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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
ESPAÑA
Número de publicación:
21
Número de solicitud: 201430543
51
Int. CI.:
A61K 36/53
A61P 35/00
Fecha de presentación:
73
11.04.2014
43
(2006.01)
72
Inventor/es:
SIERRA VEGA, Matilde;
GARCÍA VIEITEZ, Juan José;
DÍEZ LIÉBANA, Mª José;
FERNÁNDEZ MARTÍNEZ, Mª Nélida;
SAHAGÚN PRIETO, Ana Mª y
HUERGA MAÑANES, Vanessa
Fecha de la concesión:
07.04.2015
Fecha de publicación de la concesión:
14.04.2015
Titular/es:
UNIVERSIDAD DE LEÓN (100.0%)
Avda. de la Facultad, 25
24071 León (León) ES
Fecha de publicación de la solicitud:
10.07.2014
45
(2006.01)
PATENTE DE INVENCIÓN
12
22
2 475 517
11
74
Agente/Representante:
CARVAJAL Y URQUIJO, Isabel
54
Título: Uso de material de la planta Sideritis hyssopifolia para elaborar un producto alimenticio y
un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del cáncer
ES 2 475 517 B1
57 Resumen:
Uso de material de la planta Sideritis hyssopifolia para
elaborar un medicamento y un producto alimenticio
para la prevención y/o el tratamiento del cáncer. La
presente invención describe el uso de material o
extractos de la planta Sideritis hyssopifolia para
elaborar un medicamento para la prevención y/o el
tratamiento del cáncer y el uso de material o extractos
de la planta Sideritis hyssopifolia para elaborar un
producto alimenticio para la prevención del cáncer.
Los extractos pueden ser extracto etéreo, extracto
metanólico o extracto clorofórmico. El cáncer puede
ser cáncer de próstata, cáncer de colon o cáncer de
hígado.
Aviso: Se puede realizar consulta prevista por el art. 37.3.8 LP.
B1
ES 2 475 517 B1
USO DE MATERIAL DE LA PLANTA SIDERITIS HYSSOPIFOLIA PARA ELABORAR UN
PRODUCTO ALIMENTICIO Y UN MEDICAMENTO PARA LA PREVENCIÓN Y/O EL
TRATAMIENTO DEL CÁNCER
DESCRIPCIÓN
5
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a la utilización terapéutica de material o extractos de
10
plantas. En particular, la presente invención se refiere a material o extractos de la planta
Sideritis hyssopifolia para elaborar un producto alimenticio y/o un medicamento para la
prevención y/o el tratamiento del cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
15
El género Sideritis comprende más de 150 especies en el área Mediterránea, siendo España
y Turquía los países donde se encuentran más ampliamente distribuidas. Se trata de un
género botánico complicado, con una clasificación taxonómica compleja debido al elevado
número de hibridaciones que se producen entre las distintas especies.
20
Estas especies han sido utilizadas tradicionalmente por sus propiedades antiinflamatorias,
antiulcerativas,
antimicrobianas,
antioxidantes,
antiespasmódicas,
analgésicas
y
carminativas. Entre los componentes de las distintas especies de Sideritis nos encontramos
terpenos, flavonoides, aceites esenciales, iridoides, cumarinas, lignanos y esteroles. En
25
prácticamente todas ellas están presentes los diterpenos, los flavonoides y los aceites
esenciales, siendo los responsables de la mayoría de las actividades farmacológicas
observadas tanto in vivo como in vitro.
La Sideritis hyssopifolia es una planta perenne, muy ramificada, de 10-40 cm de altura, con
30
hojas lanceoladas de 1-4 cm, enteras, muy poco dentadas. Las inflorescencias son en forma
de espiga con brácteas dentadas y flores amarillas. Vive en lugares rocosos y pastos de
montaña desde los Pirineos al interior de Galicia. También crece en los Alpes franceses y en
algunos lugares de Italia.
2
ES 2 475 517 B1
La infusión de la inflorescencia se toma como estomáquico en digestiones difíciles y como
tratamiento del dolor de estómago. También se toma como bebida similar al té o café.
Igualmente se preparan licores digestivos por maceración de las inflorescencias.
5
Sideritis hyssopifolia contiene compuestos polifenólicos, entre los que se encuentran los
flavonoides. La tesis doctoral Rodríguez-Lyon ML. Aislamiento e identificación de
compuestos polifenólicos en Sideritis hyssopifolia subsp. Hyssopifolia L. Contribución a su
estudio farmacológico [Tesis doctoral]. Alcalá de Henares: Universidad de Alcalá de
Henares, 1997, describe algunos compuestos presentes en la planta Sideritis hyssopifolia
10
subespecie hyssopyfolia, y describió ácidos fenólicos (ácido clorogéncio), flavonoides
(hipolaetina, isocutalereína) y aceites esenciales con un elevado contenido en derivados del
ácido hidroxicinámico.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
15
La presente invención proporciona el uso de material o extractos de la planta Sideritis
hyssopifolia para elaborar un medicamento para la prevención y/o el tratamiento del cáncer,
en adelante uso de la invención.
20
El uso de la invención se puede definir también como un material o extractos de la planta
Sideritis hyssopifolia para su uso en la prevención y/o el tratamiento del cáncer.
Otra definición alternativa del uso de la invención es un método de prevención o tratamiento
del cáncer, que comprende administrar material o extractos de la planta Sideritis hyssopifolia
25
a un paciente.
Otra realización es el uso de material de la planta Sideritis hyssopifolia para elaborar un
producto alimenticio para la prevención del cáncer.
30
Otra realización es el uso de la invención, donde dichos extractos se seleccionan del grupo
compuesto por extracto etéreo, extracto metanólico y extracto clorofórmico.
Otra realización es el uso de la invención, donde dicho cáncer se selecciona del grupo
compuesto por cáncer de próstata, cáncer de colon y cáncer de hígado.
35
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
3
ES 2 475 517 B1
Figura 1. Visualización de la línea celular LNCaP al microscopio óptico invertido, a 10x, tras
72 h de tratamiento.
Figura 2. Visualización de la línea celular PC-3 al microscopio invertido, a 10x, tras 72h de
5
tratamiento.
Figura 3. Visualización de la línea celular Hep G2 al microscopio óptico invertido, a 10x, tras
72 h de tratamiento. A, Control. B, Quercetina 50 µg/mL. C, Quercetina 100 µg/mL. D, S3
500 µg/mL. E, S4 650 µg/mL. F, S6 600 µg/mL. G, S7 300 µg/mL.
Figura 4. Visualización de la línea celular Caco-2 al microscopio óptico invertido, a 10x, tras
10
72 h de tratamiento. A, Control. B, Quercetina 50 µg/mL. C, Quercetina 100 µg/mL. D, S3
500 µg/mL. E, S4 650 µg/mL. F, S6 600 µg/mL. G, S7 300 µg/mL.
MODOS DE REALIZACIÓN PREFERENTE
15
Ejemplo 1. Recolección de la planta
Durante los meses de julio y agosto de 2 anualidades (2010-2011) se procedió a la
recolección de las partes aéreas de la Sideritis hyssopifolia en terrenos del ayuntamiento de
Reyero en la provincia de León, contando con la colaboración de habitantes de la zona, que
20
de forma habitual realizan esta tarea cada año. Al ser una planta con aprovechamiento
regulado, no se pueden recolectar más de 2 kg por persona; se solicitaron previamente los
permisos pertinentes. A medida que se fue recolectando la planta, se iba realizando su
secado. Este proceso se finalizó a lo largo del mes de septiembre. La cantidad total de
planta recolectada, una vez secada, fue de aproximadamente 3 kg en cada una de las
25
anualidades.
Ejemplo 2. Obtención de extractos de la planta y determinación del contenido total de
fenoles y flavonoides
30
Tras finalizar el proceso de secado, se procedió a la obtención de los extractos ricos en
polifenoles siguiendo la metodología descrita en Rodríguez-Lyon ML. Aislamiento e
identificación de compuestos polifenólicos en Sideritis hyssopifolia subsp. Hyssopifolia L.
Contribución a su estudio farmacológico [Tesis doctoral]. Alcalá de Henares: Universidad de
Alcalá de Henares, 1997. A partir de las partes aéreas de la planta se obtuvieron 6
35
extractos: S3 (étereo), S4 (butanólico), S5 (acuoso butanólico), S6 (metanólico puro), S7
(clorofórmico) y S8 (acuoso final) y 20 fracciones derivadas del extracto S4 o butanólico.
4
ES 2 475 517 B1
El proceso de obtención de los extractos ricos en polifenoles consiste en pulverizar las
partes aéreas de las plantas y extraer posteriormente con n-hexano durante 3 horas. El
extracto hexánico se evapora a sequedad (S1). Por otra parte, el marco restante, se extrae
5
con una mezcla de metanol:agua (60:40) durante 24 horas a temperatura ambiente. El
proceso se repite 1 vez más durante 14 horas. Este extracto metanólico se concentra,
eliminando el metanol y parte del agua, mediante una evaporación a vacío y se extrae con
éter. El extracto etéreo (S3) se evapora a sequedad y la fracción acuosa se filtra con filtros
de MeOH60, constituyendo el precipitado el extracto S2 y el resto acuoso se extrae 3 veces
10
con metanol (14horas/4horas/2horas). Una vez extraído, la fracción acuosa constituye el
extracto S5 y la butanólica el S4.
Por otra parte, el residuo pulverizado de la planta una vez extraído con la mezcla
metanol:agua (60:40) se extrae primero con metanol (30 ml/g) durante 24 horas a
15
temperatura ambiente (S6) y después con cloroformo (S7) (12 ml/g). A continuación los
extractos clorofórmicos y metanólicos se concentran y liofilizan. Finalmente, el residuo seco
se extrae con agua destilada, obteniéndose el extracto S8.
En los diferentes extractos se determinó el contenido total en fenoles y en flavonoides.
20
Se cuantificó el contenido total de fenoles en los extractos mediante el método colorimétrico
de Folin-Ciocalteu y como patrón se utilizó el Ácido Gálico (1 mg/L).
Los resultados obtenidos se expresaron como miligramos de equivalentes de ácido gálico
25
(mgGAE) por gramo de extracto como figura en la Tabla 1.
Tabla 1. Contenido total de fenoles en los extractos
mgGAE/g
EXTRACTOS
extracto
S7-clorofórmico
11,988
S8-acuoso final
43,386
S5-acuoso butanólico
45,409
S6-metanólico puro
105,593
S3-etéreo
144,819
5
ES 2 475 517 B1
S4-butanólico
223,149
Se cuantificó el contenido total de flavonoides en los extractos mediante el método
colorimétrico del Cloruro de Aluminio y como patrón se utilizó la Quercetina (1 mg/mL).
5
Los resultados obtenidos se expresaron como miligramos de equivalentes de quercetina
(mgQE) por gramo de extracto como figura en la Tabla 2.
Tabla 2. Contenido total de flavonoides en los extractos
mgQE/g
EXTRACTOS
extracto
S8-acuoso final
8,722
S5-acuoso butanólico
12,780
S6-metanólico puro
39,776
S7-clorofórmico
58,466
S3-etéreo
59,744
S4-butanólico
79,712
10
Ejemplo 3. Evaluación de la actividad antiproliferativa de los extractos. Acción de los
extractos sobre las líneas celulares de carcinoma de próstata humana-LNCaP y PC-3.
Efecto de los extractos sobre la viabilidad celular
15
La acción antiproliferativa de los extractos de Sideritis hyssopifolia en el cáncer de próstata
se estudió en las líneas celulares de carcinoma de próstata humana LNCaP (sensible a
andrógenos) y PC-3 (insensible a andrógenos).
Las células se cultivaron a una densidad adecuada de 104 células por pocillo, en placas de
20
96 pocillos, que tras 24 h de la siembra, se añadieron los tratamientos recién preparados
durante 3 días (72h), realizando 4 réplicas para cada tratamiento y 3 experimentos
independientes.
Para cuantificar la viabilidad celular se empleó el método colorimétrico del MTT, que mide la
25
reducción metabólica del bromuro de 3- (4, 5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT)
realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa generando NADH y NADPH
6
ES 2 475 517 B1
por las células metabólicamente activas. El resultado es la formación de una sal intracelular
de color púrpura (formazán) que puede ser solubilizada y medida por espectrofotometría. De
este modo se determina la funcionalidad mitocondrial de las células tratadas y por tanto su
proliferación celular.
5
En primer lugar, se prepararon los extractos en DMSO (disolvente utilizado para disolver los
flavonoides y crioprotector en la conservación de células a -196 ºC en nitrógeno líquido) en
el rango de mg/mL.
10
De cada extracto se preparó el stock más concentrado posible. Para S3 (étereo), S5
(acuoso butanólico), S6 (metanólico puro) y S8 (acuoso final) la concentración fue de 600
mg/mL, para el S4 (butanólico) fue de 650 mg/mL y S7 (clorofórmico) fue de 350 mg/mL
Las disoluciones añadidas a los cultivos se preparaban en el momento del tratamiento y se
15
realizaron diluciones 1:1000 con el medio de cultivo completo, por tanto las unidades de las
concentraciones finales de los extractos fueron en µg/mL. De este modo, el DMSO estaba al
0,1% en las células y se evitaba su acción tóxica. Con el fin de comprobar este extremo, se
utilizaron pocillos control (sin tratamiento), unos sólo con su medio de cultivo y otros con
medio de cultivo y DMSO al 0,1%.
20
Como control negativo de viabilidad celular o patrón de muerte celular se utilizó quercetina,
flavonoide que induce muerte celular por apoptosis. El stock preparado fue de 100 mg/mL.
Las concentraciones utilizadas para cada línea celular y su porcentaje de viabilidad celular
25
respecto al control, se muestra en las tablas adjuntas (Tablas 3 a 10), incluyendo solo los
valores de las concentraciones con menos del 50% de viabilidad celular.
Tabla 3. Resultados de viabilidad celular (MTT) para PC-3, durante 24 y 48 horas de
tratamiento. CV es el coeficiente de variación.
30
24 horas
48 horas
TRATAMIENTO
(µg/mL)
MEDIA
VIABILIDA
D (%)
DESVES
T
CV
MEDIA
VIABILIDA
D (%)
DESVEST
CV
CONTROL
(células no
tratadas)
100
0.000
0.000
100
0.000
0.000
7
ES 2 475 517 B1
PATRÓN
POSITIVO:
QUERCETINA
50
S3-ETÉREO
300
S4-BUTANOL.
650
S6-METANOL.
600
S7-CLOROF.
150
65.962
1.674
2.537
44.456
1.323
2.976
68.981
2.870
4.160
50.065
2.272
4.539
86.858
3.201
3.685
85.478
2.306
2.698
67.611
2.405
3.556
55.856
2.062
3.691
67.554
3.447
5.102
65.756
3.079
4.682
Tabla 4. Resultados de viabilidad celular (MTT) para PC-3, durante 72 horas de tratamiento
TRATAMIENTO
(µg/mL)
MEDIA
VIABILIDAD (%)
DESVEST
CV
100
0.000
0.000
28.804
2.090
7.255
20.400
75.717
26.451
18.458
0.327
1.928
2.205
4.446
1.603
2.547
8.336
24.088
CONTROL (células
no tratadas)
PATRÓN
POSITIVO:
QUERCETINA 50
S3-ETÉREO 300
S4-BUTANOL. 650
S6-METANOL. 600
S7-CLOROF. 150
5
72 horas
Tabla 5. Resultados de citotoxicidad celular (MTT) para PC-3, durante 24 horas y 48 horas
de tratamiento.
24 horas
TRATAMIENTO
(µg/mL)
CONTROL
(células no
tratadas)
PATRÓN
POSITIVO:
QUERCETINA
50
S3-ETÉREO
300
S4-BUTANOL
650
S6-ETANOL
600
48 horas
MEDIA
CITOTOXI
CIDAD
(%)
DESVES
T
CV
MEDIA
CITOTOXI
CIDAD (%)
DESVEST
CV
0
0.000
-
0
0.000
-
34.038
1.674
4.917
55.544
1.323
2.382
31.019
2.870
9.252
49.935
2.272
4.551
13.143
3.201
24.354
14.522
2.306
15.881
32.389
2.405
7.424
44.144
2.062
4.670
8
ES 2 475 517 B1
S7-CLOROF.
150
32.446
3.447
10.624
34.244
3.079
8.991
Tabla 6. Resultados de citotoxicidad celular (MTT) para PC-3, durante 72 horas de
tratamiento.
TRATAMIENTO
(µg/mL)
CONTROL (células
no tratadas)
PATRÓN
POSITIVO:
QUERCETINA 50
S3 -ETÉREO 300
S4-BUTANOL. 650
S6-METANOL. 600
S7-CLOROF. 150
72 horas
MEDIA
CITOTOXICIDAD
(%)
DESVEST
0
0.000
71.196
2.090
2.935
79.600
24.283
73.549
81.542
0.327
1.928
2.205
4.446
0.411
7.941
2.998
5.453
CV
5
Tabla 7. Resultados de viabilidad celular (MTT) para LNCaP, durante 24 y 48 horas de
tratamiento
24 horas
TRATAMIENTO
(µg/mL)
CONTROL
(células no
tratadas)
PATRÓN
POSITIVO:
QUERCETINA
50
S3-ETÉREO
300
S4-BUTANOL
650
S6-ETANOL
600
S7-CLOROF.
150
10
48 horas
MEDIA
VIABILIDA
D (%)
DESVES
T
CV
MEDIA
VIABILIDA
D (%)
DESVEST
CV
100.000
0.000
0.000
100.000
0.000
0.000
62.192
6.083
9.781
30.264
6.882
22.740
65.122
3.037
4.664
44.918
2.752
6.127
99.568
1.570
1.576
73.129
1.224
1.673
55.11
0.931
1.689
53.186
10.262
19.295
61.254
2.278
3.719
51.359
5.426
10.566
Tabla 8. Resultados de viabilidad celular (MTT) para LNCaP, durante 72 horas de
tratamiento
72 horas
9
ES 2 475 517 B1
TRATAMIENTO
(µg/mL)
CONTROL (células
no tratadas)
PATRÓN
POSITIVO:
QUERCETINA 50
S3 -ETÉREO 300
S4-BUTANOL. 650
S6-METANOL. 600
S7-CLOROF. 150
MEDIA
VIABILIDAD (%)
DESVEST
CV
100.000
0.000
0.000
26.427
14.313
75.903
19.493
6.666
1.229
4.216
4.561
1.389
1.188
4.651
29.453
6.009
7.124
17.821
Tabla 9. Resultados de citotoxicidad celular (MTT) para LNCaP, durante 24 y 48 horas de
tratamiento.
24 horas
TRATAMIENTO
(µg/mL)
CONTROL
(células no
tratadas)
PATRÓN
POSITIVO:
QUERCETINA
50
S3-ETÉREO
300
S4-BUTANOL
650
S6-ETANOL
600
S7-CLOROF.
150
48 horas
MEDIA
CITOTOXI
CIDAD
(%)
DESVES
T
CV
MEDIA
CITOTOXI
CIDAD (%)
DESVEST
CV
0.000
0.000
#¡DIV/0!
0.000
0.000
-
37.808
6.083
16.089
69.736
6.882
9.869
34.878
3.037
8.708
55.082
2.752
4.997
0.432
1.570
363.596
26.871
1.224
4.554
40.890
0.931
2.073
46.815
31.552
67.399
38.746
2.278
5.879
48.641
5.426
11.156
5
Tabla 10. Resultados de citotoxicidad celular (MTT) para LNCaP, durante 72 horas de
tratamiento.
TRATAMIENTO
(µg/mL)
CONTROL (células
no tratadas)
PATRÓN
POSITIVO:
QUERCETINA 50
S3 -ETÉREO 300
72 horas
MEDIA
CITOTOXICIDAD
(%)
DESVEST
CV
0.000
0.000
-
73.573
85.687
1.229
4.216
1.671
4.920
10
ES 2 475 517 B1
S4-BUTANOL. 650
S6-METANOL. 600
S7-CLOROF. 150
24.097
80.507
93.334
4.561
11.297
1.188
18.927
14.032
1.273
Los extractos S5 y S8 fueron descartados en las primeras pruebas por dar casi 100% de
viabilidad celular. El extracto butanólico S4 redujo solo al 24 % la viabilidad celular en ambas
líneas celulares a las 72 h de tratamiento. No se correlaciona, por lo tanto, la acción
5
antiproliferativa con su actividad antioxidante ya que este extracto es el que mostró mayor
actividad antioxidante.
En general, el tratamiento en ambas líneas celulares con los extractos S3, S6 y S7 provocó
una disminución muy acusada de la viabilidad celular dependiente del tiempo de incubación
10
y de la concentración de los extractos.
Ejemplo 4. Efecto de los extractos sobre la muerte celular
Las células se cultivaron a una densidad adecuada de 200.000 células por pocillo, en placas
15
de 6 pocillos, que tras 24 h de la siembra, se añadieron los tratamientos recién preparados
durante 3 días (72h), realizando 2 réplicas para cada tratamiento y 3 experimentos
independientes. El tratamiento que se añadió a las células fueron los que figuran en las
tablas 1 a 4 obtenidas por el ensayo MTT.
20
Para medir cualquier tipo de muerte celular se utilizó el fluorocromo Ioduro de Propidio (IP)
que no atraviesa la membrana de las células intactas o vivas y si las células dañadas (por
disrupción de la integridad de la membrana) uniéndose a los ácidos nucleicos, emitiendo
una fluorescencia de color rojo y cuantificándose por citometría de flujo.
25
Los ensayos preliminares indican que el tratamiento si provoca muerte celular y es
dependiente del tiempo de incubación (24, 48 y 72 h).
Ejemplo 5. Efecto de los extractos sobre la distribución del ciclo celular
30
Los ensayos sobre ciclo celular se realizaron a la vez que los de la muerte celular, siendo
por lo tanto las mismas las condiciones del cultivo celular y tratamiento. Los reactivos
añadidos posteriores al tratamiento fueron el Igepal-630, detergente que permeabiliza la
membrana celular, la enzima RNasa A que disgrega el RNA y el IP que se une al ADN
celular.
11
ES 2 475 517 B1
La medición de las fases del ciclo celular se realizó por citometría de flujo para saber si el
tratamiento inducía parada del ciclo celular en fases concretas del ciclo. Esta técnica se
basa en la correlación entre la intensidad de fluorescencia por el ioduro de propidio y el
5
contenido de ADN de la célula, permitiendo distinguir la proporción de células que se
encuentran en la fase GO (parada celular) - G1 (síntesis ARN prot), S (síntesis de ADN) y
G2 (síntesis de proteínas) - M (mitosis). De esta forma, se pueden conocer las células
apoptóticas (sub-G0/G1).
Los resultados obtenidos indican que el tratamiento si provoca la aparición de células
10
apoptóticas y es dependiente del tiempo de incubación (24, 48 y 72 h).
A modo de resumen, podemos señalar que los extractos presentaron una alta actividad
antioxidante, pero a diferentes concentraciones, siendo en orden decreciente:
S4 > S6 > S3 > S5 > S8 > S7
15
Para el contenido en fenoles, el orden fue: S4 > S3 > S6 > S5 > S8 > S7
Para los flavonoides:
20
S4 > S3 > S7> S6 > S5 > S8
Y para el MTT para las células LNCaP y PC-3:
S7 > S3 > S6
De la aplicación de estos últimos métodos, se comprobó que un extracto que llama
especialmente la atención es el clorofórmico S7, con el menor contenido en fenoles de todos
los extractos y en contenido de flavonoides se sitúa en tercer lugar, pero es el que más
25
inhibe el crecimiento celular con más del 80 %.
El extracto butanólico S4 es el que mayor actividad antioxidante presenta, con el mayor
contenido en fenoles y flavonoides, sin embargo, no tiene acción antiproliferativa en las
líneas celulares de cáncer de próstata humana, LNCaP y PC-3.
30
El efecto inhibitorio de crecimiento que se observa en las células no es debido, por lo tanto,
a la mayor cantidad de flavonoides, fenoles y acción antioxidante, por lo que tiene que
deberse a la presencia de otros principios activos presentes en los extractos S7, S3 y en S6
que no están en S4.
35
12
ES 2 475 517 B1
Ejemplo 6. Efecto de los extractos sobre las líneas celulares de carcinoma hepatocelular
Hep G2. Efecto de los extractos sobre la viabilidad celular
Las células se cultivaron a una densidad de 104 células por pocillo, en placas de 96 pocillos.
5
Para ello, el medio de cultivo empleado fue el SensiCell MEM, suero fetal bovino al 10%
termoinactivado y penicilina /estreptomicina al 1%.
Tras 48 h de la siembra, se añadieron los tratamientos recién preparados durante 3 días
(72h), realizando 4 réplicas (4 pocillos) para cada tratamiento.
10
Para cuantificar la viabilidad celular se empleó el método colorimétrico del MTT.
El tratamiento a añadir a las células se preparó siempre fresco y se realizaron diluciones
1:1000 con el medio de cultivo completo.
15
Se pusieron pocillos control (sin tratamiento): sólo con su medio de cultivo y otros con su
medio de cultivo y DMSO al 0,1% para comprobar que este disolvente no es tóxico en las
células a esa concentración que es la misma en la cual están preparados los extractos.
20
Como control negativo de viabilidad celular se utilizó la Quercetina a 50 y a 100 µg/mL
(concentración final).
Los pocillos experimentales constaban de los extractos con las concentraciones finales
siguientes: S3 etéreo a 500 µg/mL, S4 butanólico a 650 µg/mL, S6 metanólico a 600 µg/mL
25
y S7 clorofórmico a 300 µg/mL
Como sucedió en las líneas celulares de cáncer de próstata los extractos S5 butanólico
acuoso y el S8 acuoso final se descartaron por no producir ningún efecto en las células, tras
la realización de un ensayo previo.
30
Previamente a la realización del método MTT, se ensayó el tratamiento citado en flasks
pequeños de 25 cm2, para la visualización al microscopio óptico invertido y los resultados
visuales fueron muy parecidos a los efectuados con el método MTT.
35
Se observa al microscopio y también cuantitativamente un efecto reducido sobre la
viabilidad celular producido por el extracto etéreo S3 a 500 µg/mL del 14,514 % y del
13
ES 2 475 517 B1
extracto clorofórmico S7 a 300 µg/mL del 6,492 % respecto a los pocillos control (100%) a
las 72 h de tratamiento. También se aprecia al microscopio la pérdida de la forma e
integridad celular causada por muerte celular.
5
Respecto a la quercetina, al microscopio se observa una reducida viabilidad celular pero
numéricamente no da menos del 50% de viabilidad.
14
ES 2 475 517 B1
Tabla 11
Tratam.
(µg/mL)
Control
Viabili
abs 1
abs 2
abs 3
abs 4
media
desves
cv
dad
(%)
100,00
Citotox
(%)
3,864
3,734
3,633
3,864
3,774
0,163
4,328
2,23
1,967
2,286
2,065
2,137
0,943
44,135
56,624
43,376
2,852
2,518
1,959
2,006
2,334
1,081
46,332
61,838
38,162
S3 500
0,628
0,576
0,573
0,414
0,548
0,935
170,717
14,514
85,486
S4 650
3,864
3,864
3,864
3,184
3,694
0,575
15,558
97,880
2,120
S6 600
3,864
3,508
2,995
3,305
3,418
1,477
43,203
90,567
9,433
S7 300
0,204
0,358
0,173
0,245
0,099
40,441
6,492
93,508
Querc.
50
Querc.
100
0
0,000
Ejemplo 7. Efecto de los extractos sobre las líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal
5
Caco-2. Efecto de los extractos sobre la viabilidad celular
Las células se cultivaron a una densidad de 104 células por pocillo, en placas de 96 pocillos.
Para ello, el medio de cultivo completo constaba de medio de cultivo DMEM GlutaMAX,
suero fetal bovino al 10% termoinactivado y penicilina /estreptomicina al 1%.
10
Tras 48 h de la siembra, se añadieron los tratamientos recién preparados durante 3 días
(72h), realizando 4 réplicas (4 pocillos) para cada tratamiento. Para cuantificar la viabilidad
celular se empleó el método colorimétrico del MTT.
15
El tratamiento a añadir a las células se preparó siempre fresco y se realizaron diluciones
1:1000 con el medio de cultivo completo.
Se pusieron pocillos control (sin tratamiento): sólo con su medio de cultivo y otros con su
medio de cultivo y DMSO al 0,1% para comprobar que este disolvente no es tóxico en las
20
células a esa concentración que es la misma en la cual están preparados los extractos.
Como posible control negativo de viabilidad celular se utilizó la Quercetina a 50 y a 100
µg/mL (concentración final).
15
ES 2 475 517 B1
Los pocillos experimentales constaban de los extractos con las concentraciones finales
siguientes: S3 etéreo a 500 µg/mL, S4 butanólico a 650 µg/mL, S6 metanólico a 600 µg/mL
y S7 clorofórmico a 300 µg/mL
5
Como sucedió anteriormente, los extractos S5 butanólico acuoso y el S8 acuoso final se
descartaron por no producir ningún efecto en las células, tras la realización de un ensayo
previo.
10
Previamente a la realización del método MTT, se ensayó el tratamiento citado en flasks
pequeños de 25 cm2, para la visualización al microscopio óptico invertido y los resultados
visuales fueron muy parecidos a los efectuados con el método MTT.
En los pocillos control la absorbancia también ha sido elevada, reflejo de una alta densidad
15
celular.
Respecto a los extractos, el único extracto que redujo considerablemente la viabilidad
celular fue el extracto clorofórmico S7 a 300 µg/mL con el 13,786 % respecto al control
(100% de viabilidad) a las 72h de tratamiento, donde se observa al microscopio (fotos) una
20
pérdida total de la forma celular. El extracto etéreo S3 a 500 µg/mL mostró un 60,266 % de
viabilidad celular.
Tabla 12
Tratam.
Viabilidad
Citotox
(%)
(%)
4,437
100,000
0,000
0,133
7,791
76,850
23,150
1,310
0,019
1,483
59,093
40,907
1,107
1,336
0,295
22,058
60,266
39,734
3,155
3,092
3,130
0,302
9,663
141,257
-41,257
1,618
1,712
2,545
2,112
0,517
24,490
95,284
4,716
0,294
0,401
0,233
0,306
0,070
22,867
13,786
86,214
abs 1
abs 2
abs 3
abs 4
media
desvest
cv
2,089
2,187
2,296
2,291
2,216
0,098
1,526
1,678
1,789
1,819
1,703
1,304
1,286
1,316
1,332
S3 500
1,165
1,312
1,758
S4 650
2,768
3,506
S6 600
2,571
S7 300
0,294
(µg/mL)
Control
Querc.
50
Querc.
100
16
ES 2 475 517 B1
En este caso también se cumple que el extracto clorofórmico S7 es el que más efecto
produce sobre la viabilidad celular; reduciéndola, en cáncer de hígado y colon, seguido por
el extracto etéreo S3 donde el efecto es más acusado en cáncer de hígado que en colon.
5
17
ES 2 475 517 B1
REIVINDICACIONES
1. Uso de material o extractos de la planta Sideritis hyssopifolia para elaborar un
medicamento para la prevención y/o el tratamiento del cáncer.
2. Uso de material o extractos de la planta Sideritis hyssopifolia para elaborar un producto
5
alimenticio para la prevención del cáncer.
3. Uso según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por que dichos extractos se
seleccionan del grupo compuesto por extracto etéreo, extracto metanólico y extracto
clorofórmico.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicho cáncer
10
se selecciona del grupo compuesto por cáncer de próstata, cáncer de colon y cáncer de
hígado.
18
ES 2 475 517 A1
B1
Fig. 1
19
ES 2 475 517 A1
B1
Fig. 2
20
ES 2 475 517 A1
B1
A
B
C
D
E
F
G
Fig. 3
21
ES 2 475 517 A1
B1
A
B
C
D
E
F
G
Fig. 4
22
OFICINA ESPAÑOLA
DE PATENTES Y MARCAS
21 N.º solicitud: 201430543
ESPAÑA
22 Fecha de presentación de la solicitud: 11.04.2014
32 Fecha de prioridad:
INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
A61K36/53 (2006.01)
A61P35/00 (2006.01)
51 Int. Cl. :
DOCUMENTOS RELEVANTES
Categoría
56
Documentos citados
Reivindicaciones
afectadas
X
DE LA PUERTA, R., FERNANDEZ-ARCHE, M.A., LOPEZ-LAZARO, M., GARCIA, M. D.
Antioxidant and cytotoxic activities of Sideritis perezlarae (Borja) Rosselló, Stübing and Peris.
Natural Product Research, 2013. Vol. 27, nº 17, páginas 1602-1606. ISSN: 1478-6419.
Doi: 10.1080/1478619.2012.740031.
1,3,4
X
KIRMIZIBEKMEZ, H. et al. Iridoid, phenylethanoid and flavonoid glycosides from Sideritis trojana.
Fitoterapia, 2012, vol. 83, nº 1, páginas 130-136. ISSN: 0367-326X.
Doi: 10.1016/j.fitote.2011.10.003.
1,3,4
X
KOGIANNOU, DIMITRA A. A. et al. Herbal infusions; their phenolic profile, antioxidant and antiinflammatory effects in HT29 and PC3 cells. Food and Chemical Toxicology, 2013, vol. 61,
páginas 152-159. ISSN: 0278-6915. Doi: 10.1016/j.fct.2013.05.027.
1,2,4
X
DEMIRTAS, I., SAHIN, A., AYHAN, B., TEKIN, S., TELCI, I. Antiproliferative effects of the
methanolic extracts of Sideritis libanotica Labill subsp. linearis. Records of Natural Products,
2009, Vol. 3, nº 2, páginas 104-109. Recuperado de Internet :
< URL: http://www.acgpubs.org/RNP/2009/Volume%203/Issue%201/13_RNP-0812-65.pdf
1,3
X
TADIC, V. M. et al. Anti-inflammatory, Gastroprotective and Cytotoxic effects of Sideritis scardica
extracts. Planta Medica, 2012, vol. 78, nº 5, páginas 415-427. ISSN: 0032-0943.
Doi: 10.1055/s-0031-1298172.
1
X
JEREMIC, I. et al. The mechanisms of in vitro cytotoxicity of mountain tea, Sideritis scardica,
against the C6 glioma cell line. Planta Medica, 2013, vol. 79, nº 16, páginas 1516-1524.
ISSN: 0032-0943. Doi: 10.1055/s.0033-1350809. Recuperado de Internet:
<URL: https://www.thieme-connect.com/ejournals/abstract/10.1055/s-0033-1350809
1
X
GONZALEZ-BURGOS, E., CARRETERO, M.E., GOMEZ-SERRANILLOS, M.P. Sideritis spp.:
Uses, Chemical composition and Pharmacological activities – A review. Journal of
Ethnopharmacology, 2011, vol. 135, páginas 209-225. ISSN: 0378-8741.
Doi: 10.1016/j.jep.2011.03.014
1
Categoría de los documentos citados
X: de particular relevancia
Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la
misma categoría
A: refleja el estado de la técnica
O: referido a divulgación no escrita
P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación
de la solicitud
E: documento anterior, pero publicado después de la fecha
de presentación de la solicitud
El presente informe ha sido realizado
 para todas las reivindicaciones
Fecha de realización del informe
02.07.2014
 para las reivindicaciones nº:
Examinador
A. Sukhwani
Página
1/6
OFICINA ESPAÑOLA
DE PATENTES Y MARCAS
21 N.º solicitud: 201430543
ESPAÑA
22 Fecha de presentación de la solicitud: 11.04.2014
32 Fecha de prioridad:
INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
A61K36/53 (2006.01)
A61P35/00 (2006.01)
51 Int. Cl. :
DOCUMENTOS RELEVANTES
Categoría
56
Documentos citados
Reivindicaciones
afectadas
X
TOPCU, G., GOREN, A. C. Biological activity of diterpenoids isolated from Anatolian Lamiaceae
plants. Records of Natural Products, 2007, vol. 1, nº 1, páginas 1-16. Recuperado de Internet:
<URL: http://www.acgpubs.org/RNP/2007/Volume%201/Issue%201/review_RNP-02.pdf
1
A
HUERGA, V. et al. Determination of the antioxidant activity of Sideritis hyssopifolia. Basic &
Clinical Pharmacology & Toxicology, 2011, vol. 109, Supp. 2, Sp. Iss. SI, página 49.
ISSN: 1742-7835.
3
Categoría de los documentos citados
X: de particular relevancia
Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la
misma categoría
A: refleja el estado de la técnica
O: referido a divulgación no escrita
P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación
de la solicitud
E: documento anterior, pero publicado después de la fecha
de presentación de la solicitud
El presente informe ha sido realizado
 para todas las reivindicaciones
Fecha de realización del informe
02.07.2014
 para las reivindicaciones nº:
Examinador
A. Sukhwani
Página
2/6
INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA
Nº de solicitud: 201430543
Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)
A61K, A61P
Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de
búsqueda utilizados)
INVENES, EPODOC, WPI, X-FULL, NPL, FSTA, CAPLUS, AGRICOLA, CABA
Informe del Estado de la Técnica
Página 3/6
OPINIÓN ESCRITA
Nº de solicitud: 201430543
Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 02.07.2014
Declaración
Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
Reivindicaciones 1 - 4
Reivindicaciones
SI
NO
Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
Reivindicaciones
Reivindicaciones 1 - 4
SI
NO
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de
examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).
Base de la Opinión.La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.
Consideraciones:
La presente invención tiene por objeto el uso de material o extractos de la planta Sideritis hyssopifolia para elaborar un
medicamento (reivindicación 1) y un producto alimenticio (reiv. 2) para la prevención y/o tratamiento del cáncer.
Los extractos se seleccionan de extracto etéreo, extracto metanólico y extracto clorofórmico (reiv. 3).
El cáncer se selecciona de cáncer de próstata, cáncer de colon y cáncer de hígado (reiv. 4).
Informe del Estado de la Técnica
Página 4/6
OPINIÓN ESCRITA
Nº de solicitud: 201430543
1. Documentos considerados.A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la
realización de esta opinión.
Documento
Número Publicación o Identificación
Fecha Publicación
D01
DE LA PUERTA, R., FERNANDEZ-ARCHE, M.A., LOPEZ-LAZARO, M., GARCIA, M.
D. Antioxidant and cytotoxic activities of Sideritis perezlarae (Borja) Rosselló,
2013
D02
D03
D04
D05
D06
D07
D08
D09
Stübing and Peris. Natural Product Research, 2013. Vol. 27, nº 17, páginas
1602-1606
KIRMIZIBEKMEZ, H. et al. Iridoid, phenylethanoid and flavonoid glycosides from
Sideritis trojana. Fitoterapia, 2012, vol. 83, nº 1, páginas 130-136
KOGIANNOU, DIMITRA A. A. et al. Herbal infusions; their phenolic profile,
antioxidant and anti-inflammatory effects in HT29 and PC3 cells. Food and
Chemical Toxicology, 2013, vol. 61, páginas 152-159.
DEMIRTAS, I., SAHIN, A., AYHAN, B., TEKIN, S., TELCI, I. Antiproliferative effects
of the methanolic extracts of Sideritis libanotica Labill subsp. linearis. Records
of Natural Products, 2009, Vol. 3, nº 2, páginas 104-109
TADIC, V. M. et al. Anti-inflammatory, Gastroprotective and Cytotoxic effects of
Sideritis scardica extracts. Planta Medica, 2012, vol. 78, n º 5, pág. 415-427.
JEREMIC, I. et al. The mechanisms of in vitro cytotoxicity of mountain tea,
Sideritis scardica, against the C6 glioma cell line. Planta Medica, 2013, vol.
79, nº. 16, páginas 1516-1524.
GONZALEZ-BURGOS,
E.,
CARRETERO,
M.E.,
GOMEZ-SERRANILLOS,
M.P.
Sideritis spp.: Uses, Chemical composition and Pharmacological activities – A
review. Journal of Ethnopharmacology, 2011, vol. 135, páginas 209-225
TOPCU, G., GOREN, A. C. Biological activity of diterpenoids isolated from
Anatolian Lamiaceae plants. Records of Natural Products, 2007, vol. 1, nº 1,
páginas 1-16
HUERGA, V. et al. Determination of the antioxidant activity of Sideritis
hyssopifolia. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 2011, vol. 109,
Supp. 2, Sp. Iss. SI, página 49
2012
2013
2009
2012
2013
2011
2007
2011
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de
marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración
NOVEDAD
Los documentos citados D01 a D08 divulgan actividades citotóxicas contra diversos tipos de cáncer de
especies del género Sideritis pero ninguna hace referencia a la especie Sideritis hyssopifolia reivindicada por lo
que estos documentos no afectan a la novedad de la solicitud en estudio.
En cambio, D09 se refiere a los antioxidantes de la especie reivindicada Sideritis hyssopifolia y a sus
extractos etérico, metanólico, clorofórmico y butanólico. El estudio concluye que el butanólico es el de mayor
actividad antioxidante, pero no hace alusión a su uso para el cáncer por lo que tampoco afecta a la novedad de
la solicitud.
Por ello, a la vista de los documentos D01 a D09, se puede concluir que las reivindicaciones 1 - 4 son
nuevas de acuerdo con el Artículo 6 LP 11/86.
ACTIVIDAD INVENTIVA
El uso de material o extracto de Sideritis hyssopifolia para elaborar un medicamento o un producto
alimenticio contra el cáncer, como cáncer de próstata, colon e hígado y extractos etéreos, metanólico o extracto
clorofórmico, resulta evidente para el experto en la técnica a la vista de los documentos D01 a D08 citados, en
efecto:
Informe del Estado de la Técnica
Página 5/6
OPINIÓN ESCRITA
Nº de solicitud: 201430543
- D01 divulga la actividad citotóxica de Sideritis perezlarae (endémica de Cádiz) y, en particular el extracto
metanólico de esta planta contra cáncer de colon (páginas 1603, 1604; página 1605, 3.7).
- D02 se refiere al extracto metanólico y clorofórmico de Sideritis trojana (Turquía) para cáncer de próstata
(página 132, 3., página 134, columna 2).
- D03 divulga infusiones de hierbas: perfil fenólico, antioxidante e antiinflamatorio efectos contra cáncer de colon
y de próstata de seis plantas de Grecia, entre ellas Sideritis syriaca: las quercitinas que se encuentra en la
mayoría de las Sideritis inhibe el crecimiento del cáncer de colon (página 152, 1; página 153, 2.2.; páginas 157;
páginas 158-159, Conclusions).
- D04 divulga el extracto metanólico de Sideritis libanotica (Turquía) contra cáncer Vero, C6 y HeLa (página 105,
2.2; página 106, 3.1; páginas 107, 108).
- D05 se refiere a los efectos antiinflamatorios, gastroprotectores y citotóxicos de extractos etéricos de Sideritis
scardica (endémica de Península Balcánica) en suplementos alimenticios y por sus flavonoides en la prevención
del cáncer (páginas 416, 420, 424, 425).
- D06 hace un estudio del mecanismo in vitro de citotoxicidad de Sideritis scardica (endémica de Península
Balcánica) contra C6 glioma, con extracto etérico (páginas 2, 6).
- D07 divulga una revisión del género Sideritis tanto sus usos, composición química y actividades
farmacológicas, entre otras, señala la actividad antiproliferativa de Sideritis libanotica contra líneas celulares
(página 222, 5.6).
- D08 se refiere a varias plantas Lamiaceae, entre ellas divulga los compuestos aislados de Sideritis licia y otras
Sideritis turcas que se testaron contra varias líneas celulares de cáncer muestran ligera actividad potencial
citotóxica (páginas 10, 2.4).
Cada uno de los documentos citados D01 a D08 por sí mismos afectan a la actividad inventiva de la
reivindicación 1, puesto que divulgan el uso de especies de Sideritis como citotóxicos, antiproliferativos, para el
cáncer, algunos apuntan a su uso como complemento alimenticio (D03). Pero, además, los documentos D01,
D02, D04-D06, D09 divulgan extractos metanólicos, clorofórmicos o etéricos de especies de Sideritis y D01-D03
divulgan el tratamiento para cáncer de próstata y de colon.
En resumen, según estos documentos citados en el estado de la técnica está ampliamente divulgado el uso
de especies de Sideritis para el cáncer (se citan hasta seis especies distintas) y, según la especie, la actividad
mayor la posee el extracto metanólico o el extracto etérico o el clorofórmico, o también que el extracto se use
para cáncer de próstata o cáncer de colon, por lo tanto, para el experto en la materia no supone ningún esfuerzo
inventivo el uso de distintos extractos de Sideritis hyssopifolia para éstos tipos de cáncer, puesto que estos usos
están divulgados en el estado de la técnica.
Por ello, a la vista de los documentos citados D01 a D08, se puede concluir que las reivindicaciones 1 - 4
carecen de actividad inventiva según el Artículo 8 LP 11/86.
Informe del Estado de la Técnica
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