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ESTRATEGIAS PARA LA DETECCÍON Y DIAGNOSIS DE VIRUS EN PLATANOS Y BANANOS EN LA COMUNIDAD ANDINA DE NACIONES CIRO BARRERA Instituto Nacional de Innovación Agraria (INIA) PERÚ Piura, Junio 2011 INTRODUCCION Campos comerciales Plantones de Banano Forma tradicional de la propagación e instalación de plantaciones a partir de campos comerciales. Síntomas de CMV en follaje Efecto del Virus BSV Otras síntomas de CMV Efecto del Virus BBTV BBrMV (Banana Bract Mosaic Virus) Virus del Mosaico de la Bràctea 400 nm BBTV (Banana Bunchy Top Virus) Virus del Cogollo racimosos del Banano Virus del Arrosetamiento del Banano 100 nm Descarte Altos porcentajes de descarte por no alcanzar calibres requerido para exportación. Objetivo General • Establecer las bases para la unificación y fortalecimiento del sistema de protección fitosanitaria en la Comunidad Andina (CAN) implementando un caso modelo de trabajo en el aspecto de detección y control de virus de importancia económica en la cadena productiva de Musáceas (Banano y Plátano) de países de la CAN Objetivo Específico • Implementar los laboratorios del ICA, SENASA e INIA con tecnologías y metodologías modernas para la identificación, detección y diagnosis de los virus más importantes que afectan al banano y plátano Banana Streak Virus (BSV), Cucumber Mosaic Virus (CMV), Banana Bunchy Top Virus (BBTV), Banana Brack Mosaic Virus (BBrMV), Banana Mild Mosaic Virus (BanMMV) y Abacá Mosaic Virus (AbaMV) Virus de Musáceas Estructura - Virus Procedimientos basados en ensayos con ácidos nucleicos (ADN y ARN) aplicados al diagnóstico y caracterización, entre otros. ADN Los ácidos nucleicos ADN y ARN contienen la información genética Diversas técnicas moleculares NASH: Hibridación de Ácidos Nucleicos: Dot-Blot, Southern Blot, Northern Blot PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa: AFLP, RFLP, RAPDS, NESTED, RT-PCR, SSR 0 Secuenciamiento Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR) Principio de la PCR: 4to ciclo 36 ciclos Fragmento deseado 3er ciclo ARN Segundo ciclo Transcripción Reversa Primer ciclo ADN molde ADN 21 = RT-PCR 2 copias 22 = 4 copias 8 copias 16 copias 236 = 68 billones de copias Materiales y Métodos Distribución de Virus por Países Virus Nombre Entidad BSV Banana Streak Virus ICA CMV Cucumber Mosaic Virus ICA BBTV Banana Bunchy Top Virus SENASA BBrMV Banana Brac Mosaic Virus SENASA BanMMV Banana Mild Mosaic Virus INIA AbaMV Abacá Mosaic Virus INIA PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Y EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS Selección y división Electroforesis Pulverización Visualización y documentación Centrifugación Resultados 100 bp H2O Positivo M 69 M 68 M 22 M8 H2O Positivo M 69 M 68 M 22 M8 100 bp Detección de BBrMV mediante PCR convencional: RT-PCR de un solo paso 500 400 300 280 260 bp 200 100 bp N2/NR N1/NR bp + Adgen + Agdia + Adgen + Agdia 100bp 55.3 °C 54.3 °C 53.0 °C 51.8 °C 51.1°C 55.3 °C 54.3 °C 53.0 °C 51.8 °C 51.1°C 100bp 56.4°C 55.3 °C 54.3 °C 53.0 °C 57.3 °C 56.4°C 55.3 °C 54.3 °C 53.0 °C ESTANDARIZACION DE CONDICIONES DE PCR PARA LA DETECCIÒN DEL BBTV MEDIANTE PCR CONVENCIONAL 1056 bp 349 bp Detecciòn de BBrMV mediante PCR en tiempo real BBrMV COX COX SANO Positivo para BBrMV (Sonda MGB FAM) Sano para BBrMV (Sonda MGB FAM) Internal Control COX (Sonda MGB VIC) Internal Control COX (Sonda MGB VIC) Detección del BBTV mediante PCR en tiempo real a partir del segmento DNA-1 BBTV COX COX SANO Positivo para BBTV (Sonda MGB FAM) Sano para BBTV (Sonda MGB FAM) Internal Control COX (Sonda MGB VIC) Internal Control COX (Sonda MGB VIC) Western blot 1. Preparación de la muestra 3. Transferencia a la membrana de nitrocelulosa 4. Detección 2. Electroforesis en geles de acrilamida Detección PS PV 1/50 1/50 1/250 1/500 1/1000 PS (-) PS (+) 1/50 1/50 kD 97.4 66.2 45.0 31.0 21.5 14.4 Acrilamida al 15%, Fosforilasa B BSA Ovoalbumina Anhidrasa Carbónica Inhibidor de Tripsina Lisozima Resultados Virus Genoma Técnica Detección BSV DNA IC PCR CMV RNA RT PCR DAS ELISA BBTV DNA PCR convencional PCR tiempo real BBrMV RNA RT PCR Convencional RT PCR tiempo real BanMMV RNA Western Blot Micro propagación plántulas Resultados • El proyecto permitió un mejor equipamiento de los laboratorios de las tres instituciones. • Capacitar al personal en técnicas modernas e innovación de tecnologías. Conclusiones • Trabajo en equipo dentro y fuera del país. • Las técnicas de detección y diagnosis permitirán fortalecer el sistema de producción de plantones. • Contribuir a la producción de plantones de mejor calidad fitosanitaria permitirá una mejor vida útil de las plantaciones de plátanos y bananos. • Intercambio de material de propagación de plátanos y bananos promisorios entre Perú y Colombia. • Fortalecimiento y sostenibilidad de las actividades agro exportadoras plátanos y bananos. Compromiso El Proyecto "Unificación y Fortalecimiento del Sistema de Protección Fitosanitaria en la Comunidad Andina de Naciones (CAN) Caso Modelo: Virus en Musáceas (plátano y banano) de Importancia Económica en CAN“ contribuirá significativamente a: Brindar sostenibilidad (sanidad) a las actividades de exportación del banano orgánico y la seguridad alimentaría para nuestras poblaciones Importancia del banano y plátano Gracias! Ciro Barrera Rojas cbarrera@inia.gob.pe INIA - Perú