Download Participación de expansinas en el ablandamiento de - IIB

Universidad Nacional de General San Martín
Tesis para optar por el título de Doctor en
Biología Molecular y Biotecnología
“Participación de expansinas en
ablandamientodefrutilla:
regulación hormonal, expresión
distintas variedades y efecto de
aplicacióndetratamientosfísicos”
Lic. Marcela C. Dotto
Director: Dr. Pedro M. Civello
Co-Director: Dr. Gustavo A. Martínez
InstitutodeInvestigacionesBiotecnológicas
InstitutoTecnológicodeChascomús
2008
el
en
la
A mis padres
Agradecimientos
En primer lugar quiero agradecer a mis directores, Marcos y Gustavo, por
haberme dado la oportunidad de realizar mi trabajo de Tesis en la UB4 del IIBINTECH. Pero sobre todo por haberme acompañado y ayudado durante todo este
camino de formación profesional.
A todos los AMIGOS que fui encontrando a lo largo de este tiempo, que fueron
imprescindibles para que esta etapa sea inolvidable y feliz. Son muchos para
nombrarlos a todos, algunos están lejos y hace tiempo que no veo y otros todavía están
cerca cada día, pero todos son y serán una parte fundamental de mi vida.
A mi familia que siempre estuvo presente a pesar de la distancia, apoyándome
en todas mis decisiones.
A Josi, que me acompañó en estos últimos años y se convirtió en una de las
personas más importantes de mi vida. Gracias por estar siempre y por tenerme tanta
paciencia...
A aquellos que de alguna manera hicieron tan linda esta etapa de mi vida,
Muchas Gracias a Todos...
Los resultados presentados en esta tesis han sido publicados en revistas
internacionales o presentados como comunicaciones a congresos:
Publicaciones:
ƒ
Marcela C. Dotto, Gustavo A. Martínez, Pedro M. Civello. (2006) "Expression of
expansin genes in strawberry varieties with contrasting fruit firmness". Plant
Physiology and Biochemistry 44, 301-307.
ƒ
Marina A. Pombo; Marcela C. Dotto; Gustavo A. Martínez; Pedro M. Civello.
“Influence of UV-C irradiation on gene expression and enzyme activities
associated to cell wall degradation in strawberry fruit”. Manuscrito enviado a
Postharvest Biology and Technology
ƒ
Marcela C. Dotto, Gustavo A. Martínez, Pedro M. Civello. “Effect of heat
treatments on expansin gene expression in strawberry fruit”. Manuscrito
enviado a Postharvest Biology and Technology
ƒ
Marcela C. Dotto, Gustavo A. Martínez, Pedro M. Civello. “Hormonal regulation
of expansin gene expression in strawberry fruit”. Manuscrito enviado a Plant
Physiology and Biochemistry
Comunicaciones a congresos:
ƒ
Marcela Dotto; Camilla Stephens; Gustavo Martínez; Pedro Civello; Victoriano
Valpuesta. "Cloning and functional analysis of the proximal promoter region of
FaEXP2 gene in strawberry fruit”. XLIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina
de Investigación Bioquímica y Biología Molecular (SAIB 2007)
ƒ
Dotto, Marcela C.; Pombo, Marina A.; Martínez, Gustavo A. y Civello, Pedro M.
“La expresión de genes involucrados en la degradación de la pared celular en
frutilla aumenta durante las primeras horas posteriores al corte del fruto” IV
Jornadas de Biología y Tecnología Postcosecha y I Jornadas de Postcosecha del
Cono Sur, 2007.
Marcela Dotto, Gustavo Martínez; Pedro Civello. "La expresión de expansinas de
frutilla (Fragaria x ananassa) es afectada por tratamientos térmicos". XXVI
Reunión de la Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV 2006)
ƒ
ƒ
ƒ
Dotto, Marcela; Martínez, Gustavo; Civello, Pedro. "Hormone influence on the
expression of strawberry expansin genes".
Pombo, Marina; Dotto, Marcela; Martínez, Gustavo and Civello, Pedro.
“Influence of UV-C irradiation on expansin and pectin-methylesterase gene
expression in strawberry fruit”.
XLI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica y
Biología Molecular (SAIB 2005)
ƒ
Marcela Dotto; Gustavo Martínez y Pedro Civello. “Clonado del ADNc completo
y análisis de la expresión del gen de FaExp4 en distintas variedades de frutilla.”
XXV Reunión de la Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV 2004)
ƒ
Dotto, M.; Martínez, G.and Civello, P.M. “Analysis of expansin gene expression
in strawberry fruits”. XXXIX reunión anual de la Sociedad Argentina de
Investigación Bioquímica y Biología Molecular (SAIB 2003)
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iv
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ABREVIATURAS
1-MCP: 1-metilciclopropeno
D-32P-ATP: deoxiadenosina trifosfato marcado con
32P
en posición D
ABA: ácido abscísico
AIA: ácido 3-indol-acético
ARN: ácido ribonucleico
ADN: ácido desoxirribonucleico
BSA: albúmina sérica bovina
CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio
DEPC: dietil pirocarbonato
DMSO: dimetilsulfóxido
dNTPs: deoxinucleósidos 5’-trifosfato
DTT: ditiotreitol
EST: fragmento de secuencia expresado (Expressed Sequence Tag)
EDTA: ácido etilendiamintetracético
GA: giberelinas
GA3: ácido giberélico
IPTG: isopropil-tio-E-D-galactósido
LB: medio Luria-Bertani
MOPS: ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico
M-MLV: virus de la leucemia murina
NAA: ácido naftalén acético
ORF: marco abierto de lectura (Open Reading Frame)
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction)
PEG: polietilenglicol
PVP: polivinilpirrolidona
SDS: dodecil sulfato de sodio
TBE: buffer Tris-Borato-EDTA
TCA: ácido tricloroacético
UFC: unidades formadoras de colonias
X-Gal: 5-bromo-4-cloro-3-indoil-E-D-galactósido
1
5HVXPHQ
RESUMEN
El excesivo ablandamiento es uno de los principales factores que determinan
el deterioro postcosecha de los frutos. El proceso de ablandamiento es a su vez
complejo y contribuyen al mismo diversos fenómenos, siendo el desensamblaje de la
pared celular el factor principal de los cambios de textura del fruto durante la
maduración. Las expansinas son un grupo de proteínas que participan en el
desensamblaje de la pared celular y se ha demostrado su participación en el
ablandamiento de diversos frutos. En frutilla se conocen siete genes que codifican
para expansinas, de los cuales dos (FaEXP2 y FaEXP5) se expresan específicamente
durante la maduración y fueron incluídos en este estudio, junto con otros tres
genes (FaEXP1, FaEXP4 y FaEXP6) cuya expresión se encuentra no solo en fruto
sino también en otros tejidos de la planta. Se trabajó con tres variedades de frutilla
(Fragaria x ananassa cv. Selva, Camarosa y Toyonaka) que presentan firmeza
contrastante durante la maduración y se analizó la expresión de los genes
mencionados. Además, se comparó el perfil de expresión de estos genes en frutos y
tejidos de las especies Fragaria chiloensis y Fragaria x ananassa.
La información acerca de la regulación hormonal de estos genes en frutilla es
prácticamente nula, a excepción de un trabajo previo donde se informa que la
expresión FaEXP2 es aparentemente independiente de la presencia de etileno o
auxinas. Por lo tanto, en el presente trabajo se analizó la posible regulación
hormonal de los genes mencionados por ABA, GA3, auxinas y etileno. En relación
con este punto además se clonó y caracterizó un fragmento del promotor proximal
del gen FaEXP2 a fin de analizar sus posibles elementos reguladores en cis y de
encontrar una zona mínima con capacidad promotora.
En la búsqueda de metodologías que permitan prolongar la vida postcosecha
de frutos, ha crecido el interés por la posibilidad de utilizar tratamientos físicos en
reemplazo del uso de compuestos químicos potencialmente nocivos. En particular,
la aplicación de tratamientos térmicos de altas temperaturas y la irradiación de
frutos con UV-C han resultado beneficiosas en distintos aspectos de la postcosecha,
a la vez que provoca un retraso de la maduración. Por lo tanto, se analizó la
expresión de estos genes en frutos en respuesta a tratamientos térmicos de alta
temperatura e irradiación con UV-C.
Finalmente, se analizó la influencia del etileno en relación con aumentos en
los niveles de expresión de genes asociados a la degradación de pared celular
inmediatamente después de la cosecha de los frutos.
2
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
INTRODUCCIÓN GENERAL
1.
Maduración de frutos
Las plantas con flores completan su reproducción y ciclo de vida mediante la
formación de frutos, los cuales protegen a las semillas durante su desarrollo y
promueven su dispersión en el ambiente a través de diferentes mecanismos. En el
proceso de formación de un fruto carnoso se pueden distinguir dos etapas
predominantes: el desarrollo y la maduración. El desarrollo inicial del fruto se
produce luego de la fertilización y está caracterizado por una activa división celular
de los tejidos que soportan o rodean a la semilla, lo que produce un aumento en el
tamaño del mismo. Posteriormente, la división celular cesa, pero el fruto continúa
su crecimiento como consecuencia del aumento del tamaño de las células. Una vez
finalizado el desarrollo, sigue la etapa de la maduración del fruto, la cual abarca
una suma de cambios bioquímicos y fisiológicos que, en general, incluyen
modificaciones de la estructura de la pared celular y de la textura, conversión del
almidón en azúcares simples, degradación de clorofilas, alteraciones en la
biosíntesis y acumulación de pigmentos, y cambios en el aroma y el sabor
(Giovannoni, 2001; White, 2002).
La maduración de frutos ha sido ampliamente estudiada debido a las
características únicas de este proceso de desarrollo. La relevancia de este campo de
estudio viene dada tanto por el conocimiento que aporta a la biología vegetal, como
por su importancia práctica en relación con la alimentación humana (AdamsPhillips y col., 2004). Los frutos son un componente importante de una dieta
saludable dado que constituyen una excelente fuente de vitaminas, minerales,
antioxidantes y fibras. Profundizar en el conocimiento del proceso de maduración
permite mejorar la calidad de los frutos, lo cual beneficia tanto a los consumidores
como a los productores. Una vez alcanzada la madurez comercial, los frutos son
cosechados, transportados, almacenados y finalmente comercializados. Durante
todo este período los frutos sufren deterioros ocasionados por causas diversas que
conducen a importantes pérdidas. El factor principal que determina el deterioro
postcosecha de los denominados frutos carnosos, tal como la frutilla, es el
ablandamiento, el cual influencia la vida útil de comercialización ya que puede
reducir la aceptabilidad del fruto y favorecer el ataque de patógenos. Esto limita el
transporte y almacenamiento, lo cual incide directamente sobre el costo final del
producto, generando importantes inconvenientes a productores y consumidores
(Brummell y Harpster, 2001).
El desensamblaje de la pared celular es en gran medida responsable del
ablandamiento y de los cambios de textura que se producen durante la
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
maduración. Sin embargo, el rol preciso que cumplen en el ablandamiento cada
una de las modificaciones de los componentes de la pared celular, y de las
correspondientes enzimas involucradas, no ha sido aún plenamente establecido
(Brummell y Harpster, 2001).
Los modelos que describen las bases bioquímicas de la reestructuración de la
pared celular se han tornado progresivamente más complejos a medida que
aumenta el número de enzimas y genes potencialmente involucrados en el proceso.
Por ejemplo, en los genomas de Arabidopsis y arroz y en una gran cantidad de
colecciones de ESTs de varias especies divergentes de plantas, se ha revelado que
las familias de proteínas conocidas y putativas que modifican la pared celular están
codificadas por docenas de genes, lo que sugiere un proceso altamente complejo
(Rose y col., 2004).
2.
La pared celular
La pared celular se encuentra rodeando todas las células vegetales (ver
Figura 1 y Figura 4 A). Durante muchos años se la consideró como una estructura
rígida y estática, pero últimamente se ha puesto en evidencia que la pared celular
posee una organización dinámica esencial para la división, el alargamiento y la
diferenciación celular (Roberts, 1989; Roberts, 1990), así como también para la
respuesta a estrés biótico y abiótico (Ellis, 2002; Vogel, 2004). Asimismo, se ha
visto que es la fuente de señales para el reconocimiento entre células del mismo o
de distintos organismos (Pennell, 1998; Brownlee, 2002).
Durante el proceso de crecimiento celular, el cual es conducido por la
presión de turgencia interna, la pared celular juega un rol fundamental ya que debe
ser lo suficientemente fuerte para soportar estas presiones y a la vez flexible para
permitir los cambios de volumen necesarios para el crecimiento de las células. La
extensibilidad de la pared celular depende al menos de dos factores distintos, pero
que están interconectados entre sí (Darley y col., 2001). Uno de estos factores es la
composición de la pared celular y las distintas interacciones que tienen lugar entre
los distintos componentes. El otro factor es el conjunto de modificaciones que se
producen en dichos componentes y que pueden controlar la extensión de la pared.
Estas modificaciones alteran el ensamblaje de los componentes, pero la integridad
global de la estructura de la pared se mantiene, permitiendo así la extensión de la
misma sin perturbar su funcionalidad (Rose y Bennet, 1999).
El desensamblaje de la pared es característico de diferentes eventos del
desarrollo de una planta, tales como la abscisión de frutos y de hojas, el
crecimiento del tubo polínico, la germinación de semillas, la senescencia floral y
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
también el proceso de maduración de frutos, dentro del cual se enmarca esta tesis,
donde se producen cambios sustanciales e irreversibles en la arquitectura de la
pared.
2.1.
Composición de la pared celular
Se pueden distinguir dos tipos distintos de pared celular: la pared celular
primaria, presente en células en crecimiento, altamente hidratada; y la pared
celular
secundaria,
presente
en
células
que
ya
cesaron
su
crecimiento,
caracterizadas principalmente por la presencia de lignina.
La pared celular primaria es un material complejo, que consiste en una red
de microfibrillas de celulosa embebida en una matriz de otros polisacáridos. De
acuerdo a la composición de estos polisacáridos, se pueden distinguir las paredes
celulares primarias Tipo I o Tipo II (Carpita y Gibeaut, 1993). En las paredes
celulares Tipo I, el principal polisacárido que entrecruza a las microfibrillas de
celulosa es el xiloglucano. Este tipo de pared se encuentra en dicotiledóneas y en
algunas monocotiledóneas. Las paredes de Tipo II son características de plantas de
la familia Poaceae, y en vez de xiloglucano el principal polisacárido que entrecruza
las microfibrillas es el glucoarabinoxilano.
2.2.
Componentes estructurales
En general la pared celular primaria está compuesta, aproximadamente, por
un 30 % de celulosa, 30 % de hemicelulosas, 30 % de pectinas y el resto comprende
proteínas estructurales y enzimas que modifican la arquitectura de la pared. Sin
embargo, en el caso de los frutos el contenido de pectinas puede estar aumentado y
constituir hasta un 50 % de la composición de la pared (Fischer y Bennett, 1991).
- Celulosa: está formada por cadenas lineales de (1o4)-E-D-glucopiranosa
asociadas entre sí a través de enlaces de hidrógeno, formando microfibrillas
cristalinas (Figura 1). Cada microfibrilla se forma por un agrupamiento espontáneo
y la cristalización de decenas de cadenas lineales. Las microfibrillas tienen un
grosor de entre 3 y 5 nm y una longitud de varios micrómetros, suficientemente
largas para dar varias vueltas a la circunferencia celular. Es posible que las
hemicelulosas, como el xiloglucano, queden atrapadas entre las microfibrillas
durante la biosíntesis resultando, de esta manera, en regiones desordenadas (o
paracristalinas) de las microfibrillas (Cosgrove, 2005).
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
Figura 1: Representación de las microfibrillas de celulosa. Cada microfibrilla está formada por
varias cadenas lineales de residuos de glucosa (representados en color celeste). Las microfibrillas
de celulosa son componentes estructurales de todas las células vegetales.
- Hemicelulosas: en dicotiledóneas (paredes Tipo I), la hemicelulosa
principal es el xiloglucano, una cadena lineal de (1o4)-E-D-glucopiranosa que
pueden presentar en el carbono 6 de los residuos de glucosa alguno de los
siguientes sustituyentes: residuos laterales de xilosa; ramificaciones cortas de
xilosa y galactosa o de xilosa, galactosa y fucosa, que pueden presentar Oacetilaciones. Las uniones entre los residuos de las cadenas laterales son del tipo D
o E(1Æ2) (Figura 2). Estos polímeros de xiloglucano se entrecruzan con dos o más
microfibrillas de celulosa. Otros componentes hemicelulósicos de la pared primaria
de
las
dicotiledóneas
son
mucho
menos
abundantes
e
incluyen
xilanos,
glucomananos y galactomananos (Fischer y Bennett, 1991).
Se demostró que hay al menos tres dominios de xiloglucano en las paredes
celulares de dicotiledóneas (Pauly y col., 1999). Uno de ellos es el xiloglucano
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
fácilmente extraíble, digerible por endo-E-glucanasas y que se encuentra en la pared
probablemente
intercalado
físicamente
con
otros
polímeros.
Otra
fracción
comprende un dominio inaccesible a las enzimas, que se mantiene en la pared por
interacciones más fuertes que las anteriores, como enlaces de hidrógeno con las
microfibrillas de celulosa. El tercer dominio, también inaccesible a enzimas, se
mantendría en la pared unido por interacciones aún más fuertes que las
mencionadas previamente; estaría asociado íntimamente a las microfibrillas y
probablemente provenga de cadenas de polisacáridos que quedaron atrapadas
durante la formación de las mismas.
Figura 2: Representación de hemicelulosas de dicotiledóneas: Se representa la molécula de
xiloglucano con las distintas cadenas laterales que posee. En la cadena principal los residuos de
glucosa (Glc, esferas azules) se unen a través de enlaces E(1Æ4); puede presentar regiones con
ramificaciones laterales unidas por enlaces D(1Æ6) compuestas por un único residuo de xilosa
(Xil, esferas amarillas) o ramificaciones cortas de xilosa-E(1Æ2)-galactosa (Gal, esferas celestes;
pueden presentar O-acetilaciones representadas con cuadrados celestes) o ramificaciones cortas
de xilosa-E(1Æ2)-galactosa-D(1Æ2)-fucosa (Fuc, esferas naranjas). Adaptado de Somerville y
col.(2004)
- Pectinas: son una clase de polisacáridos complejos definidos inicialmente
por su capacidad de ser extraídos con agua caliente, agentes quelantes o ácidos
diluidos. Típicamente poseen azúcares ácidos como ácido galacturónico y
glucurónico, así como también azúcares neutros como ramnosa, galactosa y
arabinosa. Algunas pectinas, como los homogalacturonanos, poseen una estructura
primaria simple formada por un polímero lineal de residuos de ácido galacturónico
unidos por enlaces D-(1o4) (Figura 3 A). Otras pectinas pueden presentar residuos
de xilosa unidos a la cadena central por enlaces D-(1o2), espaciados de una manera
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
regular, constituyendo así los xilogalacturonanos (Figura 3 B). Dentro de las
pectinas más abundantes se encuentran los ramnogalacturonanos I (RG I), los
cuales poseen subunidades repetidas de disacáridos (1o2)-D-L-ramnosil (1o2)-D-Dgalacturónico,
con
largas
cadenas
laterales
de
arabinanos,
galactanos
y
arabinogalactanos (Figura 3 C). Otras pectinas menos abundantes son los
Ramnogalacturonanos II (RG II), con un esqueleto de residuos de galacturonanos y
ramificaciones laterales complejas, compuestas de numerosos azúcares neutros
(Fischer y Bennett, 1991; Cosgrove y col., 1997; Brummell, 2006).
Las pectinas se encuentran principalmente en paredes celulares primarias,
sugiriendo que tienen un rol importante en la extensión de la pared. La elevada
concentración de pectinas presente en la pared le proveería un alto potencial de
hidratación, lo cual le confiere mayor resistencia a la compresión (Darley y col.,
2001). Los geles hidratados que forman las pectinas mantendrían a las
microfibrillas de celulosa separadas, facilitando su desplazamiento lateral durante
el crecimiento celular, a la vez que las mantienen ancladas en un lugar
determinado cuando el crecimiento se detiene. Las pectinas contribuyen a
determinar la porosidad y el grosor de la pared y además forman la laminilla (o
lámina) media, una película adhesiva rica en estos compuestos que mantiene
unidas a células adyacentes (ver Figura 4). Las pectinas también son un blanco
primario del ataque de patógenos, y sus productos de degradación funcionan como
potentes desencadenantes de las respuestas de defensa de la planta (Cosgrove,
2005).
- Proteínas estructurales: se han descrito varios tipos de proteínas
estructurales de las paredes celulares de plantas y se las clasifica de acuerdo a su
composición predominante de aminoácidos en, por ejemplo, glicoproteínas ricas en
hidroxiprolina, proteínas ricas en prolina, etc. También se encuentran incluidas en
este grupo las extensinas, que pese a su nombre no estarían involucradas en la
extensión de la pared. La mayoría de las proteínas estructurales están altamente
glicosiladas (por ejemplo, las proteínas con arabinogalactanos, AGPs). Vale la pena
destacar que las proteínas estructurales manifiestan grandes variaciones en su
abundancia, dependiendo del tipo de célula, del estadio de desarrollo y de la
estimulación previa de la planta (heridas, ataque de patógenos, etc.) (Cosgrove y
col., 1997; Darley y col., 2001).
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
Figura 3: Representación de pectinas. (A) Homogalacturonano: compuesto de residuos de ácido
galacturónico, algunos de ellos metilados; (B) Xilogalacturonano: cadena principal compuesta de
residuos de ácido galacturónico con residuos laterales de xilosa. (C) Ramnogalacturonanos tipo I
(RG I): pectinas con cadena principal compuesta de residuos alternados de ramnosa y ácido
galacturónico.
Presenta
ramificaciones
complejas,
como
arabinanos,
galactanos
y
arabinogalactanos.
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
2.3.
Modelo de la pared celular primaria
Diversos tipos de enlaces mantienen conectados y unidos a los componentes
de la pared celular. El xiloglucano y los xilanos se unen a las microfibrillas de
celulosa a través de enlaces de hidrógeno. Las moléculas de RG II se unen de a
pares a través de enlaces diésteres de boro; los homogalacturonanos se unen a
través de puentes de calcio y probablemente las pectinas se unen entre sí por medio
de enlaces éster, o a otros glicanos y compuestos fenólicos (Carpita y Gibeaut,
1993; Iiyama, 1994; Carpita y McCann, 2000). Se han reportado también enlaces
covalentes entre el xiloglucano y las cadenas laterales de los RG I (Thompson y Fry,
2000; Popper y Fry, 2005), y entre los RG I y las proteínas estructurales extensinas
(Qi y col., 1995). El entrecruzamiento físico entre moléculas también podría jugar
un rol importante, por ejemplo entre las moléculas de xiloglucano o xilanos con las
microfibrillas de celulosa, o los RG I podrían ubicarse alrededor de las microfibrillas
uniendo estrechamente la red de pectinas con la de celulosa-hemicelulosa (Vincken
y col., 2003; Zykwinska y col., 2005).
Teniendo en cuenta las evidencias experimentales, existen varios modelos de
la pared celular primaria. Uno de los modelos más ampliamente aceptado es el que
se ha denominado modelo de multi-capa (Cosgrove, 2000). En este modelo (Figura 4
B), se propone que las microfibrillas de celulosa están recubiertas de una capa de
xiloglucano y luego embebidas en sucesivas capas de hemicelulosas, cada una de
ellas más débilmente unida que la anterior, formando la red de celulosahemicelulosa; finalmente, se encuentran las pectinas llenando los espacios entre la
red mencionada.
2.4.
Modificaciones
de
la
pared
celular
durante
la
maduración
y
ablandamiento
Durante la maduración, la arquitectura de la pared celular y de los polímeros
que la componen es modificada progresivamente, produciéndose cambios en la
textura del fruto. Estos cambios de textura pueden variar entre las distintas
especies. En frutos como la frutilla o la palta, que ablandan en forma intensa y
desarrollan una textura carnosa durante la maduración, las modificaciones que
llevan a la disolución de la pared celular y el consecuente ablandamiento es
evidente. En cambio, en otros frutos como la manzana, que presenta una textura
quebradiza, no se observa dicha disolución de la pared durante la maduración. Un
proceso común para todos los frutos en este período es la reducción en la adhesión
célula-célula debido a la degradación y solubilización de las pectinas de la laminilla
media, que comienza temprano en la maduración en frutos blandos como el tomate,
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
y más tarde en frutos como la manzana. Durante la maduración también se
produce una disminución del pH en el espacio de la pared, que generalmente está
acompañada por la disminución de la turgencia celular debido al aumento en la
concentración de solutos en el espacio de la pared y a la relajación de la misma
(Brummell y Harpster, 2001).
A
B
Figura 4: Pared celular vegetal. A: Micrografía electrónica de transmisión de paredes celulares. Se
muestran dos células adyacentes, indicando sus respectivos citosoles, membrana plasmática,
paredes celulares y la lámina media, rica en pectinas. B: Modelo de “multi-capas” de la pared
celular primaria de dicotiledóneas. En la parte superior se esquematiza la vista lateral (en el plano
de la pared, paralela a la membrana plasmática). En la parte inferior se representa la sección
transversal, en ángulo recto con respecto a la vista lateral. En este modelo se presentan a las
microfibrillas de celulosa recubiertas con hemicelulosas fuertemente unidas o hemicelulosas que
quedaron atrapadas entre las microfibrillas, a su vez cubiertas por una capa de hemicelulosas
unidas más débilmente. Esta red de celulosa-hemicelulosa se encuentra embebida en la matriz de
pectinas que llena los espacios entre las microfibrillas. lm = laminilla media; mp = membrana
plasmática. Adaptado de Cosgrove (2000).
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
Las modificaciones en los componentes de pared a lo largo de la maduración
han sido analizadas en una gran cantidad de frutos. En breve, las diferentes
modificaciones observadas en los distintos trabajos indican que el ablandamiento
es un proceso que involucra múltiples factores y cambios en diversos polímeros, y
que las alteraciones varían considerablemente entre especies. Las diferencias en la
composición de la pared celular y la marcada diversidad en los cambios producidos
en la pared entre las distintas especies, contribuyen a las diferencias en textura y
firmeza características de sus frutos maduros. Probablemente estas diferencias son
el resultado de las variaciones de abundancia, actividad y momento de acción de las
distintas familias génicas que codifican para las diversas proteínas de la pared
celular expresadas durante la maduración (Brummell, 2006).
En general, la depolimerización de los componentes de la red de pectinas se
produce al inicio de la maduración y luego continúa durante la misma, por lo que
ha sido ampliamente correlacionada con el ablandamiento. En etapas tempranas de
la maduración, también se produce pérdida de las cadenas laterales de galactanos y
arabinanos de los RG I, así como demetilación de homogalacturonanos y
solubilización de poliurónidos, lo cual podría conducir a la relajación de la red de
celulosa-hemicelulosa. Estos cambios estructurales, combinados con el aumento en
la porosidad de la pared por la pérdida de las cadenas laterales de los RG I,
convierte a la pared en una estructura mucho más abierta, lo cual aumenta la
accesibilidad de enzimas que actúan en las cadenas principales de los polímeros y,
por lo tanto, contribuye al desensamblaje progresivo de la pared (Brummell, 2006).
Todos estos cambios son realizados por una amplia gama de enzimas y
proteínas cuya expresión y actividad ha sido analizada durante la maduración de
diversos frutos, incluyendo uvas (Nunan y col., 2001); manzana (Goulao y col.,
2007); pimiento (Priya Sethu y col., 1996); carambola (Chin y col., 1999) y
frambuesa (Iannetta y col., 1999), entre otros. Dentro de las enzimas habitualmente
analizadas por su papel durante la maduración se pueden mencionar las
siguientes:
- Endo-(1Æ4)-E-D-glucanasas (EGs, EC 3.2.1.4): Como se mencionó más arriba,
los residuos de glucosa de las cadenas de celulosa y hemicelulosa se encuentran
unidos por enlaces E-(1Æ4). Es lógico pensar que estas endoglucanasas, que han
sido encontradas en diversas especies como tomate y frutilla (Maclachlan y Brady,
1994; Palomer y col., 2004), actúen en la pared celular sobre sustratos como la
celulosa o hemicelulosas. Sin embargo, en los ensayos de actividad que se han
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
realizado in vitro no se detectó actividad sobre celulosa cristalina. El sustrato que
generalmente se ha utilizado para la medida de la actividad endoglucanasa es
carboximetilcelulosa, el cual es un derivado artificial no cristalino de la celulosa que
no corresponde a un posible sustrato in vivo. En ensayos in vitro se ha observado
que estas enzimas son capaces de actuar sobre xiloglucano, razón por la cual se ha
propuesto que éste podría ser su sustrato in vivo (Brummell y Harpster, 2001). Sin
embargo, medidas de actividad de EGs en distintas plantas no han revelado un
patrón uniforme de especificidad de sustrato y diferentes isoenzimas presentan
afinidades variables por los distintos glucanos ensayados (Vicente y col., 2007).
- Xiloglucano endotransglicosilasas (XETs, EC 2.4.1.207): Estas enzimas
actúan cortando enlaces internos E-(1Æ4) de una cadena de xiloglucano y
transfiriendo el extremo reductor originado a la posición C-4 de una unidad de
glucosa perteneciente al extremo no reductor de otra cadena de xiloglucano.
Presentan una alta afinidad por el xiloglucano, tanto como dador y como aceptor
(Campbell y Braam, 1999). Esta actividad ha sido detectada en frutos de tomate,
manzana y kiwi, entre otros, y se ha encontrado una alta actividad en frutos en
expansión (Redgwell y Fry, 1993; Maclachlan y Brady, 1994; Percy y col., 1996).
- Pectin esterasas (PEs, EC 3.1.1.11): Los poligalacturonanos son secretados a la
pared celular con un alto porcentaje de sus grupos carboxilos esterificados con
grupos metilo. El grado de metilación disminuye considerablemente durante la
maduración. Esto es llevado a cabo por las pectin metilesterasas, enzimas que
eliminan los grupos metilo de la posición C-6 de residuos de ácido galacturónico en
pectinas de alto peso molecular. La demetilación de las pectinas modifica el pH y la
carga de la pared celular, lo cual permite la agregación de poliurónidos en
estructuras unidas por iones calcio, y hace a los poliurónidos susceptibles al
ataque por poligalacturonasas (Brummell y Harpster, 2001).
- Poligalacturonasas (PGs): son enzimas que catalizan la ruptura hidrolítica de las
uniones
de
galacturónido,
y
se
clasifican
en
endo
(EC
3.2.1.15)
o
exopoligalacturonasas (EC 3.2.1.67) de acuerdo a su modo de acción. Aunque
ambos tipos se han encontrado en frutos, las enzimas específicas de la maduración
de frutos son del tipo endo-poligalacturonasas (Hadfield y Bennett, 1998). El
sustrato
para
las
PGs
en
la
pared
celular
son
principalmente
los
homogalacturonanos, los cuales son secretados a la pared celular en una forma
altamente metilesterificada. Dado que se ha determinado que las PGs muestran
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
una mayor afinidad por la forma de-esterificada, se ha postulado que las pectinas
serían primero demetiladas por la acción de pectin metilesterasas y luego
hidrolizadas por la acción de las PGs (Fischer y Bennett, 1991; Carpita y Gibeaut,
1993).
- Pectato liasas (PLs, EC 4.2.2.2): estas enzimas catalizan la ruptura, dependiente
de Ca2+, de las pectinas de-esterificadas a través de un mecanismo de eliminación
Beta. Se han aislado varios genes en plantas que muestran alta similitud con
pectato liasas, los cuales se expresan principalmente en los granos de polen
maduros y en tubos polínicos en desarrollo. Asimismo, se han identificado genes
con homología a PLs en paredes celulares de diversos frutos (Medina-Escobar y col.,
1997; Marín-Rodríguez y col., 2002).
- Expansinas: estas proteínas fueron aisladas como mediadoras del “crecimiento
ácido” (ver más adelante) y hasta el momento no se ha logrado detectar que las
mismas posean algún tipo de actividad enzimática. Sin embargo, las expansinas
cumplirían un rol fundamental en una serie de procesos que involucran el
desensamblaje de la pared celular. Si bien el mecanismo de acción de las
expansinas no es totalmente conocido, se ha propuesto que las mismas actuarían
en la interfase celulosa-hemicelulosa, debilitando las uniones no-covalentes
establecidas entre dichos polímeros (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995). En la
siguiente sección se describen estas proteínas en detalle.
3.
Expansinas
3.1.
Relación con el crecimiento ácido
Las expansinas fueron aisladas por primera vez como mediadoras del
“crecimiento ácido”. Este término se refiere al aumento de la velocidad de
crecimiento que ocurre cuando las células vegetales en crecimiento son expuestas a
soluciones ácidas, debido a que la pared celular se vuelve más extensible en
condiciones de pH ácido. La mayor extensibilidad no es un efecto directo del pH
sobre los polímeros de la pared celular, sino que es mediado por uno o más factores
proteicos que, de alguna manera, producen la extensión de la pared. Esta
conclusión se basa en estudios realizados in vitro con paredes celulares, que fueron
tratadas térmicamente para desnaturalizar a las proteínas presentes y que
consecuentemente perdieron la capacidad de extensión en respuesta a la
disminución del pH del medio (Figura 5 A). Sin embargo, la sensibilidad al pH fue
ampliamente reestablecida con la adición de una fracción proteica purificada a
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
partir de la pared celular, a la cual se denominó expansina (Figura 5 B) (McQueenMason y col., 1992). La dependencia del pH de la extensión de la pared inducida
por expansinas concuerda con la del crecimiento ácido, con un pH óptimo cercano
a 4 y una disminución gradual entre pH 4 y 7 (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995).
Cabe señalar que la actividad de las expansinas también es estimulada e inhibida
por los mismos agentes químicos que afectan el crecimiento ácido de las paredes.
Por lo tanto, las expansinas parecen ser los principales mediadores proteicos
responsables de este crecimiento (McQueen-Mason y col., 1992).
Figura 5: Identificación de expansinas como mediadoras del crecimiento ácido. (A): fenómeno de
crecimiento ácido en paredes aisladas de hipocótilo en crecimiento de pepino. En un medio ácido
(pH 4,5) la velocidad de elongación aumenta considerablemente con respecto a la observada a pH
7,0. (B): en paredes aisladas inactivadas por calor, no se observa el crecimiento ácido (Control),
mientras que se vuelve a observar el aumento en la velocidad de elongación al agregar una fracción
proteica que contiene expansinas purificadas (Carpita y McCann, 2000).
3.2
Características estructurales de las expansinas
Las expansinas son proteínas pequeñas constituidas por 250 - 270
aminoácidos, y su estructura incluye dos dominios (dominio 1 y dominio 2)
precedidos de un péptido señal de aproximadamente 15 a 25 aminoácidos (Figura
6). Dicho péptido señal dirigiría a estas proteínas a la ruta secretoria, según
programas de predicción como PSORT (Nakai y Horton, 1999) o TargetP
(Emanuelsson y col., 2000), conduciéndolas a la pared celular. Luego de la
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
eliminación de este péptido se generan proteínas maduras con un tamaño de
aproximadamente 25-27 kDa.
Inicialmente se identificaron dos miembros de la familia que actualmente se
conoce como D-expansinas o EXPA (ver más adelante), estas proteínas eran capaces
de provocar el alargamiento de paredes celulares aisladas (McQueen-Mason y col.,
1992). Posteriormente se demostró que proteínas pertenecientes a una familia
conocida como el grupo I de alérgenos del polen de gramíneas, eran también
capaces de alargar paredes celulares aisladas. Estas proteínas comparten solo entre
un 20 y 40 % de identidad de aminoácidos con las D-expansinas previamente
conocidas, por lo que se denominó a esta nueva familia como E-expansinas. Más
tarde se encontraron proteínas análogas a estas últimas también en tejidos
vegetativos, tanto en otras gramíneas como en otros grupos de plantas (Sharova,
2007).
En base a análisis filogenéticos, actualmente se reconocen cuatro familias de
expansinas en plantas, representadas esquemáticamente en la Figura 6 (Sampedro
y Cosgrove, 2005). De la familia más numerosa a la menos numerosa se
denominan: D-expansinas (EXPA), E-expansinas (EXPB), expansina-like A (EXLA) y
expansina-like B (EXLB). La familia EXPA está compuesta por 26 genes en
Arabidopsis y 34 en arroz. La familia EXPB, como se mencionó previamente, en un
principio fue conocida como el grupo I de los alérgenos del polen y posteriormente
se la identificó como un grupo de expansinas en base a la similitud de secuencia y
a la capacidad de extender paredes celulares en gramíneas; esta familia posee 6
representantes en Arabidopsis y 19 en arroz. El genoma de Arabidopsis posee tres
representantes del grupo EXLA, mientras que en el genoma de arroz se han hallado
cuatro genes. Finalmente, cada uno de estos genomas posee un representante de la
familia EXLB (Choi y col., 2006).
Las expansinas son proteínas evolutivamente conservadas. La identidad
entre secuencias de la familia de las D-expansinas generalmente se encuentra entre
60 y 90 %. Las E-expansinas se caracterizan por tener una mayor diversidad,
presentando una identidad entre distintos miembros de la familia que varía entre
28 y 76 %. Por otro lado, la identidad de aminoácidos entre D y E-expansinas está
entre un 20 y 40 % (Cosgrove, 1998). La conformación de las expansinas está más
conservada que su secuencia; por ejemplo, la similitud topológica entre las D y Eexpansinas es de un 75 % (Cosgrove y col., 1997).
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
Figura 6: Esquema de la estructura de las cuatro familias de expansinas: EXPA, EXPB, EXLA y
EXLB. Se indican las posiciones de los residuos conservados de cisteína (C), el dominio HFD y los
triptófanos (W). Se destaca el péptido señal (en celeste) y se indican con flechas rojas los 6 residuos
de cisteína y el residuo de triptófano conservados en todas las familias. El dominio 1 corresponde a
la región con homología a endoglucanasas y el dominio 2 correspondería al dominio de unión a
carbohidratos (CBD: carbohydrate binding domain). Adaptado de Choi y col. (2006).
Los residuos de aminoácidos conservados en las cuatro familias se
representan en la Figura 6. Las familias de D y E-expansinas (EXPA y EXPB) poseen
residuos de cisteína (C) conservados en su dominio N-terminal (dominio 1), y un
dominio His-Phe-Asp (HFD) en la zona central. Este motivo de HFD y los residuos
de cisteína están también altamente conservados en la familia 45 de las glicosil
hidrolasas, una familia de enzimas con actividad endoglucanasa también conocida
como la familia K de celulasas, donde el motivo HFD forma parte del sitio activo de
la enzima, el cual incluye también un residuo de ácido aspártico. Los intentos por
detectar actividad endoglucanasa en expansinas han sido infructuosos. Pese a
disponer de un dominio HFD, las expansinas carecen del residuo de ácido aspártico
mencionado, necesario para realizar la catálisis en las endoglucanasas, lo cual
podría explicar la ausencia de esta actividad enzimática en los ensayos “in vitro”
(Yennawar y col., 2006). Las expansinas presentan, además, una serie de residuos
de triptófano (W) en su región C-terminal (Figura 6), similares a los presentes en los
dominios de unión a celulosa de proteínas microbianas, por lo que se postula que
esta zona estaría involucrada en la unión proteína-polisacárido (Shcherban y col.,
1995).
Las proteínas EXLA también poseen residuos de cisteína conservados en su
zona N-terminal y de triptófano en su zona C-terminal, sin embargo no presentan el
dominio HFD en su zona central, las posiciones de los residuos de triptófano son
diferentes a los de las D y E-expansinas y además poseen otros residuos de
triptófano adicionales al final de la región C-terminal. Por último, la familia EXLB
tampoco posee el dominio HFD, presentan los residuos de cisteína conservados y
uno de los residuos de triptófano de la zona C-terminal (Figura 6).
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Las D-expansinas y las E-expansinas han sido ampliamente caracterizadas y
se ha demostrado su capacidad para extender paredes celulares (McQueen-Mason y
col., 1992; Cosgrove, 1999). Sin embargo, de las familias expansina-like A y B solo
se conocen sus secuencias génicas y no se ha analizado aún su funcionalidad.
A modo de ejemplo, se muestra en la Figura 7 un apilamiento de secuencias
de 3 D-expansinas (CsEXPA1 de pepino, LeEXPA2 de tomate y AtEXPA1 de
Arabidopsis) y 3 E-expansinas (Cim1 de soja; Os VB de arroz y Lol P1 de Lolium
perenne). Se destacan con flechas los residuos de C y W conservados en las dos
familias, y además se resaltan con recuadros el dominio HFD, los dos residuos de C
extra que poseen las D-expansinas y un residuo de W conservado en la zona Nterminal que presentan las E-expansinas.
Usando técnicas cristalográficas se logró determinar la estructura de una Eexpansina de maíz (Zea m1, Yennawar y col., 2006). Los 6 residuos de cisteína
conservados en ambas familias se encuentran formando enlaces disulfuro, los
cuales serían fundamentales para el correcto plegamiento de estas proteínas y les
confieren la estructura terciaria conservada a las dos familias. Probablemente, las
E-expansinas carezcan de un lazo (“loop”) determinado por el par de residuos de
cisteína extras que están presentes en las D-expansinas. Además, las E-expansinas
poseen uno o dos sitios de glicosilación (secuencia consenso Asn-X-Ser/Thr), que
no se encuentran en lasD-expansinas (Wu y col., 2001a).
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Figura 7: Apilamiento entre secuencias de D-expansinas y E-expansinas. Se indican con flechas
azules los residuos de cisteína y con flechas rojas los residuos de triptófano conservados en las dos
familias y se recuadra en color naranja el dominio HFD también común a las dos familias. Además,
se recuadra en verde la posición del residuo de triptófano conservado solo en la familia EXPB y en
violeta los dos residuos de cisteína conservados solo en la familia EXPA. Es posible observar además
la alta identidad entre miembros de una misma familia, sobre todo en EXPA. D-expansinas: AtEXP1,
CsEXP1, LeEXP2; E-expansinas: Cim1, Lol P1, Os VB.
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3.3
Mecanismo de acción
El efecto de las expansinas sobre las propiedades reológicas de la pared
celular ha sido ampliamente estudiado, y también es considerable el conocimiento
de las características bioquímicas y moleculares de estas proteínas en diferentes
sistemas. Sin embargo, el mecanismo preciso por el cual las expansinas hacen a la
pared más extensible aún no ha sido completamente esclarecido. El modelo actual
de la acción de las expansinas se basa en la interpretación de resultados de los
primeros estudios bioquímicos realizados in vitro con estas proteínas (McQueenMason y col., 1992; McQueen-Mason y Cosgrove, 1994; McQueen-Mason y
Cosgrove, 1995). Luego del descubrimiento de dos expansinas capaces de inducir la
extensión de paredes celulares aisladas (McQueen-Mason y col., 1992), se pudo
establecer que las mismas no eran capaces de hidrolizar polisacáridos de la matriz.
En diferentes ensayos no se logró detectar actividad endo o exoglucanasa
(McQueen-Mason y Cosgrove, 1994; McQueen-Mason y Cosgrove, 1995), pectinasa
(McQueen-Mason y Cosgrove, 1995) o transglicosilasa (McQueen-Mason y col.,
1993), pero se demostró que tenían la capacidad de relajar la tensión de las paredes
celulares. Además se determinó que estas proteínas se unían a la interfase entre las
microfibrillas de la matriz (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995) y que eran capaces
de debilitar papel constituido por celulosa pura, donde las fibras de celulosa están
interconectadas por puentes de hidrógeno. De este modo se propuso un modelo,
representado en la Figura 8, en el cual las expansinas actúan facilitando el
deslizamiento de los polímeros de la pared celular cuando estos están sometidos a
alguna tensión, debilitando la fuerza de la unión de los enlaces de hidrógeno que
mantienen unidos a los componentes de la red de celulosa-hemicelulosa (McQueenMason y Cosgrove, 1995). En este modelo, otras enzimas de la pared celular
podrían alterar su estructura, afectando indirectamente la extensión de la misma.
Por ejemplo, las hidrolasas podrían acortar los polímeros de la matriz, reduciendo la
resistencia viscosa de la pared y favoreciendo el desplazamiento de los polímeros
entre sí. Por otro lado, un mayor entrecruzamiento de la matriz, causado por
ejemplo por la acción de peroxidasas y pectin-metilesterasas, aumentaría el tamaño
de las unidades estructurales que intervienen en el desplazamiento de los
polímeros, traduciéndose este aumento de tamaño en una mayor resistencia al
movimiento de los polímeros entre sí (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995; Cosgrove,
1998), contribuyendo a reestructurar la pared celular para adecuarla a un nuevo
estado de menor tensión.
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
Figura 8: Mecanismo de acción de las expansinas. Cuando la pared está sometida a tensión
(representado por las flechas azules), las expansinas (en amarillo) relajarían esa tensión actuando
en la interfase entre las microfibrillas de celulosa y las moléculas de hemicelulosas que las
recubren, debilitando la fuerza de la unión de los enlaces de hidrógeno que participan en dicha
unión. Posteriormente actuarían otras enzimas (como XETs, representadas en verde) que
remodelarían la pared adecuándola al nuevo estado de menor tensión. Adaptado de Carpita y
McCann (2000).
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
3.4
Metodología para el estudio de las expansinas
Las funciones de las expansinas son estudiadas utilizando las metodologías
convencionales habitualmente empleadas para otras proteínas. Por ejemplo, la
participación de expansinas en varios de los procesos mencionados en la Tabla I fue
detectada al establecer patrones de cambios paralelos entre la actividad de las
expansinas y la velocidad del proceso en estudio. La búsqueda de una posible
correlación entre la actividad de expansinas y un determinado proceso se realiza
analizando
tanto
plantas
salvajes
como
modificadas
genéticamente
o
por
condiciones inducidas por el entorno.
Sin embargo, la cuantificación de la actividad expansina es un problema
complicado. Los ensayos de dicha actividad son llevados a cabo raramente y se
realizan con un “extensiómetro” (Figura 5). Están basados en la capacidad de las
expansinas de restituir el crecimiento ácido de paredes celulares aisladas
inactivadas por calor, generalmente de hipocótilo de pepino, o de aumentar la
extensibilidad de materiales artificiales compuestos de celulosa-xiloglucano.
Generalmente, tales ensayos se llevan a cabo con una fracción proteica de la pared
celular soluble en medio salino, y no con expansinas purificadas. Estas condiciones
de extracción son suficientes para la determinación de la potencial actividad Dexpansina; en cambio, las E-expansinas no son extraídas en soluciones salinas y su
efecto sobre la elongación de paredes aisladas de pepino es casi nula. Además, este
método es adecuado para la determinación de actividad expansina involucrada en
la regulación del crecimiento de paredes celulares, pero no en otros procesos
mediados por expansinas como el ablandamiento de frutos (Sharova, 2007).
Frecuentemente, se correlaciona el nivel de expresión de ARNm de los genes
de expansina de interés con un determinado proceso en el que estarían
involucradas, y no se avanza más allá de esta determinación (se enumeran ejemplos
en las secciones 3.5 y 3.6). Los análisis en los cuáles se ha cuantificado el
contenido de expansina con anticuerpos son menos frecuentes. En algunos casos
se han utilizado anticuerpos anti CsEXP1, una D-expansina de pepino, aún en otras
especies. Sin embargo, hay que destacar que estos anticuerpos no reconocen todas
las D-expansinas; por ejemplo, no reconocen a la D-expansina LeEXP1 de tomate
(Rose y col., 2000), contra la cual existe un anticuerpo que ha sido usado en
algunos trabajos (Rose y col., 1997; Dotto y col., 2006).
Es importante destacar que tanto los ensayos de actividad expansina usando
un “extensiómetro”, como la detección de expansinas con anticuerpos son útiles
para evaluar el contenido global de un conjunto de expansinas, pero que al
momento de estudiar un gen de expansina en particular es necesario recurrir al
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
análisis de los niveles de ARNm, ya que permite inferir posibles funciones de cada
miembro en particular de la familia de expansinas en una especie dada. Sin
embargo, es fundamental tener en cuenta y, si es posible, determinar las
modificaciones post-transcripcionales y/o post traduccionales que pudieran estar
regulando la expresión de dichos genes en particular.
3.5
Procesos en los que participan las expansinas
Se han encontrado D y E-expansinas involucradas en distintos procesos del
crecimiento y desarrollo de diversas especies de plantas. Ejemplos de estas
correlaciones se resumen en la Tabla I. La familia de las D-expansinas es la que ha
sido más ampliamente caracterizada y pertenecen a esta familia las expansinas que
han sido asociadas con el desarrollo y la maduración de frutos.
Tabla I
Procesos en los que participan las expansinas
D-expansinas
Proceso
germinación del
polen y
desarrollo del
tubo polínico
embriogénesis y
germinación
E-expansinas
Zea m1 en maíz (Wu y col.,
2001a), penetración del tubo
polínico (Li y col., 2003)
_
desarrollo del embrión y germinación de
semillas de tomate (Chen y col., 2001) y
arroz (Huang y col., 2000)
desarrollo
de
embriones
somáticos en pino (BishopHurley
y
col.,
2003);
alto
contenido
de
Cim1
en
suspensiones de células de
soja en división (Downes y col.,
2001)
crecimiento de
internodos y
coleóptilos
crecimiento de la
raíz
iniciación y
crecimiento de
hojas
zonas de elongación de hipocótilos de
tomate (Caderas y col., 2000) y de pepino
(Shcherban y col., 1995); crecimiento de
internodos de trigo (Lin y col., 2005) y arroz
(Cho y Kende, 1997a; Cho y Kende, 1997b);
OsEXPA4 en coleóptilos y mesocótilos de
arroz (Choi y col., 2003)
elongación de raíces de maíz (Wu y col.,
2001b; Kam y col., 2005), arroz (Shin y col.,
2005) y soja (Lee y Kende, 2001)
crecimiento de hojas de Arabidopsis (Cho
y Cosgrove, 2000), festuca (Reidy y col., 2001) y
álamos (Gray-Mitsumune y col., 2004).
Inducción de localización ectópica del
primordio de hoja en tomate (Fleming y col.,
zona de elongación
de
internodos de arroz (Lee y
Kende, 2001) y trigo (Lin y col.,
2005)
zona de elongación de raíces
de maíz (Wu y col., 2001b; Kam y
col., 2005)
hojas en desarrollo
festuca (Reidy y col., 2001)
de
1997; Pien y col., 2001)
simbiosis
desarrollo floral
entre Melilotus alba – Sinorhizobium
meliloti (Giordano y Hirsch, 2004); raíces de
pepino – micorrizas (Balestrini y col., 2005)
desarrollo
floral
(Gookin y col., 2003)
en
Mirabilis
jalapa
desarrollo floral temprano en
Mirabilis jalapa (Gookin y col.,
2003)
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
Tabla I (continuación)
Procesos en los que participan las expansinas
Proceso
desarrollo de
fruto
maduración de
frutos
abscisión de
órganos
3.6
D-expansinas
crecimiento de frutos de tomate (Catalá y
col., 2000), frutilla (Harrison y col., 2001),
durazno (Hayama y col., 2001)
tomate (Brummell y col., 1999b; Rose y col.,
2000);
pera (Hiwasa y col., 2003);
frutilla (Harrison y col., 2001);
banana (Asha y col., 2007);
durazno (Hayama y col., 2001; Hayama y col.,
2003);
mango (Sane y col., 2005);
cereza (Yoo y col., 2003)
abscisión de pétalos de Sambucus nigra
(Belfield y col., 2005) y pedicelo en
Arabidopsis (Cho y Cosgrove, 2000)
E-expansinas
_
_
_
Expansinas en el desarrollo y maduración de frutos
Como se menciona brevemente en la Tabla I, las expansinas han sido
asociadas a todos los estadios de desarrollo de frutos, aún los más tempranos.
Desde el inicio, en la fertilización, están involucradas en la germinación del polen: la
expresión de Zea m1, una E-expansina del grupo I de alérgenos del polen, se
restringe al último estadio del desarrollo del polen y es altamente regulada (Wu y
col., 2001a). Se cree que Zea m1 ayuda a la penetración del polen distendiendo las
paredes celulares del estigma y el estilo (Cosgrove y col., 1997; Li y col., 2003).
Luego de la fertilización comienza una etapa de división celular, el estadio
inicial del desarrollo del fruto donde se determina la formación del mismo. En
manzanas se han encontrado expansinas cuya actividad máxima se detecta en esta
etapa del desarrollo (Goulao y col., 2007); en algunos casos, por ejemplo en pera, se
han hallado genes que se expresan solamente en este estadio del fruto joven
(Hiwasa y col., 2003).
Existe luego una etapa en la que predomina la expansión celular en la cual se
produce el crecimiento del fruto y su tamaño aumenta considerablemente,
principalmente por aumento del volumen celular. En tomate, se han encontrado
varios genes de expansina cuya expresión es específica de esta etapa, que
contribuirían al crecimiento del fruto verde (Brummell y col., 1999b).
La etapa siguiente es la maduración del fruto, que involucra numerosos
cambios fisiológicos y bioquímicos. Estos cambios están altamente sincronizados,
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
ocurren durante un corto tiempo y se han encontrado numerosas D-expansinas
involucradas en esta etapa en diversas especies (Tabla I). En particular, se produce
el desensamblaje de la pared celular, con el consiguiente ablandamiento del fruto.
Se considera que las expansinas cumplen un rol fundamental en este proceso.
La presencia de una expansina específica de fruto fue reportada por primera
vez en tomate (Rose y col., 1997). En dicho trabajo se hizo el sorprendente hallazgo
de que el transcripto de LeEXP1 se acumula específicamente durante la maduración
de tomate, cuando la expansión celular ya ha cesado. Esto sugirió un nuevo rol
para las expansinas, que hasta ese momento se consideraban asociadas a procesos
relacionados únicamente con la expansión celular. En dicho trabajo se sugirió que
las expansinas específicas de maduración podrían actuar facilitando el acceso a los
sustratos
de
las
enzimas
hidrolíticas
de
la
pared,
contribuyendo
así
al
ablandamiento del fruto (Rose y col., 1997).
Más recientemente, se han descrito expansinas con expresión diferencial en
el desarrollo y la maduración de diversos frutos. En damasco (Prunus armeniaca), la
acumulación de PaEXP1 y PaEXP2 se correlaciona positivamente con el tamaño del
fruto hasta la mitad de la maduración, delimitando los roles de estas dos
expansinas al proceso de maduración (Mbéguié-A-Mbéguié y col., 2002). En banana
(Musa acuminata) se clonaron dos expansinas específicas de fruto, MaEXP1 y
MaEXP2, y la relación de sus patrones de expresión con la presencia de etileno
indica que estarían involucradas en el proceso de maduración (Trivedi y Nath,
2004; Wang y col., 2006). Otros genes cuya expresión es específica de fruto
incluyen a MiEXP1 en mango (Mangifera indica), (Sane y col., 2005); Pm68 en una
especie de ciruela (Prunus mume) (Mita y col., 2006); PpEXP3 de durazno (Prunus
persica), (Hayama y col., 2003) y OeEXP1 de olivas (Olea europaea) (Ferrante y col.,
2004). En pera (Pyrus communis) se encontraron siete expansinas (PcEXP1-7) de las
cuales PcEXP2, PcEXP3, PcEXP5 y PcEXP6 se expresan preferencialmente en la fase
de ablandamiento del fruto y PcEXP7 se expresa exclusivamente en frutos jóvenes
en crecimiento. PcEXP1 se expresa tanto en fruto en desarrollo como durante la
maduración con variaciones en su nivel de expresión, mientras que los niveles de
expresión de PcEXP4 no varían (Hiwasa y col., 2003). También se encontraron
diferentes patrones de expresión para los genes de expansina de tomate
(actualmente Solanum lycopersicum, previamente Lycopersicon esculentum): LeEXP2
y LeEXP4 se expresan solo en frutos en expansión; LeEXP5, LeEXP6 y LeEXP7 se
expresan en frutos en expansión o en frutos verdes maduros; mientras que los
transcriptos de LeEXP3 se detectan durante todo el crecimiento y la maduración de
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
tomate (Brummell y col., 1999b; Catalá y col., 2000). En frutilla se conocen siete
genes de expansina que también presentan distintos patrones de expresión, los
cuales se describen con mayor detalle en el Capítulo I (Harrison y col., 2001).
Finalmente, es conveniente destacar otro trabajo muy importante realizado
en el año 1999 (Brummell y col., 1999a). En el mismo se describen líneas de
tomates transgénicas antisentido para el gen LeEXP1, que contenían solo un 3 %
del total de esta proteína y cuyos frutos resultaron ser más firmes que los frutos
controles. A su vez, líneas transgénicas que sobreexpresaban este gen produjeron
tomates más blandos que los respectivos controles. Este trabajo aportó pruebas
significativas de la participación de las expansinas en el proceso de ablandamiento
de frutos. Trabajos posteriores indicaron que la sobreexpresión de LeEXP1
resultaba en preparados de jugo y pasta de tomate que presentaban partículas más
grandes que los procesados a partir de tomates control y que además poseían
mayor
viscosidad
que
los
controles.
También
se
observó
una
mayor
despolimerización de pectinas solubles en agua y de glicanos fuertemente unidos de
la matriz (Kalamaki y col., 2003).
4.
La planta de Frutilla (Fragaria x ananassa)
La frutilla cultivada (Fragaria x ananassa Duch.) es una valiosa especie
hortícola muy apreciada por los consumidores. En los últimos años ha crecido
considerablemente la demanda de estos frutos, desde un consumo anual de
aproximadamente 1 Kg por persona en 1970 hasta 3,2 Kg por persona en 2004
(Folta y Davis, 2006). Los frutos de frutilla son apreciados por su sabor único y sus
características nutricionales. Es una fuente importante de vitamina C, con
contenidos mayores que otros frutos pequeños como arándano o frambuesa (Kalt y
col., 1999). Son frutos ricos en compuestos fitoquímicos con potenciales
características antioxidantes, principalmente ácido elágico y flavonoides. Poseen
importancia comercial debido a sus múltiples usos ya sea para consumo directo
como para la elaboración de salsas, dulces, conservas, productos congelados,
yogures, distintos tipos de bebidas y helados (Mercado y col., 2007).
La vida útil postcosecha de frutillas destinadas al consumo directo es muy
breve, debido principalmente al proceso de ablandamiento que sufre durante su
maduración. Esto limita su comercialización tanto por el deterioro en sí del fruto
como por la mayor susceptibilidad al ataque por patógenos provocada por el
ablandamiento. Por lo tanto, es de fundamental importancia profundizar en el
conocimiento de los factores involucrados en este proceso, a fin de encontrar
tecnologías postcosecha adecuadas para prolongar la vida útil del fruto. Además, es
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
interesante entender a nivel molecular cuáles son los procesos involucrados en el
ablandamiento para identificar posibles genes que permitan la generación de frutos
genéticamente modificados con una vida postcosecha más larga, sin perder las
cualidades valiosas de estos frutos.
La frutilla pertenece a la familia Rosaceae, una familia de plantas
económicamente importante a la que también pertenecen algunos árboles frutales
como manzanos, durazneros y cerezos; plantas frutales herbáceas como moras y
frambuesas y algunas plantas ornamentales como los rosales, entre otros (Folta y
Davis, 2006). El género Fragaria es muy diverso y existen numerosas especies
dispersas alrededor del mundo, cada cual con una variedad de niveles de diploidía.
La frutilla cultivada se denomina Fragaria x ananassa, es octaploide y
proviene de un híbrido entre las especies Fragaria chiloensis y Fragaria virginiana.
La facilidad con la que ocurren los cruzamientos ha dado lugar a una gran cantidad
de cultivares con características diferenciales desde el punto de vista productivo y
de calidad del fruto. En la actualidad se han desarrollado nuevos cultivares
adaptados a una amplia variedad de condiciones ambientales (Mercado y col.,
2007).
La frutilla se encuentra dentro del grupo denominado frutos carnosos, que
presentan una textura relativamente blanda que se vuelve menos firme a medida
que avanza la maduración. También se las clasifica dentro de los frutos no
climatéricos, debido a que la maduración se inicia y progresa sin que se produzca
un máximo en la producción de etileno ni un aumento en la respiración, ambos
rasgos característicos de la maduración de los frutos climatéricos (Giovannoni,
2001).
Cabe señalar que la frutilla es considerada un falso fruto, dado que la mayor
parte del mismo proviene del desarrollo del receptáculo. Los verdaderos frutos
desde el punto de vista botánico son los aquenios, constituidos por la semilla y sus
coberturas y ubicados en la superficie del receptáculo expandido. Sin embargo,
comúnmente se denomina fruto al conjunto formado por el receptáculo expandido y
los aquenios dispuestos sobre su superficie.
En las primeras etapas del desarrollo, el aumento de tamaño de la frutilla se
debe principalmente al incremento del número de células presentes y a la
expansión celular. La división celular se detiene aproximadamente 7 días después
de la caída de los pétalos y 15 días después de la antesis. Por otro lado, el aumento
del volumen celular contribuye aproximadamente en un 90 % al crecimiento del
fruto después de la antesis. Los aquenios regulan el crecimiento del receptáculo a
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
través de la síntesis de auxinas, y la maduración del fruto a menudo se asocia con
una gradual disminución del suministro de auxinas en los últimos estadios de
crecimiento (Perkins-Veazie, 1995). Se describe con mayor detalle la regulación
hormonal en el Capítulo III.
En algunos frutos, como el tomate, la etapa del desarrollo del fruto se
encuentra claramente separada de la etapa de maduración del fruto, en la que no
se produce cambio de tamaño. Sin embargo, en frutilla estas dos etapas se
superponen debido a que todavía existe crecimiento del fruto cuando la maduración
ha comenzado, entre los estadios verde y blanco (Figura 9).
Durante el proceso de maduración se producen cambios de color, tamaño,
acumulación de sólidos solubles, disminución de la acidez y cambios en la
pigmentación y la textura del fruto. Los distintos estadios de desarrollo y de
maduración del fruto son comúnmente clasificados según el color externo y tamaño
del mismo. De esta manera, los frutos se clasifican en verde pequeño (VP), verde
grande (VG), blanco (B), 25 % rojo, 50 % rojo, 75 % rojo y 100 % rojo. Los nombres
de estos cuatro últimos estadios hacen referencia al porcentaje aproximado de
superficie del fruto que presenta color rojo (Figura 9).
Figura 9: Clasificación de los estadios de desarrollo y maduración de los frutos de
acuerdo al tamaño y color.
El fruto se ablanda considerablemente al pasar del estadio verde al estadio
blanco y luego dicho ablandamiento continúa a medida que se produce el desarrollo
de color. El ablandamiento progresivo que presenta el fruto es uno de los
principales factores que determina su susceptibilidad frente al ataque de insectos,
bacterias y hongos (Perkins-Veazie, 1995).
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
En los últimos años, varios grupos de investigación han enfocado sus
estudios de la maduración de frutilla a nivel de la genética molecular, lo que ha
permitido aislar y clonar un gran número de genes. Estos estudios se realizaron no
solo por el interés comercial que reviste el fruto, sino también porque la frutilla es
considerada un sistema modelo para el estudio del desarrollo y maduración de
frutos no climatéricos (Manning, 1994; Perkins-Veazie, 1995).
Uno de los primeros trabajos orientado a identificar genes asociados a la
maduración de frutilla fue realizado por Manning (Manning, 1998). En dicho trabajo
se aislaron 66 clones relacionados a la maduración, pertenecientes a 26 familias no
redundantes de genes. Estos genes codificaban para proteínas involucradas en los
procesos metabólicos clave, incluyendo síntesis de antocianinas, degradación de la
pared celular, metabolismo de lípidos y sacarosa, síntesis y degradación de
proteínas y respiración.
Unos años después, la tecnología de microarreglos (microarrays) se convirtió
en un medio poderoso para estudiar el perfil de expresión de cientos de genes de
frutilla (Aharoni y col., 2000). En ese trabajo se construyó un microarreglo de
frutilla usando 1701 ADNc, que comprendían 1100 ESTs secuenciados y 601 ADNc
sin secuenciar provenientes de fruto maduro, incluyendo aquenios. Estos
microarreglos han sido utilizados para monitorear la expresión génica en frutilla
sometidas a distintas condiciones: comparación de distintos estadios de desarrollo
(Aharoni y col., 2000); tejido de receptáculo versus tejido de aquenios (Aharoni y
O’Connell, 2002) y cultivares de diferente firmeza (Salentijn y col., 2003).
En relación con el ablandamiento del fruto durante la maduración, como se
mencionó antes, se admite que las enzimas que catalizan la degradación de la pared
celular cumplen un rol fundamental en este proceso. En frutilla han sido clonados
y caracterizados varios genes pertenecientes a este grupo, los cuales se presentan
resumidos en la Tabla II.
Las EGs han sido ampliamente caracterizadas, hay al menos dos genes cuya
expresión es regulada positivamente durante la maduración en frutilla, así como
también la actividad endoglucanasa (Wooley y col., 2001). La expresión de FaEG1 es
específica del proceso de maduración mientras que FaEG3 también se expresa en
fruto verde en desarrollo y en otros tejidos vegetativos jóvenes, como hojas y
estolones (Trainotti y col., 1999).
Como se menciona en la Tabla II, y se discute más detalladamente en el
Capítulo I, se conocen siete genes de expansinas en frutilla, de los cuales dos
(FaEXP2 y FaEXP5) presentan expresión específica de fruto (Rose y col., 1997;
Civello y col., 1999; Harrison y col., 2001).
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
Tabla II
Enzimas y proteínas de degradación de pared celular
asociadas a la maduración de frutilla
Específicos
Tipo de enzima
Genes aislados
de
Referencias
maduración
(Harpster y col., 1998)
Endoglucanasas
FaEG1
(EGs)
FaEG3
FaEG1
(Trainotti y col., 1999)
(Llop-Tous y col., 1999)
(Wooley y col., 2001)
FaEXP1
FaEXP2
FaEXP3
Expansinas
FaEXP4
FaEXP5
FaEXP2
FaEXP5
(Rose y col., 1997)
(Civello y col., 1999)
(Harrison y col., 2001)
FaEXP6
FaEXP7
Poligalacturonasas
(PGs)
Pectato liasas
(PLs)
FaPG1 (spG, D15)
T-PG
(Redondo-Nevado y col., 2001)
FaPG1
B4
(Salentijn y col., 2003)
(Villarreal y col., 2008)
pl A
pl A
pl B
pl B
pl C
pl C
(Medina-Escobar y col., 1997)
(Benítez-Burraco y col., 2003)
FaPE1
Pectin esterasas
FaPE2
(PEs)
FaPE3
FaPE1
(Castillejo y col., 2004)
FaEgal1
(Trainotti y col., 2001)
FaPE4
FaEgal1
E-galactosidasas
FaEgal2
FaEgal3
E-xilosidasas
FaXyl1
FaXyl1
(Martínez y col., 2004)
(Bustamante y col., 2006)
Con respecto a las enzimas involucradas en el metabolismo de pectinas,
Redondo-Nevado y col. (2001) aislaron un gen de poligalacturonasa específico de
fruto (spG) que se expresa al inicio de la maduración, y se sugirió que tendría una
función en la liberación de oligosacarinas, unas moléculas biológicamente activas
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
involucradas en la maduración de frutos, más que en la depolimerización de
pectinas. Más recientemente, se aislaron dos ADNc a partir de frutos maduros
(FaPG1 y T-PG) y se analizó su expresión en variedades de firmeza contrastante. Si
bien la secuencia de FaPG1 es prácticamente idéntica a la de sPG, su perfil de
expresión se incrementa durante la maduración y difiere del descrito en el trabajo
de Redondo-Nevado y col. (2001). El ADNc de T-PG es prácticamente idéntico al de
FaPG1, pero carece de un fragmento de 85 pares de bases y codificaría para una PG
inactiva (Villarreal y col., 2008). Es interesante señalar que las variedades más
firmes acumulan mayor cantidad de T-PG que de FaPG1, mientras que en las más
blandas se expresa preferentemente FaPG1.
Se identificaron además, tres genes de pectato liasas relacionados con la
maduración de frutilla (Medina-Escobar y col., 1997; Benítez-Burraco y col., 2003).
Los tres genes presentan patrones de expresión similares desde el estadio blanco
hasta el maduro y no se detectó mensajero en otros tejidos ensayados como raíces,
hojas, flores y estolones.
También se conocen cuatro genes de pectin esterasas de frutilla (Castillejo y
col., 2004), cuyos patrones de expresión son diferentes entre sí. FaPE1 fue
detectado exclusivamente durante la maduración y FaPE2 solo se expresa en hojas.
FaPE3 fue detectado en todos los tejidos analizados: en los distintos estadios de
maduración, pero además en hojas, estolones, raíces, flores y fruto verde en
desarrollo. Finalmente, la expresión de FaPE4 se encontró en los mismos tejidos,
pero con menor nivel de expresión que FaPE3.
Una observación frecuente durante la maduración de frutos carnosos es la
pérdida de unidades de galactosa que se encuentran en las cadenas laterales de las
pectinas. En frutilla se aislaron tres genes de E-galactosidasas (Trainotti y col.,
2001). Los tres genes fueron detectados en tejidos vegetativos y de fruto, aunque
una de ellas (FaEgal1) presentó un aumento en sus niveles de expresión durante la
maduración. Entre otras enzimas que actúan sobre las cadenas laterales de las
pectinas, se clonó un gen de E-xilosidasa (Martínez y col., 2004; Bustamante y col.,
2006) y tres de D-arabinofuranosidasas (Rosli y col., no publicado).
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
5.
Tecnologías postcosecha
Los tratamientos postcosecha de frutos son usados para mantener la calidad
de los mismos durante todo el período de comercialización, incluyendo el transporte
y almacenamiento. En la búsqueda de metodologías que permitan prolongar la vida
postcosecha de frutos, ha crecido el interés por la posibilidad de utilizar
tratamientos físicos en reemplazo del uso de compuestos químicos potencialmente
nocivos (Paull, 1990; Klein y Lurie, 1991).
El tratamiento utilizado por excelencia en la postcosecha de frutillas es la
refrigeración (Cordenunsi y col., 2003), aunque también se aplican otros
tratamientos físicos, ya sea en combinación con la refrigeración o no, como los que
se mencionan a continuación.
Un tratamiento físico habitualmente utilizado para extender la duración
poscosecha de frutos y retrasar el proceso de ablandamiento es el empleo de
atmósferas modificadas o atmósferas controladas (Kader y col., 1989). La
metodología consiste en generar una atmósfera de composición diferente a la del
aire en el recipiente de almacenamiento del fruto, generalmente con un alto
contenido de CO2 y un bajo contenido de O2. Puede mantenerse la composición
generada
originalmente
durante
el
tiempo
de
almacenamiento
(atmósferas
controladas), regulando exactamente la composición gaseosa en el ambiente donde
se encuentra el fruto almacenado; o permitir que la composición de la atmósfera
inicial dentro del empaque se modifique a través del tiempo (atmósferas
modificadas), usando envoltorios y películas que limitan la difusión de los gases
entre el producto y el aire exterior, lo cual conduce al establecimiento de una
atmósfera en general enriquecida en CO2 y empobrecida en O2. En el caso de
frutillas, se ha descrito que la aplicación de atmósferas enriquecidas en CO2 mejora
la conservación y retrasa el proceso de ablandamiento; esto es particularmente útil,
ya que el fruto tolera concentraciones de CO2 considerablemente elevadas sin sufrir
daños (Harker y col., 2000).
La aplicación de tratamientos térmicos a altas temperaturas (TAT) ha
resultado beneficiosa en distintos aspectos de la poscosecha. Los TAT se aplican a
frutos tales como papaya, mango y cítricos para controlar pestes provocadas por
insectos (Paull y Chen, 1990; Klein y Lurie, 1991). Asimismo, el tratamiento de
frutos con la adecuada combinación de temperatura y duración del mismo provoca
el retraso temporario de la maduración, lo cual incluye al ablandamiento del fruto
(Paull, 1990; Lurie, 1998b). En frutilla, se ha determinado que los tratamientos de
frutos en estadios maduros, o casi maduros, con calor seco (estufa) a 42 ºC - 48 ºC
durante 3 h seguido de almacenamiento a 20 ºC permiten mejorar la vida
,QWURGXFFLµQ*HQHUDO
postcosecha, evitando el desarrollo de hongos y retrasando el proceso de
maduración (Civello y col., 1997; Vicente y col., 2005). Este tratamiento también
fue efectivo al ser aplicado en frutos en estadio blanco, provocando el retraso en el
ablandamiento,
la
disminución
de
actividades
enzimáticas
asociadas
a
la
degradación de pared celular y la suspensión temporaria de la expresión de los
genes correspondientes (Martínez y Civello, en prensa).
Además de los tratamientos térmicos, se ha usado en diversos frutos la
irradiación con bajas dosis de luz UV como tratamiento postcosecha (Shama y
Alderson, 2005). Tanto el efecto germicida directo de esta radiación, como la
inducción de mecanismos defensivos en el tejido vegetal tratado contribuyen a
disminuir el desarrollo de hongos durante el almacenamiento postcosecha.
Asimismo, la exposición a radiación UV-C retrasa el ablandamiento de frutos, uno
de los principales factores contribuyentes al deterioro de los mismos (Nigro y col.,
2000; Mercier y col., 2001). En el caso de frutillas, el tratamiento con dosis
apropiadas de UV-C redujo el ablandamiento, incrementando la vida postcosecha
del fruto (Baka y col., 1999; Pan y col., 2004).
La aplicación de TAT y la irradiación con UV-C se describen con más detalle
en el Capítulo IV.
OBJETIVOS
Objetivos generales
x
Contribuir al conocimiento a escala molecular del proceso de ablandamiento
de frutilla, a fin de desarrollar estrategias para controlar el proceso y
aumentar la vida postcosecha del fruto.
x
Analizar el efecto de la aplicación de tratamientos físicos sobre la expresión
de genes pertenecientes a la familia de las expansinas.
Objetivos específicos
x
Completar la caracterización de la expresión de los genes FaEXP1, FaEXP2,
FaEXP4, FaEXP5 y FaEXP6 durante la maduración de distintas variedades
de frutilla que difieren en su velocidad de ablandamiento (Capítulo I).
x
Clonar el promotor de FaEXP2 e identificar sus regiones regulatorias
(Capítulo II).
x
Analizar el efecto de reguladores del crecimiento vegetal sobre la expresión de
los genes mencionados (Capítulo III).
x
Analizar la influencia de tratamientos físicos que retardan el ablandamiento
de frutilla sobre la expresión de las distintas expansinas (Capítulo IV).
&DS¯WXOR,,QWURGXFFLµQ
CAPÍTULO I
1.
Introducción
En frutilla se han descrito hasta el momento siete genes de expansinas, los
cuales se han denominado FaEXP1 a FaEXP7 de acuerdo al orden cronológico en
que fueron aislados. En el mismo trabajo en que se aisló el primer gen de expansina
asociado a maduración a partir de fruto de tomate, LeEXP1 (Rose y col., 1997), se
aislaron otros dos por RT-PCR a partir de ARN de frutilla y de melón, a fin de
verificar la presencia de expansinas en frutos de otras especies, ya que hasta ese
momento no se había asociado a estas proteínas con el proceso de maduración de
frutos.
Este primer gen de expansina de frutilla fue denominado FaEXP1 y en dicho
trabajo solo se aisló un fragmento de ADNc de 501 pb, el cual fue utilizado
únicamente para la confección de un árbol filogenético. El segundo gen que fue
aislado se llamó FaEXP2, y se determinó que su expresión aumentaba con el avance
de la maduración, que no se expresaba en otros tejidos de la planta (hojas, tallos,
raíces, sépalos, ovarios y aquenios de frutos verdes) y que su regulación no estaría
afectada por etileno o auxinas (Civello y col., 1999). Posteriormente, Harrison y col.
(2001) aislaron cinco genes más, denominados FaEXP3 a FaEXP7. Este grupo
analizó el patrón de expresión de los mismos durante la maduración de frutilla y en
distintos tejidos en crecimiento o ya expandidos (estolones, hojas y raíces). De
acuerdo a dichos patrones de expresión (Figura 10), se decidió trabajar con los
genes FaEXP2 y FaEXP5, debido a que ambos poseen expresión específica de fruto
(si bien se detectó una leve expresión de FaEXP2 en otros tejidos, Figura 10, el gen
se expresa principalmente durante la maduración del fruto); con los genes FaEXP4
y FaEXP6, ya que ambos se expresan en todos los estadios de maduración del fruto
y además en otros tejidos de la planta; y con el gen FaEXP1, del cual no existía
información acerca de su patrón de expresión durante la maduración o de su
especificidad de tejido.
De
todos
estos
genes
se
conocían
solo
fragmentos
de
sus
ADNc,
pertenecientes a la región codificante (Rose y col., 1997; Harrison y col., 2001),
excepto de FaEXP2 del cual se conocía la secuencia completa de su ADNc (Civello y
col., 1999). Por lo tanto, para iniciar la caracterización de estos genes se decidió
completar el clonado de los ADNc correspondientes a FaEXP1, FaEXP4, FaEXP5 y
FaEXP6 a fines de obtener sus secuencias completas.
&DS¯WXOR,,QWURGXFFLµQ
Figura 10: Análisis por RT-PCR semicuantitativa
de la expresión de los genes de expansina de
frutilla (Adaptado de Harrison y col., 2001).
Se indican los genes analizados en cada caso a la
izquierda (FaEXP2 a FaEXP7) y el control interno
ARNr 18S. La flecha superior resalta los estadios
de desarrollo y maduración del fruto (VP, VG, B,
T = turning, O = orange y 100%).
Otros tejidos analizados:
HC = hojas en crecimiento; HE = hojas
expandidas; RC = raíces en crecimiento;
RE = raíces expandidas; EC = estolones en
crecimiento; EE = estolones expandidos. Las dos
últimas calles son el control positivo para cada
gen (P = plásmido) y el control negativo (-RT)
Entre la gran cantidad de cultivares de frutilla con características diferentes
de producción y de calidad del fruto, existe una gran dispersión en cuanto a los
valores de firmeza de los frutos durante la maduración. Si bien todas las frutillas
poseen una textura delicada y bajos valores de firmeza en comparación con otros
frutos, es posible identificar variedades que producen frutos con características de
firmeza contrastantes. Hay variedades cuyos frutos tienen una consistencia muy
firme en todos los estadios de maduración (por ejemplo Selva, y en menor medida
Camarosa), mientras que otras variedades presentan frutos muy blandos aún en los
estadios iniciales de maduración, como Toyonaka, por lo que su vida postcosecha
es muy corta y su comercialización es limitada. Otros cultivares tienen frutos de
firmeza intermedia, entre los que podemos mencionar a Pájaro, Chandler, y
Festival.
En el presente trabajo de tesis se analizó la expresión de los genes de
expansina mencionados previamente, durante la maduración de frutos de las tres
variedades con firmeza contrastante (Selva, Camarosa y Toyonaka), a fines de
dilucidar si existía una correlación entre la expresión de los genes de expansina y la
firmeza de las variedades.
También se analizó la presencia y expresión en forma comparativa, de los
genes de expansina en frutos de Fragaria x ananassa y de Fragaria chiloensis. Esta
última especie posee frutos cuya firmeza es comparable a la de frutos de la variedad
Toyonaka.
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
2.
Resultados
2.1.
Caracterización de los ADNc completos de los genes de expansina
Inicialmente se realizaron búsquedas de los ADNc completos de los genes
FaEXP1, FaEXP4, FaEXP5 y FaEXP6 en una biblioteca de ADNc obtenida a partir de
frutillas maduras. De los clones positivos obtenidos luego de dos rondas de
hibridación y purificación para cada uno de estos genes, sólo se obtuvo el ADNc
completo correspondiente a FaEXP4 (ver más adelante). Por lo tanto, se decidió
obtener los ADNc completos de FaEXP1, FaEXP5 y FaEXP6 usando la técnica de
RACE. De esta manera se obtuvo el ADNc completo de FaEXP1 y FaEXP5 y la zona
3’-UTR de FaEXP6. El extremo 5’-UTR faltante de la secuencia del ADNc completo
de FaEXP6 fue obtenido a través de una colaboración que se realizó con el
laboratorio del Prof. Dr. Victoriano Valpuesta Fernández de la Universidad de
Málaga, España. En dicho laboratorio cuentan con una colección de ESTs de frutos
verdes y de frutos maduros de Fragaria x ananassa (resultados no publicados) y
mediante una búsqueda en su base de datos se obtuvo un clon que contenía la
zona 5’ UTR de FaEXP6 (ver más adelante) aislado a partir de frutos verdes.
FaEXP1
Mediante el uso de un kit (SMART RACE cDNA Amplification kit; Clontech) se
obtuvo la secuencia completa del gen FaEXP1 de la cual solo se conocía un
fragmento de 501 pb (Rose y col., 1997) contenido en su zona codificante. La
secuencia completa obtenida se muestra en la Figura 11 A. La zona resaltada con
fondo negro corresponde al marco abierto de lectura (ORF: Open Reading Frame)
predicho por el programa EditSeq (DNASTAR). De acuerdo a esto, el ADNc del gen
FaEXP1 posee una longitud de 1278 pb, de las cuales la zona 5’-UTR tiene 55 pb, el
ORF posee 783 pb y la zona 3’-UTR comprende 440 pb, sin considerar la cola de
poli-A.
En la Figura 11 B se muestra la secuencia predicha de la proteína FaEXP1.
Usando los programas SignalP y TargetP (ver Mat. y Mét) se predijo un péptido
señal de 23 aminoácidos (resaltado con fondo negro en la Figura 11 B) que dirigiría
la proteína hacia la ruta secretoria, con destino a la pared celular. La proteína
precursora tendría 260 aminoácidos y una masa molecular de 27,9 kDa, mientras
que la proteína madura estaría formada por 237 aminoácidos y su masa molecular
sería de 25,5 kDa (Tabla III).
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
A
B
Figura 11: ADNc completo de FaEXP1. A: Secuencia de nucleótidos, se muestra en fondo negro el
ORF predicho por el programa EditSeq. B: traducción del ORF mostrado en A, con fondo negro se
muestra el péptido señal predicho por el programa SignalP.
FaEXP4
Previamente se conocía un fragmento de 487 pb de la secuencia codificante
de FaEXP4 (Harrison y col., 2001). De la búsqueda en la biblioteca de ADNc se
obtuvieron cinco clones positivos que fueron enviados para ser secuenciados;
obtenidas las secuencias se concluyó que todos correspondían al ADNc completo de
FaEXP4. La secuencia completa obtenida se muestra en la Figura 12 A, junto con el
ORF predicho. El ADNc de este gen cuenta con 1338 pb, una zona 5’-UTR que
incluye tan solo 14 pb, el ORF 756 pb y el 3´-UTR 569 pb.
Usando los programas SignalP y TargetP se predijo un péptido señal de 22
aminoácidos, resaltado en fondo negro en la Figura 12 B, que también dirigiría la
proteína generada a la ruta secretoria. Se muestra en dicha figura la secuencia de
la proteína FaEXP4 predicha a partir de la secuencia de nucleótidos. De esta
manera, la proteína precursora tendría 251 aminoácidos y una masa molecular de
26,6 kDa, mientras que a la proteína madura le correspondería 229 aminoácidos y
24,4 kDa (Tabla III).
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
A
B
Figura 12: ADNc completo de FaEXP4. A: Secuencia de nucleótidos, se muestra en fondo negro el
ORF predicho por el programa EditSeq. B: traducción del ORF mostrado en A, con fondo negro se
muestra el péptido señal predicho por el programa SignalP.
FaEXP5
En el caso del gen FaEXP5, previamente se había descrito un fragmento de
488 pb de su secuencia codificante (Harrison y col., 2001). Al igual que lo
mencionado anteriormente para FaExp1, se utilizó el kit “SMART RACE” y se logró
clonar la secuencia completa de su ADNc (Figura 13). La secuencia completa
obtenida para este ADNc de 1154 pb se muestra en la Figura 13 A y se resalta en
fondo negro el ORF predicho de 753 pb; la zona 5’-UTR presenta 94 pb y la 3’-UTR
307 pb.
En la Figura 13 B se resalta el péptido señal de 21 aminoácidos predicho por
SignalP que, de acuerdo a lo indicado por el programa TargetP, dirigiría a la
proteína a la ruta secretoria. La proteína precursora en este caso tendría 250
aminoácidos y una masa molecular de 26,7 kDa, correspondiendo a la proteína
madura 229 aminoácidos y 24,5 kDa.
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
A
B
Figura 13: ADNc completo de FaEXP5. A: Secuencia de nucleótidos; se muestra en fondo negro el
ORF predicho por el programa EditSeq. B: traducción del ORF mostrado en A, con fondo negro se
muestra el péptido señal predicho por el programa SignalP.
FaEXP6
Para este gen se conocía previamente un fragmento de su secuencia
codificante de 494 pb (Harrison y col., 2001). La secuencia del ADNc completo del
gen de FaEXP6 contiene 1175 pb (Figura 14 A), un ORF de 780 pb, una zona 5’UTR de 23 pb y una región 3’-UTR de 372 pb.
Al igual que lo observado en las demás proteínas, se predijo un péptido señal
que dirige la proteína a la ruta secretoria, y que en este caso sería de 22
aminoácidos (Figura 14 B). La proteína precursora tendría 259 aminoácidos y una
masa de 27,8 kDa, y la proteína FaEXP6 madura, 237 aminoácidos y una masa de
25,6 kDa.
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
A
B
Figura 14: ADNc completo de FaEXP6. A: Secuencia de nucleótidos, se muestra en fondo negro el
ORF predicho por el programa EditSeq. B: traducción del ORF mostrado en A, con fondo negro se
muestra el péptido señal predicho por el programa SignalP.
En la Tabla III se resumen las características de los ADNc obtenidos y las del
ADNc completo de FaEXP2, que era el único conocido al inicio de esta tesis (Civello
y col., 1999). También se analizó la secuencia predicha de la proteína FaEXP2 con
los programas SignalP y TargetP y se predijo un péptido señal de 25 aminoácidos
que también dirigiría a la proteína a la ruta secretoria. En este caso se predice una
proteína madura de 24,2 kDa y 228 aminoácidos.
En la Figura 15 se muestra un alineamiento de las proteínas completas
predichas. Al igual que en la Figura 7, se indican con flechas los residuos de C y W
conservados y se recuadra el motivo HFD característico de las expansinas
pertenecientes a las familias EXPA y EXPB.
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
Tabla III
Características de las expansinas en estudio
Gen
ADNc
a
FaEXP1
1278 pb
FaEXP2
1199 pb
FaEXP4
1338 pb
FaEXP5
1154 pb
FaEXP6
1175 pb
ORF
b
260 aa
27,9 kDa
253 aa
26,9 kDa
251 aa
26,6 kDa
250 aa
26,7 kDa
259 aa
27,8 kDa
SignalP
c
Proteína
Madura
b
TargetP
23 aa
25,5 kDa
RS
25 aa
24,2 kDa
RS
22 aa
24,4 kDa
RS
21 aa
24,5 kDa
RS
22 aa
25,6 kDa
RS
d
longitud en pares de base del ADNc completo, sin considerar la cola de poliA.
cantidad de aminoácidos en el ORF, masa molecular de la proteína precursora y de la proteína madura
en kDa, predichos con el programa EditSeq (DNASTAR).
c tamaño del péptido señal predicho por el programa SignalP.
d RS: ruta secretoria; destino de la proteína madura predicho por el programa TargetP.
a
b
Figura 15: Alineamiento de las secuencias de proteínas predichas de las expansinas en estudio.
Se indican con flechas azules los 8 residuos de cisteína (C) y con flechas rojas los 5 residuos de
triptófano (W) conservados en la familia de las D-expansinas. También se recuadra en color naranja
el motivo HFD conservado en las familias de expansinas EXPA y EXPB.
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
2.2.
Expresión de FaEXP1 en la planta de frutilla (Fragaria x ananassa)
Se analizó la expresión del gen FaEXP1 en ovarios (Ov); hojas (H); tallos (T),
sépalos (S); pecíolos (P); raíces (R); estambres (E) y fruto maduro (100 %) (Figura
16), ya que no existían datos acerca de la especificidad de tejido para la expresión
de este gen (Rose y col., 1997). Se extrajo ARN total de los tejidos indicados de
plantas de la variedad Selva por el método del Borato caliente (Wan y Wilkins, 1994)
y, como se indica en Materiales y Métodos, se hibridizaron membranas de nylon con
una sonda específica para el gen FaEXP1 y posteriormente con una sonda para el
ARNr 18S.
Figura 16: Expresión de FaEXP1 en tejidos de frutilla.
Se muestra la expresión del gen FaEXP1 en ovarios (Ov); hojas (H); tallos (T); sépalos (S); pecíolos (P);
raíces (R); estambres (E) y frutos maduros (100 %). La misma membrana se hibridizó con una sonda
para FaEXP1 o para el ARNr 18S.
El mensajero de FaEXP1 se detectó en todos los tejidos analizados y la mayor
expresión se observó en raíces. También se vio un alto nivel de expresión en hojas,
sépalos, estambres y fruto maduro, mientras que la expresión en ovarios, tallos y
pecíolos fue de menor intensidad.
2.3.
Firmeza de los frutos
Con el fin de analizar si los genes de expansina presentaban diferencias de
expresión en distintas variedades de frutilla, se seleccionaron tres variedades cuyos
frutos poseen firmeza contrastante y se midió dicha firmeza en los distintos
estadios de desarrollo y maduración del fruto (VG, B, 25 %, 50 %, 75 % y 100 %).
Los resultados de la medida de firmeza de estos frutos, utilizando un
Analizador de Textura (ver Materiales y Métodos), están resumidos en la Figura 17.
Se observó que la firmeza de los frutos disminuye a medida que la maduración
avanza desde el estadio VG hasta el 100 % en las tres variedades utilizadas (Selva,
Camarosa y Toyonaka). La firmeza de los frutos de la variedad Toyonaka es menor
que la observada en las otras variedades en todos los estadios de madurez
analizados. A su vez, los frutos más firmes corresponden a la variedad Selva en
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
todos los estadios de maduración, salvo en VG donde su firmeza es similar a la de
Camarosa. Este cultivar produce frutos con una firmeza, en general, intermedia
entre las variedades Toyonaka y Selva.
Es importante destacar que los frutos de la variedad Toyonaka poseen una
velocidad de ablandamiento considerablemente mayor que las otras dos variedades.
El mayor descenso en la firmeza de estos frutos se produce entre los estadios VG y
B, siendo esta disminución aproximadamente de un 60 %, y luego los frutos
presentan bajos niveles de firmeza durante toda la maduración. En la variedad
Selva la disminución de la firmeza es más gradual durante la maduración, mientras
que en Camarosa el mayor descenso de firmeza se produce entre los estadios B y 25
%. Las diferencias de ablandamiento entre estas variedades son tan marcadas que
la firmeza de un fruto de un estadio temprano de maduración (B) de Toyonaka es
comparable a la de un fruto en el estadio maduro (100 %) de Selva.
25
Fuerza máxima (N)
20
15
Selva
Camarosa
Toyonaka
aa
b
a
b
10
a
a
5
c
a
b
b
b
a
c
c
c
25%
50%
75%
b
c
0
VG
B
100%
Figura 17: Análisis de firmeza
de los frutos. Se utilizó como
parámetro la fuerza máxima
necesaria para penetrar los
frutos, utilizando una sonda
de 3 mm de diámetro a una
velocidad de 0,5 mm/s. Los
datos fueron analizados por
ANOVA y las medias fueron
comparadas por un ensayo de
LSD(0,05).
Diferentes
letras
indican
diferencias
significativas en los valores de
Fuerza máxima en cada
estadio de madurez.
Estadios de madurez
2.4.
Expresión de expansinas en variedades con firmeza contrastante
Se analizó la expresión de los cinco genes de expansina durante la
maduración de frutos de las tres variedades con firmeza contrastante (Fragaria x
ananassa cv. Selva, Camarosa y Toyonaka). En todos los casos se extrajo ARN total
por el método del Borato caliente (Wan y Wilkins, 1994), se sembraron 10 Pg de
cada muestra en geles de agarosa-formaldehído, se transfirieron a membranas de
nylon y se hibridizaron con una sonda específica para el gen de interés y
posteriormente con una sonda para el ARNr 18S de frutilla como control de carga,
como se indica en Materiales y Métodos. Estos resultados se muestran en las
figuras que siguen.
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
FaEXP1
El patrón de expresión del gen FaEXP1 es distinto en cada una de las tres
variedades estudiadas (Figura 18). En los tres casos la expresión comienza a
detectarse en el estadio blanco (B). Sin embargo, en las variedades más firmes,
Selva y Camarosa, la expresión al inicio de la maduración (B y 25 %) es baja,
comparada con la variedad más blanda, Toyonaka, en la cual se observa un alto
nivel de expresión a partir del estadio B, el cual se mantiene prácticamente
constante hasta el final de la maduración.
Figura 18: Expresión de FaEXP1.
Análisis por Northern blot de la
expresión del gen FaEXP1 en las
distintas variedades (Selva, Camarosa
y Toyonaka) en los diferentes estadios
de madurez (VG, B, 25 %, 50 %, 75 % y
100 %). A la izquierda se indica la
sonda utilizada (FaEXP1 o ARNr 18S)
FaEXP2
Para la expansina FaEXP2, el patrón de expresión del gen en los distintos
estadios de madurez de las variedades analizadas se muestra en la Figura 19. Se
observa que el ARNm de FaEXP2 comienza a expresarse en el estadio blanco (B) en
las tres variedades. En el caso de Selva, el nivel de expresión en los estadios B y 25
% es bajo; a partir del estadio 50 % se observa un aumento gradual hasta llegar al
100 %, en el cual la expresión está notoriamente aumentada con respecto al estadio
blanco. En la variedad Camarosa se observa que el nivel de expresión aumenta al
pasar del estadio blanco al 25 %, a partir del cual la expresión se mantiene en un
nivel aproximadamente constante hasta el estadio 100 %. Finalmente, en la
variedad Toyonaka, más blanda que las dos anteriores, se observa un alto nivel de
expresión en el estadio blanco, que se mantiene prácticamente constante a través
de los estadios posteriores hasta llegar al 100 %.
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
Figura 19: Expresión de FaEXP2.
Análisis por Northern blot de la
expresión del gen FaEXP2 en las
distintas variedades (Selva, Camarosa
y Toyonaka) en los diferentes estadios
de madurez (VG, B, 25 %, 50 %, 75 % y
100 %). A la izquierda se indica la
sonda utilizada (FaEXP2 o ARNr 18S)
FaEXP4
El patrón de expresión de este gen durante la maduración se muestra en la
Figura 20. La presencia del mensajero de FaEXP4 comienza a detectarse en el
estadio VG en las tres variedades, aunque en Selva la señal es más intensa que en
los otros dos cultivares. El nivel de expresión en las variedades firmes, Selva y
Camarosa, aumenta en el estadio blanco y se mantiene aproximadamente
constante en el resto de los estadios analizados. En Toyonaka se observa un
máximo de expresión en el estadio blanco, mientras que en el resto de los estadios
la expresión fue muy leve o prácticamente indetectable.
Figura 20: Expresión de FaEXP4.
Análisis por Northern blot de la
expresión del gen FaEXP4 en las
distintas variedades (Selva, Camarosa
y Toyonaka) en los diferentes estadios
de madurez (VG, B, 25 %, 50 %, 75 %
y 100 %). A la izquierda se indica la
sonda utilizada (FaEXP4 o ARNr 18S)
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
FaEXP5
En el caso del gen de expansina FaEXP5, el patrón de expresión en los
distintos estadios de madurez de las variedades analizadas se muestra en la Figura
21. Nuevamente se encontraron diferencias en los patrones de expresión al
comparar las tres variedades. Si bien en los tres casos la expresión comienza en el
estadio blanco, en la variedad Selva se detectó un bajo nivel de expresión, que
aumenta al pasar al estadio 25 % y se mantiene aproximadamente constante hasta
el estadio 100 % (en la figura, la aparente disminución en el estadio 50 % se debe
probablemente a la menor cantidad de ARN cargado). En la variedad Camarosa, el
nivel de expresión se mantiene constante en los tres primeros estadios en los que se
expresa (B – 50 %) y luego se incrementa al final de la maduración. En el caso de
Toyonaka, la expresión comienza a detectarse en el estadio blanco, aumenta hacia
el estadio 25 % y se mantiene a niveles constantes hasta el 100 %. Asimismo, el
análisis de la Figura 21 indica que los niveles de expresión en Toyonaka son
mayores que en las otras dos variedades más firmes, sobre todo en los primeros
tres estadios donde se detecta expresión (B, 25 % y 50%).
Figura 21: Expresión de FaEXP5.
Análisis por Northern blot de la
expresión del gen FaEXP5 en las
distintas variedades (Selva, Camarosa
y Toyonaka) en los diferentes estadios
de madurez (VG, B, 25 %, 50 %, 75 %
y 100 %). A la izquierda se indica la
sonda utilizada (FaEXP5 o ARNr 18S)
FaEXP6
El patrón de expresión del gen de la expansina FaEXP6 en los distintos
estadios de madurez de las variedades analizadas se muestra en la Figura 22. El
ARNm de FaEXP6 también muestra distintos patrones de acumulación en las tres
variedades. En este caso se detecta una leve expresión en el estadio VG en todas las
variedades, siendo mayor en Selva y apenas detectable en Camarosa y en
Toyonaka. En la variedad Selva la expresión en los estadios VG y B es similar; luego
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
se incrementa y alcanza niveles aproximadamente constantes entre los estadios 25
% y 100 %. En la Figura 22 también se puede ver que, en Camarosa, el ARNm de
FaEXP6 se comienza a detectar en el estadio blanco y su cantidad aumenta
ligeramente en los estadios posteriores. En general, la expresión de este gen en la
variedad Toyonaka es baja; se detectó una ligera expresión en VG y un bajo nivel de
expresión en los estadios posteriores, que en el estadio 100 % se torna
prácticamente indetectable.
Figura 22: Expresión de FaEXP6.
Análisis por Northern blot de la
expresión del gen FaEXP6 en las
distintas variedades (Selva, Camarosa
y Toyonaka) en los diferentes estadios
de madurez (VG, B, 25 %, 50 %, 75 % y
100 %). A la izquierda se indica la
sonda utilizada (FaEXP6 o ARNr 18S)
2.5.
Detección de proteínas expansinas
Se realizó la comparación mediante Western blot del patrón de acumulación
de expansinas durante la maduración de frutos de una de las variedades firmes
(Camarosa) y de la variedad más blanda (Toyonaka). Para ello se utilizó un
anticuerpo anti-LeEXP1 contra una expansina de tomate (Rose y col., 1997),
obteniéndose los resultados que se muestran en la Figura 23.
Como se aprecia en dicha figura, existe una diferencia en la abundancia de
expansinas entre las dos variedades. Los anticuerpos usados detectaron una banda
de 29 kDa, lo cual es consistente con reportes previos (Harrison y col., 2001). En la
variedad más blanda se detectan expansinas desde el estadio blanco, mientras que
en Camarosa se detectan a partir del estadio 25%. Además, se ve que en el estadio
25% la acumulación en Toyonaka es aproximadamente el doble de la de Camarosa.
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
Figura 23: Western blot de extractos de proteína total.
Se sembraron 15 Pg de proteína total de cada uno de los estadios (VG, B, 25 %, 50 %, 75 % y
100 %) de frutos de Camarosa y Toyonaka, se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa. La detección se realizó con anticuerpos preparados contra LeEXP1
de tomate.
2.6.
Comparación de la expresión de los genes de expansina en frutos de
Fragaria chiloensis y Fragaria x ananassa
Como parte de un proyecto en colaboración entre nuestro laboratorio y el
laboratorio de la Dra. María Alejandra Moya-León, del Instituto de Biología Vegetal y
Biotecnología de la Universidad de Talca, Chile, se realizó un análisis comparativo
de la expresión de los genes FaEXP1, FaEXP2, FaEXP4, FaEXP5, y FaEXP6 durante
la maduración de frutos de Fragaria x ananassa cv. Chandler y de Fragaria
chiloensis.
En el caso de Fragaria chiloensis la clasificación de los estadios de madurez
se hizo de manera diferente (Figueroa y col., en prensa) ya que los frutos de esta
especie no desarrollan totalmente color rojo en el receptáculo, sino que pasan de
estadios de desarrollo verdes (pequeños o grandes) a frutos de color blanco con
aquenios de coloración roja. El receptáculo va adquiriendo una leve tonalidad
rosada y aumenta su tamaño hacia el final de la maduración. Por lo tanto, en las
figuras siguientes, los estadios se denominan A1, A2, A3 y A4 para Fragaria x
ananassa cv. Chandler y C1, C2, C3 y C4 para Fragaria chiloensis (ver Figura 25).
El estadio A1 correspondería a frutos verdes pequeños, A2 a frutos VG, A3 a frutos
con color rojo incipiente en su superficie y A4 corresponde a frutos maduros (100 %
rojos). Los estadios de Fragaria chiloensis son análogos a los de Fragaria x
ananassa; C1 corresponde también a frutos VP (receptáculo verde con aquenios
verdes), C2 son frutos VG (receptáculo verde con aquenios rojos), C3 son frutos con
maduración intermedia (frutos blancos grandes con aquenios rojos) y C4 frutos ya
completamente maduros (frutos más grandes que C3 con aquenios rojos y tonalidad
rosa en el receptáculo).
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
2.6.1 Detección de los genes de expansina en Fragaria chiloensis
Se realizaron reacciones de PCR sobre ADNc del estadio de maduración C3
de Fragaria chiloensis con cebadores específicos para cada uno de los genes de
expansina a analizar, detallados en la Tabla VI de Materiales y Métodos:
FaEXP1: FE1-5 y FE1-3
FaEXP2: 5FaEXP2 y 3FaEXP2
FaEXP4: sonda4-1 y sonda4-2
FaEXP5: 5FaEXP5 y 3FaEXP5
FaEXP6: 5FaEXP6 y 3FaEXP6
Se logró obtener amplificación de un fragmento para cada gen analizado en
Fragaria chiloensis (Figura 24). En todos los casos se corresponde con el tamaño
esperado por amplificación en Fragaria x ananassa, lo cual indicaría que los genes
de interés descritos en Fragaria x ananassa se encuentran también en frutos de F.
chiloensis.
EXP1
C3
(+)
EXP2
(-)
158 pb
C3
(+) (-)
150 pb
EXP4
C3
(+)
EXP5
(-)
272 pb
C3
212 pb
(+)
(-)
Figura 24: Detección de los genes de
expansina de Fragaria x ananassa en
F. chiloensis
Se realizaron reacciones de PCR con
cebadores específicos para cada gen
de Fragaria x ananassa en el estadio
de madurez C3 de Fragaria chiloensis.
El símbolo (+) corresponde a la
amplificación a partir de un plásmido
con el fragmento del gen clonado de
Fragaria x ananassa y el símbolo (-) es
el control negativo de la reacción de
PCR
EXP6
C3
(+)
(-)
318 pb
2.6.2 Comparación de la expresión en frutos de ambas especies
Los genes de interés se denominan simplemente EXP1 a EXP7, para
independizarlos de la especie, ya que las iniciales Fa denotan que se trata de genes
de la especie Fragaria x ananassa. Se resumen en la Figura 25 los patrones de
expresión de los genes de expansina EXP1, EXP2, EXP4, EXP5 y EXP6 durante la
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
maduración de frutos de Fragaria x ananassa cv. Chandler (A1, A2, A3 y A4) y de
frutos de Fragaria chiloensis (C1, C2, C3 y C4).
Puede observarse que el patrón de expresión de EXP1 y EXP2 es bastante
similar en las dos especies y que si bien EXP5 se expresa en estadios comparables
en las dos especies, la expresión en Fragaria chiloensis es considerablemente mayor
que en Fragaria x ananassa. También se puede ver que los genes de EXP4 y EXP6
muestran una expresión muy diferente en estas dos especies: EXP4 se detecta
levemente en C2, C3 y C4 mientras que en Fragaria x ananassa ya se detecta en A1
y la expresión es más alta en A2, A3 y A4. Por otro lado, EXP6 solo se detecta en C4
mientras que en Fragaria x ananassa se expresa en todos los estadios.
Figura 25: Comparación de la expresión de genes de expansina en frutos de Fragaria chiloensis y
Fragaria x ananassa.
Se muestran los patrones de expresión de los genes de expansina (A) EXP1, (B) EXP2, (C) EXP4,
(D) EXP5 y (E) EXP6. Cada membrana posee cuatro estadios de maduración comparables de
Fragaria x ananassa y de Fragaria chiloensis (A1 y C1; A2 y C2; A3 y C3 y A4 y C4,
respectivamente), las cuáles se hibridizaron con sondas específicas para los genes de expansinas
de Fragaria x ananassa indicados a la izquierda de cada figura y posteriormente con una sonda
para el ARNr 18S de frutilla. En la parte superior de la figura se muestran los estadios de
maduración de F. chiloensis y Fragaria x ananassa.
2.6.3 Expresión de expansinas en otros tejidos de Fragaria chiloensis
También se analizó la expresión de los genes EXP1, EXP2, EXP4 y EXP6 en
muestras de hojas (H), raíces (R), flores (F) y estolones (E) de plantas de Fragaria
chiloensis. Esto se realizó inicialmente por Northern blot, pero no se logró detectar
&DS¯WXOR,5HVXOWDGRV
expresión de estos genes en los tejidos analizados, salvo EXP1 para el cual se
detectó expresión en flor (no mostrado). Para corroborar este resultado por una
técnica más sensible, se realizó RT-PCR con los cebadores indicados en la sección
2.6.1 sobre ADNc de dichos tejidos de Fragaria chiloensis. Los resultados se
muestran en la Figura 26.
Como se ve en la Figura 26, los genes EXP4 y EXP6 se expresan en los cuatro
tejidos analizados, EXP1 efectivamente se expresa en tejido de flor, y EXP2 y EXP5
no se expresan en ninguno de los tejidos analizados.
E
EXP1
EXP2
EXP4
EXP5
EXP6
F
H
R
(+)
(-)
Figura 26: Expresión de los genes de
expansina en tejidos de Fragaria chiloensis.
Análisis por RT-PCR de los genes de
expansina que se indican a la izquierda de
la figura en los tejidos indicados en la parte
superior: estolones (E), flores (F), hojas (H)
y raíces (R). El símbolo (+) corresponde a
amplificación a partir de un plásmido con
el fragmento del gen clonado de Fragaria x
ananassa y el símbolo (-) es el control
negativo de la reacción de PCR.
ARNr 18 S
&DS¯WXOR,'LVFXVLµQ
3.
Discusión
La caracterización de los genes de expansina elegidos para este trabajo de
tesis comenzó con la obtención de los ADNc completos de cada uno de ellos. Como
se indica en la Tabla III, todas las proteínas predichas son pequeñas, entre 250 y
260 aminoácidos, y poseen un péptido señal constituido por 21 a 25 aminoácidos
que dirigiría la proteína a la pared celular; la eliminación de estos péptidos daría
lugar a la formación de las proteínas maduras, cuyas masas moleculares se
encontrarían cercanas a 24-25 kDa. Estos datos están de acuerdo con reportes
previos de genes de D-expansina provenientes de diversas especies (Sharova, 2007).
Como se mencionó anteriormente, en la familia de las D-expansinas existen 8
residuos de cisteína (C) y 5 de triptófano (W) conservados (Figura 6). Tras la
obtención de los ADNc completos de estos genes, y observando el alineamiento de
las secuencias de las proteínas predichas a partir de los mismos (Figura 15), se
corroboró la presencia de dichos residuos de cisteína y se pudo determinar la
presencia de los últimos dos residuos de triptofano conservados en la zona Cterminal y del residuo conservado en la región N-terminal, todos ellos codificados en
regiones previamente desconocidas de estos genes, las cuales fueron clonadas en
este trabajo.
El análisis de especificidad de tejido del gen FaEXP1 permitió establecer que,
si bien el mismo se expresa abundantemente en fruto durante la maduración, su
mayor acumulación se produce en raíces. De los genes de expansina que se
conocen en frutilla, ninguno presenta una expresión en raíces tan abundante como
FaEXP1 (Figura 10, Harrison y col., 2001), por lo que es probable que tenga un rol
importante en este tejido.
La mayoría de los trabajos que utilizan plantas transgénicas con el fin de
dilucidar la influencia de las distintas enzimas de pared celular sobre el
ablandamiento del fruto se han realizado en tomate (Brummell y Harpster, 2001).
En el caso particular de expansinas, Brummell y col. (Brummell y col., 1999a)
establecieron por primera vez una relación entre estas proteínas y la firmeza de los
frutos. La obtención de plantas transgénicas de frutilla, si bien es posible (JiménezBermúdez y col., 2002), no es una técnica tan ampliamente usada como en tomate.
Otro modo de evaluar procesos involucrados en el ablandamiento de frutos es a
través de la comparación de variedades con firmezas contrastantes. De esta
manera, se ha logrado detectar diferencias en el metabolismo de pared celular
durante la maduración (Rosli y col., 2004) y diferencias en la expresión génica
(Salentijn y col., 2003; Dotto y col., 2006; Bustamante y col., 2006).
&DS¯WXOR,'LVFXVLµQ
La hipótesis detrás de este análisis es que si las expansinas están
involucradas en el proceso de maduración de frutilla, y por lo tanto en su
ablandamiento, entonces la expresión de los genes analizados será distinta en
variedades con firmeza contrastante. En caso de haber una correlación entre la
expresión de alguno de estos genes y la firmeza de las variedades, esperábamos
encontrar mayor expresión en la variedad más blanda, ya que una mayor actividad
expansina produciría frutos más blandos.
Como puede observarse en las Figuras 18 a 22, los genes de expansina
analizados presentan patrones de expresión diferentes en las tres variedades.
Además, en la Figura 17 y como se mencionó en la sección 2.3, las mayores
diferencias en la firmeza de los frutos se dan en los estadios iniciales de la
maduración, por lo tanto se prestó particular atención a las diferencias detectadas
al inicio de la maduración.
El análisis de las Figuras 19 y 21 indica que existiría una correlación entre la
expresión de los genes FaEXP2 y FaEXP5 y la firmeza de las variedades. Se
encontró una mayor expresión de ambos mensajeros en el cultivar más blando
(Toyonaka) entre los estadios VG y 25 %. Sin embargo, la acumulación de estos
transcriptos
aumenta
luego
en
los
cultivares
más
firmes,
igualando
aproximadamente sus niveles en las tres variedades. Resultados similares fueron
obtenidos previamente por Salentijn y col. (2003), quién encontró que la expresión
del gen de FaEXP2 era solo levemente mayor en fruto maduro de un cultivar blando
(Gorella) en comparación con cultivares más firmes (Holiday y Elsanta). En el
presente trabajo se determinó que existen diferencias notables entre los niveles de
expresión de FaEXP2 y FaEXP5, pero que dichas diferencias se manifiestan en los
estadios iniciales de la maduración.
Por otro lado, en las Figuras 20 y 22 se ve que no es posible establecer tal
correlación entre firmeza y expresión para los genes FaEXP4 y FaEXP6. La
expresión de ambos genes fue mayor en los cultivares Selva y Camarosa (más
firmes), mientras que se observó un menor nivel de acumulación de estos
transcriptos en la variedad Toyonaka (más blanda). Este hallazgo, sumado a los
resultados obtenidos en Fragaria chiloensis (ver más adelante) y a que la expresión
de ambos genes no es específica de fruto (Harrison y col., 2001), sugiere que la
expresión de estos genes no contribuiría de modo significativo al ablandamiento del
fruto.
En cuanto a FaEXP1 (Figura 18), la expresión de este gen fue mayor en
Toyonaka que en los cultivares más firmes en los estadios iniciales de la
maduración (B y 25 %), por lo que también se podría establecer una correlación
&DS¯WXOR,'LVFXVLµQ
entre la expresión del gen y la firmeza de los frutos. Sin embargo, a diferencia de
FaEXP2 y FaEXP5, FaEXP1 no tiene expresión específica de fruto sino que también
se encuentra en otros tejidos, especialmente en raíces (Figura 16).
El gran número de genes de expansina presentes en las distintas especies ha
llevado a proponer al menos dos hipótesis acerca de la posible función de tal
cantidad de genes (Cosgrove, 1998). Una posibilidad es que cada uno de estos genes
tenga un patrón de expresión distinto del resto y característico según los
requerimientos de cada tejido, con lo cual su expresión estaría regulada espacial o
temporalmente, delimitando su acción a un determinado tejido y/o a un
determinado momento del desarrollo de la planta. De hecho, algunos trabajos han
aportado evidencias experimentales que respaldan esta hipótesis (Cho y Kende,
1997a; Rose y col., 1997; Shimizu y col., 1997). Otra posibilidad es que la función
de estos genes sea redundante, y en este caso la expresión de los diferentes genes
de expansina se superpondría parcialmente, aunque podrían tener diferente
regulación. Se han encontrado también numerosas evidencias para esta segunda
posibilidad (ver por ejemplo, referencias citadas en maduración de frutos de la
Tabla I de la Introducción General). Según los resultados mostrados en este
Capítulo, los cinco genes analizados son expresados simultáneamente entre los
estadios B y 100 %, por lo que existe cierta redundancia en su expresión en fruto,
lo cual estaría de acuerdo con la segunda hipótesis planteada. Sin embargo, solo
tres de ellos (FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP5) mostraron una correlación entre la
firmeza de los frutos y la expresión al inicio de la maduración, mientras que los
otros dos (FaEXP4 y FaEXP6) no mostraron tal correlación. Esto sugiere que
algunos de los genes de expansinas estarían involucrados en el ablandamiento y
que otros no estarían asociados con este proceso.
Además de la correlación a nivel de la expresión de algunos de estos genes,
se hallaron diferencias en la abundancia de proteínas entre un cultivar firme y el
cultivar más blando. Estas diferencias fueron más significativas al inicio de la
maduración (Figura 23), lo cual concuerda con las diferencias a nivel de expresión
génica. Si bien no podemos determinar cuáles son las expansinas que está
detectando el anticuerpo anti-LeEXP1, es probable que reconozca a varias de ellas,
sino a todas, dada la alta identidad de secuencia proteica que existe dentro de la
familia de D-expansinas (Figuras 7 y 15).
En el cultivar más blando, Toyonaka, los genes de expansina involucrados en
el proceso de maduración son regulados positivamente al inicio de la maduración,
provocando una mayor acumulación de proteína en los estadios B y 25 %, lo cual
&DS¯WXOR,'LVFXVLµQ
contribuiría a que sus frutos se ablanden más rápido que los de los otros dos
cultivares más firmes.
Estos resultados sugieren que la acumulación temprana de algunas
expansinas contribuiría al ablandamiento en frutilla al inicio del proceso de
maduración, y esto podría ser, al menos en parte, responsable de las diferentes
velocidades de ablandamiento observadas en las distintas variedades (Figura 17).
Rose y col. (1997) han propuesto dos roles putativos para la acción de las
expansinas en el ablandamiento de frutos. Estas proteínas podrían debilitar las
uniones entre los componentes de la pared celular (sección 3.3 de la Introducción
General, Figura 8), o podrían estar actuando indirectamente facilitando la acción de
las enzimas degradativas de pared. Cualquiera de estas dos posibilidades, o ambas,
podría ocurrir en los estadios iniciales de la maduración de frutilla, produciendo el
ablandamiento más rápido, como en Toyonaka, o más gradualmente, como en Selva
y Camarosa.
En el marco del proyecto en colaboración con la Dra. María Alejandra MoyaLeón, de la Universidad de Talca, Chile, se compararon los patrones de expresión de
los genes de expansina en la maduración de frutos de ambas especies,
obteniéndose algunos resultados interesantes.
Como se mencionó en la Introducción General, la planta de frutilla cultivada
Fragaria x ananassa es un híbrido entre las especies Fragaria chiloensis y Fragaria
virginiana. La amplificación por PCR con cebadores diseñados para los genes de
Fragaria x ananassa en una muestra de ADNc de Fragaria chiloensis, produjo
amplicones de los tamaños esperados en todos los casos, por lo que los genes en
estudio estarían presentes también en esta especie (Figura 24).
De los resultados de la expresión de estos genes mostrados en la Figura 25,
es interesante destacar algunos aspectos. Los resultados que se habían obtenido
previamente con distintas variedades de Fragaria x ananassa indicaban que la
expresión de FaEXP4 y FaEXP6 no sería tan relevante en la determinación de la
firmeza de los frutos, ya que no se había encontrado correlación entre la expresión
de ambos genes y la firmeza del fruto. En cambio, se había encontrado correlación
entre la expresión de FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP5, por lo que se postuló que estos
genes serían importantes en la variación de la firmeza de los frutos durante la
maduración.
El análisis comparativo realizado entre Fragaria x ananassa y Fragaria
chiloensis ha permitido reforzar esta hipótesis. Los frutos de Fragaria chiloensis son
más blandos que los frutos de Fragaria x ananassa cv Chandler en estadios de
&DS¯WXOR,'LVFXVLµQ
madurez comparables (datos no mostrados). De este modo, el hecho de que la
expresión de los genes EXP4 y EXP6 sea apenas detectable durante la maduración
de un fruto tan blando como F. chiloensis apoya la hipótesis que estos genes no
contribuirían significativamente al ablandamiento del fruto. En cambio, la
acumulación de los mensajeros EXP1, EXP2 y EXP5 en F. chiloensis sigue un patrón
similar a los observados en Fragaria x ananassa.
Respecto a la especificidad de tejido, los resultados de la Figura 26 indican
que los ARN mensajeros de EXP2 y EXP5 no se detectaron en los tejidos
provenientes de la planta de F. chiloensis, por lo que su expresión sería específica
de fruto, al igual que lo observado en Fragaria x ananassa. Además, los genes EXP4
y EXP6 se expresan en los cuatro tejidos analizados, de modo también análogo a lo
que ocurre en Fragaria x ananassa (Figura 10). En el caso de la expresión de EXP1
en estos tejidos, existen discrepancias entre las dos especies, ya que en F. chiloensis
no se detectó mensajero en raíz, mientras que en Fragaria x ananassa la expresión
en este tejido es muy importante. Tampoco se detectó expresión de este gen en
hojas ni en estolones de F. chiloensis, a diferencia de F. ananassa donde sí se
detectó expresión en hojas, aunque en un nivel menor que en raíz (Figura 16). Sin
embargo sí se encontró este mensajero en flores completas de F. chiloensis (Figura
26), lo cuál estaría de acuerdo con lo observado en F. ananassa, dado que se
detectó expresión en diferentes componentes de la flor analizados por separado
(sépalos, ovarios y estambres; Figura 16).
Estos resultados nos permiten concluir que los genes de expansina
analizados conservarían su rol en la maduración de los frutos de ambas especies,
con los genes EXP1, EXP2 y EXP5 relacionados con el ablandamiento del fruto,
mientras que EXP4 y EXP6 no tendrían un rol importante en este proceso. Además,
las expansinas mantendrían sus patrones de expresión característicos en distintos
tejidos de la planta, excepto el gen de EXP1 que de alguna manera adquirió la
capacidad de expresarse en raíces y hojas en plantas de Fragaria x ananassa.
&DS¯WXOR,,,QWURGXFFLµQ
CAPÍTULO II
1.
Introducción
Diversos estudios genéticos y moleculares han generado una cantidad
importante de información acerca de los genes que participan en cada uno de los
aspectos de la maduración de frutos, tales como el desensamblaje de la pared
celular; cambios en azúcares solubles; biosíntesis de pigmentos; producción de
vitaminas y antioxidantes; y desarrollo de sabor y volátiles aromáticos. Sin
embargo, hay muchas preguntas que siguen sin respuesta con respecto a los
elementos genéticos reguladores que controlan el proceso de maduración. Además,
la mayoría de los estudios orientados a analizar las secuencias reguladoras de
genes relacionados con la maduración han sido realizados en tomate, que es un
fruto climatérico cuya regulación difiere sustancialmente de la de los frutos no
climatéricos (Giovannoni, 2001).
En los frutos no climatéricos, no existe un pico respiratorio ni de producción
de etileno que marque el inicio de la maduración, lo cuál hace a este proceso más
intrigante aunque menos caracterizado. La frutilla pertenece a este grupo de frutos
y se conocen detalles acerca de varios aspectos relacionados con el control genético
y molecular de la maduración. Sin embargo, a pesar de que se han aislado y
caracterizado un buen número de clones de ADNc de frutilla asociados a la
maduración (Manning, 1998), el estudio de los promotores de estos genes es muy
limitado hasta el momento.
Se han estudiado los promotores de dos endoglucanasas, FaEG1 y FaEG3,
usando transformación transitoria por inyección con Agrobacterium (Spolaore y col.,
2003). También por transformación transitoria usando biobalística, se estudió el
promotor de GalUR, un gen involucrado en la síntesis de vitamina C en frutilla
(Agius y col., 2005). Además de éstos se conoce el promotor del gen STAG1 de
frutilla, un análogo del gen tipo MADS BOX AGAMOUS, y se lo estudió por
transformación permanente (Rosin y col., 2003). Es evidente que la información
acerca de regiones promotoras de genes de frutilla es sumamente escasa.
Los estudios acerca de las regiones promotoras de genes de expansina
también son escasos en la mayoría de las especies, particularmente en frutos. Se
conocen las regiones promotoras de los genes de expansina de Arabidopsis y de
arroz, debido a la secuenciación completa de sus genomas (Choi y col., 2006).
Considerando otras especies, se conoce la región promotora de dos expansinas de
&DS¯WXOR,,,QWURGXFFLµQ
banana, MaEXP1 y MaEXP2, (Trivedi y Nath, 2004; Asha y col., 2007), y de genes de
expansina de algodón (Harmer y col., 2002).
Hasta el momento no se conocen las regiones promotoras de ninguno de los
genes de expansina de frutilla. Por lo tanto, es de sumo interés aislar y caracterizar
dichos promotores a fin de comprender mejor su regulación y la posible función de
los múltiples genes de expansina encontrados. Esto también contribuiría a ampliar
el conocimiento acerca de las señales que intervienen en la maduración de frutos
no climatéricos, sobre todo estudiando las regiones promotoras de genes de
expansina asociados a maduración.
Desde otro punto de vista, el estudio de promotores de genes específicos de
maduración es de la mayor relevancia debido a las posibles aplicaciones
biotecnológicas de los mismos, ya que un promotor fuerte y específico del fruto de
interés puede ser usado para dirigir y favorecer la expresión de transgenes útiles
desde un punto de vista nutricional y/o económico. Para esto es fundamental
conocer la fuerza de las regiones promotoras y caracterizar sus regiones
reguladoras óptimas.
Una manera eficaz de evaluar la actividad de un promotor es la
transformación transitoria del tejido de interés. Esto es particularmente ventajoso,
comparado con la transformación permanente, porque permite un análisis más
rápido ya que no requiere la regeneración de las células transformadas. Esta
ventaja es importante especialmente en especies recalcitrantes a la regeneración,
como es el caso de frutilla (Passey y col., 2003); y en el caso del estudio de frutos,
los cuales son producidos normalmente bastante tiempo (en algunos casos varios
meses) después de la regeneración de la planta transgénica. A pesar de las
complicaciones surgidas al intentar aplicar la metodología de transformación
transitoria en frutos carnosos (Spolaore y col., 2001), se ha logrado utilizar con
éxito esta técnica para el estudio de promotores en frutilla a través del método
biolístico (Agius y col., 2005), y también a través de una técnica de inyección con
Agrobacterium (Spolaore y col., 2001; Spolaore y col., 2003). Es importante destacar
que estos son los dos únicos grupos, a nivel mundial, que han desarrollado este
tipo de tecnología para frutilla. El desarrollo de la transformación transitoria de
frutilla usando el método biolístico fue realizado en el laboratorio del Dr. Valpuesta,
y es donde realizamos los estudios de funcionalidad del promotor del gen FaEXP2.
&DS¯WXOR,,5HVXOWDGRV
2.
Resultados
2.1.
Obtención del promotor de FaEXP2
Se ensayaron distintos métodos de extracción de ADN genómico, y se
determinó que el método de extracción descrito en el punto 15 de Materiales y
Métodos era el más apropiado para obtener ADN genómico de frutilla de la calidad
necesaria para ser usado con el kit Universal Genome Walker (Clontech). En esta
metodología, primero se corta el ADN genómico con cuatro enzimas de restricción y
luego se ligan adaptadores con secuencias complementarias a los cebadores AP1 y
AP2 provistos con el kit, generando cuatro bibliotecas. Las hojas de frutilla poseen
alto contenido de fenoles, los cuales no son totalmente eliminados por los métodos
habituales de extracción de ADN. La presencia de fenoles puede interferir con la
actividad de las enzimas de restricción y de las ligasas, de allí la importancia de
encontrar un método de extracción apropiado para obtener ADN genómico de alta
pureza.
Luego de obtener las cuatro bibliotecas de ADN genómico cortado con las
enzimas de restricción y ligado con los adaptadores, se realizaron reacciones de
PCR usando el cebador prom2-o (Tabla VII de Materiales y Métodos) y el AP1
provisto con el kit, que permitieron obtener un fragmento de aproximadamente 800
pb. Como se ve en la Tabla VII de Materiales y Métodos, para el clonado de este
promotor se había diseñado otro cebador, prom2-i, a fin de usarlo junto con el
cebador AP2 provisto con el kit en una PCR anidada sobre una dilución del
producto de la PCR primaria. Sin embargo, esta segunda reacción de PCR no fue
necesaria ya que el producto obtenido de la primera amplificación resultó ser una
única banda nítida (Figura 27 A), que fue purificada y clonada en el vector pGEM-T
(Promega), y enviada a secuenciar (puntos 9 a 13 de Materiales y Métodos). La
secuencia obtenida correspondía a 650 pb de la región promotora proximal del gen
de FaEXP2, como se representa en la Figura 27 B.
&DS¯WXOR,,5HVXOWDGRV
0
ES
(A)
(B)
'/
aSE
SE
Figura 27: (A) Fragmento obtenido por PCR con el Universal Genome Walker kit: Se muestra la
banda obtenida a partir de DL4, una de las bibliotecas generadas con el kit; M 100 bp: marcador de
peso molecular (B) Representación del fragmento clonado: Se indican las posiciones de los cebadores
prom2-o y AP1 y las regiones contenidas de la zona conocida del gen de FaEXP2 y de la zona
promotora de secuencia desconocida.
2.2
Predicción de elementos reguladores en cis
La predicción de los elementos reguladores en cis se realizó utilizando los
programas PLACE (Prestridge, 1991; Higo y col., 1999), PlantCARE (Rombatus y
col., 1999; Lescot y col., 2002) y MatInspector (Cartharius y col., 2005). Se
obtuvieron 53 elementos predichos usando PLACE, 33 usando MatInspector y 18
usando PlantCARE. En la Figura 28 se muestran los sitios predichos por
PlantCARE y en la Tabla IV se resumen los resultados predichos por PLACE, dentro
de los que estaban incluidos los predichos por MatInspector.
Se
predijeron
diversas
secuencias
reguladoras,
entre
las
cuales
se
encuentran elementos estructurales tales como CAAT box y TATA box (Figura 28).
De las secuencias TATA box halladas, probablemente sean más significativas las
que se encuentran alrededor de la posición 600, ya que la presencia de esta
secuencia es funcional alrededor de la posición -30 del inicio de la transcripción
(Dynan y Tjian, 1985). En cuanto a secuencias relacionadas con la regulación
hormonal, fue predicho un elemento de respuesta a ácido abscísico (ABRE: Abscisic
acid Responsive Element) encontrado en genes de Arabidopsis thaliana (Simpson y
col., 2003; Nakashima y col., 2006) y un elemento de respuesta a giberelinas
(GARE: Giberellic Acid Responsive Element) encontrado en coliflor (Brassica
oleracea), (Pastuglia y col., 1997). Se detectaron también dos cajas MBS que son
sitios de unión a factores de transcripción MYB involucrados en inducción por
sequía (Urao y col., 1993), y que también estarían involucrados en respuestas a
ABA (Abe y col., 2003). Además, fueron predichos varios elementos de respuesta a
luz (Box I; G-box; I-box; GATA motif), (Gilmartin y col., 1990) y también se encontró
&DS¯WXOR,,5HVXOWDGRV
un elemento involucrado en el control circadiano de la expresión, presente en el gen
de LHC de tomate (circadian) (Piechulla y Merforth, 1998).
Figura 28: Predicción de elementos regulatorios en cis.
Se muestran en la figura los elementos predichos por el programa PlantCARE. Las
referencias en color se indican a la derecha. El elemento ABRE se encuentra oculto por el
color fucsia de una de las G-box, indicado con una flecha en la referencia de color. Los
elementos recuadrados en verde corresponden a la caja de pirimidinas y uno de los sitios
de unión DOF, y el recuadrado en rojo son las W-box predichos por PLACE y MatInspector
(ver Tabla IV).
Entre los elementos reguladores predichos por los otros dos programas y que
no fueron predichos por PlantCARE, se pueden mencionar: varios sitios de unión de
factores de transcripción DOF (AAAG; DOF: DNA binding with One Finger); una caja
de pirimidinas (Pyrimidine box, CCTTTT) que ha sido involucrada en respuestas
relacionadas con giberelinas (Mena y col., 2002); y algunos elementos W-box
(CTGACY, TGACY, TGAC; Y = C o T) que son sitios de unión de factores de
transcripción WRKY, involucrados en respuesta a heridas y en procesos en los
cuales participan giberelinas (Eulgem y col., 2000).
&DS¯WXOR,,5HVXOWDGRV
Tabla IV
Elementos reguladores predichos por PLACE y MatInspector
Secuencia†
Ubicación (hebra)*
AACAAAC
320 (-)
ACGTG
271 (-)
ACGT
193 (- ; +) ; 272 (- ; +)
AAACAAA
AGCAGC
298 (+)
642 (+)
Secuencia †
Ubicación (hebra)*
CACATG
355, 410 (-)
CTCTT
475, 522 (+)
AATAAA
345 (+)
AATAAT
308 (+)
Función
Sitio de
reconocimiento
factores MYC
Nodulación de raí ces
Señ al de poli A de
plantas
CCTTTT
330 (+)
460, 525 (-)
90 (+)
Activación específica
de polen
Caja de pirimidinas
CAAT BoxI
AGGTCA
439 (-)
Elemento Q
316, 510, 618 (+)
11, 36, 71, 78, 105 (-)
Expresión específica
de mesófilo
CAACA
323 (-)
Sitio de
recon ocimiento factor
RAV1
CCAAT
262 (+) ; 158 (-)
Secuencia común
en regiones 5’ n o
codificantes de
eucariotas
AATCCAA
118 (+)
Consenso general de l
gen rcbs
CAANNNNA
TC
140 (-)
Control circadiano
ATATT
15 (+)
14, 112, 335, 448 (-)
Motivo “raíz”
GTAC
31 5 (+ ; -)
CuRE (elemento de
respuesta a cobre)
CATGCA
353 (-)
AAAG
243, 328 (+)
9 1, 477, 497, 524, 561
(-)
Sitio de unión de
factores DOF
CATGCAT
352 (-)
NGAT
ATAGAA
CAAT
YACT
423 (+);
85, 290, 454, 539 (-);
608 (-)
84, 26 3, 307, 538 (+)
15 8, 421 (-)
Nombre y/o
Función
AACA core,
expresión especí fica
endosperma
ABRE
Expresión inducida
por etiolación erd1
ANAERO1ANAERO2
Expresión inducida
por anaerobio sis
Elemento de unión
del factor ARR1
Box II
CANNTG
282, 355 , 383,
410, 510 (+ ; -)
CANTTNC
144 (+) ; 287 (-)
GATA
GRWAAW
GAAAAA
33, 140 (+)
17 7, 613 (-)
249, 287, 331, 342, 445
(+)
40 5, 575 (-)
331 (+)
TGCAGG
WAACCA
TAACTG
YAACKG
CNGTTR
CCWACC
108 (+)
8 7, 292, 493, 509, 615
(-)
572 (+)
232, 237, 250 (-)
359 (+)
278 (+)
395 (+)
395 (+) ; 383 (-)
383 (+) ; 395 (-)
363 (-)
CATGTG
355, 410 (+)
GTGA
YTCANTYY
E-Box,
Sitio de
reconocimiento
factores MYC
EEC (elemento
enhancer consenso)
GATA box
Regulación por luz
Consenso GT1
Regulación por luz
AGAAA
Repetición RY
CATGCAY
352 (-)
ATGGTA
312 (+)
S1F box
AACCCA
374 (-)
Sitio de unión del
factor SEF3
RTTTTTR
301, 347 (-)
Sitio de unión del
factor SEF4
GT1 box, exp resión
inducida por
patógenos
GCCAC
415 (+)
SORLIP (Secuencia
sobre rep resentada
en promotores
inducidos por luz)
Motivo GTGA
GAGAC
520 (-)
SURE (elemento de
respuesta a azufre)
Elemento iniciador
GTGGWWHG
538 (-)
Core enhancer SV40
Elemento intrónico
TATATAA
TTATTT
TATTTAA
CTGACY
TGACY
TGAC
581 (+)
344 (-)
127 (+)
438 (+)
439 (+)
439 (+)
Sitio de
reconocimiento
factores MYB
TATA box
W box; sitio de unión
de factores WRKY
Sitio de
reconocimiento
factores MYC
N = A, C, G o T;
W = A o T;
Y = C o T;
K = G o T;
R=AoG
* Las posiciones se indican a partir del extremo 5’ de la secuencia mostrada en la Figura 28; (+) corresponde a
secuencias de la hebra superior; (-) de la hebra inferior y (+ ; -) a secuencias que se encuentran en ambas hebras.
†
&DS¯WXOR,,5HVXOWDGRV
2.3.
Estudios funcionales de la región promotora obtenida
Con el fin de estudiar la funcionalidad del fragmento promotor obtenido, se
realizaron deleciones escalonadas y con estas construcciones se transformaron
transitoriamente discos de frutos blancos o maduros. Simultáneamente, se intentó
transformar hojas de frutilla y frutos verdes. La transformación se hizo por
bombardeo de partículas recubiertas con la construcción de interés, usando el
sistema PSD 1000/He (BioRad) en el Laboratorio de Bioquímica y Biotecnología
Vegetal en la Facultad de Ciencias de la Universidad de Málaga, laboratorio dirigido
por el Prof. Dr. Victoriano Valpuesta Fernández.
2.3.1. Construcción de deleciones de la región promotora obtenida
Usando los cebadores 650p2; 500p2; 300p2; 150p2 y delp2-3 (Tabla VII de
Materiales y Métodos) se obtuvieron cuatro fragmentos del promotor de FaEXP2.
Dichos fragmentos terminan en el sitio putativo +15 a partir del inicio de la zona 5’UTR del gen de FaEXP2, y comienzan en la posición que se detalla en la Tabla V.
Todas las deleciones poseen en sus extremos sitios de restricción de Xho I y
Hind III (incorporados en los cebadores, Tabla VII). Los fragmentos se ligaron en el
vector pGEM-T, se digirieron con las enzimas indicadas y luego se clonaron en el
vector pGL3 basic. La estrategia de clonado se esquematiza en la Figura 29.
Tabla V
Deleciones del fragmento del promotor de FaEXP2
†
Posición
Posición
inicial †
final †
150p2 y delp2-3
-129
+15
del300
300p2 y delp2-3
-278
+15
del500
500p2 y delp2-3
-478
+15
del650
650p2 y delp2-3
-629
+15
Nombre
Cebadores
del150
Las posiciones indicadas son relativas a la posición +1, considerando a ésta como la primera base de
la zona 5’-UTR del gen de FaEXP2.
&DS¯WXOR,,5HVXOWDGRV
pGL3
del150
del300
del500
del650
purificación de las
deleciones
a partir del gel
de agarosa y clonado
en pGEM-T
purificación del vector
pGL3 previamente cortado
con XhoI y Hind III
Xho I
restricción con XhoI y Hind III
para liberar las deleciones,
nueva purificación a partir del
gel de agarosa y clonado en
pGL3
Hind III
Figura 29: Estrategia de clonado de las deleciones del promotor.
Se diseñaron cebadores para obtener por PCR fragmentos escalonados del promotor de
FaEXP2. Estos fragmentos fueron inicialmente clonados en el vector pGEM-T, luego los
insertos se liberaron mediante restricción con Xho I y Hind III y se clonaron en el vector pGL3
basic, el cual estaba previamente cortado con las mismas enzimas.
2.3.2. Análisis por transformación transitoria
2.3.2.1
Consideraciones sobre la metodología
En el laboratorio del Dr. Valpuesta se había trabajado en la técnica de
transformación transitoria empleando discos de frutilla (Agius y col., 2005). Sin
embargo, fue necesario poner a punto ciertos aspectos de esta técnica, de modo de
optimizar las condiciones de ensayo para evaluar la actividad de este promotor.
Estos ensayos se realizaron usando partículas de tungsteno en vez de oro, debido a
una mayor disponibilidad de las mismas. Se usó la construcción 35S-luc (cuatro
copias en tandem del promotor 35S en vector pGL3) en los disparos y frutos sin
&DS¯WXOR,,5HVXOWDGRV
disparar como control negativo (Neg). Las modificaciones más relevantes de la
técnica que se ensayaron, fueron las siguientes:
-
diámetro de las partículas de tungsteno: inicialmente eran de 1,3 Pm de
diámetro y no se logró la transformación de los frutos; luego se usaron partículas
de un diámetro de 1,7 Pm y se obtuvieron discos transformados. Cabe destacar que
este diámetro es similar al de las partículas de oro (1,6 Pm).
-
desinfección de las partículas de microcarrier: se utilizó glicerol 50 % v/v y
etanol absoluto, en vez de solo agua y etanol. Probablemente esta modificación
impide la formación de agregados de partículas de tungsteno, que al impactar en el
fruto provocan muerte celular, impidiendo que se establezca la transformación
transitoria en dicha zona.
-
distancia entre el macrocarrier y la placa conteniendo el disco del fruto: se
denomina macrocarrier al dispositivo donde se coloca la suspensión de partículas
(microcarrier) recubiertas con el plásmido. Se ensayaron dos distancias (ver Figura
50 de Materiales y Métodos):
-
35S-luc4: macrocarrier en nivel 2 y muestra en nivel 4 (4 cm)
-
35S-luc5: macrocarrier en nivel 2 y muestra en nivel 5 (6 cm)
Estas alternativas se probaron ya que a la mayor distancia (6 cm) las partículas
se dispersan más e impactan sobre un área mayor en el disco de fruto, mientras
que a distancias menores el impacto de las partículas se concentra en la zona
central del disco de fruto. Los mejores resultados se lograron con 4 cm de distancia
entre el fruto y el macrocarrier, como se muestra en la Figura 30. Se observa una
mayor actividad luciferasa (RLU/s) por mg de proteína total con la construcción
35S-luc4 comparada con el control negativo a la misma distancia (Neg4), y con
respecto a 35S-luc5 y su correspondiente control negativo (Neg5).
-
tiempo de incubación de los frutos: los mejores resultados se obtuvieron si
una vez realizado el disparo, los discos de frutos se incubaban durante 40 h en vez
de 24 h, tal como se había realizado en el trabajo de Agius y col. (2005).
&DS¯WXOR,,5HVXOWDGRV
200000
180000
RLU/s.mg prot tot
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
Neg4
2.3.2.2
35S-luc4
Neg5
35S-luc5
Figura 30: Disparo con tungsteno
como microcarrier en discos de
fruto maduro.
En el eje Y se muestra la actividad
luciferasa (RLU/s) por mg de
proteína total. Neg4 y Neg5: discos
sin disparar; 35S-luc4: discos
disparados con 4 cm de distancia
entre macrocarrier y muestra; 35Sluc5: discos disparados con 6 cm de
distancia entre macrocarrier y
muestra.
Disparos en hojas y en frutos en estadio verde grande
Las condiciones de disparo mencionadas en el apartado anterior fueron
utilizadas para analizar la posible funcionalidad de las construcciones en tejido de
hojas de la planta de frutilla. Se hicieron disparos con la construcción 35S-luc
sobre dos hojas, solamente en la cara abaxial, y como control negativo se dejaron
hojas sin disparar. Sin embargo, una vez realizados los disparos y luego de la
incubación por 40 h, las hojas mostraban signos de respuesta a daño (en la Figura
31: 35S-1 y 35S-2), que no se observaron en el control negativo sin disparar (Figura
31: Control negativo). Es probable que la presión utilizada para realizar el disparo
(1800 psi) haya sido excesiva, provocando muerte celular en la zona del impacto.
Dado que también se contaba con discos de ruptura de 900 psi, se hizo una
prueba con esta presión de disparo utilizando la misma construcción 35S-luc y
hojas sin disparar como control negativo. En este caso, no se observó la respuesta a
daño luego de la incubación; sin embargo, tampoco se pudo detectar actividad
luciferasa, indicando que el tejido no había sido transformado (datos no mostrados).
Además, se hicieron disparos sobre discos de frutos en estadio verde grande
con discos de ruptura de 1800 psi con la construcción 35S-luc, pero no se logró
una transformación satisfactoria. Esto podría deberse a que la firmeza de los discos
en este estadio es mucho mayor que la de los frutos maduros (Figura 17 de
Capítulo I-Resultados); probablemente, en este caso sea necesario usar una mayor
presión de disparo para lograr la penetración de las partículas y la consiguiente
transformación transitoria. Sin embargo, solamente se contaba con discos de
ruptura de 900 psi y de 1800 psi, por lo que no se pudo continuar con el análisis en
hojas y frutos verdes.
&DS¯WXOR,,5HVXOWDGRV
35S-1
35S-2
Control
negativo
Figura 31: Hojas disparadas con tungsteno como microcarrier luego de 40 h de incubación.
En las placas superiores se ven las hojas disparadas con la construcción 35S-luc (35S-1 y
35S-2) que muestran respuesta a daño luego de 40 h. En la placa del centro están los
controles negativos sin disparar donde no se ve la misma respuesta luego de la incubación.
2.3.2.3
Disparos con las construcciones del promotor de FaEXP2
Luego de determinar las condiciones mencionadas en el punto 2.3.2.1 con
partículas de tungsteno, se realizaron los disparos utilizando partículas de oro de
1,6 Pm de diámetro (BioRad) como microcarrier y las construcciones de interés
(650-luc; 500-luc; 300-luc y 150-luc), usando pGL3 sin promotor (pGL3) como
control negativo y la construcción 35S-luc como control positivo.
Construcción 650-luc
Se realizaron disparos con la construcción 650-luc en discos de frutos
blancos (Figura 32) y de frutos maduros (Figura 33). En ambos casos se logró la
transformación transitoria de los discos, detectada mediante la medida de actividad
luciferasa.
En frutos blancos (Figura 32) se ve que la actividad en los discos
transformados con 650-luc fue aproximadamente el doble de la detectada en los
frutos transformados con pGL3 (control negativo), y a su vez la actividad luciferasa
en los frutos transformados con 35S-luc fue aproximadamente un 30 % mayor que
la detectada con 650-luc.
En frutos maduros (Figura 33) la actividad luciferasa detectada en discos
transformados con la construcción 650-luc fue aproximadamente 8 veces mayor
que en el control negativo (pGL3) y 2 veces mayor que la detectada con 35S-luc.
&DS¯WXOR,,5HVXOWDGRV
35S
35S
35S
35S
650
luciferasa
35S35S-luc
luciferasa
650650-luc
luciferasa
pGL3
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
RLU. s-1/mg prot tot
Figura 32: Transformación transitoria de frutos blancos con el fragmento de 650 pb del promotor.
pGL3: control negativo, vector sin promotor; 650-luc: fragmento de 650 pb del promotor de FaEXP2
en vector pGL3; 35S-luc: 4 copias en tandem del promotor 35S en vector pGL3. El valor informado
es el promedio de dos replicas de la medida de actividad luciferasa de cada muestra proveniente de
dos eventos de transformación independientes (cuatro medidas en total).
35S
35S
35S
35S
650
luciferasa
35S35S-luc
luciferasa
650650-luc
luciferasa
pGL3
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
RLU. s-1/mg prot tot
Figura 33: Transformación transitoria de frutos maduros con el fragmento de 650 pb del promotor.
pGL3: control negativo, vector sin promotor; 650-luc: fragmento de 650 pb del promotor de FaEXP2
en vector pGL3; 35S-luc: 4 copias en tandem del promotor 35S en vector pGL3. El valor informado
es el promedio entre dos replicas de la medida de actividad luciferasa de cada muestra proveniente
de dos eventos de transformación independientes (cuatro medidas en total).
Construcción 500-luc
Con la construcción 500-luc se dispararon discos de frutos maduros y
también se logró la transformación transitoria de los mismos (Figura 34).
En este caso, la actividad luciferasa medida en los discos transformados con
la construcción 500-luc fue aproximadamente 4 veces mayor que la del control
negativo (pGL3), y un 30 % mayor que la actividad detectada en los discos
transformados con la construcción 35S-luc.
&DS¯WXOR,,5HVXOWDGRV
35S
35S
35S
35S
500
luciferasa
35S35S-luc
luciferasa
500500-luc
luciferasa
pGL3
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
RLU. s-1/mg prot tot
Figura 34: Transformación transitoria de frutos maduros con el fragmento de 500 pb del promotor.
pGL3: control negativo, vector sin promotor; 500-luc: fragmento de 500 pb del promotor de FaEXP2
en vector pGL3; 35S-luc: 4 copias en tandem del promotor 35S en vector pGL3. El valor informado es
el promedio entre dos replicas de la medida de actividad luciferasa de cada muestra proveniente de
dos eventos de transformación independientes (cuatro medidas en total).
Construcciones 300-luc y 150-luc
Con las construcciones 300-luc y 150-luc se transformaron discos de frutos
maduros, pero en ningún caso se logró detectar actividad luciferasa mayor que en
el control negativo (Figura 35). Esto indicaría que los fragmentos del promotor
presentes en estas construcciones no son capaces de conducir la expresión génica,
o bien que la transformación no fue exitosa. No se puede discernir entre estas dos
posibilidades debido a que la metodología empleada no incluye un control interno
de transformación.
35S
35S
35S
35S
300
150
luciferasa
35S35S-luc
luciferasa
300300-luc
luciferasa
150150-luc
luciferasa
pGL3
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
RLU. s-1 /mg prot tot
Figura 35: Transformación transitoria de frutos maduros con los fragmentos de 150 y 300 pb del
promotor.
pGL3: control negativo, vector sin promotor; 150-luc: fragmento de 150 pb del promotor de FaEXP2
en vector pGL3; 300-luc: fragmento de 300 pb del promotor de FaEXP2 en vector pGL3; 35S-luc: 4
copias en tandem del promotor 35S en vector pGL3. El valor informado es el promedio entre dos
replicas de la medida de actividad luciferasa de cada muestra proveniente de dos eventos de
transformación independientes (cuatro medidas en total).
&DS¯WXOR,,'LVFXVLµQ
3.
Discusión
La predicción de elementos reguladores en cis en regiones promotoras es una
tarea compleja dado que estos sitios son secuencias cortas, muchas veces de cuatro
o cinco nucleótidos, por lo que algunos elementos reguladores putativos señalados
por los programas de predicción en realidad no ejercen in vivo un efecto regulador
sobre el gen de interés (Wang y Stormo, 2003).
Sin embargo, en casos como el del gen FaEXP2 donde no existe ninguna
información acerca de su regulación, este tipo de predicciones permite obtener
algunos indicios de los posibles factores involucrados en su activación o represión,
y de este modo orientar futuros experimentos.
El
análisis
bioinformático
de
la
secuencia
obtenida
revela
posibles
regulaciones hormonales a través de ABA y giberelinas. El elemento ABRE (ABA
responsive element) se define como una secuencia de 8-10 pb que contiene la
secuencia núcleo (“core”) ACGT. Sin embargo, el ABRE no es el único elemento que
incluye esta secuencia, y los elementos ACGT se han encontrado en varios
promotores y se ha visto que median distintos tipos de respuestas, como respuesta
a luz visible o UV, o anaerobiosis. Incluso existen secuencias ACGT que no
funcionan como ABREs, aún en promotores capaces de ser inducidos por ABA
(Busk y Pagès, 1998). Es claro entonces, que hay otros requisitos además de la
secuencia que determinan la especificidad de la señal. Por ejemplo, en varios casos
se ha visto que la presencia simultánea del elemento ABRE y de determinados
elementos en cis, genera un promotor mínimo que confiere inducción por ABA al
gen de interés:
ABRE (TGTACGTGGC) – CE1 (TGCCACCGG); (Shen y Ho, 1995)
ABRE (CCTACGTGGC) – CE3 (ACGCGTGTCCTC); (Shen y col., 1996)
ABRE (CCCACGTGGC) – ABRE (GAGACGTGGA); (Busk y Pagès, 1997)
El elemento GARE encontrado corresponde al elemento en cis de respuesta a
giberelinas (GA) de Brassica oleracea (coliflor), (Pastuglia y col., 1997). Los
elementos GARE en general se encuentran formando parte de un complejo de
elementos cis, conocido como GARC (GA responsive complex) que, aunque no
siempre es tripartito, está compuesto por el elemento GARE, una caja de
pirimidinas (CCTTTT) que en este caso fue predicha por los programas PLACE y
MatInspector, y un tercer elemento TATCCAC, que en el promotor de FaEXP2 no fue
detectada. Relacionados con la respuesta a giberelinas, se encuentran los sitios de
unión a factores DOF, detectados por PLACE, los cuales se unen a sitios AAAG, que
&DS¯WXOR,,'LVFXVLµQ
son complementarios a la caja de pirimidinas previamente mencionada (Mena y
col., 2002).
En la región obtenida del promotor de FaEXP2 no se predijeron sitios de
respuesta a otras hormonas, tales como auxinas o etileno. Sin embargo, debido a
que la región promotora se extiende más allá de los 650 pb obtenidos, es posible
que los correspondientes elementos estén presentes en el promotor y no hayan sido
aún aislados, y que este gen responda efectivamente a la acción de estas hormonas.
Además de lo concerniente a la regulación hormonal, los tres programas
utilizados predijeron la presencia de elementos clasificados en la categoría de
elementos de respuesta a luz. Entre éstos se encuentran los elementos I-box y Gbox; este último tiene la secuencia CACGTG, y fue identificado inicialmente en
genes rbcs correspondientes a la subunidad menor de RuBisCO. Sin embargo, en
estudios posteriores se vio que este elemento mediaba, además, respuestas a otros
estímulos, incluidas algunas hormonas como etileno, metil jasmonato y ABA
(nótese que su secuencia incluye ACTG, representativo de los ABRE). En distintas
especies hay secuencias similares a G-box que también median respuestas a luz,
pero sus secuencias difieren de la antes mencionada. Este es el caso de las G-box
predichas por PlantCARE que tienen las secuencias CACGT (Antirrhinum majus),
CACATGG (Solanum tuberosum) y TACGTG (Daucus carota). Esta última coincide
con un elemento ABRE de Arabidopsis thaliana y el programa PlantCARE predice,
en dicha región, la superposición de estos elementos (Figura 28). Nuevamente, y de
modo análogo a lo que ocurre con el elemento ABRE, el contexto en que se
encuentra la G-box determina la funcionalidad del elemento. Por ejemplo, una Gbox junto con el elemento Box I confiere respuesta a metil jasmonato en soja, y la
misma G-box junto con un ERR (ethylene responsive element) está involucrada en
respuesta a etileno en tabaco (Menkens y col., 1995).
Como se mencionó anteriormente, los resultados obtenidos mediante estos
programas
son
orientativos
y
estas
predicciones
deben
ser
confirmadas
experimentalmente. La influencia de hormonas sobre la expresión de FaEXP2 y de
las demás expansinas en estudio fue analizada y los resultados se detallan en el
Capítulo III.
Los ensayos de funcionalidad de la región promotora obtenida se llevaron a
cabo por transformación transitoria de discos de frutilla usando el método biolístico
(Agius y col., 2005). Como se mencionó en la sección 2.3.2.1, este método presenta
numerosas consideraciones experimentales que fue necesario poner a punto al
momento de realizar los ensayos, y que a su vez influyen en la eficiencia de
&DS¯WXOR,,'LVFXVLµQ
transformación entre distintos disparos. Este problema se resuelve generalmente
realizando una co-transformación con un vector que tenga un promotor constitutivo
(en este caso 35S) fusionado a otro gen reportero (en este caso, uno distinto al gen
de luciferasa). Lamentablemente no se contaba con una construcción de este tipo,
por lo que no fue posible comparar la fuerza de las distintas deleciones del
promotor entre sí, sino que solo se pudo determinar si un determinado fragmento
era capaz de conducir la expresión génica.
Como se muestra en la Figura 19 (Capítulo I), el gen FaEXP2 se expresa a
partir del estadio blanco en frutos de la variedad Camarosa, utilizada para este
ensayo, y su expresión en hojas es indetectable (Civello y col., 1999) o muy baja
(Harrison y col., 2001). Por lo tanto, se planificó realizar transformación transitoria
de hojas, frutos verdes, blancos y frutos maduros con las cuatro construcciones de
distintas deleciones del promotor.
La Figura 31 sugiere que los disparos efectuados a la presión disponible no
permitirían la transformación transitoria de las hojas y, como se mencionó antes,
tampoco se logró transformar frutos verdes. De este modo, el análisis de las
construcciones en hojas y frutos verdes no se pudo llevar a cabo.
Con las construcciones más pequeñas, 150-luc y 300-luc, no se logró
obtener discos transformados de frutos blancos ni rojos en ninguno de los intentos
(Figura 35). Sin embargo, como se mencionó más arriba, sin un control de eficiencia
de transformación no se puede dilucidar si la ausencia de actividad luciferasa se
debía a que los fragmentos del promotor eran inactivos o a que había fallado el
evento de transformación.
Por otro lado, se logró la transformación exitosa de frutos blancos y maduros
con la construcción 650-luc (Figuras 32 y 33), por lo que se puede concluir que en
esta región promotora se encuentran los elementos necesarios para conducir la
expresión génica satisfactoriamente en estos dos estadios de madurez. Además, con
la construcción 500-luc también se logró la transformación de frutos maduros
(Figura 34), por lo que este fragmento, aunque más pequeño que el anterior,
también posee los elementos necesarios para expresar el gen de luciferasa.
Estos resultados son interesantes debido a la posibilidad de usar este
promotor para aplicaciones biotecnológicas. Actualmente, y debido a la controversia
que existe con los alimentos transgénicos, ha surgido una tendencia a desarrollar
un campo conocido como cisgénesis (Schouten y col., 2006), que consiste en
modificar la expresión de genes de interés sin introducir promotores heterólogos a
la especie en cuestión, sino mediante el uso de promotores propios de la especie.
Asimismo, se intenta eliminar la incorporación de genes de resistencia a
&DS¯WXOR,,'LVFXVLµQ
antibióticos, que tampoco son propios de especies vegetales (Jacobsen y Schouten,
2007). Desde este punto de vista, el fragmento del promotor de FaEXP2 es un
candidato promisorio para generar este tipo de alimentos cisgénicos, debido a su
especificidad de expresión en fruto y a la alta expresión que presenta este gen desde
el estadio blanco hasta el final de la maduración (Figura 19). Una ventaja adicional
es la longitud relativamente pequeña de los fragmentos funcionales, de 650 y 500
pb, ya que ésto es ventajoso para la obtención de las construcciones necesarias
para realizar la transformación.
Sería interesante completar la caracterización de este promotor en cuanto a
la fuerza del mismo, comparando los fragmentos de interés entre sí y a su vez
comparándolo con la fuerza de otros promotores (Agius y col., 2005). Asimismo,
también sería interesante obtener y caracterizar un fragmento mayor de este
promotor a fines de analizar la presencia de elementos reguladores adicionales.
&DS¯WXOR,,,,QWURGXFFLµQ
CAPÍTULO III
1.
Introducción
Las fitohormonas tienen un rol fundamental en la regulación e integración de
los procesos de crecimiento y desarrollo de las plantas, dado que actúan como señales
que vinculan el desarrollo interno con los estímulos externos que recibe la planta de
su entorno, y los transforman en respuestas adecuadas para un desarrollo correcto.
Las plantas tienen diversas formas de modular las respuestas hormonales. La
regulación se puede dar a nivel de la síntesis, transporte, incorporación o recambio de
la hormona, y también a nivel de la percepción o de la transducción de la señal
generada. Además, la sensibilidad a la hormona puede estar regulada espacial y
temporalmente en el tejido vegetal de acuerdo a la concentración de receptores en la
célula (Klee, 2004). Entre las fitohormonas más importantes se pueden mencionar
etileno, auxinas, ácido abscísico, giberelinas, ácido jasmónico y citoquininas. Las
analizadas en este trabajo se representan en la Figura 36.
Ácido abscí
abscísico (ABA)
Ácido 33-indol acé
acético (AIA)
H
H
C
C
H
Ácido giberélico (GA3)
H
Etileno
Figura 36: Estructura de fitohormonas. Se representan el ácido abscísico (ABA); el ácido 3-indol
acético (AIA), una auxina; el ácido giberélico (GA3), una giberelina; y el etileno.
Dentro de los procesos influenciados por hormonas se encuentran el desarrollo
y la maduración de frutos. Una hormona muy importante en este proceso es el etileno.
En base a la influencia de esta hormona en la maduración se clasifica a los frutos en
dos grandes grupos: climatéricos y no climatéricos (Lelievre y col., 1997). Los frutos
climatéricos se caracterizan por un aumento en la producción de etileno al inicio del
proceso de maduración, acompañado por un pico respiratorio también característico
&DS¯WXOR,,,,QWURGXFFLµQ
de este tipo de frutos. Este pico de producción de etileno es autocatalítico, y
desencadena una serie de procesos bioquímicos conducentes a la maduración del
fruto, tales como la síntesis de pigmentos, degradación de clorofilas, modificación de la
pared celular, síntesis de compuestos volátiles, etc. (Giovannoni, 2001). Dentro de este
grupo de frutos se encuentran el tomate, la manzana, la banana y el durazno, entre
otros. Por otro lado, los frutos no climatéricos agrupan a aquellos donde no se produce
aumento de producción de etileno ni de respiración al inicio de la maduración, e
incluye a frutilla, cítricos y uvas, entre otros (Barry y Giovannoni, 2007).
En contraste con la gran cantidad de información sobre la regulación de la
maduración en frutos climatéricos (principalmente obtenida en tomate), la información
acerca de los factores reguladores de la maduración en los frutos no-climatéricos es
considerablemente menor. En estos frutos, no ha sido aún identificada una única
hormona que tenga un rol fundamental en la maduración, a diferencia de lo que
ocurre con el etileno en todos los frutos climatéricos (Trainotti y col., 2005).
Particularmente en frutilla, desde hace muchos años se sabe que las auxinas
tienen un papel determinante en el desarrollo de los frutos (Nitsch, 1950). La fuente
principal de auxinas endógenas en el fruto son los aquenios, que desde el punto de
vista botánico son los verdaderos frutos derivados de los ovarios. Habitualmente se
denomina “fruto” al receptáculo expandido junto con los aquenios ubicados sobre su
superficie. Las auxinas (principalmente ácido 3-indol acético (AIA), Figura 36) son
producidas en los aquenios y conducidas al interior del receptáculo a través de haces
vasculares (Perkins-Veazie, 1995). Se detectan auxinas libres en los aquenios a los 4
días post-antesis (Nitsch, 1955; Archbold y Dennis, 1984), y en el receptáculo
aparecen pequeñas cantidades a los 11 días post-antesis (Archbold y Dennis, 1984).
Inmediatamente antes del estadio Blanco, existe un pico de producción de auxinas
tanto en los aquenios como en el receptáculo; luego el contenido de auxinas libres
disminuye rápidamente en el receptáculo y gradualmente en los aquenios hasta que
los frutos llegan al estadio 100 % rojo (Perkins-Veazie, 1995). La hipótesis actualmente
aceptada es que las auxinas inhiben el proceso de maduración, y que la disminución
gradual de su contenido a medida que el fruto madura sería el principal factor que
regula y acelera la velocidad de maduración en frutilla (Given y col., 1988).
Otra hormona que ha sido detectada en frutillas es el ácido abscísico, (ABA,
Figura 36). En los aquenios, la máxima concentración se detectó en el estadio maduro,
mientras que en el receptáculo se detectaron dos máximos, uno al momento de la
caída de los pétalos y otro antes del estadio maduro, 25 días después de la antesis
&DS¯WXOR,,,,QWURGXFFLµQ
(Archbold y Dennis, 1984). La aplicación exógena de esta hormona induce y acelera el
proceso de maduración en numerosos frutos (Brady, 1987). El ABA incrementa la
acumulación de azúcares en frutillas (Ofosu-Anim y Yamaki, 1994) y cerezas (Kondo y
Gemma 1993), y en estas últimas también acelera la producción de antocianinas. Es
muy poco lo que se sabe de la acción de esta hormona en el proceso de maduración de
frutilla. Se ha determinado que el tratamiento exógeno de frutillas con ABA produce
un mayor desarrollo de color rojo y un aumento en el ablandamiento de los frutos, en
asociación con un incremento en la producción de etileno (Jiang y Joyce, 2003). Dado
que también se ha observado que tratamientos con etileno en frutilla aumentan
procesos secundarios de la maduración, como el desarrollo de color y la senescencia
(Wills y Kim, 1995; Tian y col., 2000), es muy probable que los cambios observados
luego del tratamiento con ABA puedan ser atribuidos a la acción del etileno tras el
aumento en su producción como consecuencia de la aplicación de ABA exógeno (Jiang
y Joyce, 2003).
Las giberelinas también han sido detectadas en frutilla, aunque su efecto sobre
el crecimiento del fruto es menos directo que el de las auxinas (Archbold y Dennis,
1985). Se detectó un pico de actividad giberelina a los siete días post antesis (fruto
verde pequeño, en desarrollo) tanto en aquenios como en el receptáculo, siendo mayor
el contenido de hormona en los aquenios (Perkins-Veazie, 1995). En general, los
niveles de giberelinas son bajos en ambos tejidos y disminuyen aún más a medida que
avanza la maduración (Perkins-Veazie, 1995). En relación con la influencia de estas
hormonas en la maduración de frutillas, el tratamiento exógeno con ácido giberélico
(GA3) produce una inhibición general de la actividad metabólica, evidenciada por una
disminución en la respiración de frutos en estadios VG, Blanco y 25 % rojos; también
se determinó que inhiben el desarrollo de color de frutos verdes y Blancos, provocando
un retraso en la degradación de clorofilas (Martínez y col., 1994).
El posible efecto del etileno en frutos no-climatéricos se encuentra en una etapa
de revisión, dado que trabajos recientes han demostrado que estos frutos también
pueden sintetizar etileno (Tian y col., 1997; Chervin y col., 2004; Katz y col., 2004).
Asimismo, se ha estudiado la posible influencia de esta hormona en la maduración de
varios frutos pertenecientes a este grupo y se ha observado que, en algunos casos, el
etileno acelera el deterioro postcosecha (Wills y Kim, 1995).
La medida de etileno en frutillas cosechadas en distintos estadios de
maduración ha revelado que la producción de esta hormona es máxima en frutos
&DS¯WXOR,,,,QWURGXFFLµQ
verdes, disminuye marcadamente en el estadio Blanco y luego aumenta ligeramente
hasta el estadio maduro (Perkins-Veazie y col., 1995). Estudios más recientes
realizados in planta indican que en frutilla se producen dos picos de producción de
etileno, uno antes del estadio Blanco y otro en el estadio maduro (Iannetta y col.,
2006). Existen varios trabajos donde se han sometido frutillas a la acción de etileno
exógeno y/o a la aplicación de inhibidores de receptores de etileno, como el 1-MCP,
siendo los resultados informados un tanto contradictorios (Blankenship y Dole, 2003).
Los primeros trabajos determinaron que la frutilla tenía una completa insensibilidad a
la acción del etileno o a inhibidores de su acción (Given y col., 1988). Sin embargo,
otros reportes indicaron que el etileno aumenta el ablandamiento y reduce la vida
postcosecha de frutilla (Wills y Kim, 1995), y que además estimula el crecimiento de
Botrytis cinerea (El-Kazzaz y col., 1983). En otros trabajos, se observó que la
aplicación de etileno no afecta la velocidad de deterioro del fruto por pudrición (Bower
y col., 2003). En el caso del uso de 1-MCP, el tratamiento de frutillas con este
inhibidor logró extender la vida postcosecha de los frutos (Jiang y col., 2001); sin
embargo, la aplicación de 1-MCP y un posterior tratamiento con etileno exógeno
produjeron efectos sobre el deterioro de los frutos dependientes de las concentraciones
de 1-MCP aplicadas y del estadio de madurez de los frutos utilizados. Se observó un
mayor desarrollo de color en frutos en estadio 50 % rojo tratados con concentraciones
de etileno mayores a 40 Pl/l, y el ablandamiento fue más marcado cuando las
concentraciones de etileno fueron mayores a 0,5 Pl/l (Tian y col., 2000). Cuando se
realizaron tratamientos con concentraciones de 1-MCP entre 5 y 15 nl/l se logró
extender la vida postcosecha de frutillas en estadio maduro aún almacenando
posteriormente los frutos en aire con etileno 0,1 Pl/l. Por el contrario, concentraciones
de 1-MCP entre 15 y 500 nl/l produjeron una acelerada pérdida de calidad
postcosecha de los frutos (Ku y col., 1999).
Además del efecto de estas y otras fitohormonas por separado en el desarrollo
de frutos, estos reguladores del crecimiento pueden interaccionar entre sí, y de esta
manera sus vías de acción pueden estar influenciándose unas a otras (Ofosu-Anim y
col., 1996; Tian y col., 1997; Ozga y Reinecke, 2003).
Como se mencionó antes, se cree que las auxinas son las hormonas más
importantes en el control de la maduración de frutilla. Se han aislado varios genes
involucrados en el proceso de maduración cuya expresión estaría regulada por
auxinas (Manning, 1994), entre los cuales se encuentran genes que codifican
proteínas involucradas en procesos metabólicos claves, incluyendo biosíntesis de
&DS¯WXOR,,,,QWURGXFFLµQ
antocianinas, degradación de pared celular, metabolismo de lípidos y sacarosa,
síntesis y degradación proteica y respiración (Manning, 1998). El empleo de
microarreglos permitió detectar variaciones en la expresión de genes que no habían
sido previamente relacionados con el desarrollo y la maduración del fruto, algunos de
los cuales están involucrados en el desarrollo vascular, la respuesta a situaciones de
estrés oxidativo y la respuesta a auxinas (Aharoni y col., 2002).
Respecto a la regulación de la expresión de genes de expansinas en frutilla y de
las posibles hormonas involucradas, la información existente es muy escasa. Un único
trabajo realizado en frutos de la variedad Chandler (Civello y col., 1999) analizó la
influencia de etileno y auxinas sobre la expresión del gen FaEXP2, y los resultados
indicarían que ninguna de estas dos fitohormonas tendría una influencia importante
en la regulación de la expresión de este gen. Por lo tanto, uno de los puntos incluidos
en este trabajo de tesis, y desarrollado en el presente capítulo, es la posible influencia
de etileno, auxinas, giberelinas y ABA sobre la expresión de los genes de expansina en
estudio.
&DS¯WXOR,,,5HVXOWDGRV
2.
Resultados
Se realizaron tratamientos sobre frutos Blancos de la variedad Camarosa
(Mat. y Mét., sección 22.1) con las hormonas ABA o ácido giberélico (GA3). Por otro
lado, para analizar el efecto de auxinas se eliminaron los aquenios de un grupo de
frutos (DEA) o se trataron frutos con la auxina sintética ácido naftalén-acético
(NAA). La influencia de estas hormonas sobre los genes de expansina se analizó por
Northern blot para FaEXP2, FaEXP4 y FaEXP6, usando sondas específicas para
cada gen (Tabla VII y Tabla VIII de Materiales y Métodos). En el caso de FaEXP1 y
FaEXP5 el análisis de expresión se realizó a través de RT-PCRs semicuantitativas.
La influencia del etileno sobre la expresión de estos genes también fue
analizada, para lo cual se realizaron tratamientos con etileno exógeno o con 1metilciclopropeno (1-MCP). El tratamiento con etileno se hizo sumergiendo frutos en
estadio VG o en estadio Blanco (B) en una solución acuosa conteniendo Ethrel
(formulado comercial de ácido 2-cloroetil-fosfónico, sustancia hidrosoluble que
ingresa al tejido vegetal y libera rápidamente etileno), y comparando con frutos
controles sumergidos en agua. Por otro lado, se utilizó 1-metilciclopropeno (1-MCP),
compuesto que se une irreversiblemente a los receptores de etileno y, por lo tanto,
bloquea su acción (Blankenship y Dole, 2003). Luego de este tratamiento, algunos
frutos fueron tratados con Ethrel y luego incubados a 24 ºC durante 40 h o 65 h.
Posteriormente, se extrajo ARN total de los frutos (Mat. y Mét., sección 3). Un
esquema explicativo del tratamiento con 1-MCP y Ethrel se muestra en la Figura 51
(Mat. y Mét., sección 22.2). Se analizaron los patrones de expresión de los genes de
expansina por RT-PCR semicuantitativa para todos los genes, excepto para FaEXP2
para el cual se utilizó Northern blot.
Para realizar las RT-PCRs semicuantitativas fue necesario determinar el perfil
de amplificación de la reacción de PCR y seleccionar un número de ciclos en el cual
la reacción ocurriera dentro del rango lineal de amplificación, donde la cantidad de
producto amplificado es proporcional a la cantidad de molde inicial presente en la
muestra. En estas condiciones, es factible comparar la expresión de los genes en
diferentes condiciones utilizando un control interno, como el gen ARNr 18S. Para
ésto se realizaron reacciones de PCR a partir de ADNc de cada una de las muestras
con los pares de cebadores correspondientes y se sacaron alícuotas cada 3 ciclos
desde el ciclo 18 al ciclo 30. Se utilizaron los cebadores NFE1-5 y NFE1-3 para
FaEXP1, el par sonda4-1 y sonda4-2 para FaEXP4, el par NFE5-5 y NFE5-3 para
amplificar FaEXP5 y los cebadores 5FaEXP6 y 3FaEXP6 para el gen FaEXP6. El
detalle de todos estos cebadores y de los programas de PCR utilizados se resume en
la Tabla VII y en la Tabla VIII, respectivamente (Mat. y Mét.).
&DS¯WXOR,,,5HVXOWDGRV
A modo de ejemplo, en la Figura 37 se muestran los perfiles obtenidos
usando la muestra Control. Cabe señalar que para la elección final del número de
ciclos, además se tomaron en cuenta los resultados de experimentos similares para
cada gen en todas las muestras (C, NAA, DEA, ABA y GA3). Se determinó que el
ciclo adecuado para FaEXP1 era el 27, para FaEXP4 era el ciclo 22, para FaEXP5 el
ciclo 25 y para FaEXP6 era el ciclo 26 (Figura 37). En el caso del gen ARNr 18S se
procedió de modo similar, pero el número de ciclos abarcó desde el 5 hasta el 30
(Figura 37). De este modo, para el ARNr 18S se seleccionó el ciclo 10 para la RTPCR semicuantitativa.
18
Ciclos
21 24 27
30
18
FaEXP1
FaEXP5
FaEXP4
FaEXP6
Ciclos
21 24 27
30
ARNr 18S
5
8
11 14 17 25 30
Ciclos
Figura 37: Perfil de amplificación de los genes FaEXP1, FaEXP4, FaEXP5, FaEXP6 y ARNr 18S. Se
usaron cebadores específicos para cada gen y se amplificó por PCR el fragmento de ADNc
correspondiente luego de realizar RT de las muestras de tratamientos con hormonas. Los
fragmentos amplificados se analizaron en geles de agarosa y se transfirieron a membranas de
nylon, que fueron hibridizadas con sondas específicas para cada gen de expansina o para el ARNr
18S de frutilla. Se muestran los resultados obtenidos con la muestra Control.
2.1.
Tratamientos con auxinas, ABA y GA3
Expresión de FaEXP1
En la Figura 38 A se muestra la expresión del gen FaEXP1 por RT-PCR
semicuantitativa en frutos tratados con las hormonas ABA, GA3 y auxinas por
tratamiento exógeno con NAA y por eliminación de los aquenios (DEA). Se observa
una expresión menor de este gen en frutos tratados con NAA, ABA y GA3, mientras
que en frutos deaquenados los niveles de expresión permanecen similares a los de
los frutos control (C).
&DS¯WXOR,,,5HVXOWDGRV
Expresión de FaEXP2
Los tratamientos con auxinas y GA3 afectaron la expresión de FaEXP2
(Figura 38 B). Tras el tratamiento con auxinas exógenas (NAA) la expresión
disminuye, y en frutos sin aquenios (DEA) la expresión aumenta en comparación
con la expresión en frutos Controles (C); por lo tanto, la presencia de auxinas
regularía negativamente la expresión de este gen. Una disminución en la expresión
se observó también en frutos tratados con GA3. El tratamiento con ABA
aparentemente no afectó la expresión de FaEXP2 con respecto al Control.
Expresión de FaEXP4
La expresión de FaEXP4 también estaría influenciada por auxinas (Figura 38
C). Estas hormonas regularían negativamente la expresión de este gen, ya que la
deaquenación (DEA) de frutos produjo un aumento en la expresión, mientras que el
agregado de NAA exógeno provocó una disminución de su expresión en relación al
Control. En el caso de ABA, se detectó un nivel de expresión similar en frutos
tratados (ABA) y en controles (C) (si bien se observa una señal levemente mayor en
frutos tratados, la cantidad de ARN total en dicha calle es también mayor que en el
control). Respecto al tratamiento con GA3, los niveles de FaEXP4 detectados en
frutos tratados fueron similares a los del Control (C).
Expresión de FaEXP5
A diferencia de los genes analizados hasta ahora, la expresión de FaEXP5 no
mostró diferencias con los Controles (C) tras el tratamiento con auxinas, ya sea por
tratamiento exógeno con NAA o por eliminación de los aquenios (DEA). Tampoco en
frutos tratados con ABA se detectó un nivel de expresión distinto que en los frutos
Control. En cambio, el tratamiento con GA3 provocó la disminución de la expresión
de FaEXP5 con respecto al Control (Figura 38 D).
Expresión de FaEXP6
La disminución de auxinas por deaquenación de frutos (DEA) aumentó
levemente la expresión del gen FaEXP6 con respecto al Control (C), pero la
aplicación de NAA no afectó aparentemente la expresión de este gen. También se
observó un aumento leve en la expresión de este gen en frutos tratados con ABA y
GA3 (Figura 38 E).
&DS¯WXOR,,,5HVXOWDGRV
(A)
C
DEA NAA
(B)
ABA GA3
C
DEA NAA
ABA GA3
FaEXP2
FaEXP1
ARNr 18S
ARNr 18S
(C)
C
DEA NAA
ABA GA3
FaEXP4
ARN total
(D)
C
DEA NAA ABA
GA3
(E)
FaEXP5
FaEXP6
ARNr 18S
ARN total
C
DEA NAA ABA
GA3
Figura 38: Influencia de ABA, GA3 y auxinas sobre la expresión de los genes de expansina: El
análisis de los reguladores del crecimiento se hizo sobre frutos Blancos de la variedad Camarosa.
Se analizó la influencia de las hormonas GA3 y ABA aplicadas exógenamente en concentración 1
mM, y de auxinas por deaquenación de frutos (DEA) o por tratamiento con NAA 1 mM. Para el
análisis por RT-PCR semicuantitativa se realizaron RTs a partir de ARN total de cada muestra y se
hicieron amplificaciones por PCR con cebadores específicos para FaEXP1 durante 27 ciclos (panel
A); para FaEXP5 durante 25 ciclos (panel D) y para el ARNr 18S durante 10 ciclos como control
interno (paneles A y D). Se corrieron geles con los productos de amplificación, se transfirieron a
membranas de nylon y se hibridaron con sondas específicas para cada gen, marcadas
radiactivamente. La expresión de FaEXP2 se analizó por Northern-blot, usando sondas radiactivas
específicas para FaEXP2 o ARNr 18S (panel B); la expresión de FaEXP4 (panel C) y de FaEXP6
(panel E) se analizó también por Northern-blot con sondas específicas para cada uno de los genes y
como control de carga se utilizó la tinción con bromuro de etidio del gel transferido.
2.2.
Tratamiento con etileno y 1-MCP
Se determinó la influencia del etileno sobre la expresión de genes de
expansina en frutos en estadio VG o B de la variedad Camarosa, para lo cual se
realizaron tratamientos con Ethrel (ácido 2-cloroetil-fosfónico) (Figura 39). En otra
tanda de experimentos complementarios, se realizaron tratamientos con 1-MCP o
con 1-MCP y Ethrel en frutos en estadio VG (Figura 40).
&DS¯WXOR,,,5HVXOWDGRV
2.2.1 Expresión de los genes de expansina y etileno.
En la Figura 39 A, B, C, D y E se muestra la expresión de los genes FaEXP1,
FaEXP2, FaEXP4, FaEXP5 y FaEXP6, respectivamente, tras el tratamiento con
Ethrel en frutos VG (CEV: control y EV: tratado con Ethrel) o en frutos B (CEB:
control y EB: tratado con Ethrel).
A
B
D
C
E
Figura 39: Tratamiento con Ethrel y expresión de expansinas. Se analizó la influencia del etileno
sobre la expresión de los genes de expansina en frutos en estadio verde grande tratados con Ethrel
(EV) y blancos tratados con Ethrel (EB) con respecto a frutos Control sin tratar (CEV o CEB,
respectivamente), luego de incubar a 24 ºC durante 48 h.
Las RT-PCRs semicuantitativas se realizaron con cebadores específicos, los fragmentos
amplificados se analizaron en geles de agarosa y se transfirieron a membranas de nylon, que
fueron hibridizadas con sondas específicas para cada gen de expansina o para el ARNr 18S de
frutilla. A: FaEXP1, B: FaEXP2, C: FaEXP4, D: FaEXP5, E: FaEXP6.
La expresión de FaEXP1 no habría sido afectada cuando se trataron frutos en
estadio VG, mientras que en frutos Blancos tratados con Ethrel la expresión de este
gen fue menor que en los controles (Figura 39 A).
La expresión de los genes FaEXP2 y FaEXP4 no fue visiblemente afectada por
el Ethrel, tanto en los tratamientos realizados sobre frutos en estadio VG como en
los realizados sobre frutos en estadio Blanco (Figuras 39 B y C).
En el caso de los genes FaEXP5 y FaEXP6, la expresión en frutos VG y en
frutos Blancos tratados con Ethrel fue menor que en los controles, aunque en
ambos casos la disminución fue más marcada en el estadio Blanco.
2.2.2 Expresión de los genes de expansina y tratamiento con 1-MCP-Ethrel
Frutos en estadio VG se trataron durante 10 h solo con 1-MCP o con 1-MCP
y posteriormente con Ethrel (ver Mat. y Mét., sección 22.2, Figura 51) y se
incubaron durante 40 h o 65 h a 24 ºC (se indica como 50 h o 75 h en la Figura 40,
&DS¯WXOR,,,5HVXOWDGRV
representando las 10 h de tratamiento con 1-MCP seguidas de 40 o 65 h de
incubación, respectivamente). Se analizó la expresión de los genes de expansina en
estudio, y los resultados obtenidos se resumen en la Figura 40.
A
B
C
D
E
Figura 40: Tratamiento con 1-MCP y Ethrel y expresión de expansinas. Un grupo de frutos VG
fue Control (CM) de frutos tratados solo con 1-MCP (M) durante 10 h o con 1-MCP durante 10 h
y luego con Ethrel (ME) e incubados a 24 ºC durante 40 h (50 h en total, indicado en la parte
superior) o incubados durante 65 h (75 h, indicado en la parte superior). Los fragmentos
amplificados por RT-PCR semicuantitativa de cada gen de expansina (FaEXP1, FaEXP4, FaEXP5
y FaEXP6) o del ARNr 18S se analizaron en un gel, se transfirieron a membranas de nylon y se
hibridaron con una sonda marcada radiactivamente específica para cada gen. En el caso de
FaEXP2 el análisis se realizó por Northern-blot; se transfirieron cantidades iguales de ARN total
de cada muestra a una membrana de nylon, se hibridó con una sonda específica para este gen y
luego con una sonda para el ARNr 18S. A: FaEXP1, B: FaEXP2, C: FaEXP4, D: FaEXP5, E:
FaEXP6.
Los resultados para el gen FaEXP1 se muestran en la parte A de la Figura 40.
En los frutos incubados durante 40 h a 24 ºC se observó un leve aumento de
expresión de este gen en los frutos tratados con 1-MCP (M) con respecto a los frutos
control (CM), y luego una disminución con respecto a los frutos M en el grupo
&DS¯WXOR,,,5HVXOWDGRV
tratado primero con 1-MCP y luego con Ethrel (ME). Cuando los frutos se incubaron
por 65 h el aumento en la expresión de este gen en frutos tratados con 1-MCP (M)
fue más marcado con respecto al control (CM), y la expresión en frutos tratados
tanto con 1-MCP y con Ethrel (ME) nuevamente disminuyó con respecto a los frutos
tratados solo con 1-MCP (M).
La expresión de los genes FaEXP2 y FaEXP4 luego de los tratamientos se
muestran en la Figura 40 B y C respectivamente. Se puede ver que tanto luego de
40 h o de 65 h de incubación, la expresión de estos genes en los frutos control (CM)
presenta niveles similares a los detectados en los frutos tratados con 1-MCP (M) o
con 1-MCP y Ethrel (ME).
La expresión del gen FaEXP5 (Figura 40 D) mostró un patrón de variación
similar al de FaEXP1 (Figura 40 A). En frutos incubados durante 40 h se observó
un aumento en los frutos tratados con 1-MCP (M) en relación a la expresión en
frutos control (CM), con una disminución de la expresión en frutos tratados con 1MCP y Ethrel (ME), con respecto a M. Cuando los frutos se incubaron durante 65 h,
la expresión en frutos M y ME mostraron niveles similares, que a su vez son
mayores que la expresión detectada en el control (CM).
La expresión de FaEXP6 (Figura 40 E) se incrementó en los frutos tratados
con 1-MCP (M) incubados durante 40 h o 65 h con respecto a sus respectivos
controles (CM); a su vez, el tratamiento posterior con Ethrel (ME) redujo el nivel de
expresión en comparación con los tratados únicamente con 1-MCP (M), lo cual fue
observado en frutos incubados tanto durante 40 o 65 h.
&DS¯WXOR,,,'LVFXVLµQ
3.
Discusión
La presencia de un elevado número de genes de expansina es un rasgo
característico de las especies vegetales en las que se los ha estudiado (Cosgrove,
2000). Una de las hipótesis acerca de las razones de la gran cantidad de genes de
expansina sugiere que la expresión de los mismos es redundante, con lo cual su
expresión se solaparía en ciertos casos (Brummell y col., 1999b). Esta redundancia
en la expresión se ha detectado en frutilla a través del análisis en distintas
variedades durante la maduración (Capítulo I; Harrison y col., 2001; Dotto y col.,
2006). De todas maneras, la regulación podría ser diferente para cada gen en
cuestión (ver Capítulo I-Discusión). En este sentido, los resultados expuestos en el
presente Capítulo indicarían que los genes analizados varían su expresión de
diferente manera en frutos sometidos a tratamientos con distintos reguladores de
crecimiento. Esto sugiere que el efecto causado por las hormonas, y por lo tanto la
regulación de la expresión, sería diferente para cada gen.
En la Tabla VI se resumen los resultados de la influencia de los tratamientos
con hormonas sobre la expresión de los genes de expansina, presentados en la
Figura 38. Del análisis en conjunto de esta figura puede verse que la aplicación de
auxinas exógenas (NAA) resulta en una clara disminución de la expresión de los
genes de FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP4. No afecta la expresión de FaEXP5 y
posiblemente tampoco la de FaEXP6, aunque la señal en la muestra control (C) es
muy débil y dificulta la interpretación de los resultados. Esta regulación negativa
por la presencia de auxinas se correlaciona con los patrones de expresión
observados para estos genes durante la maduración de frutos de Camarosa (Figuras
18 a 22 del Capítulo I). En dicha variedad ninguno de estos genes presenta una
expresión importante en el estadio VG, que es donde se ha detectado un máximo en
la producción de auxinas (Perkins-Veazie, 1995), con lo cual probablemente el alto
contenido de estas hormonas en el fruto tendría relación con el bajo nivel de
expresión de FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP4. Quizás también las auxinas estén
influyendo en el patrón de expresión de FaEXP6, ya que en la Figura 38 E se
observa un leve aumento en la expresión en frutos sin aquenios (principal fuente
endógena de auxinas), lo cual indicaría que la disminución en el contenido de
auxinas produce un aumento en la expresión de este gen. Algo similar es lo que
ocurriría en el fruto al pasar del estadio VG, donde hay alto contenido de auxinas,
al estadio Blanco donde el contenido de esta hormona es menor. De este modo, el
aumento de expresión del gen FaEXP6 entre estos dos estadios de madurez (Figura
22 del Capítulo I) podría estar también influenciado por el contenido de auxinas del
fruto. Por último, la expresión del gen FaEXP5 no varió en respuesta a los
&DS¯WXOR,,,'LVFXVLµQ
tratamientos con auxinas (NAA o DEA), pero sí disminuyó en frutos tratados con
GA3. Si bien las cantidades de giberelinas presentes en el fruto son muy bajas,
existe un pico de producción en el estadio verde (Perkins-Veazie, 1995), con lo cual
es posible que el mayor contenido de esta hormona en el estadio verde esté
reprimiendo la expresión del gen FaEXP5 (Figura 21 del Capítulo I), y que la
disminución de la cantidad de giberelinas en estadios posteriores induzca el
aumento de su expresión. Nótese que el tratamiento con GA3 también afecta
negativamente la expresión de FaEXP1 y de FaEXP2 (Figura 32), por lo que la
presencia de esta hormona en frutos verdes también podría contribuir, junto con
las auxinas, a la baja expresión de estos genes en el estadio VG (Figuras 18 y 19 del
Capítulo I).
Es interesante destacar que en el promotor de FaEXP2 (Capítulo II) se predijo
un elemento de respuesta a giberelinas (GARE, Figura 28), así como sitios de unión
de factores DOF y una caja de Pirimidinas, que también han sido relacionados con
la respuesta a estas hormonas (Mena y col., 2002), lo cual es consistente con la
disminución en la expresión de este gen luego del tratamiento con GA3.
Tabla VI
Tratamientos con hormonas y expresión de expansinas
AUXINAS
ABA
GA3
DEA
NAA
FaEXP1
-
FaEXP2
-
FaEXP4
-
-
FaEXP5
-
-
-
FaEXP6
-
: la expresión del gen aumenta con respecto al control luego del tratamiento con la hormona indicada
: la expresión del gen disminuye con respecto al control luego del tratamiento con la hormona indicada
-: la expresión del gen no varía con respecto al control luego del tratamiento con la hormona indicada
En frutos tratados con ABA, disminuyó la expresión del gen FaEXP1;
aumentó levemente la expresión de FaEXP6, mientras que no se afectó la expresión
de FaEXP2, FaEXP4 y FaEXP5. Considerando que el contenido endógeno de ABA es
máximo en frutos maduros (Archbold y Dennis, 1984), es probable que esta
hormona no tenga un rol importante en los estadios iniciales de la maduración.
&DS¯WXOR,,,'LVFXVLµQ
Dado que los genes de expansina para los que se vio un efecto de esta hormona se
expresan en otras partes de la planta además del fruto (Figura 16 del Capítulo I;
Harrison y col., 2001; Dotto y col., 2006), es posible que la influencia del ABA sobre
la expresión de FaEXP1 y FaEXP6 sea más relevante en otros tejidos de la planta.
También se detectó un elemento de respuesta a ABA (ABRE, Figura 28 del
Cap. II) en el promotor de FaEXP2. Sin embargo el tratamiento con esta hormona
no afectó su expresión (Figura 38 B). Como se mencionó en el Capítulo II, la
predicción de elementos reguladores en cis da lugar a sitios potencialmente
reguladores, pero en general su funcionalidad depende, como es el caso de los
ABRE, del entorno en que se encuentra dicha secuencia. Probablemente en este
caso el sitio predicho no sea funcional por no encontrarse en el entorno adecuado.
El
1-MCP
inhibe
la
acción
del
etileno
en
plantas
a
muy
bajas
concentraciones, del orden de nl/l (Sisler y col., 1996), y extiende la vida
postcosecha de muchos vegetales y frutos, particularmente del tipo climatérico
(Blankenship y Dole, 2003).
En frutilla, diversos tratamientos con etileno exógeno y/o con 1-MCP han
llevado a algunos autores a proponer que frutos en diferentes estadios de
maduración presentarían diferentes niveles de sensibilidad al etileno exógeno.
Además, los diversos cambios que se producen durante la maduración (por ejemplo:
cambios de color, ablandamiento, variación en el contenido de sólidos solubles, etc.)
podrían estar regulados por etileno, pero requerirían diferentes niveles umbral de
esta hormona (Tian y col., 2000).
La existencia de receptores de etileno en frutilla fue demostrada hace un par
de años (Trainotti y col., 2005). En dicho trabajo se aislaron tres ADNc de
receptores de etileno, FaEtr1, FaEtr2 y FaErs2 que resultaron ser homólogos a
receptores caracterizados previamente en Arabidopsis. También se aislaron en
dicho trabajo dos ADNc de genes involucrados en la biosíntesis de etileno, FaACO1
y FaACO2, que codifican para proteínas que presentan homología a enzimas 1aminociclopropano-1-carboxilato oxidasa (ACO) de durazno (Ruperti y col., 2001).
Se encontró una buena correlación entre la expresión de estos cinco genes durante
la maduración con datos previos de producción de etileno en frutilla. También se
destaca en dicho trabajo que el receptor mayoritario durante la maduración es
FaEtr2, un receptor tipo II con un dominio degenerado histidina quinasa, y que
dicho receptor requeriría muy pequeñas cantidades de etileno para producir la
transducción de la señal. La presencia de un receptor de etileno de alta afinidad en
&DS¯WXOR,,,'LVFXVLµQ
frutilla es coherente con la baja producción de la hormona en este fruto, que es 20 2000 veces menor que la existente en frutos climatéricos (Ianetta y col., 2006).
Los resultados mostrados en la Figura 39 indican que el etileno podría tener
un efecto como regulador de la expresión de los genes de expansina FaEXP1,
FaEXP5 y FaEXP6, mientras que la expresión de FaEXP2 y FaEXP4 no sería
afectada por la aplicación de etileno exógeno. El efecto sobre la expresión fue más
notorio cuando el tratamiento se realizó sobre frutos en estadio Blanco, donde se
observa disminución de la expresión de FaEXP1 mientras que no se detectaron
diferencias en tratamientos realizados en frutos VG (Figura 39 A). Del mismo modo,
la disminución en la expresión de FaEXP5 y FaEXP6 fue más notoria cuando los
tratamientos se realizaron sobre frutos Blancos, si bien para estos genes también se
observó una leve disminución en experimentos realizados con frutos VG (Figuras 39
D y E). Según los patrones de expresión de los receptores de etileno de frutilla
conocidos hasta el momento (Trainotti y col., 2005), la expresión de FaEtr1 y
FaErs2 es baja en frutos VG, mientras que la de FaEtr2 es aproximadamente el
doble que la de los dos anteriores en este mismo estadio. Sin embargo, la expresión
de FaEtr1 y FaEtr2 aumenta notablemente cuando los frutos se encuentran en
estadio Blanco. Estas diferencias en la expresión de los receptores de etileno
podrían correlacionarse con los efectos observados en la Figura 39: la expresión del
gen FaEXP1 no se afecta, y la de FaEXP5 y FaEXP6 disminuye levemente,
posiblemente por la baja expresión de receptores de etileno en el estadio VG. Al
aumentar considerablemente la expresión de estos receptores en frutos Blancos, el
etileno exógeno puede ser entonces percibido por los frutos y producir una notoria
reducción de los niveles de expresión de estos tres genes.
Cuando se analizó el efecto del 1-MCP sobre la expresión de los genes de
expansina, tampoco se observaron diferencias para los genes FaEXP2 y FaEXP4,
reforzando la hipótesis de que la expresión de los mismos no está influenciada por
etileno. Por el contrario, este tratamiento modificó el nivel de expresión de los genes
FaEXP1, FaEXP5 y FaEXP6 (Figura 40). El aumento detectado en la expresión de
estos genes en frutos tratados con 1-MCP (M) con respecto a sus respectivos
controles (CM) está de acuerdo con los experimentos realizados con etileno exógeno,
sustentando la idea de que el etileno podría estar reprimiendo la expresión de estos
tres genes de expansinas en frutilla. De este modo, el tratamiento de frutos VG con
1-MCP bloquea los receptores de etileno impidiendo su percepción, lo cual
permitiría que los genes de las expansinas FaEXP1, FaEXP5 y FaEXP6 se expresen
a un nivel mayor que en los frutos controles.
&DS¯WXOR,,,'LVFXVLµQ
La expresión de los genes FaEXP1, FaEXP5 y FaEXP6 fue menor en los frutos
tratados con 1-MCP y luego con Ethrel (ME), en relación a los frutos tratados solo
con 1-MCP (M), a pesar de que ambos grupos de frutos tendrían sus receptores de
etileno inhibidos por el 1-MCP. Dado que el 1-MCP inhibe los receptores al unirse a
ellos de modo irreversible, se cree que los frutos tratados con este inhibidor
recuperan su capacidad de percibir al etileno a medida que se sintetizan nuevos
receptores (Blankenship y Dole, 2003). Asimismo, cabe la posibilidad de que la
aplicación de 1-MCP no haya bloqueado la totalidad de los sitios disponibles
(Watkins y col., 2000). En frutilla no existe aún información acerca de las
velocidades de degradación y síntesis de receptores de etileno. Es posible que la
disminución de la expresión de FaEXP5 y FaEXP6, observada 40 h y 65 h después
del tratamiento con 1-MCP, se deba a la regeneración de nuevos sitios receptores de
etileno, o a que el 1-MCP aplicado no haya inhibido la totalidad de los sitios
disponibles, con la consecuente percepción del etileno exógeno y su efecto sobre la
expresión génica.
Si bien el etileno generalmente activa la expresión de genes asociados a la
degradación de pared, existe un trabajo en frutilla donde se describe la represión de
la expresión de uno de estos genes por efecto del etileno (Castillejo y col., 2004). En
dicho trabajo se observó una disminución de la expresión del gen FaPE1 en frutos
maduros y senescentes luego de la aplicación de etileno exógeno.
Por último, los resultados expuestos para FaEXP2 luego de los tratamientos
realizados indican que su expresión varía con el tratamiento de auxinas, lo cual no
está totalmente de acuerdo con lo determinado previamente por Civello y col.
(1999). En dicho trabajo se concluyó que la expresión de este gen no estaba
fuertemente influenciada por auxinas, debido a que la expresión en frutos
deaquenados no variaba con respecto al control con aquenios, pero sí se observó
una ligera disminución de la expresión tras el tratamiento con NAA, lo cual coincide
con los experimentos realizados en esta tesis, tal como se muestra en la Figura 38
B.
Probablemente, las diferencias en la respuesta a auxinas estén relacionadas
con las distintas variedades de frutilla utilizadas en cada caso, ya que en el trabajo
mencionado se usaron frutos de la variedad Chandler y en este trabajo se usaron
frutos de Camarosa. Se ha comprobado (Capítulo I) que la expresión de éstos y
otros genes puede variar significativamente en distintas variedades, probablemente
a causa de un conjunto de factores (diferente contenido de reguladores del
crecimiento, elementos involucrados en mecanismos de transducción de señales,
&DS¯WXOR,,,'LVFXVLµQ
etc.) que difieren entre variedades y que dan origen a los diferentes patrones de
expresión observados.
Cabe señalar que en la predicción de elementos reguladores en cis del
promotor de FaEXP2 no se detectaron elementos relacionados con la regulación por
auxinas (Figura 28, Tabla IV, Cap. II). Sin embargo, como se mencionó en el
Capítulo II, el fragmento obtenido es relativamente pequeño, por lo que podrían
encontrarse sitios relacionados con respuesta a auxinas en la región promotora aún
no conocida.
En cuanto al efecto del etileno sobre la expresión de FaEXP2, Civello y col.
(1999) tampoco observaron diferencias en la expresión de este gen entre frutos de la
variedad Chandler controles y tratados con etileno, lo cual está de acuerdo con el
resultado mostrado en la Figura 39 B; ambos resultados refuerzan la idea de que la
expresión de esta expansina no es afectada por el etileno.
&DS¯WXOR,9,QWURGXFFLµQ
CAPÍTULO IV
1.
Introducción
El rápido progreso de la maduración, la senescencia, el daño y las
infecciones producidas por insectos, bacterias y hongos son factores determinantes
de las numerosas pérdidas, tanto cuantitativas como cualitativas, durante la
postcosecha de frutos (Civello y col., 2007). Uno de los principales objetivos de la
tecnología postcosecha es controlar estos factores con el fin de mantener la calidad
de los frutos y extender su vida postcosecha. El uso de agroquímicos ha sido
ampliamente usado con el objetivo de minimizar las pérdidas producidas por pestes
y enfermedades. Sin embargo, en los últimos años el uso de muchos de estos
compuestos ha sido cuestionado debido al riesgo potencial de los residuos de
pesticidas sobre la salud humana y de los riesgos ambientales asociados al uso de
algunos productos sintéticos.
En las últimas dos décadas se han hecho numerosos esfuerzos en identificar
y desarrollar tecnologías menos riesgosas, como es el caso de los tratamientos
físicos, que incluye el uso de atmósferas controladas o modificadas (Kader y col.,
1989), tratamientos térmicos (Lurie, 1998a) y exposición a diferentes fuentes de
radiación ionizante y no ionizante (Phillips, 1996; Andrews y col., 1998; Bintsis y
col., 2000).
Los Tratamientos Térmicos de Alta Temperatura (TAT), o simplemente
Tratamientos
Térmicos,
han
sido
ampliamente
estudiados
como
posibles
tecnologías de conservación para extender la vida postcosecha de frutas y vegetales.
Se han utilizado para controlar pestes provocadas por insectos, para evitar el
decaimiento de frutos por infecciones fúngicas y para retrasar la maduración
(Vicente y col., 2002).
Existen diversas metodologías de Tratamientos Térmicos. En muchos casos
se ha utilizado la inmersión de los frutos en agua a alta temperatura durante cortos
períodos de tiempo, generalmente unos pocos minutos (Lurie, 1998b). El modo de
acción primario de los tratamientos con agua caliente sería la desinfección de los
productos tratados debido a la eliminación de esporas de su superficie y de
infecciones latentes presentes en las capas internas de la superficie del producto.
Además, en algunas especies como cebada (Schweizer y col., 1995), pepino (Stermer
y Hammerschmidt, 1984) o uvas (Pavoncello y col., 2001) se ha reportado un
aumento en la resistencia contra posteriores inoculaciones con patógenos.
&DS¯WXOR,9,QWURGXFFLµQ
Otro tipo de TAT es el tratamiento con aire caliente durante períodos
prolongados (desde algunas horas hasta días). En tomates, se ha observado que
frutos tratados con aire caliente a 38 ºC durante dos o tres días son más resistentes
a la infección con Botrytis cinerea (Lurie y col., 1997). En manzanas, este tipo de
tratamientos redujo el desarrollo de Penicillium expansum (Fallik y col., 1996).
También se ha estudiado el efecto de los Tratamientos Térmicos sobre otros
aspectos relacionados con la maduración y vida postcosecha de diversos frutos. Se
ha observado un retraso en el ablandamiento, modificaciones en la producción de
etileno en frutos climatéricos, retraso en el desarrollo de color y modificaciones en
la abundancia de enzimas asociadas a la degradación de pared celular (Paull,
1990).
Particularmente en frutilla, se han realizado diferentes tipos de tratamientos
térmicos y se han analizado sus efectos sobre diversos aspectos de la conservación
y el metabolismo del fruto. García y col. (1995), trataron frutillas por inmersión en
agua caliente a 45 ºC y observaron una disminución en el decaimiento de los frutos,
un aumento en el contenido de sólidos solubles y una disminución de la acidez
titulable, mejorando así algunos de los factores claves relacionados con la
aceptación sensorial por parte de consumidores.
El tratamiento de frutillas con aire caliente a 42 ºC o a 48 ºC durante 3 h
también provocó un retraso en la maduración y una disminución en el decaimiento
de los frutos producido por hongos, así como también un retraso en el
ablandamiento, disminución en la actividad PAL (fenilalanina-amonio liasa, enzima
involucrada en la síntesis de antocianinas) y disminución de la síntesis de proteínas
(Civello y col., 1997).
Más recientemente, se analizó la influencia de estos tratamientos sobre la
firmeza, el contenido de pared celular y la actividad de enzimas relacionadas a la
degradación de pared celular en la zona externa e interna de frutillas (Vicente y col.,
2005). Se determinó que los frutos tratados presentaban mayor firmeza que los
controles y que la actividad de las enzimas ensayadas (EGs, PGs, E-xilosidasa y Egalactosidasa) disminuía en frutos tratados, mientras que la actividad de PME
aumentaba después de un día de incubación a 20 ºC. El tratamiento también afectó
el metabolismo de pectinas y hemicelulosas.
Finalmente, se analizó la influencia del tratamiento con aire caliente a 45 ºC
en frutillas en estadio blanco sobre la expresión de genes asociados a la
degradación de pared celular y la actividad de las enzimas correspondientes,
incluido el gen FaEXP2, y se determinó que existen diferencias en la expresión y las
actividades ensayadas entre frutos tratados y controles (Martínez y Civello, en
&DS¯WXOR,9,QWURGXFFLµQ
prensa). Hasta el momento, ese es el único reporte en relación al análisis de
expresión de genes de frutilla en respuesta al tratamiento térmico.
La irradiación con UV-C ha sido también aplicada a frutos y vegetales como
tecnología postcosecha. Este tipo de tratamiento consiste en la exposición de los
productos de interés por un determinado período de tiempo, en general breve, bajo
un banco de lámparas UV con una emisión máxima a 254 nm. Este tratamiento se
ha estudiado principalmente en relación al efecto germicida de esta radiación, y a la
posibilidad de controlar las enfermedades postcosecha. La irradiación UV-C ha
resultado ser muy útil para reducir el decaimiento, mantener la calidad (o incluso
mejorarla dado su efecto sobre la síntesis de pigmentos y otros compuestos) y
extender la vida postcosecha de frutos y vegetales (Stevens y col., 1997; Baka y col.,
1999). Sin embargo, los efectos de la radiación UV no solo están asociados a sus
propiedades germicidas, sino también a las modificaciones fisiológicas que provoca
en los productos irradiados (Maharaj y col., 1999; Nigro y col., 2000). Es conocido
que los organismos vivos expuestos a un estrés moderado, tal como una dosis no
letal de UV-C, desarrollan respuestas fisiológicas que los convierten en organismos
más resistentes a un posterior estrés (Ben-Yehoshua y col., 1992; Stevens y col.,
1997; Stevens y col., 1998). La generación de un efecto benéfico a través de la
aplicación de bajas dosis de un agente dañino ha sido definida como hormesis
(Shama y Alderson, 2005). En este concepto, junto con las propiedades germicidas
de esta radiación, se basa el uso del UV-C en dosis hórmicas para mejorar la
conservación postcosecha de frutos y vegetales.
Se ha reportado que el tratamiento con UV-C ha sido efectivo para controlar
el decaimiento de frutos causado por diversos patógenos, como Monilinia fructicola
en duraznos (Stevens y col., 1998), Botritys cinerea en uvas (Nigro y col., 1998),
Penicillium digitatum en mandarinas (Kinay y col., 2005) y Rhizopus stolonifer en
tomate (Stevens y col., 2004).
También se observó que este tratamiento modifica varios aspectos asociados
a la maduración, aunque los resultados son muy variables dependiendo
generalmente del tipo de fruto, el estadio de madurez, la época de cosecha y la dosis
aplicada. Dentro de estos efectos, se puede mencionar un retraso de la maduración
en boysenberry (Vicente y col., 2004), reducción de ésteres volátiles y aumento en la
producción de terpenoides en melón (Lamikanra y col., 2002), y retraso en el
desarrollo de color y en el ablandamiento en tomate (Maharaj y col., 1999; Stevens
y col., 2004). También se ha reportado una disminución en la actividad de enzimas
&DS¯WXOR,9,QWURGXFFLµQ
asociadas a la degradación de pared en tomate (Barka y col., 2000; Stevens y col.,
2004).
Particularmente en frutilla, se ha determinado que el tratamiento con UV-C
disminuye la respiración, retrasa el ablandamiento y aumenta el contenido de
antocianinas con dosis aplicadas entre 0,25 y 1 kJ m-2 (Baka y col., 1999), o un
retraso en el ablandamiento y en la acumulación de antocianinas con dosis de 4,1
kJ m-2 (Pan y col., 2004). También se detectó un aumento en la producción de
etileno (Nigro y col., 2000).
Por un lado, el efecto de estos dos tratamientos físicos (UV-C y Tratamiento
Térmico) sobre el ablandamiento del fruto y por el otro, la significativa contribución
de las expansinas en dicho proceso han sido comprobados en distintos sistemas
(Brummell y col., 1999a; Hayama y col., 2003). Sin embargo, la información acerca
de la influencia de dichos tratamientos físicos sobre la expresión de genes en
general y, en particular, sobre la expresión de genes de expansina es muy escasa,
por lo cual se decidió analizar los patrones de expresión de los cinco genes en
estudio en frutos controles y tratados con aire a 45 ºC, y los patrones de expresión
de los genes FaEXP2, FaEXP4 y FaEXP5 en frutos controles y tratados con UV-C.
Esto último se realizó en colaboración con la Lic. Marina Pombo como parte de su
trabajo de tesis doctoral.
En el estudio de la aplicación de tratamientos físicos y de su efecto sobre la
expresión de genes de expansina y otros genes relacionados a la degradación de la
pared celular, (Martínez y Civello, en prensa), se detectó un aumento en la
expresión de varios de estos genes pocas horas después de la cosecha en los frutos
controles (no tratados).
Las plantas son organismos que han desarrollado la capacidad de hacer a
cada célula capaz de activar los mecanismos de defensa en respuesta a los distintos
tipos de daño a los que están expuestas, ya sea daño mecánico o provocado por
insectos, o infecciones causadas por microorganismos patógenos. La activación de
los mecanismos de defensa depende en gran medida de la activación transcripcional
de genes, con el objetivo final de curar los tejidos dañados y activar mecanismos
que eviten un daño mayor (León y col., 2001). La hormona principal relacionada
con la respuesta a daño mecánico es el ácido jasmónico (Farmer y Ryan, 1990). Sin
embargo, se ha sugerido que otras hormonas como el etileno también podrían tener
un papel importante en este proceso (Liu y col., 1993; O'Donnell y col., 1996;
Bouquin y col., 1997).
&DS¯WXOR,9,QWURGXFFLµQ
A raíz de las observaciones mencionadas sobre la expresión de genes luego
de la cosecha, se decidió analizar si este aumento en la expresión estaba
relacionado con la producción de etileno como respuesta al daño provocado por el
corte de los frutos, para lo cual se analizó la expresión de FaEXP2, FaPGs y FaCel1
en frutos tratados con 1-MCP.
&DS¯WXOR,95HVXOWDGRV
2.
Resultados
2.1.
Tratamiento Térmico de Alta Temperatura y firmeza
Se sometieron frutillas de la variedad Camarosa recién cosechadas en estadio
75 % rojo a tratamiento con aire caliente durante 3 h a 45 ºC (Mat. y Mét., punto
23.1) y se midió la firmeza de los frutos (Mat. Y Mét, punto 2) luego de almacenarlos
a 20 ºC durante 0 h (T0); 24 h (T24) o 48 h (T48). Simultáneamente, se midió la
firmeza de frutos controles sin tratar, almacenados a 20 ºC y medidos
inmediatamente después (C0) de finalizada la aplicación del Tratamiento Térmico al
otro grupo de frutos, luego de 24 (C24) y de 48 h (C48).
En la Figura 40 se ve que los frutos Controles y Tratados no presentan
diferencias en su firmeza inmediatamente después del tratamiento (C0 y T0), pero
la firmeza de los frutos Tratados es mayor que la de los controles después de 24 h
de incubación (C24 y T24). Luego de dos días de almacenamiento la firmeza de los
dos grupos vuelve a ser similar (C48 y T48).
3,5
3
a
Control
Control
TTTT
a
Fuerza máxima (N)
2,5
b
2
a
a
a
1,5
1
0,5
0
0
24
48
Tiempo (h) a 20 ºC
Figura 40: TAT y análisis de firmeza de los frutos. Se utilizó como parámetro la fuerza máxima
aplicada al penetrar los frutos, utilizando una sonda de 3 mm de diámetro a una velocidad de 0,5
mm/s. Se usaron 20 frutos en estadio 75 % rojo de la variedad Camarosa para cada condición:
frutos tratados térmicamente (45 ºC, 3 h) y luego almacenados a 20 ºC durante 0 h, 24 h o 48 h
(Tratados, en color rojo) o frutos sin tratar (Controles, en color gris) almacenados a 20 ºC después
del tratamiento durante los mismos tiempos. Los datos fueron analizados por ANOVA y las medias
fueron comparadas por un ensayo de LSD(0,05). Distintas letras indican que la diferencia de firmeza
es significativa entre cada grupo de frutos Controles y Tratados.
&DS¯WXOR,95HVXOWDGRV
2.2
Tratamiento Térmico de Alta Temperatura y expresión de genes de
expansina
Se analizó la expresión de los genes de expansina en frutos Controles y
Tratados inmediatamente después del TAT (C0 y T0), y luego del tratamiento
seguido de los siguientes tiempos de almacenamiento a 20 ºC: 4 h (C4 y T4), 18 h
(C18 y T18), 24 h (C24 y T24) y 48 h (C48 y T48). Los patrones de expresión de los
genes se muestran en las Figuras 41 a 45. En todos los casos se muestra el análisis
de la expresión por Northern blot con una sonda específica para cada gen y el ARN
total transferido, teñido con bromuro de etidio. En la parte superior de cada figura
se representa la Cantidad Relativa de la señal de hibridación con la sonda
específica para cada gen con respecto a la intensidad de la banda superior de ARNr
correspondiente a cada muestra (calculado con el programa GelPro), para frutos
Controles (línea negra) o Tratados (línea roja) a cada uno de los tiempos de
almacenamiento (0 h, 4 h, 18 h, 24 h y 48 h).
2.2.1 Efecto sobre la expresión de FaEXP1
La expresión del gen FaEXP1 se muestra en la Figura 41. El nivel de
expresión en frutos Controles es mayor que en los Tratados al tiempo 0 (C0 y T0),
así como también en el resto de las muestras, salvo a las 24 h (C24 y T24) donde
ambas señales son de similar intensidad.
Figura 41: TAT y expresión de FaEXP1: Análisis por Northern blot de la expresión del gen
FaEXP1 en frutos Controles (sin tratar) y Tratados térmicamente, inmediatamente después del
tratamiento (C0 y T0) o después de 4 h (C4 y T4), 18 h (C18 y T18), 24 h (C24 y T24) y 48 h (C48
y T48) a 20 ºC. El ARN total de cada muestra se corrió en un gel (mostrado en la parte inferior
como control de carga) y se transfirió a una membrana de nylon que fue hibridizada con una
sonda específica para el gen FaEXP1. En la parte superior de la figura se grafica Cantidad
Relativa de la señal de hibridación obtenida con la sonda FaEXP1 con respecto a la intensidad de
la banda superior de ARNr correspondiente a cada muestra (calculado con el programa GelPro),
para frutos Controles (línea negra) o Tratados (línea roja) a las 0 h, 4 h, 18 h, 24 h o 48 h de
incubación.
&DS¯WXOR,95HVXOWDGRV
2.2.2 Efecto sobre la expresión de FaEXP2
El Tratamiento Térmico de los frutos provocó diferencias en la expresión de
FaEXP2 entre frutos Controles y Tratados (Figura 42). Las diferencias de expresión
para este gen a tiempos cortos después del tratamiento son similares a las
observadas para FaEXP1: a tiempo 0 h (C0 y T0) y 4 h (C4 y T4) los frutos Tratados
muestran menor expresión que los Controles, pero a tiempos de incubación más
largos las intensidades detectadas entre Controles y Tratados se tornan similares.
Figura 42: TAT y expresión de FaEXP2: Análisis por Northern blot de la expresión del gen
FaEXP2 en frutos Controles (sin tratar) y Tratados térmicamente, inmediatamente después del
tratamiento (C0 y T0) o después de 4 h (C4 y T4), 18 h (C18 y T18), 24 h (C24 y T24) y 48 h (C48
y T48) a 20 ºC. El ARN total de cada muestra se corrió en un gel (mostrado en la parte inferior
como control de carga) y se transfirió a una membrana de nylon que fue hibridizada con una
sonda específica para el gen FaEXP2. En la parte superior de la figura se grafica Cantidad
Relativa de la señal de hibridación obtenida con la sonda FaEXP2 con respecto a la intensidad de
la banda superior de ARNr correspondiente a cada muestra (calculado con el programa GelPro),
para frutos Controles (línea negra) o Tratados (línea roja) a las 0 h, 4 h, 18 h, 24 h o 48 h de
incubación.
2.2.3 Efecto sobre la expresión de FaEXP4
El Tratamiento Térmico afectó la expresión de FaEXP4 de manera diferente a
los dos genes anteriores. En este caso (Figura 43), inmediatamente después del
tratamiento se observó un leve aumento de la expresión en los frutos Tratados (T0)
con respecto a los Controles (C0). Luego de cuatro horas de incubación la expresión
de FaEXP4 en ambos grupos de frutos aumentó y alcanzó niveles similares en
Controles (C4) y Tratados (T4); dicho nivel se mantuvo en los frutos Tratados luego
de 18 h de almacenamiento (T18), pero disminuyó en los Controles (C18). A las 24
h de almacenamiento los niveles de expresión vuelven a ser similares (C24 y T24),
para volver a detectarse diferencias entre Controles y Tratados a las 48 h, aunque
&DS¯WXOR,95HVXOWDGRV
en este caso la cantidad de mensajero detectada en los frutos Tratados (T48) fue
menor que en los Controles (C48).
En el gráfico de la parte superior de la Figura 43 puede verse que la
expresión en los Controles tuvo un patrón de aumento-disminución-aumento
durante las 48 h de incubación, mientras que en los Tratados el patrón fue
aumento-disminución durante el mismo tiempo de incubación. Las diferencias de
expresión entre los dos grupos se detectaron a las 18 h (Tratados mayor que
Controles) y a las 48 h (Controles mayor que Tratados).
Figura 43: TAT y expresión de FaEXP4: Análisis por Northern blot de la expresión del gen
FaEXP4 en frutos Controles (sin tratar) y Tratados térmicamente, inmediatamente después del
tratamiento (C0 y T0) o después de 4 h (C4 y T4), 18 h (C18 y T18), 24 h (C24 y T24) y 48 h (C48
y T48) de almacenamiento a 20 ºC. El ARN total de cada muestra se corrió en un gel (mostrado
en la parte inferior como control de carga) y se transfirió a una membrana de nylon que fue
hibridizada con una sonda específica para el gen FaEXP4. En la parte superior de la figura se
grafica Cantidad Relativa de cada señal de hibridación con la sonda FaEXP4 con respecto a la
intensidad de la banda superior de ARNr correspondiente a cada muestra (calculado con el
programa GelPro), para frutos Controles (línea negra) o Tratados (línea roja) a las 0 h, 4 h, 18 h,
24 h o 48 h de incubación.
2.2.4 Efecto sobre la expresión de FaEXP5
La expresión de FaEXP5 también fue afectada por el TAT (Figura 44). Tanto
en frutos Controles como Tratados la expresión se mantuvo baja desde el tiempo 0
(C0 y T0) hasta las 4 h de incubación (C4 y T4). Sin embargo, la expresión en el
grupo Control se mantuvo baja hasta las 24 h (C24), con un aumento recién a las
48 h (C48), mientras que en los frutos Tratados ya a las 18 h de incubación (T18) se
pudo detectar mayor cantidad de transcripto, manteniéndose estos niveles de
expresión hasta las 24 h (T24) y produciéndose un aumento mayor a las 48 h (T48).
&DS¯WXOR,95HVXOWDGRV
Puede verse en el gráfico de la parte superior de la Figura 44 que la expresión de
FaEXP5 fue mayor en frutos Tratados entre las 18 h y 48 h de incubación.
2.2.5 Efecto sobre la expresión de FaEXP6
Finalmente, en el patrón de expresión de FaEXP6 (Figura 45) se detectaron
niveles bajos de expresión en Controles y Tratados desde el inicio de la incubación
(C0 y T0). A las 4 h se detectaron mayores niveles en ambos grupos, aunque en los
frutos Tratados la expresión fue menor (C4 y T4). Luego, hasta las 24 h de
incubación no se detectaron diferencias en la expresión en frutos Controles y
Tratados, aumentando a las 48 h la expresión en el grupo Control (C48) y
disminuyendo la del grupo Tratado (T48). En este caso, la expresión en los frutos
Tratados fue menor que en los Controles a tiempos cortos después del tratamiento,
de modo similar a lo observado para FaEXP2 (Figura 42).
Figura 44: TAT y expresión de FaEXP5: Análisis por Northern blot de la expresión del gen
FaEXP5 en frutos Controles (sin tratar) y Tratados térmicamente, inmediatamente después del
tratamiento (C0 y T0) o después de 4 h (C4 y T4), 18 h (C18 y T18), 24 h (C24 y T24) y 48 h (C48
y T48). ARN total de cada muestra se corrió en un gel (mostrado en la parte inferior como control
de carga) y se transfirió a una membrana de nylon que fue hibridizada con una sonda específica
para el gen de FaEXP5. En el gráfico de la parte superior de la figura se grafica Cantidad Relativa
de cada señal de hibridación con la sonda FaEXP5 con respecto a la intensidad de la banda
superior de ARNr correspondiente a cada muestra (calculado con el programa GelPro), para
frutos Controles (línea negra) o para frutos Tratados (línea roja) a las 0h, 4h, 18 h, 24 h o 48 h de
incubación.
&DS¯WXOR,95HVXOWDGRV
Figura 45: TAT y expresión de FaEXP6: Análisis por Northern blot de la expresión del gen
FaEXP6 en frutos Controles (sin tratar) y Tratados térmicamente, inmediatamente después del
tratamiento (C0 y T0) o después de 4 h (C4 y T4), 18 h (C18 y T18), 24 h (C24 y T24) y 48 h (C48
y T48). ARN total de cada muestra se corrió en un gel (mostrado en la parte inferior como control
de carga) y se transfirió a una membrana de nylon que fue hibridizada con una sonda específica
para el gen de FaEXP6. En el gráfico de la parte superior de la figura se grafica Cantidad Relativa
de cada señal de hibridación con la sonda FaEXP6 con respecto a la intensidad de la banda
superior de ARNr correspondiente a cada muestra (calculado con el programa GelPro), para
frutos Controles (línea negra) o para frutos Tratados (línea roja) a las 0h, 4h, 18 h, 24 h o 48 h de
incubación.
2.3
Irradiación con luz UV-C
2.3.1 Efecto de radiación UV-C sobre la firmeza del fruto
En este caso, se utilizaron frutos de la variedad Aroma en estadio 50 %, los
cuales se irradiaron con luz UV-C (Mat. y Mét., sección 23.2) o se dejaron sin tratar
y se almacenaron a 20 ºC durante 48 h, 72 h o 96 h. Al cabo de estos tiempos, se
determinó la firmeza de los frutos Controles y Tratados. La firmeza de los frutos
disminuyó durante el tiempo de almacenamiento a 20 ºC, tanto en los frutos
controles como en los irradiados (Figura 46). Sin embargo, los frutos no irradiados
(barras grises) se ablandaron más rápidamente que los tratados con UV-C (barras
violetas).
Inmediatamente
después
de
la
irradiación
no
hubo
diferencias
significativas en los valores de firmeza entre Controles y Tratados (tiempo 0), pero
después de 48 h, 72 h y 96 h de incubación los frutos Tratados resultaron más
firmes que los Controles.
&DS¯WXOR,95HVXOWDGRV
3.8
a
3.6
Fuerza máxima (N)
a
b
b
3.4
Control
UV-C
b
3.2
a
a
3.0
a
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
0
48
72
96
Tiempo (h) a 20 ºC
Figura 46: UV-C y análisis de firmeza de los frutos. Se utilizó como parámetro la fuerza máxima
aplicada al penetrar los frutos, utilizando una sonda de 3 mm de diámetro a una velocidad de
0,5 mm/s. Se usaron 30 frutos en estadio 50 % rojo de la variedad Aroma para cada condición:
frutos tratados con UV-C (4,1 kJ m-2) y luego almacenados a 20 ºC durante 0 h, 48 h, 72 h o 96
h (Tratados, en color violeta) o frutos sin irradiar (Controles, en color gris) almacenados a 20 ºC
después del tratamiento durante los mismos tiempos. Los datos fueron analizados por ANOVA y
las medias fueron comparadas por un ensayo de LSD(0,05). Distintas letras indican que la
diferencia de firmeza es significativa entre cada grupo de frutos Controles y Tratados.
2.3.2 Efecto de la radiación UV-C sobre la expresión de los genes de
expansina
La expresión de los genes de expansinas en frutos controles e irradiados se
evaluó a los siguientes tiempos de incubación a 20 ºC: 0, 4, 18, 24 y 48 h. El
análisis de la expresión mediante Northern blot de los tres genes de expansina
elegidos se muestra en la Figura 47.
Se observó que los genes FaEXP2, FaEXP4 y FaEXP5 (Figura 47 A, B y C,
respectivamente) variaron sus patrones de expresión de manera similar durante la
incubación, tanto en frutos Controles como Tratados con UV-C. En todos los casos
la expresión de los genes aumentó en los frutos Controles entre las 0 h y 4 h de
incubación, mientras que en los correspondientes frutos Tratados dicho aumento
fue menor. La diferencia en el aumento de expresión entre las 0 y 4 h entre frutos
Controles y Tratados fue más evidente para FaEXP2 y FaEXP5 (Figura 47 A y C) que
para FaEXP4 (Figura 47 B). Luego de 18 h, los niveles de expresión fueron similares
entre Controles y Tratados para FaEXP4 y FaEXP5, y levemente mayor en frutos
Tratados para FaEXP2 con respecto a los Controles. Tras 24 h de incubación la
expresión de las tres expansinas en frutos Tratados fue marcadamente mayor que
&DS¯WXOR,95HVXOWDGRV
en los Controles, y a las 48 h la expresión en frutos Tratados disminuye
considerablemente, mientras que la expresión de los frutos Controles permanece
prácticamente sin variaciones con respecto a la expresión detectada a las 24 h.
A
C0
T0
C4
T4
C18
T18 C24 T24
C0
T0
C4
T4
C18 T18
C0
T0
C4
T4
C18
C48 T48
FaEXP2
ARNr 18S
B
C24 T24
C48 T48
T18 C24 T24
C48 T48
FaEXP4
ARNr 18S
C
FaEXP5
ARNr 18S
Figura 47: UV-C y expresión de genes de expansina: Análisis por Northern blot de la expresión
de los genes FaEXP2 (parte A), FaEXP4 (parte B) y FaEXP5 (parte C). Se usaron frutos de la
variedad Aroma en estadio 50 % rojo: Controles (sin tratar) y Tratados con UV-C (4,1 kJ m-2),
incubados a 20 ºC por 0 h (C0 y T0), 4 h (C4 y T4), 18 h (C18 y T18), 24 h (C24 y T24) y 48 h
(C48 y T48). Se corrieron geles con ARN total de cada muestra y se transfirieron a membranas de
nylon, que fueron hibridizadas con una sonda específica para cada gen de expansina o para el
ARNr 18S.
2.4
Efecto del corte sobre la expresión de genes de pared
Un aspecto llamativo observado en el análisis resumido de las Figuras 41 a
45 y en la Figura 47 es el incremento de expresión de los genes de expansinas en
los controles cuatro horas después de aplicado el tratamiento. Esto sugirió la
hipótesis de que dicho incremento podría estar relacionado con el daño por el corte
producido durante la cosecha del fruto, y dado que dicho daño estaría asociado a la
producción de etileno (Liu y col., 1993; O'Donnell y col., 1996; Bouquin y col.,
1997), se decidió analizar la posible relación entre esta hormona y la expresión de
FaEXP2 y de otros genes que codifican para enzimas presentes en la pared celular
(PGs y EG).
&DS¯WXOR,95HVXOWDGRV
Para analizar si los aumentos en la expresión de estos genes pocas horas
después de la cosecha podrían estar influenciados por etileno, se cortaron frutos en
estadio 75 % rojo de plantas de frutilla (Fragaria x ananassa cv. Toyonaka) y se
trataron inmediatamente con 1-metilciclopropeno (1-MCP) durante 0 h, 2 h, 4 h y 8
h, manteniendo un grupo de frutos sin tratar como control.
Los resultados mostrados en la Figura 48 para FaEXP2 (Figura 48 A),
FaCEL1 (Figura 48 B) y poligalacturonasas (FaPGs, Figura 48 C) indican que en los
tres casos la expresión de los genes aumentó 4 h después de la cosecha en los
frutos sin tratar con 1-MCP (ver muestras indicadas como C a las 4 h, comparado
con los frutos C a las 0 h o 2 h). Este aumento de la expresión fue menos marcado
a las 4 h en los frutos tratados con 1-MCP para los genes FaCEL1 y FaPGs (Figuras
48 B y C), mientras que para FaEXP2 el tratamiento con 1-MCP redujo los niveles
de expresión luego de 8 h (Figura 48 A).
0h
A
C
2h
C
T
4h
C
8h
T
C
T
FaEXP2
ARN total
B
0h
C
FaCEL1
ARN total
2h
C
T
4h
C
8h
T
C
C
T
0h
C
2h
C
T
4h
C
8h
T
C
T
FaPGs
ARN total
Figura 48: Tratamiento con 1-MCP y expresión de genes de pared. Se analizó la influencia del
etileno en el aumento de la expresión de genes de pared pocas horas después de la cosecha de
frutos. Se cosecharon frutos de la variedad Toyonaka en estadio 75 % y se los trató
inmediatamente con 1-MCP (T) o se dejaron sin tratar (C) durante 0 h, 2 h, 4 h y 8 h. Se extrajo
ARN total de los frutos, se corrieron geles (mostrados como control de carga) y se transfirieron a
membranas de nylon, que fueron hibridizadas con sondas específicas para los genes de
expansina FaEXP2, endoglucanasa FaCEL1 y una sonda que reconoce poligalacturonasas. A:
FaEXP2, B: FaCEL1, C: FaPGs.
&DS¯WXOR,9'LVFXVLµQ
3.
Discusión
El ablandamiento producido durante la maduración y postcosecha de frutos
carnosos como la frutilla está relacionado con el desensamblaje de la pared celular
y es llevado a cabo por diversas enzimas y proteínas presentes en la pared,
incluyendo a las expansinas (Brummell y Harpster, 2001).
Entre los tratamientos físicos ensayados a escala de laboratorio para mejorar
la postcosecha de frutilla, se encuentran los Tratamientos Térmicos de Alta
Temperatura y la irradiación con UV-C. Entre otros efectos beneficiosos, se ha
observado
que
ambos
tipos
de
tratamientos
contribuyen
a
retrasar
el
ablandamiento de frutillas (Civello y col., 1997; Baka y col., 1999; Pan y col., 2004;
Vicente y col., 2005).
Este retraso en el ablandamiento ha sido observado en otros frutos, y se
produciría a través de una disminución en la actividad de enzimas asociadas a la
degradación de pared involucradas en este proceso (Paull y Chen, 2000). Se detectó
una menor actividad glucanasa (Pressey, 1983), pectinesterasa (Ogura y col., 1976),
endo-mananasa y galactosidasa (Sozzi y col., 1996) en tomate. En frutilla, tal
disminución en la actividad de enzimas de pared celular fue observada en frutos
que fueron tratados térmicamente tanto en estadios de maduración avanzados
(Vicente y col., 2005) como en estadios tempranos (Martínez y Civello., en prensa).
En relación a las expansinas de frutilla, hasta el momento solo se había analizado
la expresión de FaEXP2 en frutos blancos tratados térmicamente y almacenados a
20 ºC, y se observó la disminución en la expresión del gen inmediatamente luego
del tratamiento y en las siguientes 4 h (Martínez y Civello, en prensa).
La firmeza de los frutos tratados térmicamente o sin tratar disminuyó
durante el almacenamiento a 20 ºC, desde valores cercanos a 2,5 N inmediatamente
finalizado el tratamiento hasta aproximadamente 1,5 N luego de dos días (Figura
40). Una vez tratados los frutos, no se detectaron diferencias significativas entre
Controles y Tratados. Sin embargo, a las 24 h la firmeza de los frutos Tratados fue
mayor que la de los Controles, indicando un retraso en la tasa de ablandamiento. El
efecto es temporario, ya que luego de 48 h la firmeza de ambos grupos de frutos es
similar. Estos resultados están de acuerdo con resultados previos obtenidos en
otras variedades de frutillas (Civello y col., 1997; Vicente y col., 2005).
En los resultados presentados en las Figuras 41 a 45 se muestra que los
patrones de expresión de los genes de expansina en estudio son diferentes en frutos
Controles y Tratados térmicamente. Se pueden distinguir tres comportamientos: los
niveles de expresión fueron menores o iguales en frutos Tratados comparado con los
Controles, como fue el caso de FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP6; los niveles de expresión
&DS¯WXOR,9'LVFXVLµQ
fueron mayores o iguales en frutos Tratados que en Controles, como resultó con la
expresión de FaEXP5; o la expresión en frutos Tratados fue mayor, menor o igual
que en los Controles, dependiendo del tiempo de incubación, como ocurrió con
FaEXP4.
Observando estos resultados en conjunto, podría interpretarse que la
expresión menor en frutos tratados de los genes de FaEXP1 y FaEXP2 antes de las
24 h de incubación, estaría contribuyendo a la diferencia de firmeza observada
entre los dos grupos de frutos en dicho periodo. Sin embargo, la expresión de los
genes FaEXP4 y FaEXP5 es mayor a las 18 h en frutos tratados, y la de FaEXP6 fue
levemente mayor en frutos tratados también a las 18 h de incubación.
Probablemente, la contribución al ablandamiento por parte de FaEXP1 y FaEXP2
sea más importante que la de las demás expansinas, y una disminución en la
expresión de estos genes en los frutos tratados en las horas iniciales posteriores al
tratamiento podría contribuir al retraso del ablandamiento detectado durante las
primeras 24 h de almacenamiento (Figura 40). La hipótesis actual es que las
expansinas actúan directamente debilitando uniones tipo puente de hidrógeno de la
pared celular y también de modo indirecto, facilitando el acceso del conjunto de
enzimas hidrolíticas a la misma (Rose y col., 1997). De este modo, la menor
acumulación de algunas expansinas y de una serie de enzimas relacionadas a la
degradación de la pared estaría estrechamente relacionada con el retraso del
ablandamiento del fruto tratado térmicamente.
Cuando se analizó la firmeza de frutos irradiados con UV-C, no se detectaron
diferencias significativas entre Controles y Tratados inmediatamente después del
tratamiento, pero los frutos Tratados resultaron más firmes luego de 2, 3 y hasta 4
días de almacenamiento después del tratamiento (Figura 46).
En este caso se seleccionaron los genes de expansina con expresión
específica de fruto (FaEXP2 y FaEXP5) y uno de los genes que se expresan también
en otras partes de la planta (FaEXP4) para analizar sus patrones de expresión en
frutos irradiados con UV-C.
Como se muestra en la Figura 47, la expresión de las tres expansinas
analizadas disminuyó inmediatamente luego del tratamiento o 4 h después de su
aplicación, se produjo un pico de acumulación en frutos irradiados a las 24 h y
luego se volvió a detectar una disminución en la expresión a las 48 h de incubación.
Esto indicaría que la expresión de estos genes está influenciada por la irradiación
con UV-C (Figura 46). Se observa en los patrones de expresión que después del
notable aumento a las 24 h los niveles vuelven a ser menores en frutos Tratados, lo
&DS¯WXOR,9'LVFXVLµQ
que correlaciona con las diferencias de firmeza encontradas a las 48 h. Además de
la influencia de la irradiación UV-C sobre los genes de expansinas, se ha observado
que este tratamiento también disminuye la expresión de FaPG1, FaPE1 y FaCel1,
indicando que la posible disminución de la acción de estas y probablemente otras
enzimas asociadas a la degradación de pared celular, podría estar provocando el
retraso en la firmeza observado luego del tratamiento con UV-C (Pombo y col.,
enviado para publicación).
Es importante considerar que el análisis realizado en relación a la expresión
de los genes de expansina luego de la aplicación del Tratamiento Térmico o de la
irradiación con UV-C no tiene en cuenta las posibles regulaciones posttranscripcionales o post-traduccionales que puedan ocurrir en los productos de
estos genes. En tal sentido, sería interesante evaluar el patrón de acumulación de
proteínas en frutos Tratados con respecto a los Controles, a fin de analizar el
comportamiento global de estas proteínas tras el Tratamiento Térmico o luego de
irradiación con UV-C.
A partir de los resultados de los experimentos realizados para analizar el
efecto del Tratamiento Térmico (Figuras 41 a 45), se puede observar que en los
frutos Controles la expresión aumenta considerablemente entre las muestras C0
(inmediatamente después del tratamiento térmico, o sea entre 3-4 h después de la
cosecha) y C4 (4 h después del tratamiento térmico, o sea entre 7-8 h después de la
cosecha). Esto se detectó para la expresión de FaEXP1 (Figura 41), FaEXP2 (Figura
42), FaEXP4 (Figura 43), FaEXP6 (Figura 45) y un poco más levemente en el caso de
FaEXP5 (Figura 44). Un comportamiento similar se observó en los Controles
correspondientes a los experimentos de irradiación con UV-C (Figura 47). La
expresión de los genes analizados en frutos no irradiados se incrementó en las
muestras C0 (aproximadamente 2 h después de la cosecha) y C4 (aproximadamente
6 h después de la cosecha). Esto también se había observado respecto a la
expresión de otros genes de pared celular analizados en frutos tratados
térmicamente o con UV-C (Martínez y Civello, en prensa; Pombo y col., enviado para
publicación).
Es conocido que las respuestas de las plantas ante los diversos daños a los
que están sujetas es compleja (León y col., 2001; Cheong y col., 2002). En el caso
de los daños mecánicos, la respuesta desencadenada involucra moléculas de
señalización asociadas a estrés, entre las cuales se encuentra el etileno. Se han
observado modificaciones en los niveles de esta hormona como consecuencia de
&DS¯WXOR,9'LVFXVLµQ
dichos daños, y estos cambios influyen sobre la expresión de genes involucrados en
distintos procesos celulares (O'Donnell y col., 1996).
El análisis de la expresión de los genes FaEXP2, FaPGs y FaCel1, mostrado
en la Figura 48, indica que el aumento en la expresión de estos genes en los
Controles entre 4 y 8 h después del corte es revertido en frutos tratados con 1-MCP,
el cual inhibe competitivamente la unión del etileno al receptor. Esto sugiere que el
incremento de la expresión de estos genes a las pocas horas de realizada la cosecha
se produciría mediante un proceso que involucra al etileno. Sin embargo, el
tratamiento con etileno sobre frutos en estadio VG o B no afectó la expresión del
gen FaEXP2 (Figura 39 B, Capítulo III), mientras que la expresión de este gen sí fue
afectada por el corte (Figura 48). La influencia del tratamiento con 1-MCP,
inmediatamente después del corte, sobre la expresión de este gen podría
interpretarse de varias maneras: se ha propuesto que en frutilla la sensibilidad al
etileno podría ser diferente en distintos estadios de madurez (Tian y col., 2000), de
modo que la expresión de FaEXP2 en frutillas de la variedad Toyonaka en estadio
75 % rojo, utilizadas en este caso, podría responder a la acción del etileno a
diferencia de lo que ocurre en estadios iniciales de la maduración (VG o B) en
frutillas de la variedad Camarosa, donde su expresión no fue afectada por etileno
exógeno (Figura 39 B). Por otro lado, en la respuesta a daño existen evidencias de
que un péptido denominado sistemina sería la señal móvil primaria involucrada en
la activación de genes de defensa (Ryan, 2000), y que tendría un rol esencial en la
respuesta activada por heridas, tanto local como sistémica, en plantas de tomate
(McGurl, 1994). Se ha propuesto que el papel del etileno en la respuesta a daño
mecánico sería potenciar la señalización activada por sistemina a través de la ruta
del octadecanoide, mediante la cual se sintetiza ácido jasmónico (O'Donnell y col.,
1996). De esta manera, la influencia del etileno sobre la expresión de FaEXP2
podría darse a través de sistemina y no por un efecto directo del etileno.
Teniendo en cuenta lo expuesto recientemente y las diferencias de expresión
entre frutos Controles y Tratados térmicamente (Figuras 41 a 45) o con UV-C
(Figura 47) pocas horas después del corte (C4 y T4), podría interpretarse que estos
tratamientos, de alguna manera contrarrestan el aumento en la expresión de varios
genes asociados a la degradación de pared provocado por el estrés producido por el
corte. Esto podría contribuir, al menos en las primeras horas posteriores al
tratamiento, al retraso en el ablandamiento observado en frutos tratados (Figuras
40 y 46). Un aspecto pendiente a evaluar es si el incremento de la expresión de este
conjunto de genes de degradación de pared, y probablemente de otros, provocado
por el corte del fruto tiene una incidencia relevante en la posterior vida poscosecha
&DS¯WXOR,9'LVFXVLµQ
del mismo. De ser así, cobraría mayor importancia la aplicación de tratamientos
físicos o químicos tempranos para demorar la expresión de estos genes, y de este
modo extender la vida poscosecha del fruto.
&RQFOXVLRQHV
CONCLUSIONES PARCIALES
Capítulo I:
ƒ
Se obtuvieron los ADNc completos de los genes FaEXP1, FaEXP4, FaEXP5 y
FaEXP6 y se determinó que las proteínas predichas presentan las
características generales de la familia de las D-expansinas: residuos de W y C
conservados, motivo HFD, masa molecular de la proteína precursora entre
26 y 28 kDa, péptido señal predicho que las dirige a la ruta secretoria y
proteínas maduras de masa molecular alrededor de 25 kDa.
ƒ
La expresión del gen FaEXP1 no es específica de fruto. Presenta altos niveles
de expresión en raíces y también se la detectó en ovarios, hojas, tallos,
sépalos, pecíolos, raíces, estambres y en los estadios de maduración desde
Blanco hasta 100 % maduro.
ƒ
Se pudo establecer una correlación entre la expresión de los genes FaEXP1,
FaEXP2 y FaEXP5 en estadios iniciales de maduración y la firmeza de los
frutos en variedades de frutilla con frutos de firmeza contrastante (Selva,
Camarosa y Toyonaka). Dicha correlación no se observó en el caso de los
genes FaEXP4 y FaEXP6.
ƒ
La acumulación de proteínas expansinas es mayor al inicio de la maduración
en la variedad más blanda (Toyonaka) en comparación con una de las
variedades firmes (Camarosa).
ƒ
Los genes de expansina en estudio estarían presentes en la especie Fragaria
chiloensis. Los genes de EXP1, EXP2 y EXP5 se expresarían con patrones
similares a los observados en Fragaria x ananassa durante la maduración de
ambas especies, mientras que la expresión de EXP4 y EXP6 sería menos
importante en frutos de F. chiloensis.
ƒ
Los genes EXP4 y EXP6 se expresan en tejidos de hoja, flor, estolones y raíces
en F. chiloensis, mientras que EXP2 y EXP5 no se detectaron en estos tejidos.
EXP1 se expresa en flores y no en raíces.
Capítulo II
ƒ
Se clonó un fragmento de 650 pb correspondiente a la zona proximal del
promotor del gen FaEXP2.
ƒ
El análisis bioinformático de la secuencia del promotor predijo numerosos
elementos reguladores en cis, entre los que se destacan elementos de
respuesta a giberelinas, elementos de respuesta a luz y elementos de
respuesta a daño.
&RQFOXVLRQHV
ƒ
Ensayos por transformación transitoria de discos de frutillas indican que el
fragmento de 650 pb tendría los elementos necesarios para conducir la
expresión génica en frutos maduros y blancos. Un fragmento de 500 pb del
promotor de FaEXP2 también es funcional en frutos maduros.
Capítulo III
ƒ
Tratamientos con las hormonas ABA, GA3 y auxinas (NAA exógeno o
eliminación de aquenios) produjeron variaciones en la expresión de los genes
FaEXP1, FaEXP2, FaEXP4, FaEXP5 y FaEXP6:
ƒ
La expresión de FaEXP1 disminuyó en frutos tratados exógenamente
con ABA, NAA y GA3, aunque la eliminación de aquenios no afectó su
expresión.
ƒ
La expresión de FaEXP2 sería inhibida por auxinas, ya que su
expresión disminuyó en frutos tratados con NAA y aumentó en frutos
sin aquenios. El tratamiento con GA3 también disminuyó su expresión
y el tratamiento con ABA no la afectó.
ƒ
La expresión de FaEXP4 también sería inhibida por auxinas, ya que
su expresión disminuyó en frutos tratados con NAA y aumentó en
frutos sin aquenios. Los tratamientos con GA3 y ABA no afectaron su
expresión.
ƒ
La expresión de FaEXP5 no fue afectada por auxinas ni por ABA. Se
observó una disminución de expresión en frutos tratados con GA3.
ƒ
La
expresión
del
gen
FaEXP6
aumentó
levemente
en
frutos
deaquenados y en frutos tratados con ABA y GA3.
ƒ
La expresión de FaEXP1, FaEXP5 y FaEXP6 disminuyó en frutos Blancos
tratados con Ethrel. En el caso de estos dos últimos, el efecto también se
observó en frutos VG. En cambio, el tratamiento con Ethrel no afectó la
expresión de FaEXP2 y FaEXP4.
ƒ
El tratamiento con 1-MCP produjo aumento de la expresión de FaEXP1,
FaEXP4 y FaEXP6 y una posterior aplicación de Ethrel disminuyó la
expresión de estos genes.
Capítulo IV
ƒ
El tratamiento térmico a 45 ºC de frutillas en estadio 75 % resultó en frutos
Tratados más firmes que los Controles luego de 24 h de almacenamiento a
20 ºC.
&RQFOXVLRQHV
ƒ
El tratamiento térmico provocó diferentes patrones de expresión en frutos
Controles y Tratados de los genes de expansina en estudio.
ƒ
La expresión de FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP6 fue menor o igual en frutos
Tratados que en los Controles.
ƒ
La expresión de FaEXP5 fue mayor en los frutos Tratados entre 18 h y 48 h
después del tratamiento térmico
ƒ
La expresión de FaEXP4 fue mayor en frutos Tratados 18 h después del
tratamiento y menor que los Controles 48 h después del tratamiento.
ƒ
La irradiación con UV-C de frutillas en estadio 50 % resultó en frutos
Tratados más firmes que los Controles luego de 2, 3 y 4 d de almacenamiento
a 20 ºC.
ƒ
La expresión de FaEXP2, FaEXP4 y FaEXP5 fue menor en frutos irradiados
que en los Controles inmediatamente después del tratamiento y luego de 4 h
a 20 ºC. Aumentó considerablemente a las 24 h y volvió a ser menor a las 48
h.
ƒ
Pocas horas después de la cosecha de los frutos se produce un aumento en
la expresión de los genes de expansina que estaría relacionado con un
aumento en la producción de etileno inducido por el estrés asociado al corte
del fruto.
CONCLUSIONES GENERALES
Los genes de expansina estudiados se expresan simultáneamente durante la
maduración de frutilla. FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP5 podrían tener un papel más
importante que FaEXP4 y FaEXP6 en el proceso de ablandamiento, de acuerdo a la
correlación encontrada entre su expresión en estadios de maduración tempranos y
la firmeza de los frutos de distintas variedades (Selva, Camarosa y Toyonaka).
Asimismo, su participación en la maduración estaría conservada en las especies F.
chiloensis y Fragaria x ananassa.
La expresión de estos genes estaría regulada diferencialmente por las
hormonas ABA, giberelinas y auxinas al inicio de la maduración. La expresión
también estaría influenciada por el etileno.
Los tratamientos térmicos y la irradiación con UV-C afectan la expresión de
los genes de expansina, influyendo, probablemente junto con otras enzimas de
degradación de pared celular, en el retraso del ablandamiento observado tras los
tratamientos.
Estas
tecnologías
postcosecha,
probablemente,
también
&RQFOXVLRQHV
contrarrestarían el aumento en la expresión de genes de pared observado pocas
horas después de la cosecha, contribuyendo al retraso en el ablandamiento.
Los análisis de expresión realizados aportan información valiosa acerca de la
posible contribución de los distintos genes de expansina al ablandamiento del fruto
durante la maduración o en respuesta a un tratamiento físico. Sin embargo, es
necesario tener en cuenta las posibles modificaciones post-transcripcionales y/o
post-traduccionales que pudieran estar regulando la acción de las expansinas.
Finalmente, el fragmento del promotor del gen FaEXP2 obtenido tendría
potenciales aplicaciones biotecnológicas al ser funcional y conducir la expresión
génica específicamente en frutos. Es necesario completar la caracterización de
dicho fragmento, principalmente en cuanto a su fuerza comparada con otros
promotores de uso más generalizado.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
MATERIALES Y MÉTODOS
1.
Material Vegetal
Para el análisis de expresión de genes de expansina en variedades con
firmeza contrastante se trabajó con frutos de tres variedades de frutilla (Fragaria x
ananassa), seleccionadas de acuerdo a la firmeza del fruto: Selva (muy firme),
Camarosa (firme) y Toyonaka (muy blando). Se recolectaron muestras de frutos en
distintos estadios de desarrollo y de frutos ya desarrollados en distintos estadios de
madurez. Los frutos se clasificaron de acuerdo al tamaño y grado de coloración
externa en: verde pequeño (VP); verde grande (VG); blanco (B); 25 % rojo (25 %); 50
% rojo (50 %); 75 % rojo (75 %) y 100 % rojo (100 %).
Se recolectaron tallos, sépalos, ovarios, hojas, pecíolos, raíces y estambres de
plantas de frutilla de la variedad Selva para el estudio de especificidad de tejido de
FaEXP1.
En el estudio comparativo entre Fragaria chiloensis y Fragaria x ananassa se
usaron frutos de la variedad Chandler de esta última, y los estadios de madurez se
clasificaron de manera diferente (se detalla en el Capítulo I).
Para la extracción de ADN genómico se usaron hojas jóvenes de plantas de la
variedad Toyonaka.
En los ensayos con tratamientos físicos se usaron frutos de la variedad
Camarosa en estadio 75 % cuando se aplicó Tratamiento Térmico y variedad Aroma
en estadio 50 % cuando se irradió con UV-C.
Los tratamientos hormonales se realizaron usando frutos de la variedad
Camarosa en estadios VG o Blanco, según se indique.
El efecto del corte de los frutos sobre la expresión de genes se analizó usando
frutos en estadio 75 % de la variedad Toyonaka.
En
todos
los
casos,
las
muestras
fueron
cosechadas
y
utilizadas
inmediatamente o se congelaron en N2 (l) y se conservaron a –80 °C hasta su
empleo, dependiendo del trabajo a realizar.
2.
Determinación de la firmeza de frutos
La determinación de firmeza de los frutos se realizó inmediatamente después
de la cosecha, usando un Analizador de Textura (TA.XT2, Stable Micro Systems
Texture Technologies, Scarsdale, NY). Este estudio se llevó a cabo determinando la
fuerza máxima que se debe hacer para penetrar el fruto. Se utilizó una sonda de 3
mm de diámetro, la cual penetró los frutos a una velocidad de 0,5 mm/s. El ensayo
0DWHULDOHV\0«WRGRV
se interrumpió una vez alcanzada una distancia máxima de 7 mm. Cada fruto fue
medido tres veces en distintos puntos de su zona ecuatorial.
3.
Extracción de ARN total
3.1
Método del Borato caliente
La extracción de ARN total se realizó usando el método del Borato caliente
(Wan y Wilkins, 1994). Para ello se trituró el material vegetal (aproximadamente 4 g)
utilizado mortero y pilón bajo N2 (l). Posteriormente, se agregó el tampón de
extracción (borato de sodio decahidratado (Borax) 0,2 M; EDTA 30 mM; SDS 1 %
p/v; deoxicolato de sodio 1 % p/v; pH = 9,0) previamente calentado a 80 ºC, en una
proporción de 3,5 ml/g de tejido. Inmediatamente antes de usar se agregaron
aditivos a este tampón, de modo de alcanzar las siguientes concentraciones finales:
DTT 10 mM; Nonidet P-40 1 % v/v y PVP-40 2 % p/v.
El homogenato fue adicionado con 150 Pl de proteinasa K (20 mg/ml) y la
mezcla resultante se incubó 90 min a 42 ºC. Posteriormente, se agregó 100Pl de
KCl 2 M por cada 1000 Pl de tampón de extracción y se incubó en hielo durante
una hora. Se centrifugó a 12000 x g a 4 ºC durante 20 min, se recuperó el
sobrenadante, se midió su volumen, y se agregó 1/3 del volumen de LiCl 8 M. Se
incubó a 4 ºC durante toda la noche. La mezcla se centrifugó a 12000 x g a 4 ºC
durante 20 min, se descartó el sobrenadante y el precipitado se lavó 3 veces con 5
ml de LiCl 2 M frío, centrifugando cada vez durante 10 min a 4 ºC a 12000 x g. El
precipitado se resuspendió en 2 ml de Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5 y se centrifugó
durante 10 min a 4 ºC para eliminar el material celular residual. El sobrenadante
se trató con 200 Pl de acetato de potasio 2 M, pH = 5,5 y se incubó en hielo durante
20 min para eliminar polisacáridos cargados positivamente. Luego se centrifugó a 4
ºC durante 10 min y el sobrenadante se trató con 2,5 volúmenes de etanol absoluto
y se dejó a –80 ºC durante 2 h. Luego de centrifugar a 9700 x g a 4 ºC durante 30
min, el ARN precipitado se suspendió con 2 ml de etanol al 70 % v/v, se centrifugó
durante 10 min a 9700 x g y el precipitado se disolvió en 300 Pl de agua tratada con
DEPC. Posteriormente, se volvió a precipitar el ARN con 1/10 volúmenes de acetato
de sodio 3 M pH = 6,0 y 2,5 volúmenes de etanol absoluto y se dejó 2 h a –80 ºC; se
centrifugó a 16000 x g durante 20 min a 4 ºC y el precipitado se suspendió con
etanol 70 % v/v, centrifugando nuevamente a 16000 x g durante 5 min a 4 ºC.
Finalmente, luego de eliminar el etanol residual en un desecador al vacío, se
disolvió el ARN en 50 μl de agua tratada con DEPC.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
3.2
Método CTAB de extracción de ARN total
En los casos en que no se utilizó el método del Borato caliente, se utilizó el
siguiente protocolo, basado en Chang y col (1993).
Se pulverizó 8 g de material vegetal con N2 (l), el cual fue adicionado a 15 ml
del tampón de extracción a 65 ºC (CTAB 2 % p/v; PVP-40 2 % p/v; Tris-HCl 100
mM pH 8,0; EDTA 25 mM y NaCl 2 M) conteniendo 2-mercaptoetanol 2 % v/v
(agregado inmediatamente antes de usar). La mezcla se incubó a esta temperatura
durante 20 min y luego se agregó un volumen igual de cloroformo:alcohol isoamílico
en proporción 24:1. Se centrifugó a 4 ºC durante 25 min a 10000 x g, se recuperó la
fase acuosa y se repitió dos veces la operación. La fase acuosa recuperada se
precipitó con 1/3 de volumen de LiCl 8 M durante toda la noche. Se centrifugó a
10000 x g durante 10 min a 4 ºC y el precipitado se disolvió en 500 Pl de solución
SSTE a 65 ºC (NaCl 1 M; SDS 0,5 % p/v; EDTA 1 mM; Tris-HCl 10 mM, pH = 8,0).
Se agregó un volumen de cloroformo:alcohol isoamílico en proporción 24:1 y se
centrifugó a 4 ºC durante 25 min a 10000 x g. La fase acuosa se precipitó con 2
volúmenes de etanol absoluto durante 30 min a -80 ºC y se centrifugó a 4 ºC
durante 25 min a 10000 x g. Se lavó el precipitado con etanol 70 % v/v, se secó al
vacío y el ARN resultante se disolvió en 50 Pl de agua tratada con DEPC.
4.
Electroforesis
de
ARN
en
geles
de
agarosa-formaldehído.
Cuantificación de ARN
Se utilizaron geles de agarosa-formaldehído en condiciones desnaturalizantes
con el objeto de verificar la integridad del ARN total o para separar dicho ARN antes
de transferirlo a membranas de nylon. Los geles se prepararon con agarosa al 1 %
p/v, formaldehído al 3 % v/v y solución reguladora MOPS 1X (ver Apéndice). La
cantidad necesaria de cada muestra de ARN total (2 Pg para ver integridad o 10 Pg
para transferir) se desnaturalizó durante 10 min a 65 ºC en una mezcla que
contenía MOPS 1X, formamida 50 % v/v, formaldehído 20 % v/v y bromuro de
etidio 0,3 Pg/Pl. Las muestras se sembraron en el gel y se corrieron a 60 V en
solución reguladora MOPS 1X. Por último, las muestras se cuantificaron por
absorción a 260 nm usando un fotómetro (BioPhotometer, Eppendorf), utilizando
para el cálculo la siguiente equivalencia: 1 unidad de absorbancia a 260 nm (A260) =
44,2 Pg/ml de ARN.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
5.
Transcripción Reversa y Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR)
Las reacciones de transcripción reversa (RT) se hicieron a partir de una
mezcla de 2 Pg de ARN total de la muestra y la cantidad de agua destilada necesaria
para un volumen final de 15 Pl; esta solución se desnaturalizó a 70 ºC durante 10
min y se enfrió rápidamente en hielo. Se agregó el resto de los componentes: 200 U
de transcriptasa reversa M-MLV (Promega), tampón de reacción de la enzima 1X,
dNTPs 200 PM cada uno, y 10 pmol de cebador oligo dT y de Rib3 (Tabla VII), en un
volumen final de 25 ml. La reacción se llevó a cabo a 37 ºC durante 90 min y luego
se incubó a 90 ºC durante 10 min para inactivar la enzima. El ADNc obtenido se
almacenó a -20 ºC hasta su utilización.
Para realizar RT-PCR semicuantitativa se determinó para cada gen, el
número de ciclos en que la reacción de PCR estaba en zona de linealidad (donde no
existía saturación de productos amplificados). Para esto se usó 0,5 Pl del ADNc
obtenido por RT y se preparó una mezcla de PCR conteniendo tampón de la enzima
1X; MgCl2 1,5 mM; dNTPs 62,5 PM cada uno; 1 PM de los cebadores adecuados
(específicos para genes de expansina o para el ARN ribosomal 18S) y 0,5 U de Taq
polimerasa en un volumen final de 20 Pl. Una vez preparadas las mezclas de
reacción, se llevó a cabo la amplificación tomando alícuotas cada 3 ciclos a partir
del ciclo 18 para los genes de expansina o a partir del ciclo 4 para el ARNr 18S,
hasta el ciclo 30.
Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 1,5 % p/v y se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa como se indica en el punto 20.1, para
luego ser hibridizados con sondas radiactivas como se indica en el punto 20.4.
Los cebadores se indican en la sección siguiente (Tabla VII), y los programas
de PCR utilizados se indican en la sección 7 (Tabla VIII).
6.
Cebadores utilizados
En la Tabla VII se detallan todos los cebadores utilizados. En la sección A de
la tabla se agrupan los cebadores que se utilizaron para realizar sondas específicas
para los genes de expansina y para el ARNr 18S; en la sección B se indican los
cebadores diseñados para hacer reacciones de RACE (Rapid Amplification of cDNA
Ends, ver más adelante), algunos de los cuales se usaron también para fabricar
sondas específicas, y en la sección C se indican los cebadores usados en el estudio
del promotor proximal del gen de FaEXP2.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
7.
Programas de PCR utilizados
Los programas de PCR usados para cada par de cebadores se detallan en la
Tabla VIII. También se indican los usos que se le dio al fragmento amplificado en
cada caso.
8.
Visualización de ADN en geles de agarosa
Para visualizar ADN se utilizaron geles de agarosa al 1 % p/v en la mayoría
de los casos (salvo excepciones que se indicarán oportunamente), teñidos con
bromuro de etidio (0,5 Pg/ml) y preparados con solución reguladora TBE 0,5X (ver
Apéndice). Previo a la electroforesis, las muestras fueron adicionadas con colorante
de muestra (ver Apéndice) y luego sembradas en el gel. Para la corrida
electroforética se utilizó solución reguladora TBE 0,5X; la electroforesis se realizó a
un voltaje constante igual a 70 V.
9.
Purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa.
Cuantificación de ADN
Las bandas de interés se purificaron a partir del gel de agarosa usando el kit
comercial de columnas GFX (Amersham-Pharmacia). La concentración del ADN
purificado se estimó midiendo la absorbancia a 260 nm usando un fotómetro
(BioPhotometer, Eppendorf), y para el cálculo se utilizó la siguiente conversión: 1
unidad de A260 = 50 Pg/ml de ADN.
10.
Ligación de productos de PCR
Para realizar los clonados de los fragmentos de interés, se ligaron los
productos de PCR purificados a partir de geles de agarosa, en el vector pGEM-T
easy (Promega). En todos los casos, se usó una relación inserto:vector = 5:1; 25 ng
de vector; 3 U de T4 DNA ligasa; tampón de ligación rápida 1X y agua destilada
hasta un volumen final de 10 Pl. Estas mezclas se incubaron a 16 ºC durante toda
la noche.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
Tabla VII.
Cebadores utilizados
A
B
C
Nombre
Secuencia (5’Æ3’)
3FaEXP1
TGG CAT CCA CCC GGT GTT GG
5FaEXP1
ACC ATG GGG GGT GCT TGT GG
3FaEXP2
GCA TGG CCA CCA ACC CAA
5FaEXP2
CTT CTC CTT CTA GCT AGC
3FaEXP4
GAT GCC TCC CCT TCT TCT G
5FaEXP4
GGG TTG GGG TGT GGT TCT
sonda4-1
CTT GAG ACT CTA AAC TCC
sonda4-2
CAT TAC TAG TAG AAA ATG G
3FaEXP5
TGG GTT GCC AAT TAG TTC TT
5FaEXP5
TCT CGC CCA GCC CGT CTT CCA GCA T
3FaEXP6
ATC GTG AGG GTG AGC GTG
5FaEXP6
TGC GCA AAC GAC CCG AAC
NFE1-5
AGA AAA GCT CAC CCA TTA TC
NFE1-3
TTC CTG CCA GGG GCC ACC
NFE5-5
CTC ACA CCC TCA GCT CCC
NFE5-3
AAG CAT GAG CAA ACA ATG
NFE6-5
GAA AGT GTT TTT AGG GAC
NFE6-3
CTA CAG CTT TTG GTC GTA C
Rib5
ACCGTAGTAATTCTAGAGCT
Rib3
CCACTATCCTACCATCGAAA
FE1-5
GCA CTG CCG GAA AGC CCT CCA TT
FE1-3
TCC GGC TTT GTA CTC GGC GAT CTT G
FE5-5
TCT CGC CCA GCC CGT CTT CCA GCA T
FE5-3
GGA CCA GGT TGA AGT ATG AGT GAC
FE6R5
GCC ACT CTG GAA GTC CTT CGA TT
FE6R3
CTT CCG GCA TGG CAC CCG ACG AT
650p2
Gen
Nº de acceso
Región amplificada
(Genbank)
Tamaño fragmento
FaEXP1
AF163812
FaEXP2
AF159563
FaEXP4
AF226701
FaEXP4
DQ183068
FaEXP5
AF226702
FaEXP6
AF226703
4 a 471
468 pb
2 a 151
150 pb
88 a 345
258 pb
1046 a 1317
272 pb
275 a 486
212 pb
121 a 438
318 pb
3’-UTR
837 a 1093
no publicado
257 pb
3’-UTR
862a 1145
no publicado
284 pb
3’-UTR
796 a 1082
no publicado
287 pb
ARNr 18S
-
200 pb
FaEXP1
AF163812
FaEXP5
AF226702
FaEXP6
AF226703
GCT CGA GAC AGC AAA CAA G
FaEXP2
no publicado
500p2
GCT CGA GTA CCA AAT TGG AC
FaEXP2
no publicado
300p2
GCT CGA GAT GCA TGT GCA G
FaEXP2
no publicado
150p2
GCT CGA GGC TCT CTC TCA C
FaEXP2
no publicado
delp2-3
GAA GCT TGC TAG AAG GAG AAG
FaEXP2
no publicado
prom2-i
GTGAGAGCTAGCTAGCTAGAAGGAGAAG
prom2-o
AGAAAGTGGCATGGCCACCAACCCAACC
FaEXP2
AF159563
FaEXP1
FaEXP5
FaEXP6
149 a 306
158 pb
255 a 391
137 pb
143-339
197 pb
Ver Tabla V
Capítulo II
-
0DWHULDOHV\0«WRGRV
Tabla VIII
Programas de PCR usados
Cebadores
Ciclo
Desnatura-
utilizados
inicial
lización
94 ºC
3 min
3FaEXP1
Elongación
Pegado
Elongación
94 ºC
50 ºC
72 ºC
72 ºC
1 min
1 min
1 min
7 min
final
5FaEXP1
30 ciclos
1 ciclo
94 ºC
94 ºC
50 ºC
72 ºC
72 ºC
3 min
45 s
45 s
1 min
5 min
5FaEXP2
1 ciclo
3FaEXP4
35 ciclos
1 ciclo
95 ºC
95 ºC
55 ºC
72 ºC
72 ºC
3 min
30 s
30 s
1 min
10 min
5FaEXP4
35 ciclos
94 ºC
94 ºC
50 ºC
72 ºC
72 ºC
3 min
45 s
45 s
1 min
5 min
1 ciclo
35 ciclos
1 ciclo
72 ºC
72 ºC
Sonda para Northern;
3 min
30 s
30 s
1 min
10 min
Sonda para búsqueda del
ADNc completo en biblioteca;
35 ciclos
1 ciclo
94 ºC
94 ºC
55 ºC
72 ºC
72 ºC
3 min
30 s
30 s
1 min
10 min
1 ciclo
35 ciclos
1 ciclo
94 ºC
94 ºC
63 ºC
72 ºC
72 ºC
3 min
45 s
45 s
45 s
7 min
NFE1-3
1 ciclo
30 ciclos
94 ºC
94 ºC
63 ºC
72 ºC
72 ºC
3 min
45 s
45 s
45 s
7 min
1 ciclo
30 ciclos
Sonda para Northern;
PCR en F. chiloensis
RT-PCR semicuantitativa
RT-PCR semicuantitativa
1 ciclo
94 ºC
94 ºC
63 ºC
72 ºC
72 ºC
3 min
45 s
45 s
45 s
7 min
NFE6-3
Sonda para Northern de
tratamientos con hormonas
1 ciclo
Rib5
PCR en F. chiloensis
1 ciclo
NFE5-3
NFE6-5
PCR en F. chiloensis
55 ºC
5FaEXP6
NFE5-5
Sonda para Northern;
94 ºC
1 ciclo
NFE1-5
Sonda para búsqueda del
94 ºC
5FaEXP5
3FaEXP6
PCR en F. chiloensis
1 ciclo
sonda4-2
3FaEXP5
Sonda para Northern;
ADNc completo en biblioteca
1 ciclo
sonda4-1
Sonda para búsqueda del
ADNc completo en biblioteca
1 ciclo
3FaEXP2
Usos
30 ciclos
1 ciclo
94 ºC
94 ºC
50 ºC
72 ºC
72 ºC
3 min
45 s
45 s
1 min
5 min
Rib3
Sonda para Northern;
RT-PCR semicuantitativa
1 ciclo
30 ciclos
1 ciclo
0DWHULDOHV\0«WRGRV
Tabla VIII (continuación)
Programas de PCR usados
Cebadores
Ciclo
Desnatura-
utilizados
inicial
lización
94 ºC
3 min
FE1-5
Elongación
Pegado
Elongación
94 ºC
55 ºC
72 ºC
72 ºC
30 s
30 s
1 min
5 min
final
Usos
Sonda para Northern
FE1-3
1 ciclo
30 ciclos
1 ciclo
FE1-5
UPM
94 ºC
94 ºC
68 ºC
72 ºC
2 min
45 s
45 s
3 min
FE5-5
3’ RACE
UPM
FE6R5
UPM
1 ciclo
25 ciclos
FE1-3
72 ºC – 2 min
68 ºC – 30 s
94 ºC – 30 s
72 ºC – 2 min
70 ºC – 30 s
94 ºC – 30 s
FE6R3
72 ºC – 2 min
UPM
94 ºC – 30 s
FE5-3
94 ºC – 2 min
UPM
5’ RACE
UPM
Temperatura
decreciente
1 ciclo
5 ciclos
5 ciclos
25 ciclos
(Touchdown)
650p2
delp2-3
500p2
delp2-3
300p2
94 ºC
94 ºC
63 ºC
72 ºC
72 ºC
3 min
45 s
45 s
1 min
7 min
Deleciones del promotor
FaEXP2
delp2-3
150p2
delp2-3
AP1
1 ciclo
30 ciclos
1 ciclo
94 ºC
94 ºC
72 ºC
94 ºC
67 ºC
67 ºC
1 min
30 s
3 min
30 s
3 min
7 min
prom2-o
1 ciclo
7 ciclos
32 ciclos
Clonado del promotor FaEXP2
1 ciclo
0DWHULDOHV\0«WRGRV
11.
Preparación de células competentes
11.1 Método de alta eficiencia
Se utilizó el método descripto por Inoue y col. (1990), mediante el cual se
obtienen
células
competentes
con
una
eficiencia
de
transformación
de
aproximadamente 109 UFC/Pg de ADN. Se realizó un cultivo de Escherichia coli (XL1 blue) en medio sólido de LB-agar (LB líquido (ver Apéndice) con 15 g/l de agar)
con tetraciclina (12 Pg/ml) durante toda la noche a 37 ºC. De este cultivo sólido se
eligió una colonia aislada, la cual se subcultivó en medio líquido SOB (ver Apéndice)
a 18 ºC hasta que este cultivo alcanzó una densidad óptica medida a 600 nm
(DO600) igual a 0,6. El cultivo se dejó 10 min en hielo y se centrifugó a 4 ºC durante
10 min a 1075 x g. El precipitado se resuspendió en solución tampón TB (Pipes 10
mM; MnCl2 55 mM; CaCl2 15 mM; KCl 250 mM; pH = 6,7) y se incubó en hielo
durante 10 min. Posteriormente, se centrifugó a 4 ºC durante 10 min a 1075 x g, el
precipitado obtenido se resuspendió en 10 ml TB y se agregó DMSO a una
concentración final de 7 % v/v. Esta mezcla fue incubada en hielo durante 10 min,
luego se separó en alícuotas de 200 Pl y se guardaron en N2 (l) hasta su utilización.
11.2 Método TSS
Se realizó un cultivo de Escherichia coli (XL-1 blue) en medio sólido de LBagar con tetraciclina (12 Pg/ml) durante toda la noche a 37 ºC. De este cultivo se
eligió una colonia aislada, la cual se subcultivó en 5 ml de medio líquido LB
durante toda la noche a 37 ºC. Se tomó 1 ml de dicho cultivo y se incubó
nuevamente a 37 ºC en LB líquido hasta que alcanzó una DO600= 0,5. Se colocó el
cultivo en hielo durante 15 min y se centrifugó a 1100 x g durante 8 min a 4 ºC. El
precipitado de células se resuspendió en 5 ml de LB y 5 ml de solución TSS 2X
(PEG 8000 20 % p/v; DMSO 0,1 % v/v; MgCl2 70 mM; preparado en medio LB).
Luego de incubar en hielo durante 30 min, se separaron alícuotas de 200 Pl y se
guardaron en N2 (l) hasta su utilización.
12.
Transformación de células competentes
Las mezclas de ligación (punto 10) se utilizaron para transformar las células
competentes (punto 11) según el siguiente protocolo de choque térmico:
Una alícuota de 200 Pl de suspensión de células competentes se incubó con
5 Pl de la mezcla de ligación en hielo durante 30 min. Luego, dicha mezcla se
incubó durante 30 s en un baño de agua a 42 ºC y se pasó nuevamente a hielo
durante 10 min. Posteriormente, se agregó 800 Pl de medio líquido LB y se incubó a
0DWHULDOHV\0«WRGRV
37 ºC durante 45 min. Finalmente, se realizaron cultivos en medios sólidos en
placas de LB-agar con ampicilina (100 Pg/ml). En el caso de la utilización de
pGEM-T, se dispersó simultáneamente sobre la superficie de las placas con medio
de cultivo una mezcla de X-Gal (32 mg/ml) e IPTG (200 mg/ml) para poder realizar
la selección de colonias transformadas (colonias blancas) con el plásmido de
interés. En cada placa se sembraron 200 Pl de la mezcla de células transformadas y
se incubaron durante toda la noche a 37 ºC. Al día siguiente se usaron las colonias
blancas para realizar subcultivos y extraer ADN plasmídico como se detalla en el
punto siguiente.
13.
Extracción de ADN plasmídico
A partir de un cultivo de 3 ml en medio LB líquido con ampicilina (100
Pg/ml), inoculado con la colonia de interés e incubado a 37 ºC durante toda la
noche, se realizó la extracción de ADN plasmídico por la técnica de lisis alcalina
seguida de precipitación con PEG (Sambrook y col., 1989). Los cultivos se
centrifugaron a 16000 x g durante 1 min, se descartó el sobrenadante y los
precipitados obtenidos fueron resuspendidos en 200 Pl de solución P1 (Tris-HCl 50
mM, EDTA 10 mM, pH = 8,0), luego se agregaron 200 Pl de solución P2 (NaOH 200
mM; SDS 1 % p/v) y se incubó en hielo durante 5 min. Se agregó 200 Pl de solución
P3 (acetato de potasio 3 M, pH 5,0), se incubó en hielo durante 5 min y
posteriormente se centrifugó a 16000 x g durante 10 min. El sobrenadante obtenido
se incubó con ARNasa A, a una concentración final de 20 Pg/ml, a 37 ºC durante
30 min. Posteriormente, se agregó 400 Pl de cloroformo, se emulsionaron ambas
fases durante 30 s y se centrifugó a 16000 x g durante 1 min. Se recuperó la fase
acuosa y se agregó un volumen de isopropanol, dejando precipitar el ADN a –20 ºC
durante 30 min. Luego se centrifugó a 16000 x g durante 10 min, se resuspendió el
precipitado obtenido con 1 ml de etanol 70 % v/v y se volvió a centrifugar. El
precipitado se disolvió en 32 Pl de agua destilada estéril y se agregó 8 Pl de NaCl 4
M y 40 Pl de PEG 8000 al 13 % p/v. Las mezclas se incubaron en hielo durante 3-4
h y luego se centrifugaron a 4 ºC durante 30 min a 16000 x g. El precipitado
obtenido se resuspendió con etanol 70 % v/v y se volvió a centrifugar como se
indicó anteriormente. Finalmente, se disolvió el precipitado en 20 Pl de agua
destilada.
Las concentraciones de estas preparaciones fueron estimadas por absorción
a 260 nm como se indicó en el punto 9.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
14.
Reacciones con enzimas de restricción
Las reacciones con enzimas de restricción se realizaron de acuerdo a lo
indicado por el fabricante (Promega). En resumen, se utilizó una relación de 5 U de
enzima por cada 1 Pg de ADN en una mezcla que contenía el tampón 1X
correspondiente a cada enzima; BSA 0,1 Pg/Pl y agua destilada en 20 Pl finales de
reacción. Las reacciones se llevaron a cabo a 37 ºC durante 1 h como mínimo, o
durante toda la noche en el caso de digestión de ADN genómico (ver sección 21).
15.
Aislamiento de ADN genómico
Se utilizaron hojas jóvenes recién cortadas de plantas de la variedad
Toyonaka. Se trituró 1 Pg de hojas con nitrógeno líquido y se agregó tampón de
extracción (CTAB 3 % p/v; PVP-40 2 % p/v; Tris-HCl 1 M pH 8,0; EDTA 20 mM y
NaCl 1,4 M) previamente calentado a 65 ºC. Se incubó esta mezcla durante 30 min
a 65 ºC mezclando por inversión cada 5 min. Se extrajo con un volumen igual de
cloroformo:alcohol isoamílico en relación 24:1. Se centrifugó a 16000 x g durante
10 min a temperatura ambiente, se separó la fase acuosa, se le agregó un volumen
de isopropanol a -20 ºC y se incubó a -20 ºC durante 2 horas. Se centrifugó a
16000 x g durante 10 min a temperatura ambiente y se dejó secar el precipitado a
la misma temperatura. Se disolvió en 100 Pl de agua estéril a 65 ºC; se agregó
ARNasa A a una concentración final de 0,1 Pg/Pl y se incubó a 37 ºC durante 30
min. Se agregó un volumen de cloroformo:alcohol isoamílico en relación 24:1. Se
centrifugó a 16000 x g durante 10 min a temperatura ambiente y a la fase acuosa
se le agregó 2,5 volúmenes de etanol 100 % a -20 ºC. Se precipitó el ADN a -80 ºC
durante 30 min y se volvió a centrifugar a 16000 x g durante 20 min a temperatura
ambiente. El precipitado se suspendió con etanol al 70 % v/v, se dejó secar a
temperatura ambiente y se disolvió en 50 Pl de agua destilada estéril (Murray y
Thompson, 1980).
16.
Extracción de proteína total de frutos de frutilla. Cuantificación de
proteínas
Se trituraron 2 g de tejido con mortero y pilón en presencia de N2 (l); el tejido
triturado fue adicionado con tampón de extracción (Tris 50 mM; SDS 2 % p/v; 2mercaptoetanol 2 % v/v; EDTA 1 mM, sacarosa 5 % p/v; PVPP 1 % p/v; pH 7,0) en
una proporción de 1 g de tejido por cada 3 ml de tampón. Las muestras se
incubaron a temperatura ambiente durante 40 min con agitación, se centrifugaron
a 10000 x g durante 10 min y el sobrenadante se precipitó con 1/10 del volumen de
0DWHULDOHV\0«WRGRV
TCA 100 % p/v durante 30 min a 4 ºC. Luego de centrifugar 5 min a 10000 x g, el
precipitado se lavó dos veces con acetona 80 % v/v y se disolvió en NaOH 0,1 M /
SDS 1 % p/v. La cuantificación de proteína total en los extractos fue realizada
usando un protocolo modificado de Lowry (Potty, 1969), usando una longitud de
onda de 750 nm y BSA como estándar.
17.
SDS-PAGE y ensayos de western blot
Cantidades iguales de proteína (15 Pg) se mezclaron con la cantidad
adecuada de colorante de muestra 5X; se sembraron en geles desnaturalizantes de
poliacrilamida al 12 % p/v de 1 mm de espesor y se corrieron manteniendo una
intensidad de corriente de 30 mA.
Se realizaron electrotransferencias (BioRad) a membranas de nitrocelulosa
(Hybond ECL, Amersham-Pharmacia). La transferencia se realizó a 4 ºC en Tris 25
mM; glicina 192 mM; SDS 0,1 % p/v; pH = 8,3. Las membranas se bloquearon
usando leche en polvo descremada al 5 % p/v preparada en solución reguladora
TBS-T (Tris 20 mM; NaCl 137 mM; Tween-20 0,1 % v/v; pH = 7,6) durante 1 h a
temperatura ambiente con agitación. Para detectar las expansinas, la membrana se
incubó durante una hora con anticuerpos anti-LeEXP1 (Rose y col, 1997) diluido
1:250 en solución reguladora TBS-T-leche al 0,5 % p/v. Luego se lavó una vez
durante 15 min y 2 veces durante 5 min con TBS-T y se incubó durante 1 h a
temperatura ambiente con anticuerpo anti IgG de conejo (diluido 1:2000) marcado
con peroxidasa (Amersham-Pharmacia). La detección se realizó usando un método
de quimioluminiscencia (ECL Western blotting analysis system and detection
reagents, Amersham-Pharmacia).
18.
Obtención de los ADNc completos de los genes de expansina
18.1 Búsqueda en una biblioteca de ADNc
18.1.1
Obtención de las membranas
Se realizaron búsquedas en una biblioteca de ADNc de frutos de frutilla en
estadios de maduración 75-100 % con el objeto de obtener cada uno de los ADNc
completos de los genes FaEXP1, FaEXP4, FaEXP5 y FaEXP6. Dicha biblioteca fue
construida en el vector Uni-ZAP XP (Stratagene, La Jolla, CA, USA) (Civello y col.,
1999). Se infectaron células de E. coli XL1-Blue con volúmenes correspondientes a
5 x 105 ufp (unidades formadoras de placa de lisis). La mezcla de infección se
incubó a 37 °C durante 15 min y posteriormente se añadió a tubos con 7 ml de NZY
top agar (NaCl 5 g/l; MgSO4 .7H2O 2 g/l; extracto de levadura 5 g/l; NZ amina 10
0DWHULDOHV\0«WRGRV
g/l; pH 7,5; agarosa 0,7 % p/v) precalentado a 48 °C. Los tubos se agitaron en
vórtex y el contenido se extendió inmediatamente en placas de Petri de 15 cm con
medio NZY sólido (NaCl 5 g/l; MgSO4 .7H2O 2 g/l; extracto de levadura 5 g/l; NZ
amina 10 g/l; pH 7,5; agar 15 g/l). Las placas se incubaron a 37 °C hasta que se
observaron halos de lisis (aproximadamente 8 h). Luego de incubar las placas a 4
ºC durante 2 h, se transfirió el ADN de los bacteriófagos a membranas de
nitrocelulosa (Hybond N+, Amersham), para lo cual se colocaron las membranas
sobre la superficie de la placa durante 5 min. El ADN transferido se desnaturalizó
incubando las membranas en solución de desnaturalización (NaOH 0,5 M; NaCl 1,5
M) durante 2 min y luego se neutralizó incubando la membrana en solución de
neutralización (NaCl 1,5 M; Tris-HCl 0,5 M; pH 8,0) durante 5 min; finalmente, se
enjuagaron las membranas durante 30 s en una solución de Tris 0,2 M, pH 7,5;
SSC 2X. Se fijó el ADN a las membranas utilizando una dosis de radiación UV (1,2
kJ/m2) emitida por un equipo Hoefer® UVC 500 crosslinker (Amersham-Pharmacia).
18.1.2
Hibridación de las membranas
La búsqueda de los clones de interés se realizó mediante la utilización de
sondas marcadas radiactivamente correspondientes a fragmentos de los ADNc de
cada expansina. Estos fragmentos fueron obtenidos mediante reacciones de PCR,
empleando los cebadores que se indican en la Tabla VII y los programas de PCR de
la Tabla VIII: 5 y 3FaEXP1; 5 y 3FaEXP4; 5 y 3FaEXP5; y 5 y 3FaEXP6 (ver 20.2).
Una vez obtenidos, los fragmentos fueron purificados a partir de un gel de agarosa
al 1 % p/v y luego marcados con D-32P-dATP por el método de cebado al azar
(random priming), de acuerdo a lo descrito en el punto 20.3.
Las membranas con el ADN de los bacteriófagos se incubaron en tubos de
hibridación con solución de prehibridación (formamida 50 % v/v; SSPE 5X (NaCl 3
M; NaH2PO4 0,2 M; EDTA 20 mM); Denhart 1X (Ficoll 1 % p/v; PVP 1 % p/v; BSA 1
% p/v); SDS 0,2 % p/v) y con ADN de esperma de salmón (0,2 mg/ml) como agente
bloqueante durante 4 h en un horno de hibridación a 42 ºC.
Luego del agregado de la sonda correspondiente, previamente hervida
durante 5 min y enfriada en hielo, se dejó hibridando durante toda la noche a 42 ºC
con rotación suave. Posteriormente, se realizaron los lavados usando una solución
de SDS 0,1 % p/v y SSC 1X. Se realizó un lavado a 42 ºC, seguido de 3 lavados a
50 ºC, cada uno durante 30 min. A continuación, las membranas se expusieron a
placas radiográficas (X-OMAT, Kodak) a –80 ºC y se revelaron luego de cuatro días
de exposición.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
Una vez identificadas las placas de lisis que presentaban señal de
hibridación positiva, se purificaron a través de dos rondas de hibridación sucesivas
y luego se provocó la liberación del fagémido conteniendo la secuencia de interés,
siguiendo los protocolos del kit usado para la construcción de la biblioteca de ADNc
(-ZAPcDNA synthesis kit; Stratagene, La Jolla, CA). Estos fagémidos, contenidos en
el vector pBluescript SK(-), fueron secuenciados utilizando los cebadores T3 y T7 en
el servicio de Macrogen (Corea).
18.2 Reacciones de RACE
Se utilizó el SMART RACE cDNA Amplification kit (Clontech) con el objeto de
obtener las zonas 5’ y 3’-UTR de los genes de FaEXP1, FaEXP5 y FaEXP6. El
procedimiento se realizó de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.
Brevemente: se obtuvo ARN total (método del Borato en caliente) de frutos en
estadio 75 % de Fragaria x ananassa cv. Camarosa y se obtuvieron las mezclas de
ADNc “5’-RACE Ready” y “3’-RACE Ready” a partir de 1 Pg de ARN total. A partir de
estas mezclas, se realizaron reacciones de PCR usando los reactivos contenidos en
el kit Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech). Los cebadores específicos de cada gen
utilizados se indican en la Tabla VII:
FE1-3 para el 5’-UTR del gen de FaEXP1
FE1-5 para el 3’-UTR del gen de FaEXP2
FE5-3 para el 5’-UTR del gen de FaEXP5
FE5-5 para el 3’-UTR del gen de FaEXP5
FE6R-3 para el 5’-UTR del gen de FaEXP6
FE6R-5 para el 3’-UTR del gen de FaEXP6
El otro cebador utilizado en todos los casos fue UPM (Universal Primer Mix) provisto
con el kit.
Para amplificar las regiones 5’, la mezcla de PCR contenía: Advantage 2 PCR
buffer 1X; dNTPs 0,2 mM cada uno; 10 PM del cebador FE1-3, FE5-3 o FE6R3
(Tabla VII); UPM 1X; Mezcla de 2 polimerasas (2 polymerase mix) 1X y 1 Pl de “5’RACE Ready cDNA”. Para amplificar estos fragmentos se usó el programa de PCR de
temperatura decreciente (touchdown) detallado en la Tabla VIII.
Para amplificar las regiones 3’, la mezcla de PCR contenía: Advantage 2 PCR
buffer 1X; dNTPs 0,2 mM cada uno; 10 PM del cebador FE1-5, FE5-5 o FE6R5
(Tabla VII); UPM 1X; 2 polymerase Mix 1X y 1 Pl de “3’-RACE Ready cDNA”. Para
amplificar estos fragmentos no fue necesario utilizar un programa de temperatura
decreciente, y se usó el programa de PCR que se indica en la Tabla VIII.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
Los productos amplificados fueron purificados a partir del gel (punto 9), se
clonaron en el vector pGEM-T (puntos 10 a 14) y se enviaron a secuenciar
(Macrogen, Corea).
19.
Análisis de las secuencias de ADNc completas de genes de expansina
El análisis de secuencias se hizo usando el software DNASTAR (EditSeq,
SeqMan, MegAlign). La búsqueda de similitud de secuencias se hizo usando el
programa de uso público Basic Local Alignment Search (BLAST, National Center for
Biotechnology
Information;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
El
análisis
de
predicción de péptido señal y de destino de la proteína se hizo usando los
programas SignalP 3.0 y TargetP 1.1 (Emanuelsson y col., 2000), respectivamente
(WorldWideWeb Prediction Server; Center for Biological Sequence Analysis,
Technical University of Denmark; http://www.cbs.dtu.dk/services/).
20.
20.1
Ensayos de Northern Blot
Transferencia del ARN a membranas de nylon
Se extrajo ARN total por el método del Borato caliente (punto 3.1) o por el
método CTAB (punto 3.2) según se indique. La concentración de ARN total obtenido
se estimó por absorción a 260 nm (punto 4). Se sembraron 10 Pg de ARN total de
cada muestra en geles desnaturalizantes de agarosa-formaldehído (punto 4) y se
realizó la electroforesis manteniendo el voltaje constante e igual a 70 V. El gel se
lavó dos veces durante 10 min con agua destilada para eliminar el formaldehído y el
ARN fue transferido a membranas de nylon Hybond N+ (Amersham) por capilaridad
durante toda la noche, usando una solución reguladora SSC 20X. Al día siguiente,
la membrana se secó en estufa a 50 ºC durante 45 min y se aseguró la fijación del
ARN a la membrana provocando su entrecruzamiento por medio de irradiación con
luz ultravioleta (Hoefer® UVC 500 crosslinker; Amersham-Pharmacia).
20.2 Sondas utilizadas
Todas las sondas utilizadas para los ensayos de Northern y Southern blot o
para la búsqueda en la biblioteca de ADNc (ver sección 18.1) se obtuvieron
realizando reacciones de PCR con cebadores específicos para cada fragmento de
ADNc de los genes de expansina, seguido de la posterior purificación de dichos
productos a partir de geles de agarosa como se mencionó antes (punto 9). Los
programas de amplificación utilizados en cada caso se resumen en la Tabla VIII.
Las mezclas de reacción de PCR en todos los casos tuvieron la siguiente
composición: tampón de la enzima 1X; MgCl2 1,5 mM; dNTPs 62,5 PM cada uno; 10
0DWHULDOHV\0«WRGRV
PM de cada uno de los cebadores, 0,05 U/Pl de enzima Taq polimerasa (Invitrogen)
y 50 ng del molde correspondiente (banda purificada).
Los productos de reacción se corrieron en un gel, se purificaron a partir del
mismo y se cuantificaron por absorción a 260 nm (puntos 8 y 9).
20.3 Marcado radiactivo de las sondas
Las sondas se marcaron radiactivamente por el método de cebado al azar
(random priming) usando 300 ng de ADN molde (previamente calentado a 100 ºC
durante 5 min y enfriado en hielo durante 5 min), 5 Pl de tampón ADN polimerasa
10X, 2 Pl de mezcla de dCTP, dGTP y dTTP 500 PM, 1 Pl de hexámeros al azar (500
Pg/ml), 2 Pl de BSA acetilada (10 mg/ml), 1 Pl de fragmento Klenow (5 U/Pl) y 4 Pl
deD-32P-dATP (3000 PCi/mmol; 10 mCi/ml) en un volumen final de 50 Pl. La
reacción de polimerización se llevó a cabo a 37 ºC durante 1 hora. Luego, la mezcla
de reacción se sembró en una columna de Sephadex G-50 (volumen 1 ml)
equilibrada en solución reguladora TE y se centrifugó a 3000 rpm durante 1 min
para acelerar la separación entre el D-32P-dATP no incorporado (retenido en la
columna)
y
la
sonda
radiactiva
(filtrado).
Finalmente,
la
sonda
marcada
radiactivamente fue desnaturalizada durante 5 min a 100 °C y enfriada
rápidamente en hielo durante 5 min, antes de ser agregada al correspondiente tubo
de hibridación (ver punto 18.1.2).
20.4
Hibridación de las membranas
20.4.1
Hibridación usando sondas de genes de expansina
La hibridación de membranas con ARN se realizó como se indicó en el punto
18.1.2, excepto que las placas radiográficas se revelaron luego de 7 días de
exposición.
20.4.2
Hibridación de las membranas con sonda para ARNr 18S
Una vez finalizado el análisis de las membranas hibridizadas con la sonda de
la expansina de interés, se eliminó dicha sonda y cada membrana se hibridizó
posteriormente con una sonda para ARNr 18S de frutilla de modo de establecer el
control de carga. Para esto, las membranas hibridizadas con las sondas de las
expansinas se incubaron con una solución de SDS 0,5 % p/v a temperatura de
ebullición durante el tiempo necesario para que la solución llegue a temperatura
ambiente. Luego, las membranas fueron lavadas con agua destilada y se pusieron
en contacto con placas radiográficas para verificar que la sonda usada previamente
0DWHULDOHV\0«WRGRV
había sido totalmente eliminada. Posteriormente, dichas membranas fueron
sometidas al tratamiento descrito en el punto 18.1.2 usando una sonda para ARNr
18S (Tablas VII y VIII) marcada radiactivamente, con la diferencia de que los tres
últimos lavados fueron a 55 ºC y que el tiempo de exposición fue de 4 h.
21.
Obtención y análisis del promotor del gen FaEXP2
21.1 Clonado del promotor del gen FaEXP2
Para clonar la zona proximal del promotor del gen FaEXP2 se utilizó un kit
comercial (Universal Genome Walker kit; Clontech) y se procedió de acuerdo a las
indicaciones del fabricante. Brevemente, se extrajo ADN genómico como se indicó
en el punto 15, se tomaron cuatro alícuotas de 100 ng de ADN cada una y se
digirieron con las enzimas de restricción provistas con el kit (EcoRV; PvuII; DraI y
SspI). A continuación, se ligaron adaptadores (provistos con el kit) a los fragmentos
de extremos romos obtenidos y a cada una de estas mezclas se las denominó: DL1
(cortada con EcoRV), DL2 (cortada con PvuII), DL3 (cortada con DraI) y DL4
(cortada con SspI). Finalmente, se realizaron reacciones de PCR usando un cebador
específico para el gen FaEXP2 (prom2-o, Tabla VII) y un cebador correspondiente al
adaptador acoplado a los fragmentos de restricción (AP1: Adaptor Primer 1). Para
las reacciones de PCR se utilizó la enzima Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen). La
composición de la mezcla de PCR fue: tampón HF 1X; MgSO4 2 mM; dNTPs 0,2 mM
cada uno; AP1 0,2 PM; prom 2-o (Tabla VII) 0,2 PM; Polymerase Mix 0,05 U/Pl y 1
Pl de las mezclas DL1, 2, 3 o 4. El programa de PCR usado se detalla en la Tabla
VIII.
El fragmento obtenido fue clonado en el vector pGEM-T, se purificó a partir
de un gel de agarosa (puntos 8 y 9) y se envió a secuenciar (puntos 10 a 14).
21.2 Análisis bioinformático de la secuencia
El análisis bioinformático se realizó usando programas de predicción
disponibles online que utilizan bases de datos exclusivas de plantas. Se utilizó
PlantCARE
(Plant
Cis
Acting
Regulatory
Elements;
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare; Rombatus y col., 1999;
Lescot
y
col.,
2002);
PLACE
(Plant
cis
acting
regulatory
DNA
elements,
http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/; Prestridge, 1991; Higo y col., 1999); y
MatInspector
(http://www.genomatix.de/products/MatInspector/;
Cartharius
y
col., 2005).
0DWHULDOHV\0«WRGRV
21.3 Deleciones del fragmento promotor del gen FaEXP2
Para obtener deleciones del fragmento del promotor se diseñaron 4 cebadores
(Tabla VII, sección C), correspondientes a distintas zonas del extremo 5’ del
promotor, que poseen en su zona 5’ un sitio de reconocimiento para la enzima de
restricción XhoI (650p2; 500p2, 300p2 y 150p2). En el caso del extremo 3’ del
promotor, se diseñó un único cebador que incluía un sitio de reconocimiento para
la enzima HindIII (delp2-3). Estos fragmentos se obtuvieron por PCR (Tabla VIII) y
se clonaron inicialmente en pGEM-T easy (Promega). Se liberaron los fragmentos
por restricción con las enzimas XhoI y HindIII y se ligaron en el vector pGL3 basic
(Promega), el cual había sido previamente digerido con las mismas enzimas y
purificado a partir de un gel de agarosa (ver Figura 29, Capítulo II). La estructura
del vector se muestra en la Figura 49.
Figura 49: Mapa del vector pGL3 basic.
Se muestra el sitio de múltiple clonado,
el cual permite introducir el gen de
luciferasa (luc+) bajo el control del
promotor de interés.
21.4 Análisis por transformación transitoria usando el método biobalístico
Luego de determinar las condiciones óptimas (descritas en Resultados del
Capítulo II) para transformar transitoriamente discos de frutilla, se procedió de la
siguiente manera:
21.4.1
Preparación del ADN plasmídico
Se obtuvo ADN plasmídico a partir de las siguientes construcciones
realizadas en el vector pGL3 basic (Promega):
a) con el gen de luciferasa sin promotor (Control pGL3);
b) con el promotor 35S (35S-luc);
c) con los cuatro fragmentos del promotor del gen de FaEXP2 (650-luc; 500-luc;
300-luc y 150-luc).
0DWHULDOHV\0«WRGRV
Para obtener el ADN plasmídico se utilizó el kit comercial Wizard Plus SV
Minipreps DNA Purification System (Promega) y la concentración de ADN final fue
ajustada a 1 Pg/Pl.
21.4.2
Desinfección del microcarrier
Como microcarrier se utilizaron partículas de oro (1,6 Pm de diámetro) o
tungsteno (1,7 Pm de diámetro), según se indique. Se preparó una suspensión de
partículas a una concentración de 60 mg/ml en etanol absoluto, se agitó
vigorosamente con vórtex durante 30 s y se centrifugó durante 10 s a 11000 x g;
este lavado se repitió tres veces. Luego, se resuspendió el precipitado en 1 ml de
glicerol 50 % v/v preparado en agua y se repitió tres veces este lavado. Finalmente,
se resuspendió en etanol absoluto (concentración final de 60 mg/ml) y se separaron
alícuotas de 50 Pl, que fueron conservadas a 4 ºC hasta su utilización.
21.4.3
Recubrimiento de las partículas de microcarrier con ADN
plasmídico
Para recubrir las partículas de microcarrier con la construcción de interés, se
mezcló una alícuota de las partículas de microcarrier desinfectadas con 5 Pl de la
solución de ADN plasmídico; 50 Pl de CaCl2 2,5 M y 20 Pl de espermidina 0,1 M, se
mantuvo en agitación con vortex durante 3 min y se centrifugó a 11000 x g durante
10 s. Se lavaron las partículas con 500 Pl de etanol, se centrifugó nuevamente y
finalmente se resuspendieron las partículas recubiertas con el plásmido en 50 Pl de
etanol.
21.4.4
Realización de los disparos
Los disparos se realizaron en hojas o en discos de frutos maduros, blancos o
verdes grandes (recién cosechados de la planta) de 1-2 mm de espesor, incubados
durante 5 min en medio CPW12 (sales CPW: KH2PO4 0,2 mM; KNO3 1 mM; CaCl2
13,3 mM; MgSO4 1 mM; KI 1 PM; CuSO4 0,1 PM; pH = 5,8; suplementado con
manitol 12 % p/v y MOPS 20 mM pH = 7,0). Los discos se colocaron en el centro de
una placa sobre la superficie del medio sólido CPW12 (medio CPW12 con agar
sólido hasta un concentración 0,7 % p/v). El equipo utilizado para realizar los
disparos fue el sistema PDS-1000/He (BioRad). La distancia desde el disco de
ruptura hasta el macrocarrier (donde se colocaron 6 Pl del microcarrier recubierto
del plásmido de interés) fue de 4 cm. A su vez, la distancia desde el macrocarrier
(ubicado en el nivel 2, Figura 50) hasta la placa que contiene el disco del fruto (nivel
0DWHULDOHV\0«WRGRV
4, Figura 50) fue también igual a 4 cm. Las condiciones del disparo se ajustaron
utilizando discos de ruptura de 1800 psi (presión del disparo) y 28 mm Hg de vacío.
Cada disco de fruto fue disparado dos veces (una vez de cada lado), y las hojas solo
una vez en su cara abaxial. Luego se incubaron las placas a 24 ºC durante 40 h.
Posteriormente, se extrajo proteína total de los discos de fruto usando 1 ml de
reactivo
de
lisis
CCLR
(Promega),
suplementado
con
Tris-fosfato
a
una
concentración final de 300 mM y , pH 7,8. Se midió la actividad luciferasa usando
el Luciferase Assay System (Promega), midiendo la luz emitida durante 10 s en un
luminómetro
(Sirius
Luminometer;
Berthold).
Los
datos
obtenidos
en
el
luminómetro se expresan en Unidades de Luz al Azar por segundo (Random Light
Units per second; RLU/s) y en las figuras se expresan en RLU/s por miligramo de
proteína total (RLU/s. mg prot tot); el valor informado es el promedio de dos eventos
de transformación independientes. A su vez, la actividad luciferasa de una misma
muestra fue determinada por duplicado. La concentración de proteína total se
determinó usando el reactivo de Bradford (Promega).
Macrocarrier
Disco de ruptura
Ubicación de la placa
con el disco de fruto
Nivel 2
Nivel 4
Figura 50: Sistema PDS-1000/He (BioRad).
Se indica la ubicación del disco de ruptura, del macrocarrier y la placa de petri con el tejido a disparar. Se
indica además la posición de los niveles 2 y 4 donde se colocaron el macrocarrier y el fruto, respectivamente.
22.
Tratamientos con reguladores del crecimiento
22.1 Tratamientos con ABA, NAA y auxinas
Se estudió el efecto de las fitohormonas ácido abscísico (ABA), ácido
giberélico (GA3) y auxinas, aplicando la auxina sintética ácido naftalén-acético
(NAA) o eliminando los aquenios de los frutos, sobre la expresión de los genes de
expansina en estudio. Se lavaron los frutos con una solución de NaClO comercial
0DWHULDOHV\0«WRGRV
(55 g Cl/l) al 2 % v/v dos veces durante 5 min cada una, y luego con una solución
de etanol al 70 % v/v durante 2 min. Luego se secaron durante aproximadamente
10 min a temperatura ambiente y se sometieron a los tratamientos con hormonas.
Se trataron frutos (Fragaria x ananassa cv. Camarosa) en estadio de
maduración blanco en los siguientes medios:
Medio A: Solución reguladora (control): Ácido cítrico 0,06 M; Na2HPO4 0,074 M;
DMSO 2 % v/v; DTT 5 mM; pH 4,5.
Medio B: NAA 1 mM en medio A.
Medio C: ABA 1 mM en medio A.
Medio D: GA3 1 mM en medio A.
Se seleccionaron frutos blancos recién cosechados y se distribuyeron en 5
grupos de 12 frutos cada uno. Uno de ellos se dejó como Control (C) y los restantes
se destinaron a los siguientes tratamientos: i) NAA, ii) ABA, iii) GA3, y iv) se
eliminaron los aquenios de los frutos (DEA), fuente endógena de auxinas. Los frutos
Controles (C) y el grupo Deaquenado (DEA) se sumergieron durante 3 min en el
medio A y los grupos NAA, ABA y GA3 se sumergieron 3 min en los medios B, C y D,
respectivamente. Luego fueron colocados en bandejas e incubados durante 48 h a
24 ºC. El tratamiento fue repetido cada 12 h durante la incubación y finalmente los
frutos fueron congelados con N2 (l) y conservados a -80 ºC hasta su utilización.
22.2 Tratamientos con etileno y 1-MCP
Por otro lado, se realizó un experimento para analizar el efecto del etileno y
1-MCP sobre la expresión de los genes de expansina (Figura 51). Para esto se
utilizaron frutos (Fragaria x ananassa cv. Camarosa) recién cosechados en estadios
verde grande (VG) y Blanco (B). Se los trató de la siguiente manera: un grupo de 12
frutos VG y un grupo de 12 frutos B fue sumergido durante 1 min en solución de
Ethrel (ácido 2-cloroetil-fosfónico) 1 ppm (EV o EB); los grupos control (12 frutos
VG y 12 frutos B) fueron sumergidos 1 min en agua (CEV o CEB). Los cuatro
grupos se colocaron en bandejas y se incubaron a 24 ºC durante 48 h.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
FRUTOS VG
1-MCP
Control
1-MCP
10 h
Control
0h
(*)
(*)
1 día
CM
M
ME
2 días
50 h
(*) Tratamiento con ethrel
CM
M
ME
3 días
75 h
Figura 51: Esquema explicativo del tratamiento con 1-MCP y ethrel. Se indican el momento en que
se realizaron los tratamientos y los tiempos de las incubaciones. Más detalles en el texto, sección
22.2. CM: frutos control; M: frutos tratados con 1-MCP; ME: frutos tratados con 1-MCP y
posteriormente con Ethrel.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
Otro grupo de 36 frutos (VG) fue tratado del siguiente modo: 24 fueron
tratados con 1 ppm de 1-MCP en un recipiente cerrado durante 10 h, mientras 12
frutos controles (CM) se mantuvieron el mismo tiempo en otro recipiente cerrado sin
1-MCP. Luego, del grupo tratado con 1-MCP se tomaron 12 frutos y se los sumergió
1 min en una solución con 1 ppm de ethrel (ME), mientras que a los otros 12 se los
sumergió 1 min en agua (M). Todos los frutos fueron incubados durante 40 h a 24
ºC y luego se congelaron (Figura 51: 50 h= 10 h del tratamiento con 1-MCP + 40 h a
24 ºC). Se repitió la experiencia con otro grupo de 36 frutos, realizando los mismos
tratamientos, pero en este caso fueron incubados a 24 ºC durante 65 h (Figura 51:
75 h= 10 h del tratamiento con 1-MCP + 65 h de incubación a 24 ºC) y luego
congelados con N2 (l) y conservados a -80 ºC hasta su utilización.
23.
Tratamientos físicos de los frutos
23.1 Tratamiento térmico
Se cosecharon frutos en el estadio de maduración 75 % (Fragaria x ananassa
cv. Camarosa), se distribuyeron en bandejas conteniendo 20 frutos cada una, para
determinar firmeza a las 0 h, 24 h y 48 h. Además, se tomaron grupos de 10 frutos
para el análisis de expresión a las 4 h y 18 h de incubación. Las bandejas se
cubrieron (no herméticamente) con una película de PVC y se trataron térmicamente
a 45 ºC en estufa durante 3 h (Tratados). Una vez finalizado el tratamiento, se
mantuvieron a 20 ºC durante 0 h, 4 h, 18 h, 24 h o 48 h, se congelaron en N2 (l) y
se conservaron a -80 ºC hasta su utilización. Paralelamente, un lote de frutos fue
utilizado como control, incubando directamente a 20 ºC durante los tiempos
mencionados.
Para evaluar el efecto del tratamiento térmico sobre el ablandamiento, antes
de congelar los frutos se midió la firmeza (punto 2) de 20 frutos (3 medidas en cada
uno en su zona ecuatorial) Tratados o Controles a las 0, 24 y 48 h después de
realizado el tratamiento térmico.
23.2 Tratamiento con UV-C
Se cosecharon frutillas (Fragaria x ananassa cv. Aroma), con un 50 % de
madurez, y se irradiaron con una dosis de 4,1 KJ/m2 de UV-C, utilizando un banco
de lámparas germicidas y un radiómetro (Cole-Parmer Instrument Company,
Vernon Hills, Illinois, USA). Luego, las frutillas se mantuvieron a 20 ºC y se midió la
firmeza (punto 2) de los frutos Controles y de los Tratados a distintos tiempos (0 h,
48 h, 72 h y 96 h). Se congelaron muestras con N2 (l) a las 0 h, 4 h, 8 h, 18 h, 24 h,
48 h, 72 h y 96 h y se conservaron a -80 ºC hasta su utilización.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
24.
Efecto del corte del fruto
Se utilizaron plantas de la variedad Toyonaka, cultivadas en invernáculo, se
cortaron 45 frutos en estadio 75 % de maduración, de los cuales 5 fueron
congelados inmediatamente (C0), mientras que al resto se los separó en 4 grupos de
10 frutos cada uno. A la mitad de cada grupo se los trató con 1-MCP y la otra mitad
se dejó como Controles, como se describió en el punto 22.2. Se congelaron los
frutos Controles y Tratados después de incubar a 20 ºC durante 2 h (C2 y M2), 4 h
(C4 y M4) y 8 h (C8 y M8), y se conservaron a -80 ºC hasta la extracción de ARN
total por el método CTAB para ensayos de Northern blot.
0DWHULDOHV\0«WRGRV
APÉNDICE
Soluciones reguladoras
MOPS 10X
TBE 5X
MOPS 200 mM
Tris 450 mM
acetato de sodio 50 mM
ácido bórico 450 mM
EDTA 10 mM, pH = 7,0
EDTA 100 mM, pH = 8,0
SSC 20X
TE
Citrato de sodio 0,3 M
Tris 10 mM,
NaCl 3 M
EDTA 1 mM
pH = 7,0
pH = 8,0
Colorantes de muestra
ADN/ARN (10X)
Proteínas (5X)
EDTA 1 mM
Tris-HCl 1 M, pH = 6,8
Glicerol 50 % v/v
Glicerol 50 % v/v
Azul de bromofenol 0,4 % p/v
SDS 2 % p/v
2-mercaptoetanol 5 % v/v
Azul de bromofenol 1 % p/v
Medios de cultivo
LB
SOB
triptona 10 g/l
triptona 20 g/l
extracto de levadura 5 g/l
extracto de levadura 5 g/l
NaCl 5 g/l
NaCl 10 mM
pH = 7,0
KCl 2,5 mM
pH = 7,0
5HIHUHQFLDV
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