reelina será cuantificada por RT-PCR en tiempo real utilizando los
siguientes partidores: Forward 5´-AAACTACAGCGGGTGGAACC-3´; Reverse 5´ATTTGAGGCATGACGGACCTATAT-3´. La cuantificación de GAPDH será utilizada
como control interno
de acuerdo a los siguientes partidores:
Forward 5´-
AACGACCCCTTCATTGAC-3´; Reverse: 5´-TCCACGACATACTCAGCAC-3´.
Las reacciones de PCR serán realizadas en un volumen total de reacción de 50 µL
utilizando RNA-direct SYBR Green Real time PCR Master Mix Kit (TOYOBO CO.,
Osaka, Japan), conteniendo 2 µg de RNA total y 0,2 µM de cada partidor, siguiendo las
instrucciones del fabricante. Los ciclos para RT-PCR son los siguientes: transcripción
reversa se realizará a 61°C por 20 min seguida por desnaturación a 95°C por 60 s.
Posteriormente, 45 ciclos de PCR consistiendo en 3 pasos: desnaturación a 95°C por
15 s, alineamiento a 55°C por 15 s y elongación a 74°C por 45 s.
40
PLAN DE TRABAJO
OBJETIVO
MES
ETAPA
1
Obtención de
materiales
Obtención de
rebanadas de
hipocampo
Experimentos
para
determinar
metilación del
ADN
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Obtención de
implementos,
reactivos y
animales
Registros
Electrofisiológicos
Congelar
rebanadas
Modificación del
ADN por la técnica
de Bisulfito de
sodio
PCR a tiempo real
específico para
metilación
Experimentos
para
determinar la
unión de la
proteína
MeCP2 al
ADN
CHIP
Experimentos
para
determinar la
expresión del
gen de RELN
Extracción y
cuantificación de
ARN
Análisis de
datos
Reporte de datos,
conclusiones y
discusiones
41
RESULTADOS ESPERADOS Y DISCUSION
1. Inducción de potenciación a largo plazo en rebanadas de hipocampo de rata.
La LTP es una forma bien caracterizada de plasticidad sináptica que durante años
ha sido estudiada en varios modelos de roedores, donde mayoritariamente existe
evidencia que comparten mecanismos moleculares similares con humanos y otros
mamíferos.
La LTP puede ser inducida a partir de potenciales de campo excitatorios postsinápticos (fEPSP) evocados en el stratum radiatum del área CA1, en respuesta a
estimulación de axones proyectados desde la área CA3, pudiendo ser registrada
electrofisiológicamente; in vivo (sin dañar al conjunto de otras sinapsis) donde puede
persistir desde minutos, horas, días e incluso meses, e in vitro donde puede
mantenerse por aproximadamente más de 3 horas (Figura 9) (Bliss y Cooke, 2011).
Dentro de los objetivos experimentales para iniciar este proyecto, se encuentra
establecer una condición control (C) en rebanadas de hipocampo a las que no se le
aplicará el protocolo de estimulación, además de una condición tetanizada (LTP), en
donde las rebanadas serán sometidas al protocolo de estimulación de alta frecuencia
(TBS) en un curso temporal de 60, 120 y 180 minutos.
Debido a que la potenciación a largo plazo presenta dos fases de temporalidad, es
necesario registrar en cursos temporales por separado para determinar si existen
modificaciones epigenéticas, es decir, si aumenta o disminuye la metilación en el gen
de RELN dependiendo de la fase de la LTP, si eso influye en la unión de la proteína
MeCP2 a dicho gen y si tiene efectos sobre la expresión de RELN.
La condición tetanizada (LTP) se logrará utilizando un protocolo de estimulación,
el cual consiste en 4 trenes de estimulación tetánica de alta frecuencia (TBS: Theta
Burst Stimulation) de 100 Hz aplicados cada 20 s (0,05 Hz). Cada tren de TBS consiste
en 10 tétanos o ráfagas separados por 200 ms (5 Hz), y cada tétano se compone de 4
pulsos separados por 10 ms (100 Hz; Figura 10A) (Auffret et al., 2010; Boric et a., 2008;
Kirkwood, 1996). En la Figura 10B, se puede observar la condición tetanizada esperada
42
en un cuso de 120 minutos, las esferas azules representan curso temporal de los
cambios en la pendiente del fEPSP ocurridos al aplicar el protocolo de estimulación, en
rebanadas de hipocampo de rata (Datos proporcionados por el laboratorio de
neurociencia, CINV, Valparaíso).
Figura 9. Esquema de la configuración y posición de los electrodos para el registro que se realiza
en hipocampo de rata. Rebanada de hipocampo de rata, señalando el electrodo de estimulación (E)
ubicado en los axones de las colaterales de Schaffer de la región CA3, hacia la región CA1 donde se
ubica el electrodo de registro (R). (Figuras proporcionadas por el Laboratorio de Neurociencia, CINV).
43
A
B
Figura 10. LTP en neuronas del área CA1 inducidas por trenes de estimulación de alta frecuencia
en CA3 (colaterales de Schaffer) en hipocampo de rata. A. Esquema del protocolo de estimulación
para la inducción deLTP. Los 4 trenes de estimulación de alta frecuencia (TBS) se deben aplicar cada 20
segundos (0,05 Hz), cada tren estará compuesto de diez “bursts separados por 200 ms (5 Hz). A su vez
cada “burst” estará compuesto de 4 pulsos separados por 10 ms cada uno (100 Hz). B. Esferas azules
representan curso temporal de los cambios en la pendiente de los potenciales excitatorios post-sinápticos
(fEPSP) ocurridos al aplicar el protocolo de estimulación, en rebanadas de hipocampo de rata. Figuras
proporcionadas por el Laboratorio de Neurociencia, CINV.
44
2. Cambios en el estado de metilación en el gen de RELN durante potenciación a
largo plazo (LTP).
RELN, una glicoproteína de la matriz extracelular, posee una importante función
durante el desarrollo y la etapa adulta del sistema nervioso central, en donde modula la
plasticidad sináptica hipocampal y participa en la formación de la memoria a largo plazo
(Levenson et al. 2008; Miller y Sweatt 2007). Una serie de estudios en roedores
sugieren que el gen de RELN está sujeto a regulación de tipo epigenética, como lo es la
metilación del ADN, específicamente en su región promotora, y que perturbaciones en
la expresión de RELN se correlacionan con alteraciones en la formación de memoria y
cognición (Chen et al., 2002; DeSilva et al., 1997; Grayson et al., 2006; Levenson et al.,
2008; Rogers et al., 2011; Weeber et al., 2002).
Para evaluar del estado de metilación de la región promotora del gen de RELN en
rebanadas de hipocampo de rata, control y tetanizadas, se utilizará la técnica de qPCR
específica para metilación (MSP), la cual se basa en la modificación del ADN genómico
por bisulfito de sodio. Este ADN genómico modificado se utilizará como templado para 2
reacciones de qPCR, una con los partidores que reconocen los sitios CpGs metilados y
otra con los partidores para los sitios no metilados (ver metodología).
En células normales, las islas CpG asociadas a la región promotora de un gen
generalmente no se encuentran metiladas, por lo que son un posible blanco de
metilación frente a algún tipo de estímulo externo. Esta metilación suele ser modulada
dinámicamente en algunos genes, existiendo una especie de “switch” de metilación y
desmetilación (Kangaspeska et al., 2008; Métivier et al., 2008) relacionado con el
remodelamiento de la cromatina, en donde ambos procesos son dependientes de
actividad sináptica en el sistema nervioso central adulto (Martinowich et al., 2003).
Existe evidencia que indica que la disminución de la expresión de reelina
documentada en desórdenes psiquiátricos, podría deberse a una inapropiada
hipermetilación de su promotor, por lo tanto, un factor determinante en la regulación de
sus niveles de expresión es el estado de metilación de su región promotora (Chen et al.,
2002). Además estudios recientes en PFC medial de ratas, indican que los niveles de
metilación, tanto de RELN como Bdnf, pueden variar al inducir potenciación a largo
45
plazo. De hecho, al inducir LTP se potencia la desmetilación de ambos promotores (Sui
et al., 2012) (Figura 11).
Consecuente con lo anterior, uno de los resultados esperados en este trabajo es
observar una disminución en el estado de metilación de la región promotora del gen de
RELN frente a la inducción de la LTP. Existen resultados experimentales obtenidos
desde la tesis de magister en neurociencia, “Cambios en el estado de metilación en el
gen de la reelina en plasticidad sináptica” (Pablo Lizana, 2009) proporcionados por el
laboratorio de neurociencia del CINV, en donde se observa una disminución de la
metilación de una región intergénica de RELN en rebanadas de hipocampo de rata que
fueron sometidas al protocolo de estimulación de LTP y que su respuesta persiste por
aproximadamente 2 horas (L-LTP), comparado con la condición control (Figura 12).
Estos datos se correlacionan con la hipótesis planteada en este estudio, en donde
además se espera como resultado que durante el curso temporal de la LTP existan
cambios en los niveles de metilación, y que esto ayude a investigaciones posteriores
para determinar qué diferencias existen entre ellas con respecto a los mecanismos
moleculares y regulaciones que las subyacen.
Estos cambios esperados de metilación/desmetilación, podrían deberse a
alteraciones ocurridas durante la inducción de la potenciación a largo plazo sobre las
enzimas DNMTs totales. Existe evidencia que indica que en hipocampo de rata adulta
estas enzimas cumplen un rol fundamental durante un tratamiento de condicionamiento
del miedo, están asociadas con una rápida metilación y por ende silenciamiento
transcripcional del gen supresor de memoria (PP1), la desmetilación y subsecuente
activación transcripcional del gen potenciador de plasticidad sináptica, RELN. Esto
señala que dichas enzimas son necesarias para la plasticidad sináptica y la
consolidación de la memoria (Feng et al., 2010; Miller y Sweatt, 2007).
46
Figura 11. Representación cuantitativa de PCR a tiempo real, indicando la tasa de cambio del ADN
metiladoasociado a LTP.La metilación del ADN de los genes Bdnf y RELN en los grupos de
estimulación de prueba (Test, n=6) y los que inducen LTP a través de la estimulación de alta frecuencia
(HFS, es relativa a la condición naive (rebanada control, n=6). La estimulación de alta frecuencia (HFS)
induce la potenciación a largo plazo, lo que a su vez aumenta la desmetilación de las regiones
promotoras de los genes de RELN y Bdnf, con respecto a la estimulación de prueba en la corteza pre
frontal de ratas (Figura extraída desde Sui et al., 2012).
Figura 12. Disminución del estado de metilación en el gen de RELN después de L-LTP. Análisis
cuantitativo indicando la tasa de cambio de ADN metilado asociado a L-LTP con respecto al control,
asterisco indica diferencias significativas usando test t. p>0,05; n=4 (Figura extraída de tesis de magister
en neurociencia “Cambios en el estado de metilación en el gen de la reelina en plasticidad sináptica”.
Pablo Lizana, 2009).
47
3. Determinación de la unión de la proteína MeCP2 a la región promotora de RELN
durante LTP.
Una de las principales funciones de la proteína MeCP2 en el sistema nervioso
central adulto, es reprimir la transcripción de una serie de genes implicados en la
inducción de la plasticidad sináptica y memoria (Levenson et al., 2006; Martinowich et
al., 2003). Sin embargo, un estudio reciente ha revelado que MeCP2 podría tener tanto
una función represora, como activadora de la transcripción (Chahrour et al., 2008).
Se ha descrito que la actividad sináptica podría inducir la disociación parcial de la
proteína MeCP2 de la región promotora del gen de Bdnf, favoreciendo su transcripción
génica (Martinowich et al., 2003). En el caso del gen de RELN, al producirse la unión de
MeCP2 a sus sitios CpGs metilados se reprime su transcripción, por lo menos en
regiones hipotalámicas (Chahrour et al., 2008). Por lo tanto, para evaluar si la
potenciación a largo plazo como una forma de plasticidad sináptica induce cambios en
el estado de metilación del gen de RELN y a su vez si esto produce una disminución de
la unión de la proteína MeCP2 a la región promotora de dicho gen, se utilizará la técnica
de inmunoprecipitación de cromatina.
Esta técnica consiste principalmente en el entrecruzamiento o “cross-linking” del
ADN y sus proteínas asociadas, en donde a una muestra de rebanada de hipocampo
(tanto las control como las tetanizadas) se le agrega formaldehido para fijar las
interacciones ADN - proteína y proteína - proteína. Posteriormente, a partir de
fragmentos obtenidos por sonicación, se inmunoprecipitan los complejos con los
anticuerpos en cuestión (Dahl y Collas, 2008; Hao et al., 2009). Las secuencias
específicas de ADN, que en este caso son para el gen de reelina, se amplificaran y
normalizaran mediante PCR a tiempo real, para lo cual se diseñan partidores
específicos de la región promotora del gen de dicho gen (Ver metodología)
determinando de esta forma si se encuentran enriquecidas con la proteína MeCP2.
48
El resultado esperado de este experimento está relacionado con lo propuesto por
(Martinowich et al., 2003) en donde un análisis de inmunoprecipitación de cromatina
(ChIP) de la proteína MeCP2 y CREB indicó que MeCP2 se encuentra mucho más
unida al promotor del gen de Bdnf en neuronas en estado de reposo. De forma
contraria, en neuronas que han sido despolarizadas MeCP2 se encontró parcialmente
disociada del promotor de Bdnf, mientras que CREB permaneció unido firmemente a
éste. En base a esta información, en este estudio se esperaría como resultado una
disociación parcial de la proteína MeCP2 del promotor del gen de RELN en respuesta a
la LTP (Figura 13), consistente además con los resultados de la disminución de la
metilación en la región promotora del gen de RELN, en rebanadas de hipocampo de
rata (Martinowich et al., 2003).
La disociación parcial o total de MeCP2 de los sitios CpGs metilados presentes en
el promotor de RELN en repuesta a potenciación a largo plazo, podría deberse, aparte
de
la
disminución
de
la
metilación,
a
cambios
en
los
estados
de
fosforilación/desfosforilación de los residuos de serina de esta proteína. La actividad
neuronal induce la fosforilación de serina 421 (S421) y regula negativamente la
fosforilación de serina 80 (S80). Esta oposición en su funcionalidad frente a actividad
neuronal sugiere que la fosforilación de S80 se relaciona con la función de MeCP2 en
neuronas en reposo, mientras que la fosforilación de S421 se relaciona con la función
de ésta en neuronas despolarizadas. Al inducirse LTP, se produciría la desfosforilación
de la S421, lo que promueve la disociación de MeCP2 en los sitios CpGs metilados de
la región promotora, resultando en el remodelamiento de la cromatina a su forma activa,
la unión de factores de transcripción y la subsecuente expresión del gen de RELN
(Cohen et al., 2011; Tao et al., 2009).
49
Figura 13. Esquema propuesto para explicar la relación entre la metilación del ADN, asociación de
la proteína MeCP2 al promotor de RELN y la expresión génica de ésta, en respuesta a la LTP. A. Se
esperaría observar a MeCP2 unida estrechamente al promotor de RELN (representado por un rectángulo
celeste) en las rebanadas de hipocampo de rata que no han sido sometidas al protocolo de inducción de
la LTP (control). B. Posterior a la inducción de la LTP (rebanadas tetanizadas), se esperaría observar la
desmetilación parcial o total y la subsecuente disociación de MeCP2 del promotor de RELN, aumentando
la unión del factor de transcripción CREB para activar la transcripción del gen de RELN.
50
4. Cuantificación de la expresión de RELN durante LTP.
La metilación del ADN ha sido asociada a silenciamiento de la expresión génica
debido a que conduce a cambios en la estructura de la cromatina interfiriendo con la
capacidad de los factores de transcripción de unirse a elementos regulatorios presentes
en regiones promotoras. Por lo tanto, para evaluar el grado con el cual la metilación del
ADN y la asociación de la proteína MeCP2 se correlacionan con la actividad
transcripcional del gen de RELN en respuesta a la potenciación a largo plazo (LTP), se
medirán los niveles de mRNA de esta proteína, tanto en rebanadas control como
tetanizadas, mediante la técnica de RT-PCR en tiempo real.
Como
resultado,
se
espera
que
la
expresión
de
RELN
aumente
considerablemente en rebanadas de hipocampo que estarán bajo la inducción del
protocolo para LTP, producto de una disminución de la metilación y de la unión de
MeCP2 a su región promotora (Figura 13). Se espera que durante el curso temporal de
la LTP, es decir, en la fase tardía de la LTP (entre los 120 y 180 min), este aumento sea
mayor comparado con las primeras etapas de ésta (alrededor de los 60 min), debido a
que en la potenciación a largo plazo en su fase tardía requiere de la activación de
proteínas quinasas, transcripción génica y síntesis de proteínas como RELN, la cual
promueve la LTP, plasticidad sináptica y memoria a largo plazo. De hecho, se piensa
que la expresión de RELN en el hipocampo ocurre rápidamente cuando es necesario
almacenar un recuerdo, por lo que ocurre la desmetilación de su promotor activándose
la transcripción génica y subsecuente expresión (Beffert et al., 2005).
51
CONCLUSIONES Y PROYECCIONES
En base a la evidencia científica y a los resultados esperados en este trabajo, se
puede concluir que la metilación del ADN es un proceso regulado de forma dinámica y
reversible en respuesta a fenómenos de plasticidad sináptica, los cuales están
involucrados en procesos de memoria y aprendizaje, en el sistema nervioso central
adulto.
La LTP como una forma de plasticidad sináptica, puede inducir cambios en el
estado de metilación del ADN de genes implicados en dichos procesos, como lo es el
gen que codifica para la proteína RELN, disminuyendo así su estado de metilación.
Esto sugiere que dicho mecanismo epigenético tiene un rol fundamental en la
consolidación de la memoria a largo plazo, debido a que la formación de memoria
involucra un aumento de la metilación en genes supresores de memoria y disminución
en genes promotores de la misma, por lo menos en la región hipocampal (Day y Sweatt
2010; Guo et al. 2011; Kangaspeska et al. 2008; Levenson et al. 2006; Miller y Sweatt
2007; Métivier et al. 2008; Suzuki y Bird 2008).
La metilación en algún sitio CpG crítico promueve la unión de la proteína MeCP2,
quien actúa mediando la remodelación de la cromatina a su forma inactiva y con ello la
represión de la transcripción. Sin embargo, al inducirse la LTP se produciría una
disociación de la proteína MeCP2 de la región promotora del gen de RELN, dando paso
a la unión de factores de transcripción y con ello promoviendo la transcripción génica.
A pesar de que, estudios recientes sugieren que la función reguladora de MeCP2
en cuanto a la transcripción podría depender de su interacción con complejos
moleculares activadores o represores (Chahrour et al., 2008; Cohen et al., 2010), se
necesita investigar más para determinar qué mecanismos son exactamente los que
operan para que esta proteína actúe como un activador o un represor frente a diversos
estímulos, y lo que ello implica en enfermedades y desordenes neuropsiquiátricos a los
cuales ha sido asociada, los diversos genes a los cuales regula, como lo es el gen de
RELN, siendo la principal proyección para complementar el estudio actual, evaluar el
52
grado de fosforilación de los residuos de serina de la proteína MeCP2 y si su
disociación de la región promotora de RELN se debe a estos cambios, en respuesta a
la LTP.
Por ahora, se puede concluir que mecanismos como la LTP son necesarios para
inducir cambios en la metilación de genes como RELN y con ello producir la disociación
de la proteína MeCP2 de su región promotora para obtener un gen activo. Ambas
proteínas son necesarias y funcionan sinérgicamente proporcionando un equilibrio y un
funcionamiento normal del sistema nervioso central adulto.
53
ANEXO
Soluciones Electrofisiología
ACSF Stock
SAL
mM
PM
1L (g)
2L(g)
3L(g)
4L(g)
NaCl
124
58,44
7.25
14,5
21.75
29
KCl
5
74,5
0.37
0,74
1.11
1,5
NaH2PO4
1,23
138
0.172
0,34
0.516
0,68
NaHCO3
26
84
2.18
4,36
6.54
8,74
Glucosa
10
180
1.8
3,6
5.4
7,2
SAL
mM
PM
1L(mL)
100mL(mL)
200mL
300mL
400 mL
(g)
(g)
(g)
0.36
0.54
0.72
200
300mL(mL)
400mL(mL)
mL(mL)
MgCl2
1
203,3
1
0.15
0.3
0.45
0.6
CaCl2
2
147
2
0.25
0.5
0.75
1.0
Piruvato
3
110
1
1.5
2
Stock buffer disección
SAL
mM
PM
1L(g)
2L(g)
3L
4L(g)
(g)
KCl
5
74,5
0.37
0,74
1.11
1,5
NaH2PO4
1,23
138
0.17
0,35
0.516
0,68
NaHCO3
26
84
2.18
4,36
6.54
8,74
Glucosa
10
180
1.8
3,6
5.4
7,2
Sacarosa
212
342
SAL
200
300mL(g)
400
mL(g)
mL(g)
0.18
0.36
0.54
0.72
7.28
14.56
21.84
29.12
mL(g)
PM
1L(mL)
100 mL(mL)
200 mL(mL)
300mL(mL)
400 mL(mL)
MgCl2
203,3
1
1
2
3
4
CaCl2
147
2
0.05
0.1
0.2
0.3
1
1.5
2
Piruvato
mM
100
3
110
54
Soluciones ChIP.
IP buffer:
150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCL (pH 7.5), 5mM EDTA, 0,5 % v/v NP-40, 1% v/v
Triton X-100.
Inhibidores de proteasas:
500 uM PMSF, 10 ug/mL leupeptina, 10 ug/mL aprotenina, 10 mM NaF, 100 uM
Na3VO4.
RIPA buffer:
25mM Tris•HCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% Na-Desoxicolato, 0.1% SDS.
55
REFERENCIAS
Adkins, N. L., & Georgel, P. T. (2011). MeCP2: structure and function. Biochemistry and
cell biology = Biochimie et biologie cellulaire, 89(1), 1–11.
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… Zoghbi, H. Y. (2000). Influence of mutation type and X chromosome inactivation on
Rett syndrome phenotypes. Annals of neurology, 47(5), 670–9.
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age-related impairment of the late long-term potentiation in Alzheimer’s disease
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