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NOTA CORTA: FALSOS POSITIVOS EN PRUEBAS
SEROLÓGICAS DE VIRUS DE LA ENFERMEDAD VESICULAR
DEL CERDO: REACCIÓN CRUZADA CON MYCOPLASMA
M.A. JIMÉNEZ CLAVERO, V. LEY
Dpto. M.G. y Biotecnología INIA, Ctra. Coruña, km. 7,5. 28040 Madrid, España.
majimene@inia.es
RESUMEN
En las técnicas serólogicas empleadas en el diagnóstico de la enfermedad vesicular del cerdo, aunque con
baja frecuencia, ocurren falsos positivos, que representan un grave problema cuando se trata de demostrar que
una zona está libre de esta enfermedad, especialmente si ha habido brotes recientes. El presente trabajo demuestra que al menos una parte de estos falsos positivos muestran una reacción cruzada con antígenos de especies del
género Mycoplasma. Este dato puede ser útil para diseñar métodos serológicos que permitan descartar algunas
de las muestras que dan falsas reacciones positivas con el virus de la enfermedad vesicular del cerdo.
PALABRAS CLAVE:
Enfermedad vesicular del cerdo
Mycoplasma
Diagnóstico
Reacción cruzada
Falsos positivos
La enfermedad vesicular del cerdo (EVC) es una enfermedad infecciosa que afecta al
ganado porcino (Nardelli et al., 1968). El agente etiológico, el virus de la enfermedad vesicular del cerdo (VEVC), es un picornavirus del género enterovirus. Produce vesículas
en la boca, lengua y pezuñas de los animales afectados, aunque a menudo su infección es
asintomática. La similitud de estos síntomas con los causados por el virus de la fiebre aftosa hace que sea fundamental el diagnóstico diferencial a nivel de laboratorio. Ambas
patologías se encuentran incluidas en la lista A (enfermedades de declaración obligatoria)
de la Organización Internacional de Epizootías (O.I.E.).
En la vigilancia epidemiológica de la enfermedad vesicular del cerdo se emplean técnicas serológicas muy eficaces. La técnica rutinariamente empleada para el rastreo sero-
Recibido: 22-3-00
Aceptado para su publicación: 4-8-00
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epidemiológico de EVC consiste en un ELISA de competición que detecta la presencia en
la muestra de anticuerpos que compiten por la unión de un anticuerpo monoclonal
(AcMo) específico del VEVC al virus en fase sólida (MAC-ELISA) (Brocchi et al., 1995,
Dekker et al., 1995). Aunque la especificidad de este ELISA es alta (99,5 %), inevitablemente surgen falsos positivos, la mayoría de los cuales son descartados en la prueba de
confirmación por virus-neutralización (VNT) in vitro (Golding et al., 1976). La especificidad de la técnica de VNT es más elevada que la del MAC-ELISA. Sin embargo, aproximadamente uno de cada diez falsos positivos por MAC-ELISA siguen mostrando positividad en VNT, incluso si las muestras proceden de zonas en las que nunca se ha detectado
la enfermedad. Estos «falsos positivos» representan un grave problema cuando se trata de
demostrar que una zona esta libre de esta enfermedad, especialmente si ha habido brotes
recientes. Que estos sueros «falsos positivos» (singleton reactors) no surgen como respuesta a una infección por VEVC se sabe por datos indirectos (De Clercq, 1998): 1) en
ninguno de los animales que presentan estos anticuerpos, que son aparentemente sanos, se
ha conseguido aislar el agente etiológico de la enfermedad vesicular del cerdo; 2) el estado serológico de estos animales no se traduce en seroconversión a los contactos próximos,
como ocurriría en el contexto de una enfermedad infecciosa como la causada por el
VEVC; 3) la clase de inmunoglobulinas responsable de esta reacción es siempre IgM, y
nunca se ha detectado seroconversión a IgG, como ocurre en los positivos «genuinos».
Existe evidencia de que anticuerpos frente a Mycoplasma pneumoniae son capaces de
reconocer antígenos comunes a un amplio rango de enterovirus. Swanink et al. (1993) diseñaron un ELISA para el diagnóstico de la infección por enterovirus, basado en la utilización de coxsackievirus B1 humano tratado con calor. El tratamiento con calor produce
un cambio antigénico en las partículas virales de los enterovirus que expone determinantes antigénicos de grupo. El ELISA mostró una adecuada sensibilidad para detectar anticuerpos frente a distintos tipos de enterovirus humanos. Sin embargo, al investigar su especificidad, estos autores encontraron que en un 66 % (10/15) de los sueros IgM positivos
(pero no en IgG positivos) frente a M. pneumoniae existía reacción IgM positiva en el
ELISA para enterovirus (Swanink et al., 1993).
Estos hallazgos nos animaron a investigar la posible relación de la presencia de anticuerpos anti-Mycoplasma con el fenómeno de los singleton reactors en las pruebas de detección de anticuerpos frente al VEVC, un enterovirus estrechamente emparentado a nivel
filogenético con los coxsackievirus humanos (Zhang et al., 1999). En este trabajo hemos
estudiado si la observación de Swanink et al. (1993) sobre el reconocimiento de enterovirus humanos por parte de anticuerpos presentes en muestras con serología positiva de tipo
IgM a Mycoplasma puede extenderse a un enterovirus porcino, el VEVC, y en qué medida las muestras de sueros falsos positivos (singleton reactors) frente al VEVC contienen
anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con Mycoplasma.
Para comprobar si el VEVC es reconocido por sueros IgM positivos frente a Mycoplasma, tal y como describen Swanink et al. (1993) para otros enterovirus, se examinó la
reactividad de un grupo de sueros IgM positivos a Mycoplasma frente a antígenos de
VEVC. Bacterias del género Mycoplasma, tanto patogénicas (M. hyopneumoniae, M.
hyorhinis, M. hyosynoviae) como no patogénicas (M.flocculare, M.sualvi, M. hyopharingis, etc.) son huéspedes comunes en el cerdo (Ross, 1992). La mayoría de los cerdos son
portadores desde los primeros meses de vida, momento en que adquieren la infección
(Ross, 1992), por lo que presentan una respuesta inmune «madura», esto es, IgG positiva,
IgM negativa, frente a estos agentes. Esto implica que es difícil obtener muestras IgM po-
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sitivas frente a Mycoplasma en cerdo. Por ello utilizamos veinte sueros humanos, procedentes del Servicio de Microbiología del Hospital Ramón y Cajal, de Madrid, de los que
15 eran IgM positivos frente a M. pneumoniae y cinco eran sueros control, procedentes de
pacientes con infecciones respiratorias, en los que se descartó la presencia en suero de anticuerpos IgG e IgM frente a M. pneumoniae. Estas muestras fueron analizadas por
MAC-ELISA (Brocchi et al., 1995), VNT (Golding et al., 1976) y ELISA indirecto con el
polipéptido P1 recombinante, precursor de las proteínas de la cápsida del VEVC, expresado en E. coli (Jiménez Clavero et al., 1998), adaptado para detectar IgM humana mediante el uso de un conjugado anti-IgM humana-HRP (Nordic). Las dos primeras técnicas detectan anticuerpos altamente específicos frente al VEVC, mientras que la tercera técnica
detecta anticuerpos frente a un antígeno viral desnaturalizado, que expone determinantes
antigénicos similares a los específicos de grupo, como en el ELISA para enterovirus mencionado anteriormente (Swanink et al., 1993). Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Como puede verse en la Tabla 1, algunos sueros IgM positivos para Mycoplasma
pneumoniae son capaces de reconocer antígenos del VEVC. La frecuencia de muestras
IgM positivas para M. pneumoniae que presentan reactividad frente a antígenos del
VEVC en el ELISA-P1 (8/15, 53 %) es similar a la descrita por Swanink et al. (10/15,
66 %), mientras que en las otras dos pruebas (MAC-ELISA, VNT), más específicas, esta
frecuencia disminuye (3/15, 20 %). Además, esos anticuerpos son de la misma clase de
inmunoglobulinas (IgM) que las que reconocen al micoplasma. Estos resultados no sólo
confirman y extienden la observación de Swanink et al. a un enterovirus porcino, el
VEVC, sino que indican que el reconocimiento de VEVC observado en algunas de las
muestras IgM positivas para M. pneumoniae es altamente específico.
Con el propósito de comprobar si en los sueros porcinos «falsos positivos» (singleton
reactors) para VEVC existen anticuerpos IgM reactivos frente a Mycoplasma, que, de
forma análoga a lo que ocurre con los sueros humanos examinados en el experimento anterior, podrían correlacionar con la reacción altamente específica observada frente al
VEVC, se examinó la reactividad IgM de un grupo de 32 sueros porcinos «falsos positivos» para VEVC (singleton reactors) frente a M. hyopneumoniae, el micoplasma patogénico más importante en el cerdo, agente etiológico de la neumonía enzoótica porcina
(Ross, 1992). Veinte sueros singleton reactors procedían del Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia (IZSLE), Brescia, Italia (sueros SR1-20), y 12
del Institute for Animal Science and Health (ID-DLO), Lelystad, Holanda (sueros
SR21-32). Todos los singleton reactors presentaban en origen serología positiva a VEVC
por MAC-ELISA y VNT. En paralelo se analizaron 48 sueros porcinos de campo, 32 de
ellos IgM positivos para VEVC (procedentes de brotes de la enfermedad ocurridos en Italia) y 16 sueros VEVC negativos (IZSLE, Brescia, Italia). Con estas muestras se realizó
un ELISA indirecto de detección de IgM anti-Mycoplasma hyopneumoniae. Para ello se
fijó a placas de ELISA un extracto de M. hyopneumoniae (extracto crudo inactivado obtenido a partir de un cultivo en medio líquido Friis, concentrado mediante centrifugación,
facilitado por Laboratorios Hipra, Girona) diluido al 1/100 en tampón carbonato/bicarbonato 0,1M, pH 9,6. Tras el bloqueo con una solución al 0,5 % de seroalbúmina bovina en
PBS más 0,1 % Tween-20 (PBS-Tween), se incubó con los sueros diluidos al 1/250 en la
misma solución de bloqueo, durante 1 h. a temperatura ambiente. Tras lavar, se incubó
con un anticuerpo monoclonal anti-IgM de cerdo (1F11) conjugado con peroxidasa (cedido por la Dra. E. Brocchi, IZSLE, Brescia, Italia) diluido al 1/1000 en PBS-Tween, durante 40 min a temperatura ambiente. Por último, se añadió sustrato (H2O2 más TMB, teInvest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 15 (3), 2000
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TABLA 1
RECONOCIMIENTO DE ANTÍGENOS DEL VEVC POR SUEROS HUMANOS
IGM-POSITIVOS FRENTE A M. PNEUMONIAE (M1-M15), Y CONTROLES
(C1-C5), MEDIANTE TRES PRUEBAS SEROLÓGICAS DISTINTAS: ELISA
DE COMPETICIÓN BASADO EN UN ANTICUERPO MONOCLONAL
ANTI-VEVC (MAC-ELISA), VIRUS-NEUTRALIZACIÓN (VNT), Y ELISA
BASADO EN UNA PROTEÍNA RECOMBINANTE (P1) DEL VEVC (ELISA-P1)
Recognition of VEVC antigens by human sera IgM-positive to M. pneumoniae
(M1-M15), and controls (C1-C5), assessed by three different serologic tests:
Monoclonal antibody-based competition ELISA (MAC-ELISA), virus neutralization test
(VNT), and ELISA based on a recombinant protein (P1) of SVDV (ELISA-P1)
Suero
MAC-ELISA
VNT
ELISA-P1
(IgM)
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
M9
M10
M11
M12
M13
M14
M15
C1
C2
C3
C4
C5
–
–
–
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–
+
–
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+
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+
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+
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+
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–
–
–
–
(Ver descripción en el texto). Fueron consideradas positivas (+) las muestras que inhibieron el MAC-ELISA a
diluciones iguales o superiores a 1/20, neutralizaron el virus a diluciones iguales o superiores a 1/80, o dieron
una D.O. igual o superior a cuatro veces la D.O. de un suero control, a una dilución 1/100 en el ELISA-P1.
(See description in the text). Samples were considered as positive (+) when inhibited MAC-ELISA at dilutions of
at least 1/20, neutralized the virus at dilutions of at least 1/80, or gave an O.D. at least four times higher than
that given by a control serum at 1/100 dilution in the ELISA-P1.
trametibenzidina) y se dejó desarrollar el color durante 10 min, al cabo de los cuales se
paró la reacción y se registró la D.O a 450 nm. La comparación estadística de los datos
obtenidos se llevó a cabo por medio de la prueba t de Student para datos no emparejados.
Los resultados se representan en la Fig. 1A. Se observa que en el grupo de sueros singleton reactors la reactividad IgM frente a M. hyopneumoniae (D.O. media: 1,262, desviación estándar: 0,372, n: 32), aunque moderadamente, es significativamente más alta que
la obtenida para el grupo control (D.O. media: 0,959, desviación estándar: 0,317, n: 16,
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P ≤ 0,05). Por el contrario, el grupo de sueros IgM positivos «verdaderos» para VEVC no
resultó significativamente más reactivo frente a M. hyopneumoniae que el grupo control
(D.O. media: 0,912, desviación estándar: 0,213, n: 32). Sin embargo, algunos sueros singleton reactors, notablemente SR6, SR7, SR23, SR16, SR14 y SR10, mostraron una fuerte reactividad frente a M. hyopneumoniae (D.O. media: 1,788, desviación estándar: 0,298,
n: 6, P ≤ 0,05). Si excluimos estas seis muestras del grupo, los 26 sueros singleton reactors restantes no presentan una reactividad IgM anti-M. hyopneumoniae significativamente distinta que la del grupo control (D.O. media: 1,141, desviación estándar: 0,268, n: 26,
p > 0,05). Por lo tanto, de este análisis podemos concluir que algunos, pero no todos los
sueros singleton reactors frente a VEVC poseen niveles significativamente altos de IgM
reactiva frente al extracto de M. hyopneumoniae.
Para determinar si, efectivamente, los anticuerpos responsables de la unión a antígenos del M. hyopneumoniae en los singleton reactors presentaban una reacción cruzada genuina con el VEVC, y descartar que se trate de distintas inmunoglobulinas coexistiendo
en la misma muestra, hicimos un ensayo consistente en preincubar los sueros de alta reactividad frente a M. hyopneumoniae (SR6, SR7, SR23, SR16, SR14 y SR10) con extracto
de M. hyopneumoniae, antes de incubarlos con el VEVC en fase sólida, en una placa de
ELISA. Como control se trató de la misma manera un suero positivo verdadero frente al
VEVC. Los sueros a una dilución final 1/400 en PBS con un 10 % de suero de ternera fetal (PBS-STF), se incubaron 30 min a temperatura ambiente con distintas diluciones del
extracto de M. hyopneumoniae (1/4, 1/20, 1/100), o con PBS-STF sin extracto. Después
se transfirieron a una placa con VEVC capturado por un AcMo anti-VEVC. Tras una incubación de 1 la a temperatura ambiente, se lavó la placa y se incubó con el AcMo 1F11
(anti-IgM de cerdo) conjugado con peroxidasa, diluido al 1/1.000 durante 1 h a temperatura ambiente. La reacción se desarrolló como en el ELISA anterior. Los resultados, expresados como porcentajes de unión (referidos a un 100 % de unión igual a la D.O observada en ausencia de extracto de M. hyopneumoniae) se representan en la Fig. 1B. Todos
los sueros singleton reactors analizados resultaron inhibidos por M. hyopneumoniae en su
interacción con el VEVC, de una forma dependiente de la dosis de extracto. Además, se
comprobó que los que mayor reactividad presentaban a M. hyopneumoniae (SR6 y SR7)
se inhibían con mayor eficacia por el extracto. Por el contrario, el control (suero «positivo
verdadero» frente al VEVC) no resultó inhibido significativamente por dosis crecientes de
extracto de M. hyopneumoniae. Estos datos demuestran que, al menos una parte (6/32,
19 %) de los sueros «falsos positivos» para el VEVC, no sólo presentan niveles significativamente altos de IgM anti-Mycoplasma, sino que esos anticuerpos reaccionan de forma
cruzada con el VEVC.
Los datos experimentales presentados en este artículo demuestran que: en individuos
con serología IgM-positiva frente a bacterias del género Mycoplasma se encuentran con
alta frecuencia anticuerpos IgM frente al VEVC; esa reacción es muy específica en aproximadamente un 20 % de estas muestras; en un 19 % de sueros «falsos positivos», con
IgM altamente específica frente al VEVC, existen anticuerpos IgM frente a bacterias del
género Mycoplasma comunes en el cerdo; que en esos falsos positivos las IgM que reconocen al VEVC reaccionan de forma cruzada con antígenos de Mycoplasma. Sobre las
implicaciones de estos resultados en relación con los análisis serológicos de VEVC caben
distinguir dos aspectos: 1) Los anticuerpos anti-Mycoplasma pueden dar reacción cruzada
con antígenos del VEVC. La alta especificidad encontrada para esta reacción sugiere que
debe haber epítopos similares estructuralmente en ambos patógenos. La clase de inmunoInvest. Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 15 (3), 2000
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2,5
A
D.O. 450 nm
2
1,5
1
0,5
0
VP
SR
C
80
SR6
SR7
Unión (%)
60
B
SR16
40
SR23
SR14
20
SR10
Control (VEVC+)
0
1
10
100
1.000
Inverso dilución extracto
M. hyopneumoniae
Fig. 1.– A) ELISA de detección de IgM de cerdo anti- M. hyopneumoniae en tres grupos de muestras: sueros singleton
reactors (SR, D.O. media: 1,262, desviación estándar: 0,372, n: 32), sueros IgM positivos «verdaderos» para VEVC (VP, D.O.
media: 0,912, desviación estándar: 0,213, n: 32), y sueros control, negativos para VEVC (C, D.O. media: 0,959, desviación
estándar: 0,317, n: 16). El grupo SR mostró una reactividad significativamente más alta (p £ 0,05) que el grupo control (C),
mientras que el grupo VP no resultó significativamente más reactivo que éste (P > 0,05). Un grupo de seis sueros SR, a saber,
SR6, SR7, SR23, SR16, SR14 y SR10, dieron reacciones fuertemente positivas en este ELISA (por encima de un «umbral»
arbitrario, barra horizontal). Sin estas seis muestras, los 26 SR restantes no se diferenciaron significativamente del grupo
control en esta prueba (D.O. media: 1,141, desviación estándar: 0,268, n: 26, p > 0,05). Estas seis muestras fueron sometidas a
un análisis adicional por ELISA de inhibición, representado en «B»; B) Inhibición de la unión de anticuerpos a VEVC por
preincubación de las muestras con cantidades crecientes de extracto de M. hyopneumoniae. Los datos se representan como
porcentajes de unión referidos a la unión total en ausencia de extracto.
A) ELISA for the detection of swine IgM to M. hyopneumoniae in three groups of samples: singleton reactor sera (SR, mean O.D.: 1.262,
standard deviation: 0.372, n:32), «true» IgM-positive sera to swine vesicular disease virus (SVDV) (VP, (mean O.D.: 0.912, standard
deviation: 0.213, n:32), and negative sera for SVDV (C, mean O.D.: 0.959, standard deviation: 0.317, n:16). Group SR gave a significantly
higher reactivity (P £ 0.05) than group C, whereas group VP did not show significantly stronger reactions than group C in this ELISA. A
group of six SR, namely SR6, SR7, SR23, SR16, SR14 and SR10, gave the strongest positive reactions in this ELISA (above an arbitrary
threshold, horizontal bar). Without these six samples, the remaining 26 SR sera did not differ significantly from group C in this test (mean
O.D.: 1.141, standard deviation: 0.268, p > 0.05). These six samples were further analyzed in the inhibition ELISA represented in «B»; B)
Inhibition of the antibody binding to SVDV by pre-incubation of the samples with increasing amounts of M. hyopneumoniae extract. Data
are represented as percentages of binding, as referred to the total binding obtained in the absence of extract.
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globulinas IgM ya ha sido implicada en reconocimiento heteroespecífico en el caso de
Mycoplasma pneumoniae y enterovirus humanos (Swanink et al., 1993), y nuestros resultados muestran que también está implicada en el caso de la reacción cruzada con VEVC.
Sin embargo, no podemos excluir que otras clases de inmunoglobulinas puedan dar reacciones análogas. De hecho, hemos comprobado que en dos pacientes que fueron IgM positivos frente a M. pneumoniae se sigue detectando reactividad específica frente al VEVC
tras seroconversión a IgG (datos no mostrados). Desconocemos si estos resultados son representativos, ya que se han examinado dos únicas muestras, y si serían aplicables en el
caso de los micoplasmas porcinos. 2) Respecto a los singleton reactors, o reacciones IgM
falso-positivas al VEVC, en cerdo su frecuencia es del orden del 0,05 %, y tan sólo una
pequeña parte (19 %) reaccionan con antígenos de Mycoplasma. Aunque la prevalencia
de infecciones por Mycoplasma es alta en cerdo (Ross, 1992), nuestros datos sugieren que
la frecuencia de IgM frente a Mycoplasma en las poblaciones de cerdo estudiadas es muy
baja, y que parece ser mayor en la serie de SR frente al VEVC (Fig. 1A). Sin embargo, la
asociación entre infección por Mycoplasma y reacción al VEVC es incierta. Por un lado,
aunque la posibilidad de que pudiera ocurrir una reacción cruzada entre estos microorganismos mediada por IgG no ha sido examinada en este trabajo, es evidente que esto no
ocurre, a juzgar por la alta prevalencia de infecciones por Mycoplasma en cerdo. Es posible que la maduración de la respuesta inmune que implica el cambio de clase IgM a IgG,
y que resulta en un incremento de la afinidad, pueda dar cuenta de la pérdida de reactividad cruzada en la IgG. Por otro lado, no todas las muestras IgM positivas a Mycoplasma
lo son a VEVC, y viceversa, no todos los sueros singleton reactors a VEVC presentan
reactividad frente a Mycoplasma, por lo que una simple relación de causalidad no explica
satisfactoriamente estos hechos. El fenómeno de los singleton reactors es complejo, y en
él podrían jugar un papel importante otros agentes distintos de Mycoplasma. En este trabajo hemos puesto de manifiesto por primera vez que la reacción cruzada con Mycoplasma es una característica notable de una parte de las muestras falso-positivas al VEVC, fácilmente detectable a nivel serológico, por lo que podría utilizarse para descartar algunos
de estos falsos positivos.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra Messegué (Hospital Ramón y Cajal, Madrid), por facilitarnos los sueros de pacientes de M. pneumoniae. A la Dra E.Brocchi (IZSLE, Brescia) por los sueros VEVC positivos, VEVC negativos y los singleton
reactors, así como por el anticuerpo monoclonal 1F11 conjugado con peroxidasa. Al Dr. A. Dekker (ID-DLO,
Lelystad, Holanda), por los sueros singleton reactor. A los Dres. L. Costa y C. Artigas (Hipra, Gerona) por el
antígeno de M. hyopneumoniae. Este trabajo ha sido financiado por la comisión Interministerial de Ciencia y
Tecnología, CYCIT (BIO96 0400 C02) y el programa FAIR de la U.E. (CT96 1545).
SUMMARY
False positives in serologic test for swine vesicular disease virus: cross reaction
with mycoplasma
In the serologic tests for swine vesicular disease (SVD) diagnostic, false positive samples are found, although with a low frequency. These sera represent a serious problem when there is a need to demonstrate that a
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given area is free of this disease, particularly when recent outbreaks have been diagnosed. This work shows that
at least a part of these false positives have a cross-reaction with species of the Mycoplasma genus. This knowledge can help in the design of serologic methods aiming to rule out some of the samples giving false positive
results to SVDV.
KEY WORDS:
Swine vesicular disease
Mycoplasma
Diagnosis
Cross-reaction
False positives
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