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UNIVERSIDAD DE GRANADA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE ANATOMÍA Y EMBRIOLOGÍA HUMANA
TESIS DOCTORAL
POTENCIACIÓN DEL EFECTO DE LA QUIMIOTERAPIA EN EL
TRATAMIENTO DEL CÁNCER MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DEL GEN E:
ESTUDIO EXPERIMENTAL EN CÁNCER DE MAMA, PULMÓN Y COLON
Memoria presentada por Dña. Ana Rosa Rama Ballesteros para optar al grado
de Doctora Europea por la Universidad de Granada
Granada, 29 de Junio de 2009
Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: Ana Rosa Rama Ballesteros
D.L.: GR 3777-2010
ISBN: 978-84-691-7887-4
Dña.
ANTONIA
ARÁNEGA
JIMÉNEZ,
CATEDRÁTICA
DEL
DEPARTAMENTO DE ANATOMÍA Y EMBRIOLOGÍA HUMANA DE LA
UNIVERSIDAD DE GRANADA.
HACE CONSTAR:
Que Dña. Ana Rosa Rama Ballesteros ha realizado bajo mi dirección el
trabajo de Tesis Doctoral: “Potenciación del efecto de la quimioterapia en el
tratamiento del cáncer mediante la utilización del gen E: Estudio
Experimental en cáncer de mama, pulmón y colon” durante los años 20042009 y corresponde fielmente a los resultados obtenidos.
Una vez redactada la presente memoria, ha sido revisada por mí y la
encuentro conforme para ser presentada y aspirar al grado de Doctora Europea
ante el tribunal que en su día se designe.
Y para que conste, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, expido
el presente en Granada a 29 de Junio de 2009.
Fdo. Antonia Aránega Jiménez
D. JOSE CARLOS PRADOS SALAZAR, PROFESOR TITULAR DEL
DEPARTAMENTO DE ANATOMÍA Y EMBRIOLOGÍA HUMANA DE LA
UNIVERSIDAD DE GRANADA.
HACE CONSTAR:
Que Dña. Ana Rosa Rama Ballesteros ha realizado bajo mi dirección el
trabajo de Tesis Doctoral: “Potenciación del efecto de la quimioterapia en el
tratamiento del cáncer mediante la utilización del gen E: Estudio
Experimental en cáncer de mama, pulmón y colon” durante los años 20042009 y corresponde fielmente a los resultados obtenidos.
Una vez redactada la presente memoria, ha sido revisada por mí y la
encuentro conforme para ser presentada y aspirar al grado de Doctora Europea
ante el tribunal que en su día se designe.
Y para que conste, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, expido
el presente en Granada a 29 de Junio de 2009.
Fdo. Jose Carlos Prados Salazar
Dña. CONSOLACIÓN MELGUIZO ALONSO, PROFESORA TITULAR
DEL DEPARTAMENTO DE ANATOMÍA Y EMBRIOLOGÍA HUMANA DE LA
UNIVERSIDAD DE GRANADA.
HACE CONSTAR:
Que Dña. Ana Rosa Rama Ballesteros ha realizado bajo mi dirección el
trabajo de Tesis Doctoral: “Potenciación del efecto de la quimioterapia en el
tratamiento del cáncer mediante la utilización del gen E: Estudio
Experimental en cáncer de mama, pulmón y colon” durante los años 20042009 y corresponde fielmente a los resultados obtenidos.
Una vez redactada la presente memoria, ha sido revisada por mí y la
encuentro conforme para ser presentada y aspirar al grado de Doctora Europea
ante el tribunal que en su día se designe.
Y para que conste, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, expido
el presente en Granada a 29 de Junio de 2009.
Fdo. Consolación Melguizo Alonso
No hay palabras que puedan describir mi
profundo agradecimiento hacia mis Padres y
hermana, quienes me apoyaron todos estos
años, por su infinito amor, cariño, y
comprensión por el tiempo que no estuve con
ellos.
A Alex, por acompañarme en los buenos
y malos momentos.
Gracias por ayudarme a que este
momento llegara.
Quiero expresar mis más sinceros agradecimientos:
A mis directores, la Prof. Dña. Antonia Aránega Jiménez, el Prof. Jose
Carlos Prados Salazar y la Prof. Consolación Melguizo Alonso, por haberme
permitido realizar esta tesis bajo su dirección, poniendo a mi disposición todo lo
necesario para su realización, lo que me ha permitido introducirme en el
apasionante campo de la investigación. Les quiero agradecer también su apoyo
desinteresado, su dedicación constante, su ayuda y la confianza depositada en
mí
Un agradecimiento especial al Prof. Luis Álvarez Guisado, cuyas
anécdotas y amabilidad alegraban los días de trabajo en el laboratorio.
Al Prof. Miguel Burgos Poyatos, por permitirme iniciarme en la
investigación y acogerme en su laboratorio.
Al Prof. Robberto Maddedu, por haber posmilitado mi estancia en Sassari.
A los profesores, y compañeros, Houria Boulaiz, Macarena Perán, Celia
Vélez, Esmeralda Carrillo, Fernando Rodríguez, Octavio Caba, Juan Antonio
Marchal, Fidel Hita y Antonio Martínez.
A todos mis compañeros, Elena, Inma, Blanca, Marian, Ester, Raúl,
Alberto, Manuel, Jaime, Aitor, Juandi y Toni.
A todos mis amigos, que han estado apoyándome constantemente, y en
especial a “mi compi” Ana, por su inestimable amistad, apoyo y ánimo que han
hecho el transcurso de esta tesis más llevadera.
A todo el personal del Centro de Instrumentación Científica de la
Universidad de Granada, por su colaboración.
Al grupo Vilpoma S.I y la OTRI, por haberme asignado una beca con la
que he podido la mayor parte del trabajo que constituye esta tesis.
Agradecer por último, a todas aquellas personas que no siendo
mencionadas aportaron algo a la realización de esta Tesis Doctoral
Mi consejo a los estudiantes de ciencia es
que si tienes el anhelo de llevar a cabo
investigación científica, adquiere el
aprendizaje preciso y por todos los medios
hazlo. Difícilmente alguna otra cosa te
dará tanta satisfacción y, sobre todo, tal
sentido de logro” Severo Ochoa
I.ÍNDICE
Ana Rosa Rama Ballesteros Índice
II.INTRODUCCIÓN................................................................................ - 1 1.- TERAPIA GÉNICA. ESTRATEGIAS Y APLICACIONES ..................... - 3 1.1.- Estrategias de terapia génica..................................................... - 3 1.2.- Métodos de transfección génica................................................ - 5 1.2.1.- Vectores virales.................................................................. - 6 1.2.2.- Métodos no virales, mecánicos y fisicoquímicos................ - 8 1.3.- Tipos de transfección ................................................................. - 9 1.3.1- Genes no integrados........................................................... - 9 1.3.2.-Genes integrados................................................................ - 9 1.4. Terapia génica y expresión tejido específica........................... - 10 1.5.- Aplicación de la Terapia Génica. ............................................. - 11 2.- CÁNCER. GENERALIDADES. ........................................................... - 12 2.1.- Tratamiento para el cáncer. Generalidades ............................ - 13 2.1.1.- Cirugía ............................................................................. - 13 2.1.2.- Quimioterapia................................................................... - 13 2.1.3.- Radioterapia..................................................................... - 13 2.1.4.- Terapia fotodinámica........................................................ - 14 2.1.5.- Terapia génica. ................................................................ - 14 3.- CÁNCER DE MAMA ........................................................................... - 15 3.1. - Factores de riesgo del cáncer de mama. ............................... - 16 3.1.1.- Factores hormonales. ...................................................... - 16 3.1.2.- Factores ambientales....................................................... - 16 3.1.3.- Factores genéticos........................................................... - 16 3. 2.- Clasificación del cáncer de mama.......................................... - 17 3.2.1.- Clasificación histológica del cáncer de mama.................. - 17 3.2.2.- Clasificación por estadios ................................................ - 18 3.3. - Terapia convencional en cáncer de mama. ........................... - 21 3.3.1.- Cáncer de mama en estadios I, II, IIIA y operable IIIC..... - 21 3.3.1.a.- Tratamiento locorregional................................... - 21 3.3.1.b.- Radioterapia adyuvante...................................... - 21 3.3.1.c.- Terapia sistémica adyuvante .............................. - 22 -
Ana Rosa Rama Ballesteros Índice
3.3.2.- Cáncer de mama en estadio IIIB, inoperable IIIC o
inflamatorio......................................................................................... .................................................................................................... - 25 3.3.3.- Cáncer de mama en estadio IV, recurrente y metastático - 25 4.- CÁNCER DE PULMÓN....................................................................... - 26 4.1.- Factores de riesgo del cáncer de pulmón............................... - 27 4.1.1.- Tabaquismo ..................................................................... - 27 4.1.2.- Tabaquismo pasivo ("Coff, coff")...................................... - 28 4.1.3.- Asbesto y Radón.............................................................. - 28 4.1.4.- Dieta................................................................................. - 28 4.1.5.- Predisposición genética. .................................................. - 28 4.2.- Clasificación del cáncer de pulmón. ....................................... - 29 4.2.1.- Clasificación de la organización Mundial de la Salud (OMS)
del cáncer de pulmón .................................................................. - 29 4.2.1.a.- Cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) o
microcítico, ....................................................................... - 29 4.2.1.b.- Cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPNCP)
o no microcítico ................................................................ - 29 4.2.2.- Clasificación por estadíos del cáncer de pulmón ............. - 30 4.3.- Terapia convencional en cáncer de pulmón........................... - 32 4.3.1.- Tratamiento en estadios I y II. .......................................... - 32 4.3.2.- Tratamiento en estadios III y IV........................................ - 32 4.3.2.a.- CPNCP estadio III resecable.............................. - 32 4.3.2.b.- CPNCP Estadio III No Resecable ...................... - 33 4.3.2.c.- CPNCP Estadio IV No Resecable ...................... - 33 5.- CÁNCER DE COLON ......................................................................... - 34 5.1.- Factores de riesgo del cáncer de colon. ................................. - 35 5.1.2.- Fibra dietética................................................................... - 35 5.1.3.- pH fecal............................................................................ - 36 5.1.4.- Consumo de alcohol ........................................................ - 36 5.1.5.- Metales trazadores........................................................... - 36 5.1.6.- Factores genéticos........................................................... - 36 5.2.- Clasificación del cáncer de colon............................................ - 37 -
Ana Rosa Rama Ballesteros Índice
5.2.1- Grasa dietética .................................................................. - 35 5.2.1.- Clasificación anatomopatológica del cáncer de colon...... - 37 5.2.1.a.- Adenocarcinoma................................................. - 37 5.2.1.b.- Carcinoma mucinoso.......................................... - 37 5.2.1.c.- Carcinoma de células pequeñas ........................ - 37 5.2.1.d.- Carcinoma escamoso......................................... - 37 5.2.1.e.- Carcinoma adenoescamoso............................... - 37 5.2.2- Clasificación por estadíos del cáncer de colon ................. - 38 5.3.- Terapia convencional del cáncer de colon ............................. - 38 5.3.2.- Tratamiento en el estadío IV. ........................................... - 38 6.- MODELOS EXPERIMENTALES PARA EL ESTUDIO DEL CÁNCER.
ESFEROIDES MULTICELULARES......................................................... - 39 6.1- Clasificación de los MTS ........................................................... - 41 6.1.1.- MTS clonogénicos............................................................ - 41 6.1.2.- MTS agregados................................................................ - 41 6.2- Formación de MTS ..................................................................... - 42 6.3- Estructura de los MTS. .............................................................. - 43 6.4- Crecimiento de los MTS............................................................. - 44 6.5- Resistencia multicelular ............................................................ - 44 6.5.1.- Resistencia adquirida....................................................... - 45 7.- TERAPIA GÉNICA y CÁNCER........................................................... - 46 7.1.- Inhibición de oncogenes .......................................................... - 46 7.1.1.- Bloquear la expresión de oncogenes mediante terapia
antisentido................................................................................... - 46 7.1.2.- Diseño de genes que codifican anticuerpos intracelulares que
bloquean la construcción de oncoproteínas ................................ - 47 7.1.3.- Uso de oligonucleótidos que activen selectivamente los
mecanismos celulares de reparación del ADN............................ - 48 7.1.4.- Utilización de ribozimas para inhibir la expresión génica. - 48 7.2.- Sustitución de oncosupresores............................................... - 49 7.3.- Vacunas ..................................................................................... - 49 7.4.- Sistemas asesino-suicidas....................................................... - 50 -
Ana Rosa Rama Ballesteros Índice
8.- AVANCES EN LA TERAPIA GÉNICA APLICADA A CANCER DE
MAMA, PULMON Y COLON.................................................................... - 51 8.1.- Terapia génica en cancer de mama......................................... - 52 8.2.- Terapia génica en cancer de pulmón. ..................................... - 54 8.3.- Terapia génica en cáncer de colon.......................................... - 55 9.- NUEVOS GENES SUICIDAS. APLICACIÓN EN TERAPIA GÉNICA - 56 9.1.- El Gen Gef.................................................................................. - 56 9.2.- El Gen E ..................................................................................... - 58 -
III.OBJECTIVES .................................................................................. - 62 IV.MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................. - 66 1.- LÍNEAS CELULARES ....................................................................... - 67 –
2.- CULTIVO DE LÍNEAS CELULARES.................................................. - 67 3.- CONGELACIÓN DE LAS LÍNEAS CELULARES............................... - 67 4.- MANTENIMIENTO DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO........................ - 68 4.1.- Cambio de medio. ..................................................................... - 68 4.2.- Lavado de las células. .............................................................. - 68 4.3.- División del cultivo celular. ...................................................... - 68 5.- CONTAJE CELULAR. ........................................................................ - 69 6.- CONSTITUCIÓN Y CULTIVO DE LOS ESFEROIDES TUMORALES. -69 7.- AGENTES CITOTÓXICOS ................................................................. - 69 8.- INSERTOS UTILIZADOS EN TERAPIA GÉNICA. ............................. - 70 8.1.- Insertos. ..................................................................................... - 70 8.2.- PCR para obtención de insertos.............................................. - 71 9.- VECTORES......................................................................................... - 72 10.- LIGACIÓN CON EL VECTOR........................................................... - 72 11.- TRANSFORMACIÓN BACTERIANA ............................................... - 72 12.- MÉTODO DE CULTIVO BACTERIANO. .......................................... - 74 13.- EXTRACCIÓN DE PLÁSMIDO. ........................................................ - 74 14.- ANÁLISIS DE LOS PLÁSMIDOS RECOMBINANTES..................... - 75 15.- ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA. ................................. - 75 15.1.- Preparación del gel. ..................................................................... - 76 15.2.- Electroforesis................................................................................ - 76 -
Ana Rosa Rama Ballesteros Índice
16.- TRANSFECCIÓN DEL PLÁSMIDO EN LAS CÉLULAS. ................. - 77 16.1.- Método de transfección. ......................................................... - 77 16.2.- Control de la transfección ...................................................... - 77 17.- EXTRACCIÓN DE ARN. ................................................................... - 78 18.- TRANCRIPTASA REVERSA Y REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (RT-PCR). ........................................................................ - 79 19.- ESTUDIO DE EFICACIA DE TRANSFECCIÓN ............................... - 79 19.1.- Citometria de flujo................................................................... - 80 19.2 Inmunofluorescencia ................................................................ - 80 20.- PROCESAMIENTO DE LOS CULTIVOS CELULARES PARA LA
ELECTROFORESIS EN SDS-PAGE. ...................................................... - 80 20.1.- Extracción de proteínas totales. ............................................ - 80 20.2.- Cuantificación proteica........................................................... - 81 20.3.- SDS-PAGE ............................................................................... - 81 21.- IDENTIFICACIÓN DE LAS BANDAS PROTÉICAS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA POR INMUNOBLOTING. ......................................... - 82 21.1.- Inmunobloting ......................................................................... - 82 21.2.- Inmunodetección de proteínas. ............................................. - 82 22.- ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO ................................................ - 83 22.1.- Detección inmunohistoquímica ............................................. - 83 22.2.- Tinción hematoxilina-eosina. ................................................. - 84 23.- TRATAMIENTO COMBINADO MEDIANTE EL GEN E Y GEF Y
AGENTES CITOTÓXICOS....................................................................... - 84 24.- ESTUDIO DE LA PROLIFERACIÓN ................................................ - 85 25.- ESTUDIO DE LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA (APOPTOSIS).
.................................................................................................................. - 86 25.1.- Marcaje nuclear mediante DAPI............................................. - 86 25.2.- Fragmentación de ADN........................................................... - 87 25.3.- Estudio mediante Anexina V-FITC e Ioduro de Propidio ..... - 87 25.3.1.- Estudio mediante citometría de flujo............................ - 87 25.3.2.- Estudio mediante microscopía confocal ...................... - 88 25.4.- Estudio del potencial de membrana mitocondrial mediante
DIOC6. ................................................................................................ - 88 -
Ana Rosa Rama Ballesteros Índice
26.- ANALISIS DE LA MORFOLOGÍA .................................................... - 88 26.1.- Microscopía óptica.................................................................. - 88 26.2.- Microscopía de transmisión................................................... - 88 26.2.1.- Fijación de las células. ................................................ - 88 26.2.2.- Inclusión de la muestra................................................ - 89 26.2.3.- Cortes ultrafinos. ......................................................... - 89 26.2.4.- Método de tinción. ....................................................... - 90 26.3.- Microscopía de barrido........................................................... - 90 27.- ESTUDIO ESTADÍSTICO.................................................................. - 90 -
V.RESULTADOS ................................................................................. - 93 1.-
GEN
E,
GEN
GEF
Y
ADN
EUCARIÓTICO:
ESTUDIO
DE
HOMOLOGÍAS......................................................................................... - 95 2.-
GENERACIÓN
DE
VECTORES
TERAPÉUTICOS
CON
GENES
SUICIDAS. ............................................................................................... - 95 3.- PROLIFERACIÓN CELULAR TUMORALES DE CÁNCER DE MAMA
(MCF7), CÁNCER DE PULMÓN (A549) Y CÁNCER DE COLON (T84). - 99 4.- EXPRESIÓN DE E EN LAS CÉLULAS TUMORALES LÍNEAS MCF7,
A549 y T84. ............................................................................................ - 101 4.1.- Estudio de la eficacia de la transfección .............................. - 101 5.- EFECTO DE E SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE LAS CÉLULAS
TUMORALES LÍNEAS MCF7, A549 y T84. .......................................... - 103 6.- PROLIFERACIÓN DE LAS CÉLULAS TUMORALES. TERAPIA
COMBINADA. ........................................................................................ - 104 6.1.- Terapia combinada mediante la transfección del gen E y agentes
citotóxicos en células MCF7 de cáncer de mama.............................. - 104 6.1.1- Efecto de la terapia combinada con Taxol sobre la
proliferación de la línea MCF7................................................ - 104 6.1.2.- Efecto de la terapia combinada con Docetaxol sobre la
proliferación de la línea MCF7................................................ - 106 6.1.3.- Efecto de la terapia combinada con Doxorrubicina sobre la
proliferación de la línea MCF7................................................ - 107 6.2.- Terapia combinada mediante la transfección del gen E y
agentes citotóxicos en células A-549 de cáncer de pulmón ....... - 108 -
Ana Rosa Rama Ballesteros Índice
6.2.1.- Efecto de la terapia combinada con Taxol sobre la
proliferación de la línea A-549 ................................................ - 109 6.2.2.- Efecto de la terapia combinada con carboplatino sobre la
proliferación de la línea A-549. ............................................... - 110 6.2.3.- Efecto de la terapia combinada con gemcitabina sobre la
proliferación de la línea A-549. ............................................... - 111 6.3.- Terapia combinada mediante la transfección del gen E y
agentes citotóxicos en células T-84 de cáncer de colon............. - 112 6.3.1.- Efecto del 5-Fluoracilo/Ácido Folínico sobre la proliferación
celular .
.............................................................................. - 112 -
6.3.2.- Efecto del 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Irinotecán sobre la
proliferación celular. ............................................................... - 114 6.3.3- Efecto del 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Oxaliplatino sobre la
proliferación celular. ............................................................... - 116 7.- TERAPIA COMBINADA APLICADA A ESFEROIDES ................... - 119 –
7.1.- Efecto del gen E sobre la proliferación de esferoides de la línea
MCF-7. .............................................................................................. - 119 7.2.- Efecto de la terapia combinada con Taxol sobre la proliferación
de los esferoides de la línea MCF7 ................................................ - 120 7.3.- Efecto de la terapia combinada con Docetaxol sobre la
proliferación de los esferoides de la línea MCF7. ........................ - 121 7.4.- Efecto de la terapia combinada con Doxorrubicina sobre la
proliferación de los esferoides de la línea MCF7. ........................ - 122 8.-
REDUCCIÓN
DE
LAS
CONCENTRACIONES
EFECTIVAS
DE
AGENTES CITOTÓXICOS FRENTE A CÁNCER DE MAMA, PULMÓN Y
COLON EN BASE A SU ASOCIACIÓN CON LA EXPRESIÓN DE E... - 123 8.1.- Reducción de concentraciones efectivas en la línea MCF7.- 123 8.2.- Reducción de concentraciones efectivas en la línea A-549.- 124 8.3.- Reducción de concentraciones efectivas en la línea T-84. . - 126 8.4.- Reducción de concentraciones efectivas en esferoides de la
línea MCF7. ...................................................................................... - 127 9.- ESTUDIO DE LA INDUCCIÓN DE APOPTOSIS.............................. - 128 -
Ana Rosa Rama Ballesteros Índice
9.1.- Aproximación mediante tinción con DAPI y electroforesis en gel
de agarosa ....................................................................................... - 128 9.2.- Estudio mediante Anexina (FACScan). ................................. - 129 9.2.1.- Análisis mediante Anexina en la línea MCF7. ................ - 130 9.2.2- Análisis mediante Anexina de la línea A-549 .................. - 131 9.2.3- Análisis mediante Anexina V-FITC de la línea T-84........ - 132 9.3.- Estudio de caspasas: Western-Blot e Inmunohistoquímica - 134 10.- ESTUDIO DE LA MODIFICACIÓN DEL POTENCIAL DE MEMBRANA
................................................................................................................ - 136 11.- EFECTO DE E SOBRE LA MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS
TUMORALES ......................................................................................... - 137 11.1.- Morfología celular. Microscopio óptico............................... - 137 11.2.- Morfología celular. Microscopio de Barrido y de transmisión
.......................................................................................................... - 138 12.-
ESTUDIO
COMPARATIVO
DE
LAS
MODIFICACIONES
MORGOLÓGICAS QUE INDUCEN DOS GENES SUIDCIDAS (Gef y E) EN
CÉLULAS DE CÁNCER DE PULMÓN .................................................. - 140 -
V.DISCUSIÓN .................................................................................... - 147 VI.CONCLUSIONS............................................................................ - 173 -
II.INTRODUCCIÓN
La respuesta a las
bases moleculares
de muchas patologías,
especialmente cáncer, ahora demanda el diseño racional de intervenciones
moleculares para regímenes terapéuticos. En los últimos 15 años, el campo de
la terapia génica ha emergido como una plataforma terapéutica potencialmente
poderosa al servicio de este fin (Glasgow y cols, 2006).
La terapia génica se puede definir como “el conjunto de técnicas que
permiten vehiculizar secuencias de ADN o de ARN al interior de células diana,
con objeto de modular la expresión de determinadas proteínas que se
encuentran alteradas, revirtiendo así el trastorno biológico que ello produce”.
La terapia génica se presenta como una promesa terapéutica de utilidad
en patologías tan diversas como las infecciosas, las autoinmunes, las
hereditarias y también en las tumorales o lo que denominamos en general
CÁNCER.
1.- TERAPIA GÉNICA. ESTRATEGIAS Y APLICACIONES
1.1.- Estrategias de terapia génica.
La terapia génica puede ser aplicada siguiendo dos estrategias básicas
que podíamos denominar in vivo y ex vivo.
1) Terapia génica in vivo: el material genético se introduce directamente
en las células del organismo a través del torrente sanguíneo (mediante inyección
intravenosa). Se emplea en células difíciles de extraer e implantar nuevamente.
Su ventaja sobre las técnicas in vitro es su mayor sencillez. Sin embargo,
presenta el inconveniente de no poder seleccionar las células transfectadas,
tampoco podemos amplificar las células transducidas y es difícil conseguir un
alto grado de especificidad tisular, por lo que la eficacia de esta técnica depende
directamente de la correcta transferencia y expresión del gen.
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
2) Terapia génica ex vivo: el material genético se introduce en las células
previamente extraídas del tejido u órgano del paciente. Posteriormente son
disgregadas y crecidas en condiciones de cultivo. Finalmente son transfectadas
y seleccionadas con el fin de amplificarlas y reimplantarlas en el paciente. Es la
técnica más utilizada por las ventajas que presenta:
El riesgo de rechazo es mínimo.
•
Permite la selección del tipo de célula a tratar.
•
Se puede controlar el proceso, lo que aumenta la eficacia de la
transducción.
Aunque también presenta diversos inconvenientes:
•
Mayor complejidad.
•
Mayor coste.
•
No se pueden tratar aquellos tejidos que no crecen en cultivo.
•
Posibilidad de contaminación de los cultivos al ser manipulados.
-4-
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Tanto un caso como otro pueden llevarse a cabo de diferentes formas:
•
Por modificación génica, mediante la cual el gen defectuoso es
normalizado por mutagénesis dirigida.
•
Por cirugía génica, mediante la cual el gen defectuoso es sustituido
por su versión normal.
•
Por inserción génica, mediante la cual se introduce en las células una
nueva versión normal del gen defectuoso sin modificar éste.
La imposibilidad de determinar in vivo si la transferencia génica ha sido
efectiva; qué órganos o tejidos han sido transducidos; en dónde se expresa el
transgén; cuánto dura y de qué magnitud es dicha expresión, puede ser crucial
al momento de conocer o predecir el comportamiento del vector administrado. El
desarrollo de un método no invasor aplicable a humanos que permitiera
determinar in vivo de manera simple y repetida la localización y magnitud de la
expresión génica significaría un avance de gran trascendencia (Mazzolini, 2002).
1.2.- Métodos de transfección génica.
Son varios los procedimientos por los que se puede conseguir la
transferencia aunque su eficiencia depende de factores como:
-5-
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
•
Tipo de célula a transfectar.
•
Pureza del material genético que se va a transfectar.
•
Método utilizado para transfectar.
Debemos tener presente que el aumento en la eficacia de transfección es
proporcional al número de células que mueren en el proceso: a mayor eficacia,
mayor número de células muertas. Y es que las células diana deben sobrevivir a
su extracción, al proceso de transfección y a su reintroducción en el organismo.
Aunque lo más importante en la elección del método y su correcta aplicación se
encuentra en la capacidad que muestre la célula diana en mantener la estructura
y funcionamiento del material genético transfectado.
Actualmente los métodos de transfección se llevan a cabo valiéndose de
la ayuda de vectores, pudiéndose clasificarse en vectores virales y no virales
(Dulak y cols, 2006). Cuando se utilizan vectores virales para la transfección se
suele hablar de transducción.
1.2.1.- Vectores virales
La manipulación de virus es uno de los abordajes iniciales (St George,
2003). Estos elementos tienen una historia establecida en la investigación
molecular de la biología y de la genética por tres razones: la facilidad y la
eficacia con las cuales los cassettes genéticos virales específicos se pueden
introducir en las células; el conocimiento acumulado extenso del virus y sus
mecanismos de transferencia del gen en los cromosomas; y el gran número de
sitios en los genomas en los cuales pueden integrarse (Hackett y cols., 2007).
Sin embargo, un problema fundamental es la integración al azar que podría
potencialmente causar mil millones de las mutaciones insercionales (Miller y
cols., 2005). Ésto es más problemáticos que las mutaciones al azar, pues los
vectores virales se integran de forma preferente en la codificación o las regiones
reguladoras de genes expresados, a menudo dando por resultado la
sobreexpresión de los genes en los cuales se integran (Bushman y cols., 2005).
Los tipos de vectores virales se citan a continuación:
•
Adenovirus (Khalighinejad y cols., 2008).
-6-
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
•
Virus adenoasociados (Gregorevic y cols., 2004).
•
Virus vaccinia (Liu y cols., 2008).
•
Herpesvirus (Nishiyama y Goshima, 2007).
•
Retrovirus (Mikkers y Berns., 2003).
TABLA 1
VENTAJAS y DESVENTAJAS DE LOS PRINCIPALES VECTORES VIRALES
PARA TERAPIA GENETICA
Retrovirus
- Estabilidad a largo plazo
-
Transduce
- No induce inmunidad
división
células
en
- Biología bien estudiada
Adenovirus
- Gran capacidad para
genes largos
-Transduce células que no
están en división
- Altos títulos obtenibles
Virus asociados a adenovirus
- Expresión genética es
transiente (gen no integrado
al
genoma)
Respuesta
inmune
significativa
- No causa enfermedad
- Sitio de integración
- Poca capacidad para el
específico
- Expresión estable
Virus de Herpes Simple
tamaño del gen terapéutico
- Transduce células que no
están en división
- Gran capacidad para
genes largos- Eficiente
parneuronas
-7-
- Citotoxicidad en células
infectadas
-
Expresión
transientes
genética
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
1.2.2.- Métodos no virales, mecánicos y fisicoquímicos
Fueron desarrollados como alternativa debido a ciertos inconvenientes
que presentan los vectores virales. Entre sus ventajas encontramos su fácil
producción, son poco tóxicos, no son inmunogénicos y no presenta limitaciones
en el tamaño del material genético a transferir. Su inconveniente es la baja
proporción de células transfectadas con el ADN foráneo, los glicosaminoglicanos
de la superficie celular inhiben la transfección in vitro (Ruoponen y cols., 2004), y
que el gen introducido pude alterarse al pasar por el citoplasma o al integrarse
de manera no específica en el genoma celular, ya que debe ser transportado al
núcleo para buscar la maquinaria transcripcional (Lechardeur y Lukacs, 2002;
Lukacs y cols., 2000), y esto debe ocurrir durante la mitosis (Laitala-Leinonen,
2005). Podemos citar como físicos:
•
Microinyección (Hirabayashi, 2008).
•
Electroporación (Zhou y Dean, 2007).
•
Bombardeo con microproyectiles (Köchling y cols., 2003)
•
Podemos citar como químicos:
•
Precipitación con fosfato cálcico (Eguchi y Yamaguchi, 2007).
•
Conjugados ADN-proteínas (Guo y cols., 2007).
•
Liposomas (Liu y cols., 2008)
-8-
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Transfección génica por liposomas
Lípidos
DNA
Liposoma
1.3.- Tipos de transfección
Con la transferencia génica, los genes pueden integrarse en el ADN de la
célula o quedarse como elementos genéticos extracromosómicos, denominados
episomas.
1.3.1- Genes no integrados.
Se trata de una transfección transitoria, ya que al encontrarse el gen
introducido como epitoma, no se segrega igualmente a las células hijas. En
principio, esta falta de expresión a largo plazo pude ser un problema, sin
embargo, no en todos los casos se requiere una expresión tan larga. Éste es el
caso del cáncer, en el que se busca la eliminación de las células transfectadas,
por lo que tras la eliminación del tumor, el ADN foráneo ya no es necesario.
1.3.2.-Genes integrados.
Se trata de una transfección estable, ya que al integrarse el gen en el
cromosoma se perpetúa en las siguientes generaciones, obteniéndose una
expresión a largo plazo. La aplicación de esta técnica va encaminada a la
transfección de células madres de diferentes tejidos, ya que presentan una
activa división dando lugar a nuevas células madres y a células maduras del
tejido (Yla-Herttuala y Martin, 2000). Obtendríamos así una población que se
perpetúa, existiendo la posibilidad de curar anomalías genéticas.
-9-
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Los inconvenientes de esta transfección se encuentra en el azar: la
inserción de los genes en el cromosoma varía de unas células a otras. Puede
ocurrir que el gen al insertarse no se exprese por localizarse en zonas muy
condensadas, que inactive un gen crucial para la célula conduciendo a la
apoptosis celular, la activación de un oncogén... (Haider y cols., 2008). Por este
motivo sólo podemos estar seguros de que la transfección ha sido la esperada
en experiencias ex vivo, ya que nos permite seleccionar las células donde la
integración ha sido correcta.
1.4. Terapia génica y expresión tejido específica.
La construcción transgénica debe constar del gen que queremos
expresar pero puede ir acompañada de un promotor que dirija su expresión
hacia un tejido de forma específica. Este hecho es de enorme importancia en
patologías como el cáncer en las que se pretende que nuestro gen actúe sólo
sobre las células alternadas reduciéndose los efectos secundarios derivaron de
la expresión del gen en células normales (Yun y cols., 2008). A nivel
experimental se puede añadir un gen indicador (reporter) que ponga de
manifiesto en qué células y tejidos se está produciendo la expresión de nuestra
construcción. Para ello el gen indicador se coloca bajo el control del mismo
promotor, frecuentemente mediante la inclusión de un IRES (lugar interno de
unión a ribosomas) que permite la expresión de dos secuencias codificadoras a
partir del mismo mensajero. El gen indicador más utilizado es el lacZ, que
codifica para la proteína bacteriana B-galactosidasa, y que permite tras la
incubación con el sustrato adecuado, lo localización de los tejidos donde se
localiza su expresión. Se ha extendido el uso de marcadores luminescentes
como la luciferasa para su detección, o fluorescentes, como la GFP o sus
variantes (Yun y cols., 2008). Una variante en el uso del transgénico no persigue
la expresión de un gen, sino caracterizar una expresión reguladora. En esta
aproximación se combina un promotor del que se desconoce su lugar o tiempo
de acción dirigiendo la expresión de un gen indicador. Esta aproximación se ha
utilizado exhaustivamente para determinar el área de influencia de promotores y
regiones reguladoras del genoma.
- 10 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Así pues, el promotor usado determinará tanto el lugar como el momento
del desarrollo en los que el transgén se exprese, por lo que la elección debe ser
cuidadosamente sopesada para los fines que buscamos. Existen promotores
ubicuos, que permiten la expresión en todos los tejidos del animal como el
promotor vírico CMV. Pero el creciente conocimiento de promotores específicos
de tejido ha permitido crear transgenes de expresión restringida a determinados
tejidos o linajes celulares. Por ejemplo si colocamos nuestro gen bajo el control
del promotor TTS conseguiremos su expresión selectiva ese diseñamos que se
apunta específicamente a las células cancerosas del pulmón pero no a otros
tipos de células del cáncer o del normal incluyendo las células madre (Fukazawa
y cols., 2007).
1.5.- Aplicación de la Terapia Génica.
En la actualidad, la terapia génica puede ser usada para el tratamiento de
enfermedades hereditarias o adquiridas y puede realizarse a dos niveles,
germinal o somático, con distinto grado de posibilidad técnica.
1) Terapia génica de células germinales: implica la modificación genética
de todas las células del organismo y el paso de estas modificaciones a la
descendencia. Su correcta aplicación eliminaría de forma definitiva las
enfermedades congénitas, ya que la corrección de la anomalía se transmitiría de
generación en generación. Sin embargo, debido a sus implicaciones éticas
respecto a la manipulación de las células germinales humanas, dicha técnica no
puede ser desarrollada.
2) Terapia génica somática: implica la modificación genética de todas las
células no germinales, es decir, de las células somáticas o constituyentes del
organismo, por lo que las generaciones posteriores nos se verían afectadas (Zhu
y cols., 2007). Su aplicación eliminaría las enfermedades genéticas heredadas o
adquiridas. Actualmente sólo ésta es la que se lleva a cabo, por no presentar
impedimentos éticos siempre que su fin sea la curación de enfermedades.
Estas técnicas abren un nuevo camino en la curación de determinadas
enfermedades, como pueden ser:
- 11 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
•
Patologías del sistema inmune (Ye y cols., 2005).
•
Patologías infecciosas como el SIDA (Engelman y Cherepanov,
2008).
•
Patologías hereditarias debidas a la expresión no correcta de un
determinado gen o su deficiencia (Price y cols., 2006).
•
Patologías tumorales, donde el conocimiento de la anatomía
molecular de las células cancerosas permite que la terapia génica
pueda convertirse en un método potencial para la terapia del cáncer,
no solo de forma terapéutica, sino también preventiva (Zhangy cols.,
2007).
2.- CÁNCER. GENERALIDADES.
La proliferación celular está cuidadosamente regulada. La activación de
un oncogén se implica en el control positivo del crecimiento celular, lo que
conduce a la producción de una neoplasia. La transformación celular - el
proceso por el cual una célula normal “es transformada” en mala - ocurre con la
acumulación de mutaciones, así como los cambios epigenéticos, que activan
oncogenes o genes supresores del tumor y llevan a la extensión clónica
incontrolada (Pedraza-Fariña, 2006). Ésto suele ocurrir cuando aumenta el
número de errores en la reparación y detección de las mutaciones o cuando el
tejido está expuesto de forma reiterada a un agente carcinógeno (Copagni y
Cristofori, 2000).
Las células tumorales presentan diferentes características que las
diferencian de las células normales:
•
Cambios morfológicos y estructurales, generalmente son más
redondeadas que las normales, porque se han alterado las moléculas
de adhesión celular que posibilitan las uniones intercelulares (Hinton y
cols., 2008). La reducida adhesividad intercelular y las alteraciones en
el citoesqueleto contribuyen a sus cambios morfológicos.
•
Índice mitótico elevado, es decir se dividen con mayor rapidez que las
normales, ya que sintetizan sus propios factores de crecimiento.
- 12 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
•
Introducción
Fenotipo diferente, existe una relación núcleo citoplasmática elevada,
con nucleolos prominentes y mitosis abundantes.
•
Pueden tener actividad angiogénica, es decir, que generan factores
que inducen la formación de nuevos vasos a fin de suministrarle los
recursos materiales y energéticos para su desarrollo dentro del tejido
donde aparece la localización primaria y metástasis secundarias
(Harlozinska, 2005).
2.1.- Tratamiento para el cáncer. Generalidades
El tratamiento depende de una serie de factores, incluyendo el tipo de
cáncer, del tamaño, sitio y extensión del tumor, y de la salud general del
paciente. Se pueden usar muchos tratamientos diferentes y combinaciones de
tratamientos para controlar el cáncer o para mejorar la calidad de vida al reducir
los síntomas. Tanto de forma aislada como combinadas, las principales
estrategias terapéuticas frente al cáncer son:
2.1.1.- Cirugía.
Tiene por objetivo erradicar la masa tumoral o en algunos casos
disminuirla. Esta última situación se produce cuando el tumor ha alcanzado una
extensión en la que la extirpación total es imposible. El éxito de la cirugía
depende por tanto del diagnóstico precoz de la patología.
2.1.2.- Quimioterapia.
La quimioterapia es el uso de fármacos anticancerosos para destruir las
células cancerosas. Se puede usar para disminuir el crecimiento del cáncer o en
algunos casos sólo para aliviar los síntomas (quimioterapia paliativa).
2.1.3.- Radioterapia.
Está dirigida a un área limitada, el área tumoral, y puede usarse antes de
la cirugía para reducir el tamaño de un tumor o después de la cirugía para
destruir cualquier célula cancerosa que haya quedado en el área tratada. La
radiación puede aplicarse como radiación externa (desde un sistema emisor) o
- 13 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
bien mediante un implante radiactivo que se coloca directamente dentro del
tumor o cerca de él (radiación interna).
2.1.4.- Terapia fotodinámica.
Consiste en el uso de un compuesto químico especial que se inyecta en
el torrente de la sangre, es expulsado rápidamente de las células normales pero
permanece por más tiempo en las células cancerosas. Una luz láser dirigida al
cáncer hace reaccionar el compuesto químico, el cual lesiona las células
cancerosas.
2.1.5.- Terapia génica.
Desde hace algunos años la terapia génica sola o en combinación con
otras estrategias se presenta como una nueva posibilidad para tratar diferentes
tipos de cáncer. Las terapias génicas contra el cáncer suelen implicar la
transferencia y expresión de genes a células cancerosas con el propósito de
eliminarlas.
Son muchas las diferentes estrategias aplicadas en los ensayos clínicos
realizados en terapia génica del cáncer, entre las que se encuentran aquellas
que (Ronchera-Oms y González Valls, 1998).
– Aumentan la actividad antitumoral de células inmunes por medio de
citoquinas (interleucinas, factores de necrosis tumoral, factores estimulantes de
colonias o interferones).
– Aumentan la inmunogenicidad del tumor introduciendo antígenos
foráneos (“vacunas tumorales”).
– Introducen un gen “suicida” o de sensibilidad aumentada a
determinados fármacos.
– Bloquean la expresión de oncogenes mediante terapia antisentido.
– Introducen genes supresores de tumores.
- 14 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
– Eliminan las células tumorales mediante adenovirus oncolíticos.
– Transfieren genes con efecto antiangiogénico, para inhibir la formación
de vasos sanguíneos inducidos por el propio tumor.
– Introducen genes de resistencia a fármacos para reducir la toxicidad de
la quimioterapia, particularmente sobre la médula ósea.
3.- CÁNCER DE MAMA.
El carcinoma mamario se presenta como el de mayor prevalencia en la
mujer aunque también se presenta en hombres. El Centro Internacional de
Investigaciones sobre el Cáncer (CIIC) de la Organización Mundial de la Salud
(OMS) estima que 216.000 mujeres han manifestado la enfermedad en la Unión
Europea durante el año 2000 y que han fallecido más de 79.000 pacientes por
esta causa (Tyczynski y cols., 2002).
Aunque todos los países industrializados, excepto Japón, muestran
elevadas tasas de incidencia, se perciben grandes diferencias entre las distintas
áreas geográficas. En Europa, las tasas de incidencia más altas se observan en
las regiones occidentales y septentrionales, con un aumento de un 1,5% al año.
En Europa occidental, el riesgo de presentar cáncer de mama es un 60%
superior al de Europa oriental. La mayor supervivencia a los 5 años se halla en
Finlandia y Suiza (74%); en Italia, Francia, los Países Bajos, Dinamarca y
Alemania se encuentran valores intermedios (70%), y los peores resultados
corresponden a España, y el Reino Unido, Estonia y Polonia (55-64%). Además,
el cáncer de mama es la causa más frecuente de muerte entre las mujeres de
35-55 años (Merck y cols., 2005).
Su incidencia hace de este tipo de tumor una de las principales vías de
investigación no sólo en cuanto al diagnóstico precoz sino también en cuanto al
desarrollo de nuevas terapias que reduzcan su mortalidad en aquellos casos en
que una vez diagnosticado el tratamiento convencional no es efectivo.
- 15 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
3.1. - Factores de riesgo del cáncer de mama.
3.1.1.- Factores hormonales.
Datos experimentales sugieren que los estrógenos tienen un papel
importante en el desarrollo y crecimiento del cáncer de mama, aunque el
mecanismo exacto de actuación sigue sin ser aclarado. La prolongada
exposición a estrógenos y todos los factores que contribuyen a ella (menarquía
precoz, menopausia tardía, nuliparidad, uso de estrógenos, anovulatorios y
terapias hormonales de sustitución) son factores que incrementan el riesgo de
padecer un cáncer de mama (Zamora y cols., 2001).
3.1.2.- Factores ambientales.
Aspectos como la dieta (consumo de grasas, antioxidantes, fibra,
vegetales, etc.), la ingesta de fitoestrógenos, los hábitos tóxicos, especialmente
la ingesta elevada de alcohol, la actividad física, el ambiente laboral, la
exposición a radiaciones ionizantes, etc., pueden actuar a través de las
modificaciones que ejercen en el perfil hormonal (Zamora y cols., 2001).
3.1.3.- Factores genéticos.
Se considera que menos del 10% de los cánceres de mama
diagnosticados son hereditarios. Los genes de susceptibilidad genética a cáncer
de mama más importantes son el BRCA1 y el BRCA2. Ambos son considerados
genes supresores del tumor. El primero se considera responsable del 50% de
los casos de cáncer de mama hereditarios. El BRCA2 se considera responsable
del 30% del cáncer de mama hereditario y se relaciona con el desarrollo del
cáncer de mama en mujeres jóvenes y en varones (Zamora y cols., 2001).
Otro gen de susceptibilidad genética a cáncer de mama es el gen ATM de
la ataxia teleangiectasia. Esta rara enfermedad autosómica recesiva se asocia a
un incremento de riesgo para padecer cáncer tanto en los homocigotos como en
los sujetos heterocigotos, así se ha estimado en un 11% el riesgo de los
heterocigotos de desarrollar cáncer de mama a los 50 años y de 30% a los 70
años (Zamora y cosl., 2001). Además, se asocian al riesgo de cáncer de mama
- 16 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
el síndrome de LyFraumeni, asociado a una alteración en el gen p53 y el
síndrome de Cowden, conocido también como el síndrome de hamartomas y
neoplasias múltiples, que está ligado a una alteración en el gen supresor PTEN
(Zamora y cosl., 2001).
3. 2.- Clasificación del cáncer de mama.
3.2.1.- Clasificación histológica del cáncer de mama.
El cáncer ductal invasor o infiltrante es el tipo histológico más común que
se presenta, abarcando entre 70% y 80% de todos los casos.
1.- Carcinoma NOS, (sin otra especificación, siglas en inglés)
Tipo mixto
Pleomorfico: generalmente BCL2, ER y PR (-), P53+
Con células osteoclasticas gigantes
Coreocarcinomatoso
Melanótico
2.- Carcinoma Ductal
Intraductal (in situ): Actualmente entre el 12% y el 15% de los CM
diagnosticados (Winchester y cols., 2000)
•
Invasor con componente intraductal predominante
•
Invasor, NOS: E-cadherin (-)
•
Comedón
•
Inflamatorio Invasor con componente intraductal predominante
•
Invasor, NOS: E-cadherin (-)
•
Inflamatorio, caracterizado por la existencia de eritema, calor y edema de
la piel de la mama, y cuyo sustrato histológico es la invasión de los
linfáticos dérmicos por células tumorales (Zamora y cols, 2001).
•
Medular con infiltración linfocítica: 8-13% es BRCA1 +, 40-100% P53-
•
Mucinoso (coloide): ER+
- 17 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
•
Papilar: ER +
•
Escirro
•
Tubular.
Introducción
3.- Carcinoma Lobular
a. In situ; las opciones terapéuticas serian:
b. Invasor con componente predominante in situ.
c. Invasor
4.- Cáncer en el Pezón. Enfermedad de Pager:
-Enfermedad de Paget, NOS (sin otra especificación).
-Enfermedad de Paget con carcinoma intraductal
-Enfermedad de Paget con carcinoma ductal invasor
5.- Carcinoma no diferenciado
-Cistosarcoma filoide
-Angiosarcoma
-Linfoma primario
3.2.2.- Clasificación por estadios.
Este sistema de clasificación del Comité Estadounidense Conjunto sobre
el Cáncer (AJCC, siglas en inglés) proporciona una estrategia para agrupar los
pacientes con respecto a su pronóstico. Las decisiones terapéuticas se formulan
en parte de acuerdo con las categorías del sistema de clasificación, pero
principalmente de acuerdo al tamaño del tumor, estado de los ganglios linfáticos,
los niveles de los receptores de estrógeno y progesterona en el tejido tumoral, el
estado menopáusico y la salud general de la paciente.
Las definiciones para la clasificación del tumor primario (T) son las
mismas tanto para la clasificación clínica como para la patológica. Si la medida
se hace mediante un examen físico, el examinador usará los títulos principales
(T1, T2, o T3). Si se usan otras medidas, como las medidas mamográficas o
- 18 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
patológicas, se puede usar el subconjunto de T1. Los tumores se deben medir al
incremento más cercano a 0,1 cm.
Tumor primario (T)
-TX: El tumor primario no puede ser evaluado
-T0: No hay prueba de tumor primario
-Tis: Carcinoma intraductal, carcinoma lobular in situ o enfermedad de Paget
del pezón sin infiltración del tejido de mama normal
. Tis (DCIS): Carcinoma ductal in situ
Tis (LCIS): Carcinoma lobular in situ
Tis (Paget): Enfermedad de Paget del pezón sin tumor
-T1: Tumor ≤2,0 cm. en su mayor dimensión
T1mic: Microinvasión ≤0,1 cm. en su mayor dimensión
T1a: Tumor >0,1 cm. pero ≤0,5 cm. en su mayor dimensión
T1b: Tumor >0,5 cm. pero ≤1,0 cm. en su mayor dimensión
T1c: Tumor >1,0 cm. pero ≤2,0 cm. en su mayor dimensión
-T2: Tumor >2,0 cm. pero ≤5,0 cm. en su mayor dimensión
-T3: Tumor mide >5,0 cm. en su mayor dimensión
-T4: Tumor de cualquier tamaño con extensión directa a (a) la pared torácica
o (b) la piel, sólo como se describe a continuación
T4a: Extensión a la pared torácica, sin incluir el músculo pectoral
T4b: Edema (incluso piel de naranja), o ulceración de la piel de la
mama o ganglios satélites de la piel limitados a la misma mama
T4c: Ambos casos T4a y T4b
T4d: Carcinoma inflamatorio
- 19 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Ganglios linfáticos regionales (N).
-NX: No se pueden evaluar los ganglios linfáticos regionales
-N0: No hay metástasis regional de los ganglios linfáticos
-N1: Metástasis a ganglio o ganglios linfáticos axilares ipsilaterales móviles
-N2:
-N2a: Metástasis en los ganglios linfáticos axilares ipsilaterales unidos
uno con el otro (emparejados) o con otras estructuras.
-N2b: Metástasis solamente en ganglios mamarios internos ipsilaterales
clínicamente aparentes* en la ausencia de metástasis de ganglios
linfáticos clínicamente evidentes.
-N3:
-N3a: Metástasis en ganglio(s) linfático(s) infraclavicular(es) ipsilateral(es)
-N3b: Metástasis en ganglios linfáticos mamarios internos ipsilaterales y
ganglios linfáticos axilares.
-N3c:
Metástasis
en
ganglio(s)
linfático(s)
supraclavicular(es)
ipsilateral(es)
Metástasis a distancia (M)
•
MX: No se puede evaluar la presencia de metástasis a distancia.
•
M0: No hay metástasis a distancia.
•
M1: Presencia de metástasis a distancia
Agrupación por estadios del AJCC
Estadio 0: Tis, N0, M0
Estadio I: T1,* N0, M0
Estadio IIA: T0, N1, M0 / T1,* N1, M0 /T2, N0, M0
- 20 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Estadio IIB: T2, N1, M0 / T3, N0, M0
Estadio IIIA: T0, N2, M0 / T1,* N2, M0 / T2, N2, M0 / T3, N1, M0 / T3, N2,
M0
Estadio IIIB: T4, N0, M0 / T4, N1, M0 / T4, N2, M0
Estadio IIIC**Cualquier T, N3, M0
Estadio IV: Cualquier T, cualquier N, M1
* [Nota: T1 incluye T1mic]
3.3. - Terapia convencional en cáncer de mama.
3.3.1.- Cáncer de mama en estadios I, II, IIIA y operable IIIC
3.3.1.a.- Tratamiento locorregional. El cáncer de mama en estadios I, II, IIIA y
operable IIIC suele exigir un tratamiento multimodal. Las opciones quirúrgicas
para tratar el tumor primario incluyen la cirugía conservadora de la mama más
radioterapia, la mastectomía con reconstrucción y la mastectomía sola (Eubank
y cols., 2002). Se debe efectuar una disección de los ganglios linfáticos axilares
para fines de clasificación.
La cirugía conservadora de la mama sola sin radioterapia ha sido
comparada con la cirugía conservadora seguida de radioterapia en cuatro
ensayos aleatorios. Todos los ensayos muestran una tasa general de
recurrencia más alta en la mama con la cirugía conservadora solamente. No se
ha identificado ningún subconjunto que no se haya beneficiado de la adición de
la radioterapia.
3.3.1.b.- Radioterapia adyuvante. Para erradicar las micrometástasis, prolongar
el tiempo libre de recaída y extender la sobrevida global de enfermedad se han
desarrollado tratamientos adyuvantes (hormonoterapia o quimioterapia). Para
evaluar qué pacientes son candidatas a tratamientos adyuvantes se aplican
parámetros clínico-patológicos tales como edad, tamaño tumoral, compromiso
de linfonodos axilares, tipo y grado histológico, y receptores hormonales (Eifel y
- 21 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
cols., 2001). Se administra radioterapia adyuvante a la pared torácica y a los
ganglios linfáticos regionales a aquellas mujeres que se piensa que corren alto
riesgo de desarrollar recurrencia locorregional después de la mastectomía.
3.3.1.c.- Terapia sistémica adyuvante: dentro de la que destacamos los
siguientes tratamientos:
Tamoxifeno. Las ventajas del tamoxifeno están limitadas a las mujeres
cuyos tumores de mama tienen un RE positivo o desconocido (Marzo Castillejo
2007). Los ensayos clínicos aleatorizados (ECA) con tamoxifeno en mujeres con
riesgo elevado muestran una reducción del cáncer de mama del 35% (Marzo y
cols., en prensa). Los resultados generales de los datos disponibles indican que
agregar quimioterapia al tamoxifeno en la mujer posmenopáusica con RE
positivo produce una ventaja significativa, aunque pequeña, en la supervivencia.
Ablación ovárica. La supervivencia general a los 15 años fue mejorada
significativamente por la ablación en el grupo de mujeres premenopáusicas
(reducción absoluta de mortalidad de 6,3%) pero no en el grupo de mujeres
posmenopáusicas.
Quimioterapia adyuvante. La ventaja de la quimioterapia varía bastante
de acuerdo con la edad de la paciente y el estado menopáusico. Para todas las
mujeres menores de 50 años de edad, la quimioterapia de combinación mejora
la supervivencia a los 10 años de 71% a 78% para aquellas con enfermedad de
ganglios negativos, y de 42% a 53% para las que tenían ganglios positivos. En
las mujeres entre 50 y 69 años, la quimioterapia de combinación mejora la
supervivencia a los 10 años de 67% a 69% para las que padecían enfermedad
con ganglios negativos, y de 46% a 49% para las que tenían ganglios positivos.
Paclitaxel es un agente antineoplásico hidrofóbico con demostrada
actividad antitumoral contra un amplio espectro de cánceres, incluyéndose los
de mama, pulmón y ovario (Scripture y cols., 2005).
Las antraciclinas comúnmente más usadas en el tratamiento del cáncer
de mama son la Doxorrubicina y Epirubicina (Glück, 2005).
- 22 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Docetaxel
ha
rendido
Introducción
tasas
de
respuesta
prometedoras
como
componente asociado a doxorrubicina en pacientes con el cáncer de pecho
metastático, incluyendo docetaxel/doxorrubicina y docetaxel/doxorrubicina/
ciclofosfamida (Pérez y cols., 2002).
La quimioterapia preoperatoria podría ser beneficiosa para las mujeres
que desean cirugía conservadora de la mama pero que de otra forma no serían
candidatas debido al tamaño de su tumor. La postergación de la radioterapia
varios meses después de la cirugía conservadora de la mama hasta terminada
la quimioterapia adyuvante parece ser segura y puede ser preferible para las
pacientes con alto riesgo de diseminación distante. La quimioterapia adyuvante
se ha asociado con varios efectos tóxicos característicos que varían de acuerdo
a los fármacos específicos utilizados en cada régimen.
Opciones de tratamiento sistémico adyuvante para mujeres con cáncer
de mama y ganglios axilares negativos.
Grupo de
Bajo riesgo
Riesgo intermedio
Alto riesgo
Premenopáusica,
Ninguno o
Tamoxifeno y quimioterapia,
Quimioterapia y
RE-positivo o RP-
tamoxifeno
tamoxifeno solo, ablación
tamoxifeno,
ovárica, análogo de la GnRH*
quimioterapia y
pacientes
positivo
ablación o análogo
de la GnRH*,
quimioterapia con
tamoxifeno y
ablación ovárica o
GnRH*, más
ablación ovárica
sola o con
tamoxifeno o
GnRH solo o con
tamoxifeno
- 23 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Grupo de
Introducción
Bajo riesgo
Riesgo intermedio
Alto riesgo
—
—
Quimioterapia
Posmenopáusica,
Ninguno o
Tamoxifeno y quimioterapia,
Tamoxifeno y
RE-positivo o RP-
tamoxifeno
tamoxifeno solo
quimioterapia,
pacientes
Premenopáusica,
RE-negativo o RPnegativo
positivo
Posmenopáusica,
tamoxifeno solo
—
—
Quimioterapia
Ninguno o
Tamoxifeno solo, tamoxifeno y
Tamoxifeno;
tamoxifeno
quimioterapia
considerar
RE (-) o RP(-)
>70 años
quimioterapia si
RE- negativo o
RP-negativo
Opciones de tratamiento para mujeres con cáncer de mama y ganglios
axilares positivos
Grupo de pacientes
Tratamientos
Premenopáusica,
Quimioterapia y tamoxifeno, quimioterapia con ablación
RE-positivo o RP-
ovárica/análogo de la GnRH, quimioterapia con tamoxifeno y
positivo
ablación ovárica/análogo de la GnRH*, ablación ovárica solo o
con tamoxifeno GnRH solo o con tamoxifeno
Premenopáusica,
Quimioterapia
RE-negativo o RPnegativo
Posmenopáusica,
Tamoxifeno y quimioterapia, tamoxifeno solo
RE-positivo o RPpositivo
- 24 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Grupo de pacientes
Tratamientos
Posmenopáusica,
Quimioterapia
RE-negativo o RPnegativo
>70 años
Tamoxifeno solo, considerar quimioterapia si receptores
negativos
* Esta opción de tratamiento está bajo estudio.
3.3.2.- Cáncer de mama en estadio IIIB, inoperable IIIC o inflamatorio.
La administración de terapia multimodal con intento curativo es el
tratamiento estándar para las pacientes con enfermedad en estadio clínico IIIB.
Una serie retrospectiva indica que aproximadamente 32% de los pacientes con
implicación del ganglio supraclavicular ipsilateral y sin prueba de enfermedad
metastásica distante (pN3c) pueden tener sobrevivencia prolongada sin
enfermedad a los 10 años bajo terapia de modalidad combinada. La cirugía
inicial suele limitarse a una biopsia para permitir la determinación histológica, los
niveles del receptor de estrógeno (RE) y del receptor de progesterona (RP), y la
sobreexpresión del HER2/neu. El tratamiento inicial con quimioterapia con base
en antraciclina o la terapia con base en taxano es la norma.
3.3.3.- Cáncer de mama en estadio IV, recurrente y metastático.
A menudo, el cáncer recurrente de mama responde a terapia a pesar de
que el tratamiento rara vez cura en este estadio de la enfermedad. Sin embargo,
las pacientes con recaídas ubicadas en la pared torácica y el seno pueden
sobrevivir a largo plazo con el empleo de la terapia apropiada.
Cáncer de mama locorregional recurrente. La recurrencia local en la
pared torácica después de una mastectomía, suele ser precursora de una
propagación amplia de la enfermedad pero, en un subconjunto de pacientes,
puede ser el único sitio de recurrencia. Para las pacientes que integran este
subconjunto, la cirugía o la radioterapia pueden ser curativas.
- 25 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Enfermedad en estadio IV o metastásica. El tratamiento de la
enfermedad sistémica tiene fines paliativos. El tratamiento para el cáncer
metastásico de mama suele comprender la hormonoterapia, la quimioterapia o
ambas, con trastruzumab (Herceptin) o sin el. La radioterapia, la cirugía o ambas
están indicadas para las pacientes con metástasis sintomática limitada.
No se sabe con certeza si la quimioterapia de agente único o la
quimioterapia de combinación es preferible para el tratamiento de primera línea.
Un estudio cooperativo agrupó pacientes de forma aleatoria para recibir
paclitaxel y doxorrubicina ambos administrados en forma de combinación o en
secuencia. Aunque la tasa de respuesta y el tiempo que trascurre hasta la
enfermedad fueron ambos mejores en el caso de la combinación, la
supervivencia resultó ser igual en ambos grupos. La tasa de evolución de la
enfermedad, la presencia o ausencia de afecciones médicas comórbidas y la
preferencia del médico y del paciente influirán en la selección de la terapia para
cada paciente en particular. En estos momentos no hay ninguna información que
apoye la superioridad de ningún régimen en particular. Se puede utilizar agentes
únicos o combinaciones en sucesión para las pacientes que tienen recaídas.
4.- CÁNCER DE PULMÓN.
En la Unión Europea (UE) el cáncer de pulmón es la principal causa de
muerte por cáncer en varones y la tercera en mujeres. En este territorio, el
cáncer de pulmón tuvo una mortalidad estimada de 171.990 varones y 64.100
mujeres durante 2006, lo que representa el 26,3 y el 12,5% de la mortalidad por
cáncer, respectivamente (Ferlay y cols., 2006). Sin embargo, los datos de
evolución de mortalidad durante el período 1997-2002 mostraron un descenso
de las tasas estandarizadas del 1,9% anual en los varones, mientras que en las
mujeres se incrementaron un 1,6% (Levi y cols., 2007).
En Andalucía, tras 2 períodos de aumentos significativos en 1975-1988 y
1988-1994, con incrementos anuales para varones y mujeres del 3,6 y el 1,4%,
respectivamente, las tasas estandarizadas de mortalidad por cáncer de pulmón
en los varones se estabilizaron en el período 1994-2002. Por el contrario, en las
- 26 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
mujeres, tras un período inicial (1975-1992) de descenso (-0,5%; p < 0,05), las
tasas sufren un incremento significativo del 3,3% anual (Cayuela y cols., 2006).
4.1.- Factores de riesgo del cáncer de pulmón.
4.1.1.- Tabaquismo.
Sin lugar a duda el tabaco es el factor de riesgo más importante asociado
al desarrollo de cáncer de pulmón. En España se han realizado varios estudios
de casos y controles sobre el tabaco y el cáncer de pulmón (Rodríguez y cols.,
2000) y todos confirman esta asociación. El porcentaje de pacientes fumadores
con cáncer de pulmón es tremendamente alto, de manera que la tasa de
tabaquismo en varones se encuentra prácticamente siempre por encima del 95%
en la serie de 1992-1993 (Hernández IS y cols., 2006). Estas cifras son
inferiores en las mujeres, aunque se aprecia un marcado aumento de fumadoras
cuando se comparan series más antiguas (Miravet y cols, 2001) (6,1%) frente a
otras más recientes (Santos-Martínez y cols. 2005) (23,08, 38,4 y 44%). La
evidencia que vincula tabaquismo con cáncer de pulmón proviene de las
siguientes observaciones (Thrasher y cols., 2006):
•
Los cambios en las tasas de mortalidad por cáncer de pulmón
evolucionan paralelamente a la prevalencia de tabaquismo.
•
El riesgo de desarrollo de cáncer de pulmón es de 11 a 17 veces
mayor
en mujeres
y
varones
que
fuman
(respectivamente),
comparado con no fumadores.
•
Hay una relación dosis-respuesta entre el número de cigarrillos
fumados y el riesgo de cáncer de pulmón.
•
El riesgo de cáncer de pulmón secundario al tabaquismo es
parcialmente reversible.
•
La exposición a humo de cigarrillo provoca la formación de aductos de
ADN en el epitelio bronquial.
•
Hay 55 carcinógenos en el humo del tabaco que han sido evaluados
por la Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer (IARC), y
para los cuales hay "evidencia suficiente de carcinogenicidad" en
animales de laboratorio o en humanos.
- 27 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
•
Algunos
estudios
Introducción
epidemiológicos
sugieren
que
las
mujeres
fumadoras son más susceptibles a los carcinógenos del tabaco (Sin y
cols., 2007).
4.1.2.- Tabaquismo pasivo ("Coff, coff").
Se ha estimado que el riesgo relativo de desarrollar cáncer de pulmón en
no fumadores expuestos pasivamente al humo de tabaco es de 1.35. La
exposición involuntaria al humo de tabaco ("tabaquismo pasivo") ha sido
declarada "carcinogénica" por la Agencia de Protección del Medio Ambiente
(E.P.A.) de los EEUU (E.P.A.) (Vineis y cols., 2007).
4.1.3.- Asbesto y Radón
En Gran Bretaña, el riesgo relativo de cáncer de pulmón en trabajadores
expuestos laboralmente a asbestos fue de 1.4 a 2.6. La exposición al humo del
cigarrillo incrementa el riesgo de desarrollar cáncer de pulmón (O'Reilly y cols.,
2007). Las concentraciones de radón son mayores en excavaciones mal
ventiladas. La exposición a radón se asocia con riesgo aumentado de cáncer de
pulmón; unas 10 veces superior en mineros fumadores que en los que no fuman
(de Las Casas y Fernández, 2005).
4.1.4.- Dieta.
Diversos estudios retrospectivos han señalado una correlación inversa
entre la ingesta de beta-caroteno y el riesgo de cáncer de pulmón. También se
observó menor incidencia de cáncer de pulmón en poblaciones con mayor
ingesta de vegetales frescos, carotenoides, y vitamina C.
4.1.5.- Predisposición genética.
Sólo 15-20% de los fumadores desarrolla cáncer de pulmón durante su
vida. ¿Qué co-factores son necesarios? Posiblemente, la susceptibilidad
individual dependa en parte del balance entre activación metabólica y
destoxificación de los carcinógenos. Por otra parte, los procesos de reparación
del ADN son importantes para determinar si el complejo covalente carcinógeno-
- 28 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
ADN persistirá o no (Cote y cols, 2007). El riesgo de cáncer de pulmón parece
aumentado en determinadas familias. El patrón metabólico para drogas y
carcinógenos, mediado por isoenzimas del sistema microsomal de citocromos P450 (Larsen y cols., 2005) puede jugar un rol en la activación (y también en la
destoxificación) de carcinógenos ambientales, incluyendo particularmente, los
carcinógenos presentes en el humo del tabaco.
4.2.- Clasificación del cáncer de pulmón.
4.2.1.- Clasificación de la organización Mundial de la Salud (OMS) del cáncer de
pulmón.
La clasificación de la OMS, aceptada en todo el mundo, es la más
utilizada. Se basa en criterios de microscopia óptica. El cáncer de pulmón (CP)
se divide en dos grandes grupos por sus características histológicas, curso
clínico y respuesta al tratamiento:
4.2.1.a.- Cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) o microcítico, que
representa el 20% del total de cánceres de pulmón.
4.2.1.b.- Cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPNCP) o no microcítico,
que correspondería al 80% restante.
i.
Benigno
ii.
Displasia y carcinoma in situ
iii.
Maligno
A. Carcinoma de células pequeñas
1. Células de grano de avena
2. Células intermedias
3. Células de grano de avena combinada
B. Carcinoma de células escamosas o epidermoide
C. Adenocarcinoma
1. Acinar
- 29 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
2. Papilar
3. Broncoalveolar
4. Mucosecretor
D. Carcinoma de célula grande
1. Célula gigante
2. Células claras
4.2.2.- Clasificación por estadíos del cáncer de pulmón.
Según los estadios podemos clasificarlo en:
Tumor primario (T)
•
TX: El tumor primario no puede ser evaluado,
•
T0: No hay prueba de tumor primario
•
Tis: Carcinoma in situ
•
T1: Un tumor que tiene ≤3 cm en su mayor dimensión, rodeado por
pleura pulmonar o visceral, y sin prueba broncoscópica de invasión más
proximal que un lóbulo bronquial (es decir, no en el bronquio principal).
•
T2: Un tumor con cualquiera de las siguientes características de grado o
tamaño:
>3 cm en su dimensión mayor
Compromete el bronquio principal y está ≥2 cm distal de la carina
Invade la pleura visceral
Está relacionado con atelectasias o neumonitis obstructiva que se
extiende a la región hiliar pero que no compromete todo el pulmón.
•
T3: Un tumor de cualquier tamaño que invade directamente cualquiera de
los siguientes: pared torácica (incluyendo tumores del surco superior),
diafragma, pleura mediastínica, pericardio parietal; o tumor en el
bronquio principal de <2 cm distal a la carina pero sin compromiso de la
carina; o atelectasia asociada o neumonitis obstructiva de todo el
pulmón.
- 30 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
T4: Un tumor de cualquier tamaño que invade cualquiera de los siguientes
órganos: el mediastino, el corazón, los grandes vasos, la tráquea, el esófago, el
cuerpo vertebral, la carina; o tumores ganglionares separados en el mismo
lóbulo; o tumor con derrame pleural maligno. [Nota: La mayoría de los derrames
pleurales asociados al cáncer de pulmón se deben a un tumor; sin embargo, en
unos pocos pacientes, los exámenes citopatológicos múltiples del líquido pleural
son negativos para tumor. En estos casos el líquido no tiene sangre y no es
exudativo. Dichos pacientes serán evaluados más a fondo por medio de una
videotoracoscopia y biopsias pleurales directas. Cuando estos elementos y los
criterios clínicos dicen que la efusión no está relacionada con el tumor, deberá
ser excluida como un elemento de clasificación y el paciente deberá ser
clasificado como T1, T2 o T3.]
Compromiso ganglionar (N).
NX: Los ganglios linfáticos regionales no pueden ser evaluados
N0: No hay metástasis a los ganglios linfáticos regionales
N1: Metástasis a los ganglios linfáticos peribronquiales ipsilaterales, los ganglios
linfáticos hiliares ipsilaterales o ambos y los ganglios intrapulmonares incluyendo
el compromiso por extensión directa del tumor primario
N2: Metástasis al ganglio (o ganglios) linfático mediastínico ipsilateral, subcarinal
o ambos
Metástasis a distancia (M)
MX: La presencia de metástasis distante no puede ser evaluada
M0: No hay metástasis a distancia
M1: Existe metástasis a distancia [Nota: En M1 se incluyen glándulas tumorales
separadas en lóbulos diferentes (ipsilateral o contralateral).]
Agrupación por estadios del AJCC
Carcinoma oculto: TX, N0, M0
- 31 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Estadio 0: Tis, N0, M0
Estadio IA: T1, N0, M0
Estadio IB. T2, N0, M0
Estadio IIA : T1, N1, M0
Estadio IIB : T2, N1, M0 / T3, N0, M0
Estadio IIIA : T1, N2, M0 / T2, N2, M0 / T3, N1, M0 / T3, N2, M0
Estadio IIIB: Cualquier T, N3, M0 / T4, cualquier N, M0
Estadio IV: Cualquier T, cualquier N, M1
4.3.- Terapia convencional en cáncer de pulmón.
4.3.1.- Tratamiento en estadios I y II.
Los pacientes candidatos a Cirugía incluyen estadios I y II, y algunos IIIA.
Tras la cirugía, el rango de supervivencia varía desde un 67% para los estadios
IA a un 23% para el estadio IIIA. La mayoría de los pacientes presentan en su
evolución, recidiva a distancia, lo que sugiere la existencia de enfermedad
micrometastásica oculta en el momento del diagnóstico. Las recidivas locales
suponen aproximadamente el 10%. En un intento de mejorar la supervivencia de
estos pacientes, se ha administrado quimioterapia adyuvante. Con los datos
actuales, podemos concluir que la quimioterapia adyuvante con CisplatinoVinorelbina debe ser el estándar tras la cirugía en los estadios II y IIIA. Algunos
pacientes con estadio IB podrían beneficiarse de quimioterapia adyuvante con
Taxol- Carboplatino, sobre todo cuando la lesión es mayor de 4cm.
4.3.2.- Tratamiento en estadios III y IV
4.3.2.a.- CPNCP estadio III resecable
El estadio IIIA se considera resecable y el IIIB generalmente se cataloga
como no quirúrgico. La quimioterapia de inducción se ha estudiado ampliamente
- 32 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
en el estadio IIIA y ha demostrado mejorar supervivencia global y supervivencia
libre de enfermedad. Por tanto la secuencia de tratamiento no está claramente
establecida, auque la tendencia actual es la administración de quimioterapia
neoadyuvante. Los pacientes con afectación ganglionar voluminosa o T4
probablemente se beneficien de quimiorradioterapia, sin cirugía.
4.3.2.b.- CPNCP Estadio III No Resecable
Hay que diferenciar en este grupo los pacientes con derrame pleural, que
tienen un pronóstico semejante a los pacientes con estadio IV, y su tratamiento
debe ser similar, y basarse en quimioterapia paliativa.
El estudio realizado por de Cos y cols., 2007, randomizó 92 pacientes a
recibir radioterapia y quimioterapia de inducción con carboplatino-etoposide,
carboplatino-gemcitabina, y carboplatino-paclitaxel seguida de Radioterapia. El
resultado de este estudio demostró que el uso de la quimioterapia combinada
con la radioterapia debe ser considerada contraindicada en el caso de mal
estado general del paciente.
4.3.2.c.- CPNCP Estadio IV No Resecable
En esta situación el objetivo del tratamiento es la paliación. La evidencia
científica actual apunta a que el mejor tratamiento de soporte es la
quimioterapia. La cuestión que se plantea es la combinación de citostáticos a
utilizar. Se aleatorizan a recibir tratamiento según 4 esquemas: Brazo A
Cisplatino- Paclitaxel; Brazo B Cisplatino- Gemcitabina; Brazo C CisplatinoTaxotere; Brazo D Carboplatino- Paclitaxel. Los cuatro esquemas obtienen un
índice de respuestas similar, sin diferencias en supervivencia, por lo que se
concluye que cualquiera de estos 4 esquemas es válido.
El tratamiento de segunda línea se puede considerar en pacientes con
buen PS que presenten una recaída tras quimioterapia basada en platino. En el
momento actual hay dos fármacos citotóxicos aprobados en esta situación:
Docetaxel y Premetrexed. Los agentes más estudiados han sido docetaxel,
premetrexed, paclitaxel, vinirelbina y gemcitabina, con un índice de respuestas
que oscila entre 0-20%.
- 33 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
El Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal que bloquea el factor de
crecimiento vásculo endotelial. En un estudio fase II/III (ECOG 4599), con 842
pacientes con CPNCP avanzado no epidermoide, la combinación Bevacizumab
con Paclitaxel y Carboplatino, resultó ser superior en supervivencia libre de
enfermedad y supervivencia global, frente a Paclitaxel – Carboplatino. La
toxicidad en el brazo de Bevacizumab fue significativamente superior. La FDA ha
raíz de este estudio ha aprobado en el 2006, Bevacizumab, en combinación con
Paclitaxel – Carboplatino, para pacientes con CPNCP no epidermoide,
localmente avanzado o metastásico.
5.- CÁNCER DE COLON
El cáncer colorrectal es una de las neoplasias más frecuentes en los
países desarrollados. Se estima que, sólo en EE.UU, durante el año 2006 se
habrán diagnosticado más de 148.000 nuevos casos y que más de 55.000
pacientes habrán fallecido como consecuencia de dicha enfermedad (Jemal y
cols., 2006). En España es el segundo cáncer más frecuente, siendo
responsable del 11.5% del total de muertes provocadas por cáncer en hombres
y del 14.9% en mujeres (López-Abente y cols., 2003). El cáncer de recto,
además de ser uno de los tumores más frecuentes, genera problemas
terapéuticos no sólo por la propia disección anatómica quirúrgica, sino por los
resultados tan dispares en cuanto a cifras de recidiva local y supervivencia
(García-Granero, 2006). En España la supervivencia general de estos pacientes
es del 50,6% (Moreno y Ardanaz, 2004).
Las tasas de incidencia son más elevadas en países desarrollados que
en países en desarrollo (Stanley y Lauri, 2000), como: América del Norte,
Canadá, Australia, Nueva Zelanda y noroeste de Europa (Parkin, 2004). Las
diferencias más notables son la baja tasa observada en Japón (Yoshimi y
Kaneko, 2005) y en poblaciones negras subsaharianas africanas. La existencia
de unas marcadas diferencias geográficas en la incidencia y mortalidad del
cáncer colorrectal lleva a pensar que además de factores genéticos, no
modificables, los factores ambientales juegan un papel fundamental en la
patogenia de este proceso (Ruiz y cols., 2005). La relación que existe entre
cierto tipo de dieta (Berrino y cols. 2003) rica en carnes rojas, colesterol y grasas
- 34 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
animales está siendo cada vez mejor establecida como factor de riesgo y,
aunque discutidas, existen evidencias respecto al consumo de tabaco y alcohol
(Sharpe y cols, 2002). Alrededor del 50.2% de los casos de cáncer colorrectal se
localizan en el colon distal y el 27% se localizan en el recto. Estudios recientes
han demostrado un desplazamiento proximal altamente significativo en la
localización del cáncer colorrectal en las dos últimas décadas (El-Bolkainy y
cols., 2006).
Afecta sobre todo a individuos de edad avanzada, su frecuencia aumenta
de manera estable a partir de los 50 años, hasta alcanzar un máximo a los 80
años. La edad promedio a la que se establece el diagnóstico es a los 59 años,
siendo de 46.5 años para el cáncer rectal y de 52.7 años para el cáncer de colon
(El-Bolkainy y cols., 2006). En los hombres, la frecuencia de padecer cáncer
colorrectal ha tenido un claro ascenso especialmente llamativo a partir de 1986 y
en las mujeres la curva de evolución temporal ha sido mucho más suave (Ruiz y
cols., 2005).
5.1.- Factores de riesgo del cáncer de colon.
5.2.1- Grasa dietética.
Varios estudios epidemiológicos han demostrado que la obesidad y el
sobrepeso está generalmente asociadas con el riesgo incrementado para cáncer
de colon (Bergstrom y cols. 2001)
5.1.2.- Fibra dietética.
El papel de la fibra dietética en la carcinogénesis del colon fue propuesto
por primera vez por Burkitt en 1969. Posteriormente, diversos estudios
epidemiológicos analíticos han demostrado la asociación de la fibra con un
menor riesgo de padecer cáncer colorrectal (Alberts y cols., 2000). La fibra se
une a los ácidos biliares, disminuye el tiempo de tránsito, aumenta el volumen de
las heces y fermenta los ácidos grasos volátiles que pueden ser directamente
anticarcinógeno (Park y col., 2005) y que, disminuyendo el pH, pueden reducir la
conversión de los ácidos biliares primarios en secundarios (Alberts y cols.,
2000).
- 35 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
5.1.3.- pH fecal.
Diversos estudios sugieren que un pH colónico alto promueve la
formación de cocarcinógenos a partir de ácidos biliares degradados por
bacterias o colesterol, un proceso inhibido a pH fecal inferior a 6,5.
5.1.4.- Consumo de alcohol.
Estudios de experimentación animal parecen demostrar que aunque el
alcohol no es un carcinógeno en sí mismo, posee un efecto favorecedor del
desarrollo de cáncer, es decir co-carcinogénico (Martinez y cols. 2005). El
alcohol actuará desplazando los inhibidores de la dieta (Cho y cols., 2004).
5.1.5.- Metales trazadores.
El Selenio es un elemento esencial encontrado en cereales, carne,
pescado y productos diarios (Sunde, 2000) y está relacionado con una
prevalencia reducida de los adenomas colorrectales. Ensayos clínicos de
investigación
con
el
selenio
lo
presentan
como
un
potente
agente
quimiopreventivo para los adenomas de colon y cáncer de colon (Connelly-Frost
y cols., 2006).
5.1.6.- Factores genéticos.
El 20% de los cánceres colorrectales tienen un trasfondo genético,
aunque de éstos en sólo una cuarta parte tiene una importancia fundamental
(Casimiro, 2002). Se calcula que aproximadamente un 5-6% de los casos
aparecen en familias con predisposición genética a padecer este tipo de
neoplasia. El prototipo de estos cánceres sería la poliposis adenomatosa
colónica familiar (APC). Entre 1990 y 2002, el 49% pacientes con poliposis
adenomatosa colónica familiar presentan mutación en el gen ADP (Aretz y cols,
2004). La mutación en dicho gen está implicado en la iniciación y expansión del
cáncer de colon (Aoki y Taketo, 2007).
- 36 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
5.2.- Clasificación del cáncer de colon.
5.2.1.- Clasificación anatomopatológica del cáncer de colon.
La más utilizada es la anatomopatológica en la que podemos distinguir:
5.2.1.a.- Adenocarcinoma. Es el tumor más frecuente en el intestino grueso, y su
incidencia global oscila entre el 75-85%.
5.2.1.b.- Carcinoma mucinoso. Constituye aproximadamente el 5-15% de los
tumores colorrectales (AJCC Cancer Staging Manual, 2002). Se distinguen dos
formas:
Carcinoma coloide o mucinoso, caracterizado por grandes cantidades de
moco situado preferentemente fuera de las células.
Una
variante
más
rara
constituido
por
células
con
moco
intracitoplasmático y núcleos localizados periféricamente en anillo de sello
(Ogino y cols., 2006).
5.2.1.c.- Carcinoma de células pequeñas. El carcinoma de células pequeñas
colorrectal es un tumor muy infrecuente que histológicamente se parece al
carcinoma de células pequeñas de pulmón (El Demellawy y cols., 2007). En la
mayoría de los casos se localizan en el colon ascendente.
5.2.1.d.- Carcinoma escamoso. Es muy raro con un mecanismo patogénico aún
no aclarado y un comportamiento clínico algo agresivo. La incidencia de este
tumor es poco conocida, pero puede oscilar entre el 0,25-0,5% (Theodosopoulos
y cols., 2008).
5.2.1.e.- Carcinoma adenoescamoso. El cáncer adenoescamoso y epidermoide
o escamoso de vesícula biliar se considera una neoplasia de mal pronóstico,
generalmente diagnosticado en etapas avanzadas, fundamentalmente por la
escasa repercusión clínica en estadios iniciales (Lada y cols., 2007).
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
5.2.2- Clasificación por estadíos del cáncer de colon.
La clasificación en base a la extensión del tumor ya fue propuesta en
1954 por Astler y Coller, y la podríamos resumir así:
Lesiones limitadas a la mucosa
B1.
Lesiones limitadas a la muscular propia, con ganglios negativos.
B2.
Tumores que penetran la muscular propia con ganglios negativos.
C1.
Tumores limitados a la pared con ganglios positivos.
C2.
Lesiones que se han extendido a través de la pared y que tienen
ganglios positivos.
En 1967 Turbull et al. añadió el estadio D que define metástasis
tumorales en hígado, pulmón, hueso, siembra de tumor, tumor inextirpable por
invasión parietal o invasión a órganos adyacentes.
5.3.- Terapia convencional del cáncer de colon.
5.3.1.- Tratamiento en los estadíos I, II y III.
Muchos cánceres colorrectales en etapa I, y la mayoría de los que están
en las etapas II y III, pueden extirparse mediante una resección anterior baja o
resección abdominal.
Casi todos los pacientes con cáncer de colon en las etapas II y III deben
recibir quimioterapia después de la cirugía aproximadamente durante 6 a 8
meses. Se ha demostrado que el medicamento quimioterapéutico 5- fluoracilo
incrementa la posibilidad de cura en ciertos pacientes.
5.3.2.- Tratamiento en el estadío IV.
Algunos pacientes en la etapa IV deberán hacerse una colostomía de
derivación. La otra opción para liviar o prevenir un bloqueo rectal es calentar el
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
tumor rectal mediante un haz de rayos láser enfocado a través del ano llamado
fotocoagulación.
Si el cáncer se ha diseminado será necesario recurrir a la cirugía para
extraer partes de otros órganos afectados, como son el hígado, pulmones y
ovarios.
La radioterapia o quimioterapia también se utiliza para tratar pacientes
con cáncer de colon en etapa IV. El irinotecán, el oxaliplatino y el 5- fluoracilo
son los 3 medicamentos que se utilizan con más frecuencia. Además, se han
empleado anticuerpos monoclonales, como cetuximab (Erbitux), panitumumab
(Vectibix) y bevacizumab (Avastin) solos o en combinación con la quimioterapia
(Weitz y cols., 2005).
6.- MODELOS EXPERIMENTALES PARA EL ESTUDIO DEL CÁNCER.
ESFEROIDES MULTICELULARES
Durante muchos años los cultivos celulares como sistema in vitro y los
ratones inmunodeprimidos o no en los que se podían genera tumores de
diferente extirpe han sido los elementos claves en la investigación del cáncer.
Desde hace algunos años, el desarrollo de los denominados esferoides
tumorales sólidos (MTS), ha permitido avanzar en un nuevo sistema
experimental con características de los dos citados anteriormente que ofrecen
una gran cantidad de posibilidades. Los MTS son un conjunto de células
cancerosas que crecen de forma esférica al ser sometidas a condiciones
mecánicas y nutricionales in vitro. Presentan una serie de características típicas
de los tumores avasculares que permite utilizarlos para analizar el crecimiento,
microambiente y perturbaciones fisiológicas que ocurren en un tumor de manera
experimental.
Los esferoides muestran, en general, la misma cinética de crecimiento
que los tumores nodulares in vivo, incluyendo crecimiento cuasi-exponencial y
saturación de tamaño (Gallardo y cols., 2006).
La utilización de esferoides tumorales multicelulares (MTS) como modelo
in vitro de tumores sólidos ha cobrado gran relevancia en los últimos años.
- 39 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Estudios de angiogénesis, migración, invasión, ensayos de toxicidad y
resistencia a drogas, estrategias antitumorales son algunas de las últimas
investigaciones realizadas con MTS. Los MTS presentan una mayor semejanza
con la forma y simetría que adquieren los tumores sólidos in vivo que las células
cultivadas en monocapa (Desoize y Jardillier, 2000). Muy explícito son los
estudios comparativos realizados por Frankel y cols., 2000, donde han
demostrado que todos los agentes citotóxicos conocidos de la línea celular
cultivada en monocapa son menos eficaces en las células de cáncer que en los
modelos esferoidales.
En los tumores sólidos, in vivo, las células más resistentes a
quimioterapia o radioterapia se ubican a una distancia entre 100 y 150 µm de los
vasos sanguíneos y áreas necróticas con reducida concentración de oxígeno.
Dentro del esferoide, al aumentar el número de células y compartamentalizarse,
se incrementa también su resistencia al efecto de diversos fármacos, tal y como
sucede in vivo (Gallardo y cols., 2006).
Los contactos célula-célula y célula-matriz incrementan en los esferoides,
alterando la expresión de genes (Ghosh y cols., 2005) y la resistencia a
tratamientos antineoplásicos, pero también limitan la difusión de nutrientes,
oxígeno y otros productos hacia dentro y fuera de los esferoides (Wallenta y
cols., 2002)
Las células de capas intermedias que sufren hipoxia, pero no a niveles
letales, adquieren una mayor resistencia a la radiación y drogas, tal y como
sucede in vivo. Este aumento de resistencia es conocido como efecto de
contacto y fue descrita originalmente por Durand y Sutherland, 1998.
Los mecanismos por los que las células tumorales llegan a ser invasivas
y eventualmente metastásicas es una cuestión crucial en la biología y medicina
cancerígena (Green y cols., 2004). Los esferoides son un modelo in vivo de
micrometástasis cuyas habilidades adhesivas aún no han sido descritas (Casey
y cols., 2001).
Estudios recientes revelan que la capacidad que poseen las células para
crecer en forma tridimensional está influida por factores de señalización del
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Introducción
suero tales como antígeno carcinoembrionario, interferón-γ, IGFII, heregulina β1,
plasmina, y Ecadherina (Novak y Tronka, 2005). La integridad del esferoide se
mantiene por el incremento de uniones estrechas, comunicantes y desmosomas
entre las células y un aumento de matriz extracelular (Gallardo y cols., 2006).
6.1- Clasificación de los MTS
Existen dos tipos de esferoides tumorales.
6.1.1.- MTS clonogénicos
Provienen de una célula tumoral o un pequeño explante de tejido,
denominándose entonces como esferoide multicelular organotípico (OMS), y
pueden ser monocultivos (una sola línea celular) o co-cultivos con fibroblastos,
células inmunes, mesenquimales o endoteliales, con lo que se añaden nuevos
niveles de complejidad (Walenta y cols., 2002).
Inicialmente son cultivadas en recipientes con superficie antiadherente y
estática, originándose un núcleo primario. Posteriormente los esferoides
formados son cultivados en agitación orbital para favorecer la consolidación del
MTS. Presentan el inconveniente de su largo proceso de formación (semanas),
aunque ello favorece su compartimentalización. Son utilizados en estudios en
donde se analiza el efecto de la hipoxia sobre la estructura esferoidal completa
(Gallardo y cols., 2006).
6.1.2.- MTS agregados.
Provienen de una célula tumoral cultivada en recipientes con superficie
antiadherente en agitación orbital constante favoreciendo su agregación.
Básicamente no hay formación de un centro necrótico y la mayor parte de las
capas contienen células en proliferación (Gallardo y cols., 2006). Sus uniones no
son fuertes, lo que provoca que en un corto tiempo las células terminen por
disgregarse; por el contrario tienen la ventaja de una rápida formación. Son
utilizados en experimentos de corta duración en los que los MTS agregados no
llegan a compartamentalizarse, siendo ideales para los estudios de terapia
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Introducción
génica o fármacos, debido a su aumento de permeabilidad respecto a los MTS
clonogénicos.
6.2- Formación de MTS.
Las principales técnicas de cultivo empleadas para generar MTS pueden
revisarse en la Tabla 2 (Gallardo y cols., 2006).
TABLA 2
TÉCNICAS DE CULTIVO DE ESFEROIDES
Técnica
Diámetro
(mm)
Días
Método
Fase 1. Las Líneas celulares se siembran
Líquido
en cajas cubiertas con agar o agarosa, en
sobrelapante
una incubadora sin movimiento.
1-1.5
20-40
Fase 2. Después de 1 semana se trasladan
“Liquid overlay”
a un matraz con medio fresco y se mantienen
(clonogénicos)
en agitación constante.
Emplea cuentas acarreadoras en gelatina
CultiSpherG
(clonogénicos)
1-2
30
macroporosa. Las células se aglutinan más
fácilmente entre los poros de la membrana
microacarreadora y establecen contactos.
Las células se siembran junto con las
Cytodex-3
(clonogénicos)
1-2
20
cuentas
microacarreadoras
en
placas
cubiertas con poli (2-hidroxietilmetacrilato)
para prevenir la adhesión celular.
Consiste en conjugados de polietilenglicol y
poli-N-isopropilacrilamida.
Polímero de
transitorias
gelación
termorreversible
(TGP)
(Cionogénicos)
entre
Las
solución
y
fases
gel
son
manipuladas al cambiar la Tª. La solución
1-1.5
28
acuosa del polímero permite el crecimiento
tridimensional. El cambio de medio y la
obtención
de
los
esferoides
se
realiza
disminuyendo la Tª, permitiendo la gelación
del polímero
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Introducción
Las células se colocan en matraces de
Matraz Spinner o
0.25
Rotación
2-4
plástico o en tubos de cultivo con medio y se
colocan en una incubadora giratoria
giratoria
(agregados)
El esferoide se forma en una gota colgante
Gota colgante
(agregados)
0.25
5
suspendida de una placa de microtilulación.
Los
esferoides
formados
son
muy
homogéneos.
6.3- Estructura de los MTS.
Podemos distinguir tres capas de poblaciones celulares:
Centro necrótico/apoptótico, debido a que los nutrientes ingresan al
esferoide por difusión, el centro se encuentra privado de nutrientes y oxígeno
(zona de hipoxia). Estas condiciones inducen positivamente la expresión de
factores como el TNF (Factor de Necrosis Tumoral) y TGF (Factor de
Crecimiento Tumoral) que activan la vía de Fas/CD95 conduciendo a la
formación del centro necrótico/apoptótico.
Capa intermedia, es la de mayor diámetro y está constituida por varias
capas de células quiescentes con tendencia a diferenciarse. En esta zona se
desarrollan
microambientes
con
gradientes
de
oxígeno,
nutrientes,
concentración de glucosa, lactato, ATP, factores de crecimiento derivados del
suero, concentración de productos de desecho y pH (Kawano y cols., 2001).
Debido al proceso de difusión de nutrientes y oxígeno, las capas de células más
cercanas a la superficie del esferoide tendrán mayor accesibilidad, y conforme
nos aproximamos al núcleo se darán condiciones de hipoxia. Estas células que
sufren hipoxia, pero no a niveles letales, adquieren una mayor resistencia a la
radiación y drogas (Gallardo y cols., 2006).
Capa externa de células, las células están en contacto con lo nutrientes y
el oxígeno, lo que hace que las células consuman una gran cantidad de
alimentos y proliferen activamente.
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Introducción
Estructura de un MTS clonogénico de por lo menos 500 µm de diámetro
que representa sus tres principales capas: células proliferativas, quiescentes y
necróticas (Gallardo y cols., 2006).
6.4- Crecimiento de los MTS
Los MTS se caracterizan por una dinámica de crecimiento como la
descrita en el modelo de Gompertz (Walenta y cols., 2002):
•
Fase inicial de crecimiento lento; corresponde a la formación del
esferoide.
•
Fase de crecimiento exponencial.
•
Fase de meseta; en la cual mantiene su tamaño final, debido a que
los nutrientes ya no pueden difundir a las capas más profundas,
incrementándose la población de células necróticas y la disminución
de la población de células proliferativas.
6.5- Resistencia multicelular
En los tumores sólidos, in vivo, las células más resistentes a
quimioterapia o radioterapia se ubican a una distancia entre 100 y 150 µm de los
vasos sanguíneos y áreas necróticas con reducida concentración de oxígeno.
Dentro del esferoide, al aumentar el número de células y compartamentalizarse,
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Introducción
se incrementa también su resistencia al efecto de diversos fármacos, tal y como
sucede in vivo. Esto se conoce como resistencia multicelular e incluye a la
quimioterapia, radiación, terapia vectorial y mecanismos de defensa (Gallardo y
cols., 2006). Los mecanismos de resistencia “multicelular” aparecen en los
cultivos de agregados celulares tridimensionales, y no en las mismas células
cultivadas en monocapa o en una suspensión de células individuales (Desoize y
Jardillier, 2000).
Tanto en tumores sólidos como en esferoides tumorales, se han descrito
como posibles responsables del proceso de resistencia la sobreexpresión de
glicoproteína P, la cual actúa como bomba de flujo de drogas intoxicando a las
células cancerosas, la desregulación de proteínas de reparación del ADN, el
incremento de Hsp 70 o la desregulación de procesos celulares como la
apoptosis, la cual es un paso crítico en la generación y mantenimiento del
cáncer y cuyo mecanismo implica la sobreexpresión de Bcl-2 y DR5 (Kim y cols.,
2005). Desoize y Jardillier (Desoize y Jardillier, 2000) dividieron a la resistencia
multicelular en dos tipos:
6.5.1.- Resistencia adquirida.
Es consecuencia del crecimiento tridimensional, los gradientes de
oxígeno y nutrientes, y la hipoxia. Un ejemplo es la inhibición de la apoptosis en
las células de las capas más superficiales de los tumores sólidos y los
esferoides tumorales. Este fenómeno queda demostrado en estudios en los que
la resistencia multicelular se revierte mediante proteasas que producen la
disrupción de las uniones intercelulares (Burgués y cols., 2005). Otros muchos
estudios se basan en la permeabilidad de los fármacos, cuya concentración final
en las capas más profundas o alejadas de los vasos sanguíneos, es tan baja
que resulta ineficaz. Además, hay fármacos que deben ser menos eficaces en
condiciones hipóxicas, acídicas o de menores concentraciones de nutrientes
(Minchinton y Tannock, 2006).
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Introducción
6.5.2.- Resistencia intrínsica.
Está determinada genéticamente, y puede ser inherente a la propia
estirpe tumoral o aparecer de novo como consecuencia de las mutaciones
producidas por la evolución neoplásica.
7.- TERAPIA GÉNICA y CÁNCER.
La terapia génica es la estrategia más atractiva inicialmente para tratar el
cáncer, pero probablemente la más difícil de llevar a cabo, es dar con las
alteraciones genéticas clave de las células malignas y corregirlas (Prieto y cols.
2004).
La eficacia de muchos citostáticos depende del equilibrio entre su
actividad antitumoral y sus efectos adversos. Transfiriendo al interior del tumor
genes que producen enzimas que transforman profármacos en sus metabolitos
tóxicos, se consigue poder dar dosis altas de citostáticos a nivel tumoral con
bajos efectos sistémicos. En humanos, el tratamiento se ha mostrado seguro y,
en ciertos tumores como la próstata, se está investigando su utilidad (Ruiz
Castellanos y Sangro, 2004).
En la actualidad, se han desarrollado distintas estrategias en terapia
génica del cáncer, y se están realizando diversos ensayos clínicos para tratar
diferentes tipos de cáncer: de mama, ovario, cabeza y cuello, pulmón, próstata,
células renales, tumor cerebral, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide
crónica, linfomas, melanoma, mieloma múltiple y neuroblastoma. A continuación
se enumeran diferentes estrategias aplicadas en los ensayos clínicos realizados
en terapia génica del cáncer:
7.1.- Inhibición de oncogenes
7.1.1.- Bloquear la expresión de oncogenes mediante terapia antisentido.
Se basa en el empleo de oligonucleótidos antisentido, que son
complementarios de secuencias específicas de un determinado ARN mensajero
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Introducción
(secuencia sentido) que hibridan con dicho ARN y anulan su actividad y
expresión celular.
Su eficacia ha sido demostrada frente oncogén K-ras (oncogén que se
encuentra activado aproximadamente en el 70% de los cánceres colorrectales
humanos) y el gen de la telomerasa, sobre la viabilidad de una línea celular
humana (SW480), derivada de un adenocarcinoma de colon. Los resultados
ponen de manifiesto que el tratamiento con oligodesoxirribonucleótidos
antisentido independiente con cada uno es capaz de ejercer efectos inhibidores
parciales (50%, aproximadamente) sobre la proliferación celular. Sin embargo, el
tratamiento conjunto con oligodesoxirribonucleótidos antisentido contra K-ras y
telomerasa ejercen una importante sinergia que conduce a la pérdida completa
de la viabilidad (> 99,5%) de las células tumorales (Lledó y cols., 2005).
Sin embargo, presentan el inconveniente de su corta vida media en la
circulación sistemática y su dificultad para acceder con actividad funcional al
citoplasma y/o núcleo celular.
ANTISENSE STRAND
CYTOPLASM
SENSE-ANTISENSE
DUPLEX
RNAse H
mRNA
DNA
CLEAVED mRNA
NO PROTEIN!
NUCLEUS
7.1.2.- Diseño de genes que codifican anticuerpos intracelulares que bloquean la
construcción de oncoproteínas.
El Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal específico de la porción
extracelular de HER-2/neu, proteína cuya sobreexpresión está relacionada con
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Introducción
el 10–34% cáncer de mama (Navolanic y cols., 2003). La terapia con este
anticuerpo fue inicialmente dirigida específicamente para pacientes con cáncer
de mama avanzado y que sobreexpresan la proteína HER-2/neu (Huston Jy
George, 2001). Con el trastuzumab se han alcanzando resultados excelentes en
el tratamiento del cáncer avanzado HER-2/neu-positivo y en ensayos clínicos
presenta una eficacia potencial cuando se utiliza en etapas tempranas (Ross y
cols., 2004).
7.1.3.- Uso de oligonucleótidos que activen selectivamente los mecanismos
celulares de reparación del ADN.
Dichos oligonucleótidos serán específicos para las secuencias genómicas
anteriores al lugar de mutación, de manera que se unirán al ADN, mediante
puentes de hidrógeno de Hoogsteen, provocando la lesión selectiva del
nucleótido mutado y la consecuente activación del proceso de reparación del
ADN.
7.1.4.- Utilización de ribozimas para inhibir la expresión génica.
Las Ribozymas son pequeñas moléculas de ARN con actividad específica
endonucleolítica y cataliza la hidrólisis de enlaces fosfodiéster específicos (Sun y
cols., 2000). Los ribozimas utilizan unas Secuencias Guía Internas (IGS) que le
permiten unirse a secuencias complementarias (antisentido) de un determinado
ARN. Mediante mutaciones del elemento IGS es posible cambiar la especificidad
del ribozima hacia un ARN específico. Se ha demostrado lo posibilidad de utilizar
ribozimas para inhibir la expresión del ARNm alterado como una factible terapia
génica en el tratamiento del cáncer de mama (Choi y cols., 2003).
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Introducción
7.2.- Sustitución de oncosupresores.
Consiste en insertar una copia normal de un oncosupresor como pueden
ser rb, dcc o p53 que se encuentra defectuoso.
El gen supresor tumoral (oncosupresor) p53, está inactivado en muchos
tumores y, como consecuencia de esto, se activa el crecimiento tumoral y
aumenta la resistencia a la quimioterapia y la radioterapia. Se ha demostrado la
expresión de la proteína después de la transfección de la copia sana del gen y la
reversión del fenotipo maligno frecuentemente asociados con la inducción de la
apoptosis en las células tumorales. Teóricamente, si se transfiere la forma no
mutada del gen p53 a las células tumorales que lo tienen inactivado se debería
inhibir su crecimiento y aumentar su sensibilidad a los quimioterápicos (Ruiz y
cols., 2005).
Se están realizando ensayos clínicos en los que se deposita mediante un
retrovirus una copia intacta de p53 cerca de la zona donde se localiza el cáncer
de pulmón. Lo que se ha visto en modelos animales de tumores es que la
administración repetida (por vía intraarterial o intratumoral) de un vector
adenoviral que exprese el gen p53 inhibe el crecimiento tumoral. En los ensayos
clínicos en los que se ha empleado la inyección intratumoral de un vector como
este, la acción es segura y es capaz de producir remisiones tumorales objetivas.
En otros tumores, parece que este tratamiento puede potenciar la acción de la
quimioterapia y la radioterapia (Burdelya y cols., 2006).
La eficacia de esta terapia podría ser incrementada con la llegada de
varios oncogenes y oncosupresores en un mismo vector para que pudiesen
actuar simultáneamente en la corrección de las anomalías de las células
tumorales.
7.3.- Vacunas.
Aunque
algunos
tumores
expresan
antígenos
que
podrían
ser
reconocidos por el sistema inmune, no existe una respuesta eficaz del
organismo a la proliferación de células tumorales. Las vacunas antitumorales
tienen baja toxicidad, no influyen contra el tejido normal, incrementan
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Introducción
inmunogenicidad y previenen el crecimiento tumoral. Una atención especial se
ha centrado en el uso de vacunas mediante factores estimuladores de colonias
de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), interleukinas 2, 4, 6, 7 y 12, factor de
necrosis tumoral alfa e interferones beta y gamma antólogos (Harrington y cols.,
2001). El GM-CSF puede ser transferido mediante vectores virales a células
tumorales autólogas o alogénicas ex vivo, posteriormente se inyecta en la
próstata y es capaz de estimular a células presentadoras de antígenos
iniciándose una respuesta inmune específica (Gómez Pérez y cols., 2007). Otra
posibilidad es transferir un transgen contra el cual queremos suscitar la
respuesta inmune.
7.4.- Sistemas asesino-suicidas
Se basan en la aplicación de genes suicidas o genes que puedan inducir
apoptosis en las células tumorales y en una serie de estrategias dirigidas a
inhibir la neovascularización de los tumores y la propagación de las células
malignas (Khalighinejad y cols., 2008).
Suelen consistir en genes que codifican enzimas que convierten un
fármaco a su forma activa, con el objetivo de detener el ciclo celular y provocar
la muerte de la célula tumoral respetando a la célula huésped, ya que la máxima
concentración del metabolito activo queda circunscrita al tejido tumoral.
Actualmente existen dos tipos de terapias con genes suicidas en investigación,
el sistema herpes virus timidina kinasa (HSV-TK) (Hu y cols., 2004) y el de la
Escherichia coli citosina deaminasa (Gómez Pérez y cols., 2007).
El gen de la citosina deaminasa, ausente en células de mamíferos,
expresa una enzima capaz de transformar citosina en uracilo. Al inyectar el
profármaco 5 fluorocistina lo transforma en el metabolito activo 5 fluoracilo, que
inhibe la síntesis de ADN y ARN, induciendo muerte celular con mayor eficacia
que el sistema HSV-TK5 (Mazhar y cols., 2004).
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Introducción
Mecanismo por el que actúa la terapia génica basada en genes de acción
indirecta (HSV-tk o CD) que son capaces de transformar las prodrogas
(ganciclovir o fluorocotosina) en compuestos activos frente a las células
tumorales.
8.- AVANCES EN LA TERAPIA GÉNICA APLICADA A CÁNCER DE MAMA,
PULMÓN Y COLON.
Se necesitan al menos tres condiciones para desarrollar nuevas terapias
génicas:
•
La existencia de estudios clínicos relacionando la sobreexpresión de
un gen para determinar que pacientes se pueden beneficiar de esta
terapia, y adaptarla a cada subtipo de cáncer.
•
Conocimiento del modo de acción de la molécula involucrada en la
carcinogénesis o progresión.
•
Una manera de alcanzar específicamente al tumor y no a las células
normales para minimizar la toxicidad y aumentar la selectividad del
tratamiento.
En base a lo anterior, se pueden considerar varias posibles terapias
génicas:
- 51 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
•
Introducción
La estrategia de compensar la mutación génica sea por ablación de
los productos del oncogén, recuperar los genes supresores o interferir
en las ya alteradas señales de transducción.
•
Una segunda estrategia es la quimioterapia molecular, que busca
aumentar la especificidad de la entrega de fármacos o aumentar la
sensibilidad hacia estos fármacos.
•
Una tercera estrategia, inmunoterapia génica, que pretende aumentar
la especificidad y/o magnitud de la respuesta inmune normal hacia los
tumores.
•
Y una última con la introducción de genes suicidas.
8.1.- Terapia génica en cáncer de mama.
A pesar
del desarrollo de un importante número de agentes
quimioterápicos y del aumento de la sobrevivencia global de los pacientes con
cáncer de mama, las esperanzas de vida de los pacientes que desarrollan
metástasis son limitadas. Éste es el motivo de la urgente necesidad de
desarrollar nuevas estrategias sistémicas para afrontar este problema.
Hay múltiples oncogenes cuya desregulación contribuye a la ontogénesis:
Amplificación del gen cyclin D1, presente entre el 15-20%, codificando
una proteína nuclear involucrada en la regulación del ciclo celular. Cyclin D1
puede unirse como ligando a un ER y en este caso esta sobreexpresado en el
80% de los carcinomas ductales invasivos, pero no siempre acompañado por la
amplificación del gen. (Lee y cols., 2007).
MYC: presente en el 20% de los casos, está relacionado con el
crecimiento y la apoptosis (Butt y cols., 2008).
HER2: presente entre el 20-30% de los casos (Huang y cols., 2005). La
expresión positiva de HER2 se asocia a un fenotipo desfavorable de cáncer y ha
sido estudiado como diana de intervención terapéutica (Jhabvala-Romero y
cols., 2003).
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Introducción
La inhibición o ablación de la función del oncogén se puede realizar en
tres niveles:
1. Atacar la traslación del oncogén usando moléculas antisentido para
secuestrar el RNAm oncogénico. Por ejemplo un MYC antisentido produjo efecto
citostático en estrógeno dependiente-independiente neo de mama (Butt y cols.,
2008).
2. La función del producto del gen se puede atacar usando polipéptidos
que contienen mutaciones dominantes que inhiba la señal de transducción. Un
objetivo atractivo son los receptores tirosinquinasa (Erb B1/EGFR, ErbB2 y
ErbB3) que están ampliados o sobreexpresados en el cáncer de mama. Hay dos
mecanismos para bloquearlos. Uno es interrumpir la dimerización necesaria para
la señal intracelular transfectando un dominio citoplasmático mutado con un tipo
salvaje de receptor EGFR (Olayioye y cols., 2000), otro es utilizar un factor de
crecimiento mutado o secuestrar de manera extracelular el factor de crecimiento
(Earp y cols., 2003).
La P-glicoproteína se produce por un grupo de genes llamados MDR. El
gen MDR1 provoca una resistencia a la quimioterapia, y se comprobó que
bloqueando esta proteína se produce un retroceso en la resistencia (Katayama y
cols., 2007). Otras formas de estimular la función de MDR1 son a través de la
fosfoinositida 3-kinasa y el Erb2 (Misra y cols., 2005).
3. Evitar que el producto oncogénico alcance su destino intracelular,
usando anticuerpos intracelulares que bloqueen y secuestren los receptores del
factor de crecimiento intracelular.
4.- Aumento de la función del gen supresor. Las mutaciones en el gen
P53 se encuentran entre las alteraciones genéticas más frecuentes en el cáncer
de mama (30%) (Malamou y cols., 2002) por lo que se propone la reintroducción
de una versión virgen en lugar de los genes delectados o defectuosos. Otro gen
implicado
es
el
BRCA-1
ó
2
que
presentan
alguna
mutación
en
aproximadamente el 90% de los cánceres de mama hereditarios; estos tienen la
función de reparación del ADN (Cipollini y cols., 2004). Otro gen es el E-cadherin
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
alterado en el 60% de los carcinomas lobulillares infiltrantes, pero no en los
ductales
Las estrategias alternativas se basan en la alteración de las propiedades
biológicas de las células tumorales. La transfección de un Receptor Estrogénico
(ER) en el interior de una célula de cáncer de mama ER- resulta en una
disminución de las metástasis celulares y del potencial invasivo incluso sin
terapia hormonal (Toran-Allerand, 2004). Otra estrategia es la transfección de
tromboespondín que redujo el crecimiento del tumor primario y el potencial
metastático por la inhibición de la angiogénesis tumoral (Stasinopoulos y cols.,
2007).
Otra estrategia novedosa es transfectar células cancerígenas con genes
apoptóticos procedentes de otras especies, como podría ser el gen gef
procedente de Escherichia coli, que produce muerte celular en células tumorales
mamarias, aberración del control del ciclo celular, aumento de la expresión de
RE y RP, disminución progresiva de la expresión del oncogén c-erb-2,
disminución de la expresión del antígeno Ki-67 y finalmente un aumento en la
expresión del gen p53 (Boulaiz y cols., 2005).
8.2.- Terapia génica en cáncer de pulmón.
El gen frágil de la tríada de la histidina (FHIT) es una blanco
frecuente de delecciones en cáncer de pulmón. Estudios han demostrado que la
transferencia del gen de FHIT en las células cancerosas de pulmón que carecen
la expresión de FHIT da lugar a la inducción de apoptosis (Kim y cols., 2006).
Además, dicha expresión de Fhit en dio lugar a una reducción de la
sensibilidad a los fármacos etoposide, doxorrubicina, y docetaxel. Sin embargo,
no moduló la sensibilidad a taxol y sí la aumento levemente frente a cisplatino
(Adriani y cols., 2006).
Las GTPases pequeñas de la familia rho son estudiadas por sus
fundamentales papeles en la invasión y metástasis de las células durante la
carcinogénesis. Las células del cáncer de pulmón presentan una elevada
expresión de los genes Rac, Rho, y ROCK. Estudios con células tumorales de
pulmón, A-549 y SQ5, demostraron una disminución de la proliferación y un
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Introducción
aumento de apoptosis tras la inhibición de la expresión de los genes Rac y Rho.
Con la inhibición del gen ROCK, no se observó disminución significativa de la
proliferación, pero la actividad de la migración/invasión fue suprimida
perceptiblemente (Shimada y cols., 2007).
En modelos animales de tumores de cáncer de pulmón, la administración
repetida (por vía intraarterial o intratumoral) de un vector adenoviral que exprese
el gen p53 inhibe el crecimiento tumoral. En los ensayos clínicos en los que se
ha empleado la inyección intratumoral de un vector como este, la acción es
segura y es capaz de producir remisiones tumorales objetivas. En otros tumores,
parece que este tratamiento puede potenciar la acción de la quimioterapia y la
radioterapia (Burdelya y cols., 2006).
8.3.- Terapia génica en cáncer de colon.
El VEGF (Factor de Crecimiento Endotelial Vascular) es una de las llaves
reguladoras del desarrollo tumoral, por lo cual se considera un blanco
terapéutico importante para el tratamiento contra el cáncer. Estudios con la línea
HCT116 de cáncer de colon basados en el uso de ARNsi para el silenciamiento
de VEGF proporcionó efectos antitumores óptimos, incluyendo la inhibición de la
angioénesis, el bloqueo de la supervivencia de la célula tumoral y aumento de la
sensibilidad a la radiación y a las terapias de droga (Masuda y cols., 2008).
Otros estudios basados en genes suicidas, (Schepelmann y cols., 2007)
combinan la expresión selectiva del gen para la carboxipeptidasa G2 (CPG2) de
la enzima profármaco activa en los tumores usando el promotor humano de la
telomerasa (hTERT).
El oncogén K-ras es un oncogén que se encuentra activado
aproximadamente en el 70% de los cánceres colorrectales humanos. Los
resultados
ponen
de
manifiesto
que
el
tratamiento
con
oligodesoxirribonucleótidos antisentido frente a éste oncogén es capaz de
ejercer efectos inhibidores parciales (50%, aproximadamente) sobre la
proliferación celular. También se ha demostrado que el tratamiento conjunto con
oligodesoxirribonucleótidos antisentido contra K-ras y telomerasa ejercen una
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Introducción
importante sinergia que conduce a la pérdida completa de la viabilidad (> 99,5%)
de las células tumorales (Lledó y cols., 2005).
9.- NUEVOS GENES SUICIDAS. APLICACIÓN EN TERAPIA GÉNICA
9.1.- El Gen Gef
El gen gef pertenece a una familia de genes bacterianos que codifican
para la muerte celular (Verdes y cols., 1990). Dicha familia está formada por los
genes cromosómicos gef y relF de E. Coli y los plásmidos que codifican para los
genes hok, flmA, srnB y pndA (Poulsen y cols., 1992).
Todos ellos codifican unas pequeñas proteínas muy similares, sobretodo
en el extremo C-terminal hidrofílico (Gerdes y cols, 1990), con perfil muy
parecido (Gerdes y cols., 1986; Ono y cols 1987; Sakikaw y cols., 1989) y que
actúan de forma similar (Poulsen y cols., 1991). Son proteínas de 50-52
aminoácidos que interfieren con las funciones de la membrana. Se unen a la
membrana mediante unos receptores específicos, provocando una caída del
potencial de membrana que conlleva la apertura de poros en la membrana, y por
tanto un flujo saliente de Mg2+ y entrante de moléculas periplásmicas (Gerdes y
cols., 1986; Ono y cols., 1986-1987; Sakikawa y cols., 1985-1989; Loh y cols.,
1988). Las células experimentan cambios morfológicos transformándose en
células “fantasma” no viables, caracterizadas por presentar un centro translúcido
y el material celular condensado en los polos (Gerdes y cols., 1986b). Todos
ellos se encuentran regulados a nivel transcripcional, y subdividen en cuatro
familias en función de la proteína que codifican y su localización.
hok y flmA, están regulados por la relación entre ARNs antisentido y los
ARNms. El ARNs antisentido inhibe la traducción de los ARNms estables que
codifica la proteína tóxica y al propio ARNs antisentido (Gerdes y cols., 1988;
1990b; Loh y cols., 1988). Dicho mecanismo regula la translación de una
estructura iniciando así el funcionamiento de la región que codifica para la
proteína tóxica (Loh y cols., 1988; Gredes y cols., 1988).
Pnd y srnb, descubiertos por su capacidad de dañar la membrana y
degradar el ARN.
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Gef y relf, descubiertos debido a su semejanza con la secuencia a niveles
genómico y de la proteína con otros miembros de la familia del gene del hok.
Están regulados por un mecanismo aún no descrito. No se conoce ninguna
función que desempeñen, de forma que si son suprimidos no ocurren
modificaciones fenotípicas aparentes (Poulsen y cols., 1989; Gredes y cols.,
1986b).
En condiciones de crecimiento normal, la expresión de estos genes
suicidas debe estar reprimida, por ser tóxica para la célula. Esto ocurre con la
proteína del gen Gef, que aún no ha sido detectada por western blot en E. Coli
en condiciones normales de crecimiento, lo que nos indica que el nivel de su
expresión debe ser extremadamente bajo en estas condiciones. El ARNm del
gen gef detectado en las células vivas indica que los mecanismos deben actuar
a nivel de la translación (Poulsen y cols., 1991b).
La proteína del gen gef se ancla a la membrana citoplasmática por su
extremo
N-terminal
(hidrofóbico)
mediante
la
formación
de
un
canal
transmembrana de alfa hélice, quedando su extremo C-terminal (hidrofílico)
localizado en el espacio periplasmático en forma dímera con por lo menos un
enlace disulfuro. Por mutagénesis de gef, se ha demostrado que es esta porción
periplásmica la que codifica el dominio tóxico, y que la dimerización de gef no es
esencial para el efecto tóxico (Poulsen y cols., 1991b). En bacterias, la inducción
de gef conlleva la muerte celular, adquiriendo dicha célula un aspecto de
fantasma tras una o dos horas (Poulsen y cols., 1989). Aún no se conoce bien el
mecanismo de acción de la proteína gef, aunque se han descrito dos posibles
modelos:
La proteína gef interactúa con una compleja proteína de membrana
La proteína no tiene un receptor específico en la membrana. Forma un
oligómero que abre poros.
Sin embargo, aún no se ha conseguido confirmar alguna de estas teorías
(Poulsen y cols., 1991b).
- 57 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
8.2.- El Gen E
La proteína E es una proteína de membrana del X174 constituida por 91
residuos aminoacídicos (Sanger F y cols., 1977), que causa la lisis celular
mediante un mecanismo de crecimiento-dependiente igual que el de los
antibióticos en la pared celular, sugiriendo que la proteína E actúa inhibiendo la
síntesis de peptidoglicanos (Bernhardt y cols., 2000).
El análisis de fusión del gen sugieren la subdivisión de la proteína E en
un dominio N-Terminal (hidrofóbico) localizado en el citoplasma, por el que se
ancla a la membrana citoplasmática y en el que reside la actividad lítica, y un
dominio C-Terminal (hidrofílica) necesario para la oligomerización (Bernhardt y
cols., 2001). La proteína E no tiene ninguna actividad perceptible de degradación
de la pared de celular, y dado su estructura primaria simple, es poco probable
que tenga alguna actividad enzimática. Por lo tanto, debe promover que la lisis
celular se produce por un mecanismo distinto de la degradación directa de la
pared celular (Bernhardt y cols., 2000).
El mecanismo por el cual la proteína E causa la lisis de célula es
polémico. Son muchos los modelos que se han propuesto para explicar su
función lítica. La lisis provocada por la expresión del gen E es similar a la
causada por el antibiótico penicilina. La penicilina causa la lisis de la célula
inhibiendo la síntesis de la pared celular a nivel de la formación de los enlaces
peptídicos entre los filamentos de los peptidoglicanos. Estas observaciones
condujeron a un modelo en el cual la proteína E inhibe a la translocasa MraY,
que cataliza la primera etapa de las reacciones involucradas en la biosíntesis de
peptidoglicanos de la pared bacteriana (Mendel y cols., 2006). La inhibición de la
regeneración de la pared celular conlleva la lisis.
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Etapas de unión de los lípidos en la biosíntesis de peptidoglicanos,
mostrando la reacción catalizada por la translocasa MraY y el sitio de acción de
E (Mendel y cols., 2006).
La unión de E a la región transmembrana de MraY interrumpe la
formación de los complejos de proteínas esenciales para la activación de la
MraY, observándose una inhibición de la actividad translocasa in vivo, lo que
conlleva a la lisis celular Mendel y cols., 2006).
Protein-Protein interactions with cellwall synthesis protein/enzymes –
hight turnover
Cell
division
E-SlyD
- 59 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Introducción
Sin embargo, también se ha divulgado que la lisis de la célula inducida
por la expresión del gen E es deficiente de enzimas autolíticas, conduciendo a la
hipótesis que E funciona activando un componente del sistema autolítico en E.
Coli (Lubitz y cols., 1984). Por otra parte, Lubitz y sus compañeros de trabajo
(Witte y cols, 1990) observaron agujeros de 50-200-nm localizados en el tabique
de la célula y de vez en cuando en los polos. Esta observación los ha conducido
a proponer un modelo en el cual la proteína E oligomeriza para formar un "túnel
transmembrana" que atraviesa la célula causando la disminución rápida de la
presión osmótica celular, dando por resultado la expulsión del contenido
citosólico, incluyendo los virones de la progenie (Witte A y cols, 1990). Las
células quedan vacías, desprovistas del material citoplasmático y genómico,
“células fantasma” (Haidinger y cols., 2003).
- 60 -
III.OBJECTIVES
Ana Rosa Rama Ballesteros
Objectives
The general objective that we set in the first phase of the Research
Proyect and Doctoral Thesis is to determine the therapeutic possibilities of a new
gene named E, witch has “suicide” actions and it comes from a prokaryote
organism, as an useful agent in gene therapy protocols for the treatment of
breast, lung and colon cancer.
The specific objectives are:
To construct vectors of expression in eukaryotes with systems of control
of this expression that allows us to express the gene E in culture of cellular
tumour effectively.
To determine the mechanism of action of the gene E on transfected
tumour cells and the changes that it induces in the proliferation and cycle cellular
of the same.
To determine protocols of the combined therapy based on the association
of gene E and citotoxic agents of habitual use in breast, lung and colon cancer to
analyze their profitable relationship with conventional combined therapy.
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II.MATERIAL Y MÉTODOS
Ana Rosa Rama Ballesteros
Material y Métodos
1.- LÍNEAS CELULARES
Todas las líneas celulares utilizadas en el estudio fueron líneas
comerciales establecidas por la ATCC (American Type Culture Collection). La
línea MCF-7-EU (carcinoma de mama) fue suministrada por Centro de
Instrumentación Científica de la Universidad de Granada. La línea T-84 de
cáncer de colon y A-549 de cáncer de pulmón de células no pequeñas fue
adquirida directamente de la ATCC.
2.- CULTIVO DE LÍNEAS CELULARES.
Todas las líneas celulares, MCF7 EUROPEA, T-84 y A-549 fueron
cultivadas en medio DEMEM (GIBCO, Paisley, UK) suplementadas con
glutamina 2mM, ampicilina 500 µM/ml, gentamicina (Genta-Gobens) 40 µM/ml y
10% de suero bovino fetal inactivo (Sigma S.L). Para dichos cultivos se utilizaron
frascos de cultivo (Falcon) estériles y la incubación se llevó a cabo en una estufa
a 37 ºC, en atmósfera de CO2 y 90% de humedad.
3.- CONGELACIÓN DE LAS LÍNEAS CELULARES.
Las células fueron despegadas de la superficie de los Falcons mediante
una solución de PBS-EDTA (0.02%), centrifugadas a 600 x g durante 5 min y
lavadas 2 veces con PBS. Tras retirar el sobrenadante, se resuspendieron a
razón de 0.5 x 106 células por ml de medio de congelación. A continuación
fueron dispensadas en criotubos e introducidas inmediatamente en congelador a
-80ºC donde permanecieron 24 h, siendo almacenadas definitivamente en
nitrógeno líquido.
Medio de congelación: suero fetal bovino, inactivado en calor
húmedo a 60º C durante 30 min, y dimetil sulfóxido (DMSO)
al 10%.
Medio de congelación: suero fetal bovino, inactivado en calor
húmedo a 60º C durante 30 min, y dimetil sulfóxido (DMSO)
al 10%.
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Material y Métodos
4.- MANTENIMIENTO DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
4.1.- Cambio de medio.
El medio de cultivo fue renovado de acuerdo con su acidificación
(amarillo). En cámara de flujo laminar se procede a la retirada del medio y la
adicción de nuevo medio de cultivo.
4.2.- Lavado de las células.
Esta operación se realiza para retirar los restos de medio de cultivo
cuando las células van a ser sometidas a algún experimento posterior como la
extracción de ácidos nucleicos o proteínas, van a ser congeladas o va a ser
dividido el cultivo celular.
Para el lavado se añadieron 20 ml de PBS a las células, las cuales se
centrifugaron a 200xg durante 5 min., eliminándose el sobrenadante y
quedándonos con el botón celular para su posterior uso.
4.3.- División del cultivo celular.
Si el frasco de cultivo está confluente de células, se procede a la división
de las células, para lo cual las células adheridas al plástico del frasco de cultivo
deben ser despegadas añadiendo una solución de PBS-EDTA 0,02%. Las
células son incubadas 10 min. en la estufa a 37 ºC, transcurridos los cuales
debemos de golpear ligeramente el frasco para que las células se despeguen,
ya que el EDTA habrá ejercido su acción secuestrando el Ca++, necesario para
la adhesión celular. Seguidamente la suspensión celular es centrifugada a 200xg
durante 5mints. A continuación se procede al lavado de las células con PBS. El
sobrenadante es desechado y el botón de células resuspendido en un nuevo
medio de cultivo que se pasará a un nuevo frasco de cultivo. Cuando el frasco
de cultivo es saturado por el crecimiento celular, las células son repartidas en
dos frascos de cultivo nuevos, siguiendo el procedimiento anteriormente
descrito, consiguiendo así su duplicación.
Tampón PBS: 10 mM Na2HPO4, 170 Mm NaCl, 3mM KCl, pH:
7.2PBS-EDTA: 2g EDTA 1 mM por cada litro de tampón PBS.
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Material y Métodos
5.- CONTAJE CELULAR.
Tras el despegue de las células, éstas se centrifugan a 200xg durante
5mins. Eliminamos el sobrenadante y resuspendemos el botón celular en 1ml de
medio DMEM. La densidad del cultivo será determinada con ayuda de una celda
de conteo o cámara de Neubauer. La densidad del cultivo será determinada con
ayuda de una celda de conteo o cámara de Neubauer. La densidad celular del
cultivo se obtiene para poder calcular el volumen necesario para asegurar 2000
células por esferoide.
6.- CONSTITUCIÓN Y CULTIVO DE LOS ESFEROIDES TUMORALES.
Los esferoides se obtuvieron de las diferentes líneas celulares aunque los
estudios se centraron especialmente en los obtenidos con la línea MCF7. Las
células fueron cultivados en placas de 48 pocillos cuyas bases fueron cubiertas
con 100µl de una disolución 0.75% Noble Agar (Difco Laboratories, Detroit, MI)
preparado en DMEM. Una vez solidificado el agar, se le añade a cada pocillo
250µl de medio DMEM (GIBCO, Paisley, UK) suplementado con glutamina 2mM,
ampicilina 500 µM/ml, gentamicina (Genta-Gobens) 40 µM/ml y 10% de suero
bovino fetal inactivo (Sigma S.L). Por último se sembrarán 2000 células de
MCF7 por esferoide en cada pocillo. La incubación se llevó a cabo en agitación
suave (40 a 50 rpm), que favorece la consolidación del esferoide, en una estufa
a 37 ºC, en atmósfera de CO2 y 90% de humedad.
7.- AGENTES CITOTÓXICOS.
Todos los agentes citotóxicos fueron obtenidos del Servicio de
Farmacología de Hospital Clínico San Celio y del Servicio de Oncología del
Hospital Virgen de las Nieves, ambos Hospitales Universitarios de Granada.
El tratamiento de las células de cáncer de mama MCF-7 fue realizado con
Doxorrubicina, Paclitaxel (Taxol) y Docetaxel (Taxotere). Cada uno de ellos fue
utilizado a las siguientes concentraciones en base a experiencia previas de otros
autores:
Doxorrubicina: 10nM, 1nM y 0.1nM. (Monazzam y cols., 2006)
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Material y Métodos
Paclitaxel: 10nM, 1nM y 0.1nM. (Monazzam y cols., 2006)
Docetaxel: 10nM, 1nM y 0.1nM. (Monazzam y cols., 2006)
El tratamiento de las células de cáncer de pulmón A-549 fue realizado
con Paclitaxel, Gemcitabina y Carboplatino. Cada uno de ellos fue utilizado a las
siguientes concentraciones en base a experiencia previas de otros autores:
Paclitaxel: 100µM, 50µM y 1 µM (Dasgupta y cols., 2006)
Gemcitabina: 100µM, 50µM y 1 µM (Dasgupta y cols., 2006)
Carboplatino: 100µM, 50µM y 1 µM (Ulukaya y cols., 2008)
El tratamiento de las células de cáncer de colon T-84 fue realizado con 5fluoracilo (5-Fu) y Ácido Folínico (FA), en combinación con Oxaliplatino o
Irinotecán. Cada uno de ellos fue utilizado a las siguientes concentraciones en
base a experiencia previas de otros autores:
5-Fu: 5000µM, 500µM y 5µM (Ganten y cols., 2006)
FA: 5µM (Fischel y cols., 1998)
Irinotecán: 200µM, 50µM y 10µM (Ganten y cols., 2006)
Oxaliplatino: 100µM, 10µM y 0.5µM (Ganten y cols., 2006)
Los tiempos en los que se realizaron los tratamientos sólo o en
combinación con la transfección génica los describiremos posteriormente.
8.- INSERTOS UTILIZADOS EN TERAPIA GÉNICA.
8.1.- Insertos.
Se utilizaron los genes suicidas E y el gen Gef. Ambos genes fueron
amablemente cedidos por el Dr. Juan Luis Ramos del CSIC, Estación
experimental del Zaidín Granada.
- 70 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Material y Métodos
8.2.- PCR para obtención de insertos
La PCR (ver más abajo) para la obtención de insertos se realizó
mezclando en un tubo de PCR los siguientes reactivos:
REACTIVO
VOLUMEN (µl)
Tampón 10x
2,5
MgCl2 (25mM)
1,5
dNTP (10mM)
0,5
Oligo
0,5
Oligo
0,5
H2O
15,3
Taq
0,2
Plásmido (1:100)*
5
Plásmido con Gef o plásmido con E dependiendo del gen que a
amplificar. La muestra proviene de una previa miniprep (posteriormente se
describe esta técnica) que diluimos 1:100 para cargar como muestra en la PCR.
Los ciclos de amplificación fueron:
TEMPERATURA (ºC)
TIEMPO CICLOS
94
5 min
94
10 s
50 – 58 *
10 s
72
20 s
72
7 min
- 71 -
1
30
1
Ana Rosa Rama Ballesteros
Material y Métodos
* 50 ºC para el gen E y 58 ºC para el gen Gef
9.- VECTORES
Los plásmidos pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Gef y pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E
fueron obtenidos a partir del vector recombinante pcDNA3.1/V5-His-TOPO
(Invitrogen).
10.- LIGACIÓN DEL INSERTO CON EL VECTOR
La topoisomerasa I del virus Vaccinia reconoce la secuencia 5'(C/T)CCTT-3' en una hebra doble de ADN, y se une de manera covalente a un
3'-fosfato de la tiamina situado al final de ésta secuencia. Dicha secuencia de
reconocimiento se coloca de forma que la topoisomerasa protege al vector
linealizado de su degradación por exonucleasas y su religado.
La Taq polimerasa tiene una actividad terminal nontemplate-dependiente
transferasa que añade una sola deoxiadenosina (A) a los extremos 3' de los
productos de PCR. Como he citado antes, el plásmido pcDNA3.1 lineal tiene una
deoxitimidina (T) en el extremo 3' donde se encuentra unida la topoisomerasa I.
Ésto permite que los insertos de PCR que liguen eficientemente con el vector.
- 72 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Material y Métodos
La reacción de ligación se llevó a cabo en un eppendorf mezclando los
siguientes reactivos según el protocolo de TOPO® Cloning.
REACTIVOS
VOLUMEN (µl)
Producto de PCR
4
Solución Salina
1
Vector TOPO®
1
Dicha reacción fue mezclada en un agitador y posteriormente se incubó
durante 5 min a Tª ambiente.
11.- TRANSFORMACIÓN BACTERIANA.
Tras la ligación se tomaron 2 µl de dicha reacción y se añadieron a un vial
de bacterias E. Coli químicamente competentes, One Shot® TOP10. Tras
mezclar mediante agitación, se dejaron incubar 10 min en hielo. Después las
bacterias fueron sometidas a un choque térmico (42ºC durante 30s) y
rápidamente depositadas nuevamente en hielo. El siguiente paso es añadirle
250 µl de medio SOC, que se encuentra a Tª ambiente, e incubar en posición
horizontal durante 1h en agitación en una estufa a 37 ºC. Transcurrida la hora,
se sembraron 200 µl de dichas bacterias en una placa de agar/ampicilina y se
incubaron en la estufa a 37 ºC hasta el día siguiente.
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Material y Métodos
12.- MÉTODO DE CULTIVO BACTERIANO.
De las colonias obtenidas al día siguiente, se picaron 5 para sembrar
cada una en 3ml de medio LB e incubar a 37 ºC con agitación continua a 200
rpm hasta el día siguiente. Todo el manejo de las bacterias se realizó bajo
condiciones de esterilidad en campana de flujo laminar, utilizando material y
soluciones estériles.
Medio LB: Para un litro, disolver 10 g Bacto Tryptona, 50 g Extracto de
Levadura, 10 g de NaCl en 1L de agua destilada. Ajustar, si fuese necesario, el
pH a 7 añadiendo NaOH. Autoclavar la solución, y dejar enfriar hasta que su Tª
es aproximadamente de 55 ºC, momento en el que añadimos la ampicilina para
que quede a una concentración de 100 µg/µl.
Medio LB-Agar: Se prepara el medio LB anteriormente descrito, con la
excepción de que le añadimos 15 g/L de agar antes de autoclavar.
Posteriormente, tras añadirle la ampicilina (100µg/µl) a 55 ºC, vertimos el
contenido en placas de 10 cm. Cuando la mezcla ha gelificado, podemos
guardar las placas en posición invertida a 4 ºC y en oscuridad.
13.- EXTRACCIÓN DE PLÁSMIDO.
Se llevó a cabo mediante el kit “QIAprep Spin Miniprep” (QIAGEN,
Germany): Se centrifugaron los 3 ml de cultivo bacteriano a 4000 rpm durante 15
min a 4 ºC. El sedimento bacteriano fue resuspendido en 250 µl del tampón de
resuspensión P1 (con RNAsa añadida según lo indicado en el protocolo) y
trasferido a eppendorf. A continuación se añadieron 250 µl del tampón de lisis
P2 que se mezclaron por inversión 8-10 veces hasta observarse una solución
clara y viscosa. La reacción fue neutralizada añadiendo 350 µl del tampón de
neutralización N3 y mezclando por inversión 8-10 veces hasta observarse unos
grumos blanquecinos (parecido a la clara de huevo) que indican la presencia de
proteínas
que
son
precipitadas
junto
con
la
membrana,
estructuras
citoplasmáticas, el ADN cromosómico y el ARN de alto peso molecular al
centrifugar durante 10 min a máxima velocidad en una microcentrífuga. El
sobrenadante, en el cual no deben quedar partículas flotando (en caso contrario
volvemos a centrifugar añadiendo 1 gota de Cl3CH) es transferido a una
- 74 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Material y Métodos
columna de QIAprep que previamente hemos colocado en un nuevo eppendorf.
Se vuelve a centrifugar durante 30-60 s, y descartamos el sobrenadante del
eppendorf. Le añadimos 750 µl del tampón PB (con RNAsa añadida según lo
indicado en el protocolo) y se volvió a centrifugar durante 30-60 s. Volvemos a
descartar el sobrenadante del eppendorf y centrifugamos nuevamente durante 1
min para eliminar los posibles restos de etanol. Por último colocamos la columna
en un nuevo eppendorf y le añadimos 50 µl de tampón EB, dejando reposar 1
min y recuperándose dicho volumen tras volver a centrifugar durante 1 min.
14.- ANÁLISIS DE LOS PLÁSMIDOS RECOMBINANTES.
Con los plásmidos extraídos se realiza una PCR con los primers con los
que amplificamos el inserto, como anteriormente se ha citado. Posteriormente,
comprobamos mediante electroforesis en qué plásmidos se ha amplificado el
gen. Los plásmidos en que contienen el inserto son secuenciados con el primer
T7 para comprobar su correcta orientación en el plásmido: T7 5´TAATACGACTCACTATAGGG-3´.
Aquellas
colonias,
que
efectivamente
contienen el plásmido con el inserto en la orientación correcta, son las elegidas
para realizar la siguiente fase de transfección.
15.- ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA.
Se trata de una técnica que permite separar los fragmentos de ADN en
función de su tamaño y conformación, así como localizarlos en función de su
peso molecular por comparación con la movilidad de unos marcadores de peso
molecular conocido. Posteriormente, si fuese preciso, podría extraerse del gel el
fragmento de interés para posteriores aplicaciones (amplificación, clonación,
secuenciación, transfección, etc.).
El % de agarosa en el gel es elegido en función del tamaño de los
fragmentos a separar:
>1
kb
---------------------------- 0.8-1%
0.5-1 kb
---------------------------- 1-2%
< 0.5 kb
---------------------------- 2-3%
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Material y Métodos
- Agarosa (Sigma)
- Marcador de peso molecular (Boheringer Mannheim)
- Solución TAE 50X: 0.4M Tris-Acetato, 0.01M EDTA pH 8.0.
- Solución de Bromuro de Etidio: 10mg/ml
- Tampón de carga 6X: 0.25% azul de bromofenol, 0.25% Xileno
Cyanol, 15% Ficol 400.
15.1.- Preparación del gel.
Fueron usados geles de agarosa del 1% (en el caso de plásmidos) y del
2% (en el caso de los genes Gef y E). Para la preparación de 250ml de gel, se
pesan 2.5g de agarosa para el 1% y 5g para el 2%. En ambos casos se añaden
5ml de TAE 50X y se enrasa hasta 250ml con agua bidestilada. Dicha disolución
se calienta hasta ebullición, y a continuación se deja enfriar hasta una
temperatura de 65ºC, momento en el que se añade Bromuro de Etidio. Hay que
tener cuidado con los vapores de bromuro de etidio, pues son altamente tóxicos.
Posteriormente se vierte sobre el soporte del gel, previamente preparado y con
el peine, y se deja solidificar, momento en el que es retirado el peine, dejando
visible los pocillos de carga.
15.2.- Electroforesis.
Debemos introducir el gel en la cubeta de electroforesis y llenarla con
TAE 1X hasta que el gel sea cubierto totalmente. Seguidamente cargamos el
marcador de peso molecular y nuestras muestras junto con el tampón de carga,
cada una en un pocillo. A continuación se someten a una deferencia de potencial
de 50-100 V. Cuando el frente ha avanzado algo más de la mitad del gel, se
para la electroforesis y el gel es chequeado en un transiluminador UV, donde
podremos visualizar las bandas de ADN y compararlas con el marcador de peso
molecular para conocer el tamaño de nuestras muestras.
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Material y Métodos
16.- TRANSFECCIÓN DEL PLÁSMIDO EN LAS CÉLULAS.
16.1.- Método de transfección.
Las células de cáncer de mama, pulmón y colon fueron transfectadas con
el
plásmido
pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E
mediante
liposomas
utilizando
FuGENETM6 Transfection Reagent (Roche), que es una mezcla multi-lipídica de
formulación no liposomal, que se caracteriza por una alta eficiencia de
transfección y una ausencia de toxicidad.
En placas de 24 pocillos se siembran las líneas MCF7, A-549 y T-84 a
una densidad de 10.000 células/pocillo que permita obtener, después de 7 días,
una confluencia de 65-85%. La relación Fugene/ADN es de 3 µl de Fugene/µg
de ADN y se utilizó 0.4µg de ADN por pocillo. Se calculan 20µl de la mezcla
medio+Fugene+ADN por pocillo. En un eppendorf se añade el medio de cultivo,
sin suero bovino fetal ni antibióticos, y el Fugene (el orden de adicción es
importante y hay que evitar el contacto directo de los liposomas con el plástico
del eppendorf). La mezcla se incubó durante 5min a temperatura ambiente.
Después se añade el plásmido mezclándolo suavemente por repipeteo. Después
de una incubación a temperatura ambiente de 15-30 minutos, se puede añadir la
mezcla a las células. Después de haber dispersado uniformemente la mezcla
sobre las células, éstas se incubaron en una estufa a 37ºC, en atmósfera de CO2
y 90% de humedad.
En placas de 96 pocillos, donde se encuentran formados los esferoides,
se utilizó 0.06µg de ADN por pocillo. Se calculan 5µl de la mezcla
medio+Fugene+ADN
por
pocillo,
siguiéndose
el
mismo
procedimiento
anteriormente descrito.
16.2.- Control de la transfección.
Como control de la transfección de las líneas y esferoides celulares se
utilizó el plásmido pcDNA3.1/V5-His-TOPO/LacZ, que contiene el gen de la βGalactosidasa. 24 horas después de la transfección con el plásmido
pcDNA3.1/V5-His-TOPO/LacZ (en las mismas condiciones del apartado
anterior), se lavaron los pocillos de las placas 3 veces con PBS, se fijaron con
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Material y Métodos
0.5ml de la mezcla de glutaraldehido (1% de glutaraldehido, 0.1M de tampón
fosfato, 1mM MgCl2) durante 15 min y se lavaron con PBS 3 veces.
Posteriormente se les adicionó 0.5ml de la mezcla tampón X-Gal/X-Gal al 2%
(5.4ml tampón X-Gal; 0.6ml X-Gal al 2%) y se incubaron en estufa a 37ºC
durante 24 horas, tras las que apareció la coloración azul en las células
demostrando así la correcta transfección.
17.- EXTRACCIÓN DE ARN.
Se obtuvo ARN total de las células parentales y sus respectivos cultivos
transfectados, solos o en combinación con los fármacos. La extracción del ARN
se realizó mediante Micro RNA Isolation Kit (Promega, Madison, WI) a partir de
cultivos de 105-106 células. Las células fueron lavadas con PBS frío dos veces y
posteriormente centrifugadas a 1500 rpm durante 10 min para recoger el pellet
celular. Los pellet celulares se resuspendieron en 1ml de PBS y se llevaron a un
eppendorf en el cual se les añadió 300µl de solución de desnaturalización. Se
mezclaron y se centrifugaron durante 5min (13-14000 rpm). Se transfirió la fase
transparente (superior) a otro eppendorf estéril teniendo cuidado de no arrastrar
la interfase. Se le añadieron 300µl de isopropanol, se mezcló bien y se dejó
reposar 30min a -20ºC. Se retiró el sobrenadante y se lavó el pellet con 600µl de
la mezcla etanol 75% y DEPC H2O 25%. Se volvió a retirar el sobrenadante y se
secó el pellet al vacío durante 5min. Al final se resuspendió el ARN en 50µl de
H2O bidestilada y se guardó a -20ºC.
Un µg de ARN fue chequeado mediante electroforesis a 80V durante 2h
en un gel de agarosa al 1%. La visualización del ARN por transiluminador de
ultravioletas nos permitió comprobar que no se encontraba degradado. Su
concentración fue estimada mediante espectrofotómetro.
Solución de desnaturalización:
2.16µl de NaOAC 2M, 60ml de
cloroformo.
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Material y Métodos
18.- TRANCRIPTASA REVERSA Y REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (RT-PCR).
Utilizando el ARN total obtenido previamente, se realizó la transcriptasa
reversa mediante kit Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI).
Cada tubo de reacción contenía un volumen total de 20 µl compuestos de:
- ARN total (2µgr)
- d NTP (2 µl)
- Tampón de transcriptasa reversa 10x (2 µl)
- MgCl2 (4 µl)
- Proteína inhibidora de RNAsa (0,5 µl)
- Agua hasta 20 µl
- Transcriptasa reversa (1 µl)
Los tubos fueron calentados a 94ºC durante 2 min para desnaturalizar el
ARN y rápidamente fueron enfriados en hielo. La reacción de la transcriptasa
reversa tuvo lugar a 42ºC durante 15 min. Tras este periodo los tubos fueron
enfriados 5 min en hielo. El resultado de la transcriptasa reversa fue diluido al
1/10 en agua destilada. Se utilizaron 5 µl para la reacción en cadena de la
polimerasa. Cada tubo de reacción contenía:
- Resultado de la transcriptasa reversa (5 µl)
- Buffer de Taq polimerasa 10X (5 µl)
-Dexosiribonucleotidos trifosfato (concentración final 250 µM )
- Primers (100 ng de cada)
- Taq polimerasa (2,5 U)
- Agua hasta 50 µl
La amplificación del gen esperado fue visualizado mediante un gel de
agarosa teñido mediante bromuro de etidio (tal y como hemos escrito
previamente).
19.- ESTUDIO DE EFICACIA DE TRANSFECCIÓN.
Para valorar la transfección de los cultivos celulares por pcDNA3.1/V5His-TOPO-E, 106 células de las líneas parentales MCF7, A-549 y T-84 fueron
sembradas en 4 pocillos de placas de 6, respectivamente. El primer día fueron
transfectadas con el vector pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E.
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Material y Métodos
19.1.- Citometría de flujo.
El último día (7) las células fueron despegadas con PBS-EDTA 0.04%,
lavadas dos veces con PBS y centrifugadas a 1500 rpm durante 10 min. El pellet
fue resuspendido en 100 µl de PBS frío y se añadió 900 µl de etanol 70% frío
mediante vortex para fijar las células. Se incubaron 5 min a 4º C tras los cuales
se centrifugaron y lavaron con 2 ml de PBS frío. A continuación se incubó en 1
ml de PBS-SBF 10% durante 15 min a Tª ambiente. Transcurrido el tiempo se
centrifugaron las células (1500 rpm durante 10 min), se remplazó el
sobrenadante por el anticuerpo conjugado Anti-V5-FICT (Invitrogen) (1:500) en
250 µl de PBS-SBF 10% y se incubó 20 min a Tª ambiente. Las células fueron
lavadas dos veces con PBS, resuspendidas en 500 µl de PBS y analizadas en
citómetro de flujo.
19.2.- Inmunofluorescencia.
El día 3, uno de los pocillos de cada una de las líneas parentales y
transfectadas, fueron fijadas con 2 ml de metanol 100% durante 2 min a Tª
ambiente. Se eliminó el metanol y se lavaron 2 veces con PBS. A continuación
se incubaron con 2 ml de PBS-SBF 10% durante 20 min a Tª ambiente.
Posteriormente los 2 ml de PBS-SBF 10% fueron remplazados por el anticuerpo
Anti-V5-FICT (Invitrogen) (1:500) en 1 ml de PBS-SBF 10%. La incubación se
llevó a cabo en oscuridad durante 1 h a Tª ambiente. Por último, el anticuerpo se
eliminó y las células fueron lavadas 2 veces durante 5 minutos con PBS para ser
observadas en el microscopio de fluorescencia.
20.- PROCESAMIENTO DE LOS CULTIVOS CELULARES PARA LA
ELECTROFORESIS EN SDS-PAGE.
20.1.- Extracción de proteínas totales.
Se tomaron 106-107 células de las líneas MCF-7, A-549 y T-84 parentales
y transfectadas con pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E y se despegaron de los frascos
de cultivo con PBS-EDTA (0.02%) y se recogieron tras dos lavados con PBS,
por centrifugación a 1500rpm durante 5 min. El pellet celular fue resuspendido
en el buffer de lisis, homogenizado, calentado hasta ebullición y centrifugado a
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Material y Métodos
1500 rpm durante 10min. El sobrenadante, con las proteínas totales, fue
recogido aislándose una muestra de 100µl para la determinación de la
concentración proteica.
Buffer de lisis: 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% glicerol, 2%
SDS, 5% 2-mercaptoetanol, 0.5% azul de bromofenol y 100
mM ditiotreitol.
20.2.- Cuantificación proteica.
La concentración proteica fue determinada en alícuotas de 100µl aisladas
a tal efecto mediante la reacción colorimétrica de Bradford. Para ello, se realizó
una curva patrón de concentración de seroalbúmina bovina (Sigma) (1-10
mg/ml). 1 ml de lisado se añadió a 1 ml de solución Bradford 1x (Bio-Rad,
GmbH, München, Germany). La densidad óptica se midió a 596 nm.
20.3.- SDS-PAGE.
Las proteínas fueron disueltas en tampón de carga obteniendo una
concentración final de 1µg/µl. Una vez se obtuvo una mezcla homogénea
tampón-extracto, se calentaron las muestras durante 5 minutos a 95 ºC para
facilitar la acción del SDS. Las muestras se introdujeron en el gel utilizando una
jeringa Hamilton (20µl por pocillo). Una vez cargadas las proteínas, se procedió
al corrido de los geles en una cubeta Mini Protean IIÒ (Bio-Rad) a 120V durante
90 min. En todos lo geles se utilizó un patrón de pesos moleculares (Precision
Plus Protein Kaleidoscope Standards, Bio-Rad Laboratoires, SA).
GEL INFERIOR
REACTIVOS GEL SUPERIOR
REACTIVOS
7.5%
12%
Acrilamida 30%
1.15 ml
1.85 ml
Acrilamida 30%
200 ml
Runnig Buffer 4X
1.15 ml
1.15 ml
Stacking Buffer 4X
500 µl
SDS 10%
45 µl
45 µl
SDS 10%
20 µl
Glicerol 50%
450 µl
450 µl
H2O
1.28 ml
H2O
1.75 ml
600 µl
APS 10%
12.5 µl
APS 10%
25 µl
25 µl
TEMED
7 µl
TEMED
15 µl
5 µl
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Material y Métodos
Buffer de carga: 7.6 µM Tris, 10% glicerol, 2% SDS, 5.5% 2-mercaptoetanol
y 0.025% azul de bromofenol.
Runnig Buffer 4X: 18.5 g Tris en 100 ml H2O (pH 8.0).
Stacking Buffer 4X: 6 g Tris en 100 ml H2O (pH 6.8).
Tampón de elctroforesis: 0.25 M Tris, 0.192 M glicina y 0.1% SDS, pH 8.3.
21.- IDENTIFICACIÓN DE LAS BANDAS PROTEICAS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA POR INMUNOBLOTING.
21.1.- Inmunobloting
El inmunobloting o western-blot se realizó por modificación de la técnica
descrita por Towbin y cols. (1997) y Leiva y cols. (1989). Finalizada la
electroforesis, a los geles se les cortó el gel concentrador del separador y se
fueron equilibrados en tampón de transferencia durante 15 min. Se cortó el papel
Whatman (Sigma, SL) y una membrana de nitrocelulosa (poro 0.45 µm)
(Millipore, Fr), siguiendo las dimensiones del gel y se equilibraron durante 15 min
en tampón de transferencia.
A continuación, se procedió a la elaboración del sanwich de transferencia,
colocando seriadamente y del polo negativo al positivo los siguientes
componentes: papel Whatman, gel, membrana de nitrocelulosa, papel Whatman.
Todo el montaje se introdujo en la cubeta de transferencia y se cubrió con
tampón de transferencia. La transferencia se realizó a 15 V durante 20 min.
Acabada la transferencia se pudo teñir el gel con rojo Ponceau durante unos 10
segundos para determinar si la transferencia fue correcta. Se lavó la membrana
con agua destilada para eliminar el exceso de tinción del rojo Ponceau y se
acabó de desteñirla con PBS.
Tampón de transferencia: 25 mM Tris, 192 mM glicina y 20% metanol, pH 8.3
21.2.- Inmunodetección de proteínas.
Tras la transferencia, la membrana de nitrocelulosa fue sometida a tres
lavados de 5 min (solución de lavado) y posteriormente se procedió al bloqueo
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Material y Métodos
de los sitios de unión inespecíficos mediante una solución de bloqueo (1 h en
agitación). Posteriormente la membrana fue sometida a tres lavados de 5 min
(solución de lavado) para posteriormente ser incubada con el anticuerpo primario
a 4º toda la noche en agitación. A continuación la membrana fue sometida de
nuevo a tres lavados de 5 min y posteriormente se incubó con el anticuerpo
secundario, marcado con peroxidada, durante 1 h en agitación. Tras tres lavados
más de 5 min, se procedió al revelado mediante ECL Western blotting detection
reagents (Amersham Biosciences, USA) y analizados los resultados usando el
Fuji LAS-4000 imaging system (Japan).
Solución de lavado: TBS-Tween-20 (0.1%) y 1.5% leche desnatada.
Solución de bloqueo: TBS-Tween-20 (0.1%) y 5% leche desnatada.
Anticuerpos:
•
Primarios: policlonal IgG en conejo citocromo c, caspasa-3, caspasa-8
y caspasa-9 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), anti-β-actina
(Sigma Chemical Co). Dilución 1:200 en solución de lavado.
•
Secundarios: monoclonal anti-IgG anti-conejo (Santa Cruz Biotech,
Santa Cruz, CA). Dilución 1:1000MX: No se puede evaluar la presencia
de metástasis a distancia.
•
M0: No hay metástasis a distancia.
22.- ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO.
22.1.- Detección inmunohistoquímica
El estudio inmunohistoquímico se realizó mediante el kit ChemMate
(Dako).
Las líneas MCF-7, A-549 y T-84 parentales y sus transfectadas fueron
cultivadas sobre cubres colocados dentro de los pocillos de placas de 6.
Transcurridas 48 h después de la transfección, los cubres fueron fijados a portas
y secados al aire libre y fijados durante 10 min con paraformaldehido 4%. A
continuación se lavó con PBS-Tritón (0.1%) durante 5 min para posteriormente
incubar con buffer de bloqueo (kit ChemMate) durante 1 h. Se retiró el buffer y
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Material y Métodos
se procedió a incubar con el anticuerpo primario diluido en el buffer de bloqueo
(1:500) durante una noche a 4º. Al siguiente día se retiró el anticuerpo y se lavó
con PBT 10%. Se incubó con la solución de bloqueo de la peroxidada endógena
(kit ChemMate) durante 1h. Se volvió a lavar con PBT 10% y se incubó otra hora
con la solución de bloqueo de la biotina (kit ChemMate). A continuación se
volvieron a lavar las células y se incubaron con el anticuerpo secundario diluido
en el buffer de bloqueo (1:1000) durante 1 h. Tras 3 lavados con PBT 10% se
incubo a Tª ambiente durante 1 h con el complejo enzimático (ABC). Por último
se volvieron a lavar (PBT 10%) y se procedió al revelado con diaminobencidina
(DAB) hasta que apareció, bajo control microscópico, la tinción deseada.
22.2.- Tinción hematoxilina-eosina.
Con el objetivo de mejorar la visualización de las células, se procedió a
teñirlas:
-
Hematoxilina de Mayer 3 min.
-
Lavar bajo flujo de agua corriente hasta azulear.
-
Eosina (1%) 30 seg.
-
Eliminar los restos de eosina en etanol 70º
Deshidratación:
-
70% etanol – 30 segundos
-
85% etanol – 30 segundos
-
95% etanol – 30 segundos
-
100% etanol – 2 x 2 minutos
Aclarado con Xilol 3 min y montaje.
Dejar secar los portas en la estufa de 37º.
- Hematoxilina de Mayer: Sulfato de aluminio potásico 50 gr; Hematoxilina 1
gr; Iodato sódico 0.1 gr; Acido cítrico (Monohidratado) 1 gr; Hidrato de Cloral
50 gr; Completar hasta 1litro.
- Eosina: Solución acuosa 1%.
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Material y Métodos
23.- TRATAMIENTO COMBINADO MEDIANTE EL GEN E Y GEF Y AGENTES
CITOTÓXICOS.
Para determinar la efectividad de un tratamiento de terapia génica
mediante el gen E y agentes citotóxicos de elección en cáncer de mama, pulmón
y colon se diseño una doble experiencia. En ella cultivos celulares de las tres
líneas fueron transfectados una sola vez al principio del tratamiento o fueron
transfectadas de forma repetida cada dos días. Esta transfección fue
acompañada de la administración al medio de cultivo de los diferentes fármacos
a diferentes concentraciones descritos previamente (ver citotóxicos). La
experiencia se realizó con cuatro grupos: el grupo control, el grupo con sólo
transfección, el grupo tratado sólo con agentes citotóxicos y el grupo de terapia
combinada. El tratamiento se mantuvo durante 8 días haciendo diferentes
determinaciones en las células cada 48 horas para observar las modificaciones
producidas.
El mismo protocolo fue aplicado a los cultivos de esferoides de la línea
MCF 7 una vez que éstos alcanzaron un volumen adecuado. En este caso las
determinaciones fueron fundamentalmente referentes a modificación de
volumen. Los esferoides una vez formados fueron transferidos a placas de 96
pocillos (uno por pocillo) mediante una pipeta Pasteur. Los pocillos fueron
tratados previamente con agarosa (200 µl). Los esferoides fueron transfectados
con los genes terapéuticos una sola vez o de forma continua estructurando la
experiencia en cuatro grupos como anteriormente. Las experiencias fueron
realizadas por cuadruplicado.
24.- ESTUDIO DE LA PROLIFERACIÓN
Células de las líneas parentales MCF7, A549 y T84, se sembraron en
placas de 6 pocillos a distintas densidades (como indica el diagrama). Tras 24h
se determinaron sus curvas de crecimiento mediante la tinción de sulforrodamina
B (SRB).
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Material y Métodos
Tras periodos de 2, 3, 4, 5, 6 y 7 días en cultivo, tres muestras de cada
tratamiento en las diferentes líneas celulares, fueron coloreadas con
Sulforrodamina-B (SRB) siguiendo este protocolo. El tapiz celular se trató con
ácido tricloroacético al 10% frío y se incubó durante 30 min a 4ºC, lavándose a
continuación con agua destilada y dejando secar. Las células así fijadas se
tiñeron, durante 15 min con SRB al 0,4 % en ácido acético al 1%.
Posteriormente, se lavó el tapiz con ácido acético al 1% y se dejaron secar las
placas de nuevo. El colorante fijado sobre las células se solubilizó con una
solución 10mM Tris base (pH 10,5) con agitación suave. Alícuotas de 100 µl se
transfirieron a placas de 96 pocillos y se leyeron en un colorímetro Titertek
multiscan a 492 nm.
25.- ESTUDIO DE LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA (APOPTOSIS).
25.1.- Marcaje nuclear mediante DAPI.
El DAPI, 4,6-diamino-2-fenilindol (Sigma, SL), se prepara 1mgr/100 ml
en PBS y se conservar protegido de la luz a 4 ºC. Células (104) de las líneas
parentales MCF7, A-549 y T-84 y de sus respectivos cultivos transfectados sólo
o en combinación con los fármacos, fueron cultivadas en placas de 6 pocillos.
Transcurridas 48h de la transfección, las células se lavaron 2 veces con PBS y
fijadas con metanol absoluto frío (-20ºC) durante 2 min. Se volvieron a lavar 2
veces con PBS para posteriormente añadir 1 gota de DAPI diluido 1:1 en PBS
sobre la monocapa. El cultivo es cubierto con un cubreobjetos y visualizado
directamente en el microscopio de fluorescencia.
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Material y Métodos
25.2.- Fragmentación de ADN.
En la apoptosis se activan endonucleasas que causan cortes en los
espacios internucleosomales del ADN, (Williams et al., 1974) lo que se visualiza
en la electroforesis como un típico patrón de bandas en escalera provocado por
los fragmentos de ADN (180-200 pb). 106 células de las líneas MCF-7, A-549 y
T-84 tanto parentales como transfectadas fueron despegadas mediante PBSEDTA 0.04% 48 h tras la transfección. Las células se centrifugaron a 1500 rpm
durante 10 min y se lavaron 2 veces con PBS. Las células fueron incubadas
durante 1 h a 37º C en el buffer de lisis al que se le añadió proteinasa K (1
mg/ml). Posteriormente las muestras fueron calentadas a 70ºC durante 10 min
tras los cuales se añadió RNAase (200 µg/ml) y se volvió a incubar 1 h a 37°C.
Las muestras de ADN fueron visualizadas mediante un gel de agarosa 2%
teñido mediante bromuro de etidio, tal y como hemos escrito previamente.
Buffer de lisis: 10 mM TRIS, 10 mM EDTA and 0.5 % Triton X-100
25.3.- Estudio mediante Anexina V-FITC e Ioduro de Propidio.
Se utilizó el Kit TACSTM Annexin V-FITC (Pharmingen).
25.3.1.- Estudio mediante citometría de flujo.
Células (106) de las líneas parentales MCF7, A-549 y T-84 y de sus
respectivos cultivos transfectados sólo o en combinación con los fármacos,
fueron despegadas de los frascos de cultivo con una solución de PBS-EDTA
0.04%, lavadas dos veces con PBS frío y centrifugadas a 1500 rpm durante 10
min. A continuación fueron resuspendidas en 100µl de la solución de binding
buffer, teñidas con 10µl de la solución de anexina V, 10µl de binding buffer, 10µl
de Ioduro de Propidio (PI) (50µg/ml), 79µl de H2O e incubadas en oscuridad
durante 15 min a Tª ambiente. Posteriormente se les añadió 500µl de binding
buffer y se procedió a su análisis por medio del citómetro de flujo.
Binding Buffer: 10mM hepes, pH 7.1; 150mM NaCl; 5mM KCl, 1mM
MgCl2; 1.8 mM CaCl2)
Solución de Anexina V: 1ml Anexina V-FITC (25µg/ml)
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Material y Métodos
25.3.2.- Estudio mediante microscopía confocal
Células (106) de las líneas parentales MCF7, A-549 y T-84 y de sus
respectivos cultivos transfectados sólo o en combinación con los fármacos,
fueron despegadas de los frascos de cultivo con una solución de PBS-EDTA
0.04%, lavadas dos veces con PBS frío y centrifugadas a 1500 rpm durante 10
min. A continuación fueron resuspendidas en 100µl de la solución de binding
buffer, teñidas con 10µl de la solución de anexina V, 10µl de binding buffer, 10µl
de Ioduro de Propidio (PI) (50µg/ml), 79µl de H2O e incubadas en oscuridad
durante 15 min a Tª ambiente. Posteriormente se les añadió 300µl de binding
buffer. Una gota fue puesta sobre un porta y fue observada inmediatamente en
el microscopio confocal.
25.4.- Estudio del potencial de membrana mitocondrial mediante DIOC6.
Células (106) de las líneas parentales MCF7, A-549 y T-84 y de sus
respectivos cultivos transfectados sólo o en combinación con los fármacos,
fueron despegadas de los frascos de cultivo con una solución de PBS-EDTA
0.04%, lavadas dos veces con PBS y centrifugadas a 1500 rpm durante 10 min.
A continuación se resuspenden en 250µl de DIOC6 40nM en PBS y se incuban
en oscuridad a 37º C durante 20 min., transcurridos los cuales se procedió
directamente a su análisis por medio del citómetro de flujo.
26.- ANÁLISIS DE LA MORFOLOGÍA.
26.1.- Microscopía óptica.
Las células transfectadas y no transfectadas fueron observadas mediante
el microscopio invertido de contraste de fase Nikon TM Phase Contrast-2, ELWD
0.3, a partir del cual se tomaron fotografías.
26.2.- Microscopía de transmisión.
26.2.1.- Fijación de las células.
A partir de cultivos de las líneas a analizar se obtuvieron botones
celulares de 5 x 106 células. Los pellet celulares fueron fijados con un tampón de
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Material y Métodos
cacodilato sódico 0.1 M (pH 7.2-7.5) con glutaraldéhido al 4%, durante un
periodo de 14 a 19 h a 4ºC. Las muestras fueron lavadas en el mismo tampón
suplementado con sacarosa hasta alcanzar una concentración final de 0.25 M,
durante 20-22 h, a 4ºC. Se realizó postfijación en tetróxido de osmio (Merck) al
1% en tampón de Milloning, durante 2 h y 30 min con un lavado posterior en el
mismo tampón durante 1 h.
Las muestras fueron posteriormente deshidratadas en una batería de
alcoholes creciente: un paso de 15 min en alcoholes de 30º y 50º; 1h y 30 min
en alcohol de 70º, al que se le añadió acetato de uranilo a saturación y, por
último, dos cambios de 30 min en alcoholes de 90º y 100º.
26.2.2.- Inclusión de la muestra.
La resina de inclusión se obtuvo de la siguiente forma: la solución base
se realizó a partir de la mezcla a partes iguales de una solución A y una solución
B. Se añadieron por cada 10 ml de esta solución, 0.15 ml de p-dimetilfenol (DMP
30) (Serva).
Las muestras fueron introducidas dos veces en óxido de propileno
durante 15 min y una vez en una mezcla 1:1 (v/v) de óxido de propileno y “Epon˜
durante dos horas y, por último, fueron transferidas a cápsulas de gelatina en las
que previamente se habían vertido unas gotas de “Epon˜. Las cápsulas se
rellenaron con resina y se colocaron en estufa (3 días) a 37º C, 45º C y 60º C
(24 h en cada temperatura) para la polimerización de la resina.
Solución A: Epon 812 (Serva) 62 ml y Dodecenylsuccinic anhídrido (DDSA)
(Serva) 100 ml.
Solución B: Epon 812 (Serva) 100 ml Metilnadic anhídrido (MNA) (Serva) 89 ml
26.2.3.- Cortes ultrafinos.
Las muestras fueron sometidas a cortes ultrafinos en un Ultracut E
(Reichert-Jun). Los cortes se realizaron con un grosor de 60-70 nm de grosor,
utilizando cuchillas de vidrio.
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Material y Métodos
26.2.4.- Método de tinción.
La tinción de las rejillas se realizó con citrato de plomo y acetato de
uranilo. La tinción se llevó a cabo cubriendo una placa de Petri con cera de
dentista. Las rejillas se dejaron durante 30 min con unas gotas de una solución
de acetato de uranilo al 5%, y después fueron lavadas durante 1 min en agua
destilada. Sobre esta superficie hidrófoba se añadieron unas gotas de la
solución de citrato de plomo, colocando las rejillas sobre ellas durante unos 20
min. Para evitar la aparición de precipitados provocados por la presencia de
anhídrido carbónico, se colocaron en la placa lentejas de hidróxido sódico,
tapando posteriormente la placa. Antes de proceder a la lectura las rejillas se
lavaron cuidadosamente en agua destilada.
Solución citrato de plomo: 1.33 gr nitrato de plomo y 1.76 gr de citrato sódico
(dihidratado) en 30 ml de agua destilada (hervida). Posteriormente
adicionamos: 6.5 ml de hidróxido sódico 1N, completando con agua destilada
hasta 50 ml y ajustando el pH a 12. Filtrar la solución final con un filtro de 45
mm de diámetro (Millipore, HA), inmediatamente antes de usar.
Solución citrato de plomo: 1.33 gr nitrato de plomo y 1.76 gr de citrato sódico
(dihidratado) en 30 ml de agua destilada (hervida). Posteriormente adicionamos:
6.5 ml de hidróxido sódico 1N, completando con agua destilada hasta 50 ml y
ajustando el pH a 12. Filtrar la solución final con un filtro de 45 mm de diámetro
(Millipore, HA), inmediatamente antes de usar.
26.3.- Microscopía de barrido.
Los diferentes cultivos celulares fueron analizados mediante microscopía
de barrido con el objeto de determinar las modificaciones a nivel de la
membrana celular. El proceso se llevó a cabo siguiendo los protocolos del
Servicio de Instrumentación Científica de la Universidad de Granada.
27.- ESTUDIO ESTADÍSTICO.
Se utilizó el programa SPSS 7.5 (SPSS, Chicago, IL, USA). Los
resultados fueron comparados usando el test de la T de Student. Todos los
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Material y Métodos
datos se expresan como media ± SD. Las diferencias se consideraron
estadísticamente significativas cuando el valor de P fue <0.05.
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V.RESULTADOS
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Resultados
1.- GEN E, GEN GEF Y ADN EUCARIÓTICO: ESTUDIO DE HOMOLOGÍA.
Para poder utilizar los genes E y Gef de procariotas como genes
terapéutico en células tumorales y poder chequear su presencia en dichas células
una vez transfectadas sin la aparición de posibles falsos positivos, se realizó un
estudio de homología con el objetivo de detectar secuencias iguales o similares en
el ADN eucariótico humano. Utilizando Programa NCBI BLAST ENTREZ se realizó
un rastreo que determinó la no existencia de ninguna secuencia homóloga entre
ambos ADNs (Figura 1).
Vector
Gen E
>gb|FJ84 9058.1| E nterob acteria pha ge phiX17 4 iso late JACS, co mp lete geno me Le ngth=5 386 Score = 503
bits (27 2), Expect = 2e-139 Id entities = 272/272 (10 0% ), Gaps = 0/272 (0%) S tra nd=Plus/P lus
Query
2
Sbjct
568
Query
62
Sbjct
628
Query
122
Sbjct
688
Query
182
Sbjct
748
Query
242
Sbjct
808
ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCTG
61
CCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAACGGCCTGTCTCATCATGGAAG
121
GCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAAT
181
TGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAG
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TGTTCGCGTTTACCTTGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAG
241
AAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCAGAAGGA
||||||||||||||||||||||||||||||||
AAAACGTGCGTCAAAAATTACGTGCAGAAGGA
627
687
747
807
273
839
Figura 1. Imagen representativa del estudio de homología que resultó negativo
entre la secuencia del gen E y el ADN genómico de eucariota. Los resultados con el
ADN mitocondrial también fueron negativos. La imagen muestra la secuencia de E de
Coliphage phiX174.
2.- GENERACIÓN DE VECTORES TERAPÉUTICOS CON GENES SUICIDAS.
Para analizar el efecto del gen E como gen terapéutico en cáncer de mama,
pulmón y colon y poder desarrollar experiencias de terapia combinada con agentes
citotóxicos hemos desarrollado construcciones con capacidad de expresión en
eucariotas de forma constitutiva. Por otra parte, para poder compara sus efectos
con otros genes suicidas, hemos realizado el mismo procedimiento con el gen Gef.
- 95 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
Las construcciones para transfección han sido el resultado del aislamiento
del gen de interés y de su clonación en el vector. El aislamiento del gen E se
realizó mediante primers específicos utilizados sobre la construcción original y
contenedora del gen (Figura 2). Los primers elegidos fueron:
OCM2 - Senso: 5´ CATGGTACGCTGGACTTTGT 3´
OCM6 - Antisenso: 5´ TCCTTCTGCACGTAATTTTTGA 3´
La secuencia amplificada fue de 273pb (gen E).
Gen E ORIGINAL
1 c atggtacgct ggactttgtg ggataccctc gctttcctgc tcctgttgag 61 tttattgctg
ccgtcattgc ttattatgtt catcccgtca acattcaaac ggcctgtctc 121
atcatggaag
gcgctgaatt tacggaaaac attattaatg gcgtcgagcg tccggttaaa 181
gccgctgaat
tgttcgcgtt taccttgcgt gtacgcgcag gaaacactga cgttcttact 241
gacgcagaag
aaaacgtgcg tcaaaaatta cgtgcagaag ga//
La amplificación del gen Gef se realizó mediante primers específicos lo que
nos permitió clonarlo en el mismo vector de expresión (Figura 2). Se utilizaron:
Gef 1 - Senso: 5´ ATGAAGCAGCATAAGGCGATG3´
Gef 2 - Antisenso: 5´ GTACTCGGATTCGTAAGCCGTG 3´
que amplificaron la siguiente secuencia de 154pb, correspondientes al gen Gef.
Gen Gef ORIGINAL
1 atgaagcagc ataaggcgat gattgtcgcc ctgatcgtca tctgtatcac cgccgtagtg 61
gcggcgctgg taacgagaaa agacctctgt gaggttcaca tccgaactgg ccagacggag 121
gttgctgttt tcacggctta cgaatccgag tac//
- 96 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
273 pb
154 pb
1
2
3
Figura 2. Aislamiento mediante PCR de las secuencias completas de los genes
suicidas E y Gef a partir de los plásmidos contenedores para posterior secuenciación y
ligación en los vectores de expresión en eucariotas. 1, PM; 2. gen gef; 3, gen E.
Los genes aislados fueron integrados en el plásmido pcDNA3.1/V5-HisTOPO-E mediante el procedimiento descrito anteriormente (ver Material y
Métodos). Para poder obtener las cantidades adecuadas de vector terapéutico en
las experiencias de transfección, las construcciones fueron clonadas en bacterias
E. Coli. El resultado fue la obtención de placas Petri con 20 colonias para el gen E
y 13 colonias para el Gef de las que fueron seleccionadas 8 en cada caso. Las
colonias fueron chequeadas mediante PCR (ver Material y Métodos) utilizando los
primers T7 y BGH correspondientes al vector. El amplificado fue chequeado en un
gel de agarosa en donde se pudo determinar que las ocho colonias presentaban
vector (Figura 3) obteniéndose un amplificado de 273 pb en el caso de la
construcción de E y de 154 pb en el caso de la construcción de Gef (Figura 4).
Finalmente, para determinar la correcta estructura de las construcciones
presentes en las colonias transformadas y positivas, se procedió a su
secuenciación utilizando el primer T7. Nuestros resultados demostraron que el
caso de la construcción con E sólo una colonia (colonia 2) presentó un secuencia
correcta indicando inserto se había integrado en la dirección adecuada. En el caso
- 97 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
del gen Gef la colonia correcta fue la colonia 4. Los clonos fueron denominados
TOPO. COL2.E y TOPO. COL 4. Gef.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
COLONIA 2: pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E secuenciada con T7
CCGGGTCATGTTTAGCCTTGGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATT
GCCCTT
CATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGAGTTTATTGCT
GCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATProtein-Protein interactions with
cell-wall synthesis protein/enzymes – hight turnover
Gen E
>gb|FJ849058.1|
Enterobacteria
phage
phiX174
isolate
JACS,
complete
genomeLength=5386 Score = 503 bits (272), Expect = 2e-139 Identities = 272/272
Gen E
Primers
Figura 3. PCR de las colonias obtenidas tras la transformación con las construcción
pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E mostrando una amplificación de 400 pares de bases. 1, PM; 2.
Control positivo; 3-10 colonias positivas. Posterior secuenciación de vector de la colonia 2.
- 98 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
1
2
Resultados
3
4
5
6
7
8
9
10
COLONIA 4: pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Gef secuenciada con T7
CGGTGCAGCTAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTGCCCT
T
ATGAAGCAGCATAAGGCGATGATTGTCGCCCTGATCGACATCTGTATCACCGCCGTAGTG
GCGGNGCTGGTAACGAGAAAAGACCTCTGTGAGGTTCACATCCGAACTGGCCAGACGGAG
GTTGCTGTTTTCACGGCTTACGAATCCGAGTACA
AGGGCAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGCGGT
TCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATC
ATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCT
Gen E
Primers
Figura 4. PCR de las colonias obtenidas tras la transformación con las construcción
pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Gef mostrando una amplificación de 154 pares de bases. 1, PM;
2. Control positivo; 3-10 colonias positivas.
3.- PROLIFERACIÓN CELULAR TUMORALES DE CÁNCER DE MAMA (MCF7),
CÁNCER DE PULMÓN (A549) Y CÁNCER DE COLON (T84).
Las líneas celulares de los diferentes tipos de tumores fueron analizadas
para determinar sus características de cultivo y especialmente su capacidad de
proliferación en las condiciones en las que íbamos a realizar las experiencias
(Figura 5).
- 99 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
Para la determinación del número de células se utilizó la tinción mediante
sulforrodamina con posterior medición de la intensidad del colorante en un
colorímetro Titertek multiscan a 490nm (ver Material y Métodos). Siguiendo este
procedimiento se obtuvieron las curvas patrón para la determinación del
crecimiento celular.
B
MCF7
Nº CE LULA S X 1000
N º CE LULA S X 1000
A
80
60
CONTROL
40
TOPO1
20
TOPO3
0
0
2
4
6
8
A-549
80
60
CONTROL
40
TOPO1
20
TOPO3
0
0
2
DIAS
4
6
8
DIAS
Nº CE LULA S X 1000
T-84
50
40
CONTROL
30
20
TOPO1
TOPO3
10
0
0
2
4
6
8
DIAS
Figura 5. Representación esquemática para ilustrar los gráficos de modelo ajustado
obtenidos al realizar los estudios de la curva patrón de proliferación en las líneas MCF7
(A), A-549 (B) y T-84 (C). Las graficas de proliferación representan el efecto de la
expresión del gen E sobre la proliferación celular en las líneas MCF7 (A) A549 (B) y T84
(C).
- 100 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
4.- EXPRESIÓN DE E EN LAS CÉLULAS TUMORALES: LÍNEAS MCF7, A549 y
T84.
Células de las diferentes líneas celulares utilizadas en el estudio fueron
transfectadas con pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E siguiendo el protocolo previamente
descrito. Para demostrar la adecuada expresión del gen E, se obtuvo ARN total a
las 48 h de la transfección (Figura 6A) y se procedió a realizar una RT-PCR con los
primers específicos para amplificar dicho. Como se observa en la Figura 6B, en las
tres líneas se pudo detectar un amplificado correspondiente al gen E indicando la
eficacia de nuestra construcción para inducir la expresión de dicho gen en las
células objeto de análisis.
A
B
1
2
3
1 2 3 4 5 6
4
Figura 6. Determinación de la expresión de E en las líneas tumorales
transfectadas (pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E). A. Extracción de ARN total de las
líneas tumorales. 1, línea MCF-7; 2. línea A-549; 3, línea T-84. B. La transfección
con pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E de las líneas MCF-7, A-549 y T-84 provoca la
expresión constitutiva de E que provocó un amplificado visualizado en gel de
agarosa y mediante tinción de bromuro de etidio. . 1, Control Positivo (Gen E); 2.
MCF-7; 3. A-549; 4; T-84; 5, PM; 6. Control Negativo.
4.1.- Estudio de la eficacia de la transfección.
Para comprobar si la expresión del gen E se mantenía hasta el final de la
experiencia, los días 3, 5 y 7 las células fueron marcadas con el anticuerpo
conjugado Anti-V5-FICT, observadas mediante microscopio de fluorescencia
(marcado el citoplasma con verde refejando la expresión del gen E y el núcleo
- 101 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
teñido con DAPI) y analizadas mediante citómetro de flujo, observándose que un
71%, 69.5% y 64,6% (MCF-7, A549 Y T-84, respectivamente) de las células
estaban marcadas, y por lo tanto expresaban el gen E. (Figura 7).
A
D
B
E
C
F
G
H
Figura 7. Determinación de la eficacia de la transfección en las líneas
tumorales transfectadas (pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E). Histogramas: A: MCF-7; B:
A-549; C: T-84; Microscopio de Fluorescencia: Marcado con verde Anti-V5-FICT y
- 102 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
con azul (DAPI) el núcleo. D: MCF-7 (día 3); E: MCF-7 (día 5); F: MCF-7 (día 5); G:
MCF-7 (día 7); H: MCF-7 sin transfectar.
5.- EFECTO DE E SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE LAS CÉLULAS
TUMORALES: LÍNEAS MCF7, A549 y T84.
Células de las líneas MCF7, A549 y T84 fueron transfectadas con el vector
pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E según el siguiente esquema.
CÉLULAS
DIA 0
CONTROL
SIEMBRA
TRANSFECTADAS
TRANSFECTADAS
DIA 1
DIA 3
DIA 5
pcDNA3.1SIEMBRA
TOPOE
pcDNA3.1- pcDNA3.1- pcDNA3.1-
SIEMBRA
TOPOE
TOPOE
TOPOE
La determinación de la proliferación fue dependiente del tiempo de
transfección y de la cantidad de vector transfectado. En general podemos inferir de
los
resultados
que
la
expresión
del
gen
E
inhibe
dicha
proliferación
fundamentalmente a partir del quinto día y que la inhibición es mayor cuando los
procesos de transfección se repiten en el tiempo.
Así, los análisis de la línea de cáncer de mama MCF-7 demuestran que tras
una única transfección se produce una inhibición de la proliferación de un 8.8% a
los cinco días mientras que a los 7 días este efecto se duplica alcanzando una
inhibición del 10.4%. Cuando las transfecciones se repitieron cada dos días la
inhibición de la proliferación fue de un 12.6% y se incrementó a un 22.7% a los 7
días (Figura 5).
Las experiencias realizadas en cáncer de pulmón (línea A-549) mostraron
unos efectos algo menores. Así, la inhibición de la proliferación a los cinco días fue
de un 8.28% pero a los 7 días el efecto fue similar alcanzando 8.6%. Sin embargo,
cuando las transfecciones se repitieron cada dos días la inhibición de la
proliferación fue de un 11.3% y se incrementó a un 19.8% a los 7 días.
- 103 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
Por último, en las células T-84 procedentes de cáncer de colon no se pudo
observar una diferencia significativa entre la transfección única de E o la
transfección repita en varios días. Así, en el primer caso la inhibición de la
proliferación fue de 7.6% a los cinco días mientras que a los 7 días este efecto fue
mucho mayor alcanzando un 8.9%. Resultados similares e incluso menores fueron
detectados cuando las transfecciones se repitieron cada dos días. En este caso la
inhibición de la proliferación fue de un 11.6% a los cinco días y de un 19.2% a los 7
días.
6.-
EFECTO
DEL
GEN E
ASOCIADO
A CITOTÓXICOS
SOBRE
LA
PROLIFERACIÓN DE LAS CÉLULAS TUMORALES. TERAPIA COMBINADA.
6.1.- Terapia combinada mediante la transfección del gen E y agentes
citotóxicos en células MCF7 de cáncer de mama.
Células de las líneas MCF7 fueron cultivadas en distintos periodos de
tiempo siguiendo el siguiente esquema:
CÉLULAS
DIA 0
SÓLO
SIEM_
FÁRMACO
BRA
TRANSFECTAD
SIEM_
AS
BRA
DIA 1
DIA 2
DIA 3
DIA 4
DIA 5
DIA 6
10
10
10
1
1
1
0.1
0.1
0.1
pcDNA3.
10
10
10
1-
1
1
1
TOPOE
0.1
0.1
0.1
10
10
pcDNA
10
1
3.1-
1
TRANSFECTAD
SIEM_
pcDNA3.
AS
BRA
1TOPOE
1
pcDNA
3.1-
0.1
- 104 -
TOPOE
0.1
TOPO
E
0.1
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
6.1.1- Efecto de la terapia combinada con Taxol sobre la proliferación de la línea
MCF7.
Células de las líneas MCF7, transfectadas con el vector pcDNA3.1/V5-HisTOPO-E, y sin transfectar, fueron cultivadas en distintos periodos de tiempo en
presencia de Taxol a las concentraciones de 10, 1 y 0.1nM respectivamente.
Cuando se valoró la modificación en la inhibición de la proliferación de
MCF-7 sometida a terapia combinada en relación a MCF-7 tratada sólo con el
fármaco (taxol) pudimos comprobar que: 1) en general, la expresión de E en las
células tumorales provoca una potenciación relevante del efecto del fármaco
aumentando significativamente la reducción en su proliferación, 2) que un
protocolo de transfección repetida facilita la acción del fármaco más que la
aplicación de una sola transfección y 3) que en general, el efecto de la expresión
de E es tiempo dependiente y por tanto es más visible después de un periodo largo
de expresión.
Así, los datos más relevantes fueron observados a los 7 días de tratamiento
y con las dosis más altas de taxol (Pacl 10nM). La línea MCF-7 sufrió una
inhibición de la proliferación de un 23.6% y un 52.6% mayor (con pcDNA3.1/V5His-TOPO-E de forma única o de forma repetida, respectivamente) que la obtenida
con la utilización sólo del fármaco (Figura 8).
No obstante, también fue muy importante el resultado obtenido cuando se
utilizó taxol a 1nM (Pacl 1nM) en combinación con la transfección y expresión de
E. En este caso pudimos observar a los 7 días inhibiciones de la proliferación
cercanas a las obtenidas con dosis más altas de taxol. En concreto dicha inhibición
fue un 17.9% y un 40.5% mayor (transfectando una sola vez o de forma repetida,
respectivamente) que la obtenida sólo con el fármaco (Figura 8).
Estos resultados sugieren que la asociación de terapia génica con E en el
tratamiento de células tumorales de cáncer de mama permite reducir la dosis de
fármaco obteniendo resultados similares.
- 105 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
B
120
120
100
100
80
80
17.9%
23.6%
40.5%
52.6%
60
60
40
40
20
20
0
0
Pacl
10nM
Pacl
1nM
Pacl
Pacl
0.1nM
Pacl
10nM
Pacl + E
Pacl
1nM
Pacl
0.1nM
Pacl + E 3 transfecciones
Figura 8. Efecto de la terapia combinada con Paclitaxel (Pacl) sobre la proliferación
de la línea MCF7. Se expresa en % de inhibición de proliferación de la línea MCF-7
respecto al fármaco. Se muestran sólo los datos de A. Tratamiento realizado durante 5
días; B. Tratamiento realizado durante 7 días.
6.1.2.- Efecto de la terapia combinada con Docetaxol sobre la proliferación de la
línea MCF7
El Docetaxol (Doce), otro fármaco de la familia de los taxanos usado como
tratamiento de elección en cáncer de mama, fue ensayado en el protocolo de
terapia combinada. En este caso las concentraciones utilizadas fueron iguales a
las de taxol (10, 1 y 0.1nM).
En general, los resultados obtenidos en cuanto a aumento en la inhibición
de la proliferación tras la transfección de E son similares a los obtenidos con
paclitaxel. Así, a los 7 días de tratamiento combinado usando el fármaco a una
concentración de 10nM, la inhibición de la proliferación aumentó un 23.1% con una
sola transfección de pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E pero alcanzó una reducción de un
50.8% con la transfección continuada del gen respecto al tratamiento sólo con
docetaxol 10nM.
Por otra parte, y al igual que en el caso del paclitaxel, la utilización del
mismo protocolo de tratamiento pero con dosis 100 veces menores de Docetaxol
(Doce 0.1nM) consiguió una reducción en la proliferación cercana a la alcanzada
- 106 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
con la primera dosis. Así, línea MCF-7 sufrió una inhibición de la proliferación un
38% mayor, con pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E de forma repetida, que la obtenida con
la utilización de la droga a la dosis 0.1nM. Ésto apoya la idea de la posible
reducción del la dosis de fármaco en este tipo de tumor (Figura 9).
A
B
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
Doce
10nM
Doce
Doce
1nM
0
Doce
0.1nM
38.%
50.8%
Doce
10nM
Doce + E
Doce
1nM
Doce
0.1nM
Doce + E 3 transfecciones
Figura 9. Efecto de la terapia combinada con Docetaxol (Taxotere) sobre la
proliferación de la línea MCF7. Se expresa en % de inhibición de proliferación de la línea
MCF-7respecto al fármaco. Se muestran sólo los datos de A. Tratamiento realizado
durante 5 días; B. Tratamiento realizado durante 7 días.
6.1.3.- Efecto de la terapia combinada con Doxorrubicina sobre la proliferación de
la línea MCF7
Por último, realizamos experiencias con otro de los fármacos de elección en
el tratamiento de cáncer de mama la doxorrubicina (Doxo). En este caso la mayor
inhibición de la proliferación fue obtenida con el tratamiento combinado que incluía
doxorrubicina a 10nM en la exposición más prolongada (7 días). A diferencia de los
casos anteriores, la disminución de la proliferación obtenida con dosis menores de
este agente ya fuera con una sola transfección o varias de gen E, fue
significativamente menor que la obtenida con la máxima dosis (29.6% de inhibición
respecto a la dosis 1nM y 25.8% respecto a la dosis 0.1nM al transfectar
respectivamente de forma continuada). Como se observa en la Figura 10 la
máxima inhibición de la proliferación se situó en un 38.4% al transfectar de forma
continuada en combinación con doxorrubicina 10nM respecto al tratamiento sólo
- 107 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
con el fármaco a la misma concentración. La terapia combinada gen
E/doxorrubicina fue la más eficaz en cuanto a la reducción de la proliferación de
este tipo tumoral.
A
B
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
29.6%
25.8%
38.4%
50.5%
59.3%
68.1%
0
0
Doxo
10nM
Doxo
Doxo
1nM
Doxo
0.1nM
Doxo
10nM
Doxo
Doxo
+E
Doxo
Doxo
1nM
Doxo
0.1nM
Doxo + E 3 transfecciones
Figura 10. Efecto de la terapia combinada con Doxorrubicina sobre la proliferación
de la línea MCF7. Se expresa en % de inhibición de proliferación de la línea MCF-7
respecto al fármaco. Se muestran sólo los datos de A. Tratamiento realizado durante 5
días; B. Tratamiento realizado durante 7 días.
6.2.- Terapia combinada mediante la transfección del gen E y agentes
citotóxicos en células A-549 de cáncer de pulmón.
El protocolo desarrollado para terapia génica con E combinada con agentes
citotóxicos fue ensayada en cáncer de pulmón utilizando la línea A-549. Los
agentes utilizados son los de uso clínico en esta patología. El diseño de la
experiencia fue similar al anterior utilizando diferentes concentraciones de
fármacos unidos a una única transfección o a varias transfecciones.
- 108 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
CÉLULAS
DIA 0
SÓLO
SIEM_
FÁRMACO
BRA
TRANSFEC_
SIEM_
TADAS
BRA
TRANSFEC_
SIEM_
TADAS
BRA
Resultados
DIA 1
DIA 2
DIA 3
DIA 4
DIA 5
DIA 6
100
100
100
50
50
50
1
1
1
pcDNA3
100
100
100
.1-
50
50
50
TOPOE
1
1
1
pcDNA3
100
pcDNA3
100
pcDNA3
100
.1-
50
.1-
50
.1-
50
TOPOE
1
TOPOE
1
TOPOE
1
6.2.1.- Efecto de la terapia combinada con Taxol sobre la proliferación de la línea
A-549
En general, la terapia de asociación utilizando de forma simultánea
paclitaxel (taxol) y terapia génica con E fue menos efectiva en cáncer de pulmón
que en cáncer de mama. El efecto fue mayor cuando se utilizó una transfección
continua y la mayor inhibición de crecimiento fue observada en los periodos de
exposición más prolongados (7 días). Además el mayor efecto fue obtenido con la
dosis más alta de taxol empleada pero pudimos comprobar que dosis más bajas
de este fármaco conseguían efectos similares, sugiriendo de nuevo la posibilidad
de que la asociación de las dos terapias permita reducir la dosis de fármaco.
Así, la combinación de la expresión de E y una dosis de taxol de 100µM
provocó una reducción en la proliferación de un 55.4% más, en relación a la
inhibición que provoca el taxol sólo a dicha concentración. Esta reducción fue sólo
ligeramente menor (49.2%) cuando se empleó una concentración de 1µM y
considerando siempre el mismo tiempo de tratamiento (7 días). Con dosis menores
se obtuvieron resultados más limitados (38.5% de inhibición del crecimiento)
(Figura 11).
- 109 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
B
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
Pacl
100µM
Pacl
Pacl
50µM
Pacl
1µM
31.7%
38.5%
49.2%
55.4%
Pacl
100µM
Pacl + E
Pacl
50µM
Pacl
1µM
Pacl + E 3 transfecciones
Figura 11. Efecto de la terapia combinada con taxol sobre la proliferación de la
línea A-549. Se expresa en % de inhibición de proliferación de la línea A-549 respecto al
fármaco. Se muestran sólo los datos de A. Tratamiento realizado durante 5 días; B.
Tratamiento realizado durante 7 días.
6.2.2.- Efecto de la terapia combinada con carboplatino sobre la proliferación de la
línea A-549.
Los resultados obtenidos mediante la combinación de transfección de E y
carboplatino demuestran que es la asociación con la que menos efecto
antiproliferativo se obtiene no sólo en A-549 sino también en comparación con los
resultados de MCF-7. La inhibición de la proliferación con carboplatino (Carbo) a
100µM a los 7 días de tratamiento unido a la expresión de E fue sólo de un 43.9%
más que cuando se utilizó el fármaco sólo. Como en el caso del taxol, la actuación
del tratamiento asociado en las primeras fases fue muy reducido siendo en los 2 o
3 primeros días valorado como reducciones de los aumentos en la inhibición de la
proliferación de cerca de un 10% (Figura 12).
Sin embargo es relevante constatar que también en este caso se pudo
observar el mismo efecto antiproliferativo de la dosis más alta y la dosis media de
carboplatino, lo que sugiere la facilitación que el gen E provoca en la “actividad”
antitumoral (en el sentido más amplio) del fármaco.
- 110 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
B
120
120
100
100
80
80
36.3%
43.9%
60
60
40
40
20
20
0
Carbo
100µM
Carbo
Carbo
50µM
0
Carbo
1µM
Carbo
100µM
Carbo + E
Carbo
100µM
Carbo
1µM
Carbo + E 3 transfecciones
Figura 12. Efecto de la terapia combinada con Carboplatino sobre la proliferación
de la línea A-549. Se expresa en % de inhibición de proliferación de la línea A-549
respecto al fármaco. Se muestran sólo los datos de A. Tratamiento realizado durante 5
días; B. Tratamiento realizado durante 7 días.
6.2.3.- Efecto de la terapia combinada con gemcitabina sobre la proliferación de la
línea A-549.
Por último, realizamos experiencias con gemcitabina asociada a terapia
génica con E. Como se observa en la Figura 13, la gemcitabina (Gem) a una dosis
de 100µM y facilitada por la transfección continuada y expresión de E, consigue
una reducción de la proliferación de hasta 46.6% más que la utilización del
fármaco de forma aislada. Ésta fue el mayor incremento de inhibición observado si
bien es verdad que a dosis 50µM se obtuvieron reducciones de hasta de un 22.4%
a los cinco días y de un 41.2% a los 7 días.
6.3.- Terapia combinada mediante la transfección del gen E y agentes
citotóxicos en células T-84 de cáncer de colon.
Finalmente, realizamos un ensayo para determinar la eficacia de la terapia
combinada en células de cáncer de colon utilizando la línea T-84. La transfección
con E se asoció al uso de los agentes 5- fluoracilo/Ácido Folínico sólo o con
Irinotecán y Oxaliplatino a diferentes concentraciones por ser de uso clínico en
esta patología.
- 111 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
B
120
120
100
100
80
80
22.4%
41.2%
46.6%
60
60
40
40
20
20
0
0
Gem
100µM
Gem
Gem
50µM
Gem
1µM
Gem
100µM
Gem + E
Gem
50µM
Gem
1µM
Gem + E 3 transfecciones
Figura 13. Efecto de la terapia combinada con Gemcitabina sobre la proliferación
de la línea A-549. Se expresa en % de inhibición de proliferación de la línea A-549
respecto al fármaco. Se muestran sólo los datos de A. Tratamiento realizado durante 5
días; B. Tratamiento realizado durante 7 días.
El diseño de la experiencia fue similar al anterior utilizando diferentes
concentraciones de fármacos unidos a una única transfección o a varias
transfecciones.
6.3.1- Efecto del 5-Fluoracilo/Ácido Folínico sobre la proliferación celular.
Células de las líneas T84, transfectadas con el vector pcDNA3.1/V5-HisTOPO-E, y sin transfectar, fueron cultivadas en distintos periodos de tiempo en
presencia de la mezcla de los fármacos 5-Fluoracilo/Ácido Folínico a las
concentraciones de 5000:5, 500:5 y 50:5µM respectivamente.
Los datos más relevantes fueron observados a los 7 días de tratamiento y con la
dosis más alta de 5-FU/FA (5000:5µM). Al transfectar de forma continua la
inhibición de la proliferación fue 35,3% mayor que con el uso sólo del fármaco a
dicha concentración. No obstante, también fue muy importante el resultado
obtenido cuando se utilizó la dosis 5:5µM en combinación con la transfección
continua y expresión de E, observándose inhibición de la proliferación de 25,3%
(Figura 14).
- 112 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
CÉLULAS
DIA 0
SÓLO
SIEM_
FÁRMACO
BRA
TRANSFECTA
SIEM_
DAS
BRA
TRANSFECTA
SIEM_
DAS
BRA
Resultados
DIA 1
DIA 2
DIA 3
DIA 4
DIA 5
DIA 6
5000:5
5000:5
5000:5
500:5
500:5
500:5
5:5
5:5
5:5
pcDNA3
5000:5
5000:5
5000:5
.1-
500:5
500:5
500:5
TOPOE
5:5
5:5
5:5
pcDNA3
.1TOPOE
A
5000:5
pcDNA
5000:5
500:5
3.1-
500:5
TOPO
5:5
E
5:5
pcDNA3
.1TOPOE
5000:5
500:5
5:5
B
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
25,3%
5FU/FA
5000µM
5FU/FA
5FU/FA
5000µM
5FU/FA
5000µM
35,3%
5FU/FA
5000µM
5FU/FA + E
5FU/FA
5000µM
5FU/FA
5000µM
5FU/FA + E 3
Figura 14. Efecto de la terapia combinada con 5-Fluoracilo/Ácido Folínico (5FU/FA) sobre la proliferación de de la línea T-84. Se expresa en % de inhibición de
proliferación de la línea T-84 respecto al fármaco. Se muestran sólo los datos de A.
Tratamiento realizado durante 5 días; B. Tratamiento realizado durante 7 días.
6.3.2.- Efecto del 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Irinotecán sobre la proliferación
celular.
Células de las líneas T84, transfectadas con el vector pcDNA3.1/V5-HisTOPO-E, y sin transfectar, fueron cultivadas en distintos periodos de tiempo en
- 113 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
presencia de la mezcla de los fármacos 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Irinotecán
según el esquema 1.
Los resultados demuestran una mayor inhibición de la proliferación celular,
53.1%, a los 7 días de tratamiento combinado de la transfección continua con la
mezcla de fármacos 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Irinotecán a la dosis 500:5:200µM
respecto al uso aislado de dicha mezcla (Figura 15). Esta inhibición es similar a la
obtenida transfectando de forma continua en combinación con la misma mezcla de
fármacos a la concentración 5000:5:50µM (46.5%) y 500:5:200µM (48.4%) a los 7
días de tratamiento respecto al uso aislado de la correspondiente mezcla de
fármacos.
CÉLULAS
DIA 0
DIA 1
DIA 2
5FU/FA IRI
DIA 3
200
5000:5 50
10
200
SÓLO FÁRMACO SIEMBRA
500:5 50
10
200
5:5
50
10
200
5000:5 50
10
200
pcDNA3.1TRANSFECTADAS SIEMBRA
500:5 50
TOPOE
10
200
5:5
50
10
200
5000:5 50
10
200
pcDNA3.1pcDNA3.1TRANSFECTADAS SIEMBRA
500:5 50
TOPOE
TOPOE
10
200
5:5
50
10
DIA 4
5FU/FA IRI
DIA 5
200
5000:5 50
10
200
500:5 50
10
200
5:5
50
10
200
5000:5 50
10
200
500:5 50
10
200
5:5
50
10
200
5000:5 50
10
200
pcDNA3.1500:5 50
TOPOE
10
200
5:5
50
10
DIA 6
5FU/FA IRI
200
5000:5 50
10
200
500:5 50
10
200
5:5 50
10
200
5000:5 50
10
200
500:5 50
10
200
5:5 50
10
200
5000:5 50
10
200
500:5 50
10
200
5:5 50
10
Esquema 1: Terapia combinada con 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Irinotecán (5FU/FA/IRI) en la línea T-84.
- 114 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
120
100
80
60
40
20
0
5000:5: 5000:5: 5000:5:
10µM
200µM 50µM
B
500:5:
200µM
500:5:
50µM
500:5:
10µM
5:5:
200µM
5:5:
50µM
5:5:
10µM
500:5:
10µM
5:5:
200µM
5:5:
50µM
5:5:
10µM
120
100
53.1%
46.5%
48.4%
80
60
40
20
0
5000:5: 5000:5: 5000:5:
10µM
200µM 50µM
5FU/FA/IRI
Figura
15.
500:5:
200µM
500:5:
50µM
5FU/FA/IRI + E
Efecto
de
la
terapia
5FU/FA/IRI + E 3 transfecciones
combinada
con
5-Fluoracilo/Ácido
Folínico/Irinotecán (5-FU/FA/IRI) sobre la proliferación de la línea T-84. Se expresa en %
de inhibición de proliferación de la línea T-84 respecto al fármaco. Se muestran sólo los
datos de A. Tratamiento realizado durante 5 días; B. Tratamiento realizado durante 7 días.
6.3.3- Efecto del 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Oxaliplatino sobre la proliferación
celular.
Células de las líneas T84, transfectadas con el vector pcDNA3.1/V5-HisTOPO-E, y sin transfectar, fueron cultivadas en distintos periodos de tiempo en
presencia de la mezcla de los fármacos 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Oxaliplatino
(Esquema 2).
- 115 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
CÉLULAS
DIA 0
Resultados
DIA 1
DIA 2
5FU/FA OXA
1000
5000:5 10
0.5
DIA 3
DIA 4
5FU/FA OXA
1000
5000:5 10
0.5
1000
SÓLO FÁRMACO SIEMBRA
500:5
10
0.5
10
0.5
1000
5000:5 10
0.5
TRANSFECTADAS SIEMBRA
pcDNA3.1500:5
TOPOE
TRANSFECTADAS SIEMBRA
10
0.5
10
0.5
10
0.5
1000
5000:5 10
0.5
1000
500:5
10
0.5
10
0.5
10
0.5
1000
5000:5 10
0.5
1000
500:5
1000
5:5
10
0.5
1000
5:5
1000
500:5
1000
5:5
1000
5000:5 10
0.5
1000
5:5
1000
10
0.5
DIA 6
5FU/FA OXA
1000
500:5
1000
5:5
DIA 5
10
0.5
1000
5:5
10
0.5
1000
5000:5 10
0.5
1000
5000:5 10
0.5
1000
5000:5 10
0.5
1000
1000
1000
pcDNA3.1500:5
TOPOE
pcDNA3.110 TOPOE 500:5
0.5
1000
5:5
10
0.5
pcDNA3.110 TOPOE 500:5
0.5
1000
5:5
10
0.5
10
0.5
1000
5:5
10
0.5
Esquema 1: Terapia combinada con 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Oxaliplatino (5FU/FA/OXA) en la línea T-84.
En general, los resultados obtenidos en cuanto a aumento en la inhibición
de la proliferación tras la transfección de E son similares a los obtenidos con la
mezcla 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Irinotecán. Así, a los 7 días de tratamiento
combinado usando la mezcla 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/ Oxaliplatino a la dosis
5000:5:1000µM, la inhibición de la proliferación aumentó un 58.9% con la
transfección continuada del gen respecto al tratamiento sólo con dicha mezcla a
esa concentración.
- 116 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
A
Resultados
120
100
80
60
40
20
0
5000:5: 5000:5: 5000:5:
0.5µM
1000µM 10µM
500:5: 500:5:
1000µM 10µM
500:5:
0.5µM
5:5:
5:5:
1000µM 10µM
5:5:
0.5µM
B
120
100
41.9%
58.9%
40.4%
42.4%
80
60
40
20
0
5000:5: 5000:5: 5000:5:
0.5µM
1000µM 10µM
5FU/FA/OXA
Figura
16.
Efecto
500:5: 500:5:
1000µM 10µM
5FU/FA/ OXA +
de
la
terapia
500:5:
0.5µM
5:5:
5:5:
1000µM 10µM
5:5:
0.5µM
5FU/FA/ OXA + E 3
combinada
con
5-Fluoracilo/Ácido
Folínico/Oxaliplatino (5-FU/FA/OXA) sobre la proliferación de la línea T-84. Se expresa en
% de inhibición de proliferación de la línea T-84 respecto al fármaco. Se muestran sólo los
datos de A. Tratamiento realizado durante 5 días; B. Tratamiento realizado durante 7 días.
A diferencia de los casos anteriores, la disminución de la proliferación
obtenida con dosis menores de este agente, ya fuera con una sola transfección o
varias de gen E, fue significativamente menor que la citada. Sin embargo, la
inhibición de la proliferación al usar dicha mezcla de fármacos a la dosis
5000:5:0.5µM (40.4%) fue similar a los resultados obtenidos a dosis 500:5:10µM
(42.4%) y 5:5:1000µM (41.9%) a los 7 días en comparación con el uso respectivo
de sus concentraciones de forma aislada y con la transfección continua (Figura
16).
- 117 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
Los resultados obtenidos sugieren que la aplicación de una terapia con la
transfección
del
gen
E
puede
permitir
una
notable
reducción
en
las
concentraciones de citotóxicos utilizadas en el tratamiento convencional de los
pacientes afectos de cáncer de mama. Esta reducción no provocaría un menor
efecto en la actividad antitumoral del tratamiento y sin embargo, redundaría en una
reducción de los efectos secundarios que induce. En esta línea de actuación, la
terapia combinada gen E/5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Oxaliplatino fue la más eficaz
en cuanto a la reducción de la proliferación de este tipo tumoral.
7.- TERAPIA COMBINADA APLICADA A ESFEROIDES.
Para determinar si el potencial terapéutico de E se mantenía en un sistema
experimental más cercano a la actuación en un tumor, se realizaron experiencias
de terapia combinada utilizando esferoides multicelulares (MTS) que se generaron
tal y como se describe en material y métodos. Para realizar esta experiencia se
seleccionó como sistema celular la línea MCF-7 por su facilidad para formar
esferoides.
7.1.- Efecto del gen E sobre la proliferación de esferoides de la línea MCF-7.
Las experiencias en esferoides de la línea MCF7 fueron las mismas
anteriormente descritas para el cultivo en monocapa, en los mismos tiempos,
transfecciones con el vector pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E y los mismos fármacos a
sus respectivas dosis. Al igual que ocurrió con las líneas MCF-7, A-549 y T-84
cultivadas en monocapa, la determinación de la proliferación fue dependiente del
tiempo de transfección y de la cantidad de vector transfectado, corroborándose
que la expresión del gen E inhibe dicha proliferación fundamentalmente a partir del
quinto día y que la inhibición es mayor cuando los procesos de transfección se
repiten en el tiempo.
Así, los análisis de los esferoides de la línea de cáncer de mama MCF-7
demuestran que tras una única transfección se produce una inhibición de la
proliferación de un 7.1% a los cinco días mientras que a los 7 días este efecto se
incrementa alcanzando una inhibición del 10.7%. Cuando las transfecciones se
repitieron cada dos días la inhibición de la proliferación fue de un 8.1% y se
incrementó a un 18.9% a los 7 días (Figura 17).
A
- 118 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
30
VO L U M EN
25
20
Control
15
TOPO1
10
TOPO3
5
0
2
3
5
7
DÍ AS
1
2
3
4
B
Día 3
Día 5
Día 7
Figura 17. A. Gráfica de proliferación: Representa el efecto de la expresión del gen
E sobre la proliferación celular del esferoide de la línea MCF7. B. Análisis del efecto de la
transfección de E y citotóxicos en esferoides de MCF-7. 1. Control; 2. Esferoides tratados
con doxorrubicina 10nM; 3. Esferoides tratados con taxol 10nM; 4. Esferoides tratados con
docetaxol 10nM; asociados a pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E. La gráfica representa la
modificación de los esferoides con las diferentes concentraciones de droga.
7.2.- Efecto de la terapia combinada con Taxol sobre la proliferación de los
esferoides de la línea MCF7.
Como se observa en la Figura 18 el tratamiento combinado gen E y droga
consiguió un aumento significativo en cuanto a la reducción del volumen de los
esferocitos de MCF-7. Dicha disminución se situó a los 7 días próxima al 37.3%,
- 119 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
cuando se transfectó de forma continua en combinación con la dosis de taxol
10nM, respecto al uso solo de taxol a esa misma dosis.
La disminución del volumen fue muy similar en el caso de la dosis 1nM,
30.5%, y algo más baja, 28.1%, con la dosis 0.1nM, referidos ambos a los 7 días
cuando se transfecta de forma continua en comparación con el uso aislado del
fármaco a su respectiva dosis. Esta semejanza indica la posibilidad de asociación
de terapia génica con E con la reducción de la dosis de fármaco obteniendo
resultados similares.
7.3.- Efecto de la terapia combinada con Docetaxol sobre la proliferación de
los esferoides de la línea MCF7.
Al igual que en el cultivo en monocapa los resultados obtenidos en cuanto a
aumento en la disminución del volumen del esferoide son similares a los obtenidos
con paclitaxel. Así, a los 7 días de tratamiento combinado usando el fármaco a una
concentración de 10nM, la disminución del volumen del esferoide aumentó un
15.2% con una sola transfección de pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E pero alcanzó una
reducción de un 36.6% con la transfección continuada del gen respecto al
tratamiento sólo con docetaxol 10nM.
Por otra parte, y al igual que en el caso del paclitaxel, la utilización del
mismo protocolo de tratamiento con docetaxol pero a la dosis 1nM y 0.1nM,
consiguió
una
reducción
de
volumen
muy
similar
(29.2%
y
26.5%
respectivamente). Estos datos apoyan la hipótesis de que la transfección del gen E
puede adyuvar al tratamiento con citotóxicos permitiendo una reducción notable de
las dosis de fármaco a aplicar para alcanzar un efecto antitumoral efectivo en este
tipo de tumor (Figura 18).
7.4.- Efecto de la terapia combinada con Doxorrubicina sobre la proliferación
de los esferoides de la línea MCF7.
Al igual que en el cultivo en monocapa, es este fármaco el que presenta
una mayor disminución del volumen del esferoide, observándose el dato más
relevante a los 7 días de tratamiento con doxorrubicina 10nM cuando
- 120 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
transfectamos de forma continua (47%) respecto a la disminución de volumen
cuando se usa sólo doxorrubicina a la misma dosis.
A
B
120
120
80
28.1%
30.5%
37.3%
29.2%
60
40
40
20
20
Pacl
10nM
Pacl
1nM
0
Pacl
0.1nM
26.5%
36.6%
80
60
0
15.2%
100
100
Doce
10nM
Doce
1nM
Doce
0.1nM
C
120
100
25.5%
39.9%
80
34%
47%
60
40
20
0
Doxo
10nM
Fármaco
Doxo
1nM
Fármaco + E
Doxo
0.1nM
Fármaco + E 3 transfecciones
Figura 18. Efecto de la terapia combinada con A. Paclitaxel (Taxol); B. Docetaxol;
C. Doxorrubicina; sobre la proliferación de los esferoides de la línea MCF7. Se expresa en
% de inhibición de proliferación del esferoide de la línea MCF-7 respecto al fármaco. Se
muestran sólo los datos del tratamiento realizado durante 7 días.
Como se observa en la Figura 18, al reducir la dosis 10 veces, la
disminución del volumen del esferoide, nuevamente referido a los 7 días de
tratamiento transfectándose de forma continua y respecto al uso solo del fármaco a
la dosis 1nM, es similar, 34%, a la dosis más alta. Corroborándose la posibilidad
de obtener similares resultados reduciendo la dosis del fármaco en combinación
con el gen E.
- 121 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
Estos resultados indican que el tratamiento fue eficaz en un sistema que
remeda al tejido tumoral ya que mantiene las interconexiones celulares.
8.- REDUCCIÓN DE LAS CONCENTRACIONES EFECTIVAS DE AGENTES
CITOTÓXICOS FRENTE A CÁNCER DE MAMA, PULMÓN Y COLON EN BASE
A SU ASOCIACIÓN CON LA EXPRESIÓN DE E.
Como indican los resultados de estudio de la proliferación, se puede reducir
la dosis de fármaco combinándola con la transfección de E obteniéndose
resultados similares a los de dosis superiores.
8.1.- Reducción de concentraciones efectivas en la línea MCF7.
Con el tratamiento de Taxol 10nM la reducción de la proliferación es 38.8%,
superándose hasta 59.5% al reducir la dosis 100 veces (Taxol 0.1nM) en
combinación con la transfección continua de E (Figura 19).
En el tratamiento con Docetaxol 10nM también podemos reducir la dosis
100 veces (Docetaxol 0.1M) al combinarla con el gen E para obtener una mayor
inhibición de la proliferación (38.1% y 56.5% respectivamente).
La Doxorrubicina es el fármaco que ha presentado una mayor acción
inhibiendo la proliferación y en combinación con el gen E. Como se observa en la
Figura 19, a dosis 10nM dicha inhibición es de 47%, ampliamente superada por la
dosis 0.1nM combinada con la transfección continua de E, 67.7%.
8.2.- Reducción de concentraciones efectivas en la línea A-549.
En comparación con la línea MCF7, la reducción de las dosis de los
fármacos utilizados sobre la línea A-549 es menor (Figura 20). En esta línea, A549, el Taxol fue el fármaco con mayor actuación sobre la inhibición de la
proliferación de forma aislada y en combinación con la transfección de E. A dosis
100µM la inhibición de la proliferación es de 44.7%. Al reducir la dosis a 1µM y
combinarla con la transfección continua de E, la inhibición de la proliferación es
58.8%, superior a la de la dosis alta.
- 122 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
B
120
120
100
100
80
38.8%
80
38%
56.5%
59.5%
60
60
40
40
20
20
0
0
Pacl
10nM
Pacl
1nM
Pacl
0.1nM
Doce
10nM
Doce
1nM
Doce
0.1nM
C
120
100
80
47%
67.7%
60
40
20
0
Doxo
10nM
Fármaco
Doxo
1nM
Doxo
0.1nM
Fármaco + E
Fármaco + E 3
Figura 19. Efecto de la terapia combinada con A. Paclitaxel (Taxol); B. Docetaxol;
C. Doxorrubicina; sobre la proliferación celular de la línea MCF7. Se expresa en % de
inhibición de proliferación celular de la línea MCF-7. Se muestran sólo los datos del
tratamiento realizado durante 7 días.
La dosis de Carboplatino 100µM (34.9% inhibe la proliferación) puede
reducirse a la mitad (50µM) para obtener en combinación con la transfección de E
una reducción de 40.2% de crecimiento.
Igualmente ocurre con Gemcitabina, pudiéndose reducir la dosis 100 veces,
1µM, para obtener una mayor inhibición de la proliferación (36.9% y 52.4%
respectivamente).
- 123 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
B
120
120
100
100
80
80
44.7%
34.9%
58.8%
40.2%
60
60
40
40
20
20
0
0
Pacl
100µM
Pacl
50µM
Pacl
1 µM
Carbo
100µM
Carbo
50µM
Carbo
1µM
C
120
100
80
36.9%
52.4%
60
40
20
0
Gem
100µM
Fármaco
Gem
50µM
Gem 1µM
Fármaco + E
Fármaco + E 3
Figura 20. Efecto de la terapia combinada con A. Paclitaxel (Taxol); B.
Carboplatino; C. Gemcitabina; sobre la proliferación celular de la línea A-549. Se expresa
en % de inhibición de proliferación celular de la línea MCF-7. Se muestran sólo los datos
del tratamiento realizado durante 7 días.
8.3.- Reducción de concentraciones efectivas en la línea T-84.
En la línea T-84 es donde mayor se refleja los efectos de la combinación de
los fármacos con el gen E para reducir la dosis de los fármacos (Figura 21). La
mezcla de los fármacos 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Irinotecán a la dosis
5000:5:200µM inhiben la proliferación en 44.5%, siendo superada hasta 59.4% y
50.1% al reducir la dosis a 500:5:10µM y 5:5:10µM, respectivamente, al
combinarse con la transfección del gen E.
- 124 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A120
100
80
44.5%
50.1%
59.4%
60
40
20
0
5000:5: 5000:5: 5000:5:
10µM
200µM 50µM
500:5:
200µM
OXA
500:5:
50µM
500:5:
10µM
5:5:
50µM
5:5:
200µM
OXA + E
5:5:
10µM
OXA + E 3 transfecciones
B120
100
55.7%
80
48.6%
58.3%
60
40
20
0
5000:5: 5000:5: 5000:5:
0.5µM
1000µM 10µM
500:5: 500:5:
1000µM 10µM
OXA
Figura
21.
Folínico/Irinotecán
Efecto
500:5:
0.5µM
5:5:
5:5:
1000µM 10µM
OXA + E
de
(5-FU/FA/IRI);
la
terapia
B.
combinada
5-Fluoracilo/Ácido
5:5:
0.5µM
OXA + E 3 transfecciones
con
A.
5-Fluoracilo/Ácido
Folínico/Oxaliplatino
(5-
FU/FA/OXA); sobre la proliferación de la línea T-84. Se expresa en % de inhibición de
proliferación de la línea T-84. Se muestran sólo los datos de tratamiento realizado durante
7 días.
Con el tratamiento de 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Oxaliplatino la inhibición
de la proliferación fue algo superior. El uso de la dosis 500:5:0.5µM y 5:5:10µM en
combinación con la transfección continua de E fue muy similar, 58.3% y 55.7%
respectivamente. Ambas superiores a la inhibición de la proliferación, 48.6%, de la
dosis más elevada, 5000:5:1000µM.
- 125 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
8.4.- Reducción de concentraciones efectivas en esferoides de la línea MCF7.
Con el tratamiento de Taxol 10nM la reducción de la proliferación es 30.6%,
superándose hasta 46.6% al reducir la dosis 100 veces (Taxol 0.1nM) en
combinación con la transfección continua de E (Figura 22).
A
B
120
120
100
100
30.6%
29.6%
46.7%
80
80
60
60
40
40
20
20
0
Pacl
10nM
Pacl
1nM
Pacl
0.1nM
0
Doce
10nM
Doce
1nM
Doce
0.1nM
C
120
100
80
38.7%
51.8%
60
40
20
0
Fármaco
Doxo
10nM
Doxo
1nM
Doxo
0.1nM
Fármaco + E
Fármaco + E 3
Figura 22. Efecto de la terapia combinada con A. Paclitaxel (Taxol); B. Docetaxol;
C. Doxorrubicina; sobre la proliferación celular del esferoide de la línea MCF7. Se expresa
en % de inhibición de proliferación celular del esferoide de la línea MCF-7. Se muestran
sólo los datos del tratamiento realizado durante 7 días.
En el tratamiento con Docetaxol 10nM también podemos reducir la dosis
100 veces (Docetaxol 0.1M) al combinarla con el gen E para obtener una mayor
inhibición de la proliferación (29.6% y 41.9% respectivamente).
- 126 -
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Resultados
La Doxorrubicina es el fármaco que ha presentado una mayor acción
inhibiendo la proliferación y en combinación con el gen E. Como se observa en la
Figura 22, a dosis 10nM dicha inhibición es de 38.742%, ampliamente superada
por la dosis 0.1nM combinada con la transfección continua de E, 51.8%.
9.- ESTUDIO DE LA INDUCCIÓN DE APOPTOSIS.
9.1.- Aproximación mediante tinción con DAPI y electroforesis en gel de
agarosa
El 4,6 diamino-2fenilanido (DAPI), un fluorocromo de unión preferente a las
bases A y T del ADN, permite una primera aproximación a la generación de
apoptosis celular ya que visualiza a través de un microscopio de fluorescencia la
condensación y compactación de la cromatina que se reordena y cambia de
localización en el interior del núcleo. Para determinar la presencia de apoptosis en
nuestras células tumorales se realizó una tinción con DAPI después del
tratamiento. En todas las células tratadas se pudo observar con mayor o menor
intensidad la presencia de núcleos teñidos que presentaban una notable
morfología apoptótica con la presencia de zonas de condensación del colorante
que reflejan la compactación de la cromatina y dan lugar a una imagen al
microscopio de fragmentación nuclear (Figura 23). Estas observaciones no
pudieron ser realizadas en los controles de células sin tratar.
El ADN extraído las líneas MCF-7, A-549 y T-84 tanto parentales como
transfectadas se visualizó en la electroforesis como un típico patrón de bandas en
escalera provocado por los fragmentos de ADN (Figura 23).
9.2.- Estudio mediante Anexina (FACScan).
Uno de los primeros eventos que ocurren durante la apoptosis es la externalización
de fosfatidilserina, un fosfolípido que se limita normalmente al interior de la
membrana plasmática. Es importante destacar que ésto precede a los daños en la
membrana. Además, la externalización de fosfatidilserina puede supervisarse
mediante anexina V, una fosfatidilserina específica de la proteína de unión. Otro
importante evento secundario durante la apoptosis es la pérdida de integridad de la
- 127 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
membrana plasmática. Intactas las membranas plasmáticas ciertos tintes son
excluidos, como PI, el más utilizado marcador de la integridad de membrana.
A
B
E
C
D
1
2
3
4
5
6 7
Figura 23. Tinción con DAPI de células tumorales tras tratamiento con terapia
génica mediante el gen E. Las células fueron transfectadas y se realizó la tinción tras 48 h.
A. Células control; B, C y D. Detalle de la presencia de células apoptóticas (flechas) en las
líneas T-84, MCF-7 y A-549 en cultivo. E. Electroforesis en gel de agarosa. En la
electroforesis se observa un típico patrón de bandas en escalera provocado por los
fragmentos de ADN en las líneas transfectadas con el vector pcDNA3.1/V5-HisTOPO-E 1: PM; Líneas parentales 2: MCF-7; 3: A-549; 4: T-84; Líneas Transfectadas 5:
MCF-7; 6: A-549; 7: T-84.
Para corroborar los resultados anteriores de inhibición de la proliferación se
decidió realizar un estudio de apoptosis con Ioduro de Propidio y Anexina V
conjugada con fluoresceína (FITC). Las células en los primeros estadios de
apoptosis estarán teñidas únicamente con Anexina V-FITC, las células que están
en la última fase de apoptosis estarán teñidas con la Anexina V-FITC e Ioduro de
Propidio (apoptosis tardía) y las que están muertas (necróticas) estarán teñidas
solamente con Ioduro de Propidio.
- 128 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
9.2.1.- Análisis mediante Anexina en la línea MCF7.
El estudio en la línea MCF-7 nos permitió determinar las modificaciones en
los porcentajes de las células viables, necróticas y en un estado de apoptosis
tardío y temprano. Dichos porcentajes fueron de un 91.49%, 2.56%, 1.76% y
4.19% respectivamente. Por otra parte, el estudio con anexina en células MCF-7
transfectadas con E permitió demostrar la modificación en el porcentaje celular
relacionado con el fenómeno apoptótico observando un aumento significativo en
ambas fases de apoptosis (temprana, 20.94% y tardía, 13.99%) que se reflejo en
una disminución de células viables (50.36%) y necróticas (14.7%).
Para analizar los efectos que sobre la apoptosis provoca la asociación de
terapia génica con E y agentes citotóxicos, se seleccionó el tratamiento con
doxorrubicina por ser este el fármaco con el que mayor inhibición de la
proliferación pudo observarse en las experiencias previas. Así, en la línea MCF7
tratada con sólo Doxorrubicina (10nM) pudimos observar a las 48h un porcentaje
de células viables, necróticas y en un estado de apoptosis tardío y temprano de un
35.20%, 27.13%, 34.31% y 3.36%, respectivamente. Sin embargo, al comparar
estos resultados con los obtenidos en la línea MCF7 tratada con Doxorrubicina
(0.1nM) y transfectada con el gen E, pudimos constatar la modificación de los
porcentajes que ahora se situaron en un 9.84%, 2.48%, 50.63% y 37.06%
respectivamente. Estos datos sugieren que la Doxorrubicina a 0.1nM cuando se
combina con la transfección del gen E posee una mayor acción apoptótica (Figura
24).
9.2.2- Análisis mediante Anexina de la línea A-549.
El estudio citométrico de la línea A-549 parental reflejó un porcentaje de
células viables, necróticas, apoptóticas tardías y apoptóticas de un 94.16%, 5.09%,
0,75% y 0% respectivamente. Sin embargo, el análisis del mismo tipo celular, línea
A-549, transfectada con el gen E, demostró una significativa modificación de estos
porcentajes (60.46%, 8.85%, 8.88% y 21.80% respectivamente) que indicaron un
aumento del proceso apoptótico al igual que en la línea MCF7.
- 129 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
a
b
2.6%
4.2%
14.7%
20.9%
IP
IP
1.8%
14.0%
ANNEXIN-V-FITC
ANNEXIN-V-FITC
c
d
27.1%
34.3%
2.5%
50.6%
IP
IP
3.4%
37.1%
ANNEXIN-V-FITC
ANNEXIN-V-FITC
Figura 24. Análisis mediante citometría de flujo porcentaje de células viables,
necróticas, apoptóticas tardías y apoptóticas de la línea MCF7. Marcaje con Anexina VFITC.
Por otra parte, el análisis de apoptosis en el tratamiento combinado terapia
génica con E y agente citotóxico se realizó con taxol, por ser este el fármaco con
que se obtuvo una mayor inhibición de la proliferación. El análisis de la línea A-549
tratada con Taxol (100µM) demostró unos porcentajes de un 17.5%, 1.5%, 73.4%
y 7.7%, que se modificaron notablemente a favor del proceso apoptótico cuando
fueron comparados con los obtenidos en la línea A-549 tratada con Taxol (50µM) y
transfectada con el gen (1.1%, 0.3%, 67% y 31.7%) (Figura 25).
9.2.3- Análisis mediante Anexina V-FITC de la línea T-84.
Un estudio similar fue realizado en la línea T-84 parental, obteniéndose los
porcentajes 95.46%, 4.42%, 0.12% y 0% y en la línea T-84 transfectada con el gen
E (59.6%, 21.3%, 18% y 1.1%). El estudio con agentes citotóxicos fue realizado
con 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Oxaliplatino a la dosis 5000:5:1000µM, por ser el
de mayor acción, y los porcentajes fueron de un 30.95%, 10.38%, 37.38% y
21.3%.
- 130 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
a
b
5.1%
0.7%
8.8%
8.9%
IP
IP
0%
21.8%
ANNEXIN-V-FITC
ANNEXIN-V-FITC
c
1.5%
d
73.4%
0.3%
67%
IP
IP
7.7%
31.7%
ANNEXIN-V-FITC
ANNEXIN-V-FITC
Figura 25. Análisis mediante citometría de flujo porcentaje de células viables,
necróticas, apoptóticas tardías y apoptóticas de la línea A-549. Marcaje con Anexina VFITC.
El estudio de asociación fármaco-terapia génica con E fue realizado con 5Fluoracilo/Ácido Folínico/Oxaliplatino (5000:5:0.5µM) en células transfectadas con
E en las cuales los porcentajes fueron de un 5.58%, 18.97%, 75.45% y 0%; a la
dosis 5:5:1000µM combinada con E obtuvimos unos porcentajes de 7.16%,
89.82%, 3.02% y 0%, respectivamente.
El análisis mediante microscopía confocal avaló los resultados obtenidos
mediante citómetro de flujo (Figura 27). Puesto que las células viables no son
teñidas y por tanto no son visualizadas, en la líneas parentales se pudieron
observar las células necróticas teñidas con ioduro de propidio, sin embargo las
tratadas con los fármacos y/o transfectadas fueron observadas teñidas solamente
con anexina V-FITC (apoptóticas), con anexina V-FITC e Ioduro de Propidio el
núcleo (apoptosis tardía) y solamente teñidas el núcleo con Ioduro de Propidio
(necróticas).
- 131 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
a
4.4%
0.1%
IP
0%
ANNEXIN-V-FITC
b
c
21.3%
18%
10.3%
37.9%
IP
IP
1.1%
21.3%
ANNEXIN-V-FITC
ANNEXIN-V-FITC
d
e
19%
89.8%
75.5%
3%
IP
IP
0%
3.4%
ANNEXIN-V-FITC
ANNEXIN-V-FITC
Figura 26. Análisis mediante citometría de flujo porcentaje de células viables,
necróticas, apoptóticas tardías y apoptóticas de la línea T-84. Marcaje con Anexina VFITC.
- 132 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
B
C
Figura 27. Análisis mediante citometría de flujo porcentaje de células viables,
necróticas, apoptóticas tardías y apoptóticas de la línea T-84. Marcaje con Anexina VFITC.
9.3.- Estudio de caspasas: Western-Blot e Inmunohistoquímica.
Para identificar el mecanismo por el que el gen E induce apoptosis, se
estudiaron las caspasas 3, 8 y 9, así el citocromo c en las líneas MCF-7, A-549 y
T-84 tanto parentales como transfectadas. Se pudo observar una clara activación
de las caspasas 3 y 9, y no la de caspasa 8, así como la salida del citocromo c de
la mitocondria al citosol, tras un periodo de 48 h en las líneas transfectadas. Éstos
resultados nos indican que el gen E induce apoptosis tras 48 h de su transfección
mediante la ruta mitocondrial o intrínseca (Figura 28 A).
Así mismo se corroboraron los resultados del western blot mediante
inmunohistoquímica (Figura 28 B).
- 133 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
1
2
3
4
5
6
Precursor Caspase-3
32 KDa
Cleaved Caspase-3
20 KDa
Caspase-8 Precursor
55 KDa
Precursor Caspase-9
42 KDa
Cleaved Caspase-9
36 KDa
β-actin
42 KDa
a
b
c
d
e
f
29 KDa
Bcl2
Cleaved Caspase-9
15 KDa
B
a
d
g
b
e
h
c
f
i
Figura 28. Análisis de inducción de apoptosis. A. Western blot. Líneas
transfectadas con pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E (1: MCF-7; 2: A-549; 3: T-84;) Líneas
parentales (4: MCF-7; 5: A-549; 6: T-84;) Citoplasma de las líneas transfectadas(a: MCF-7;
b: A-549; c: T-84;) Mitocondria de las líneas transfectadas (d: MCF-7; e: A-549; f: T-84); B.
- 134 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
Inmunohistoquímica de la línea A-549 transfectada con pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E.
a, b, c, caspasa 3; d, e f, caspasa9, g, h, caspasa 8; i, línea A-549 sin transfectar.
10.- ESTUDIO DE LA MODIFICACIÓN DEL POTENCIAL DE MEMBRANA.
Para determinar si la transfección y expresión del gen E en nuestras células
tumorales puede actuar a través de la lesión de las mitocondrias, se realizó un
estudio comparativo entre las tres líneas tumorales parentales, MCF7, A-549 y T84, y sus respectivas líneas transfectadas mediante tinción con DiOC6 que permite
determinar la integridad de la membrana de estas organelas. Como se muestra en
la Figura 27 una significativa disminución en el potencial de membrana fue
observada en las tres líneas indicando un aumento en su permeabilidad después
del tratamiento con E. El mayor cambio fue observado en MCF-7. Por el contrario,
no se observaron cambios mitocondriales en las células control.
A
B
C
Figura 27. Análisis mediante citometría de flujo del potencial de membrana de
células transfectadas con el gen E de la línea A: MCF7; B: A-549; C: T-84. Marcaje con
DIOC6.
- 135 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
11.-
EFECTO
DE
E
Resultados
SOBRE
LA
MORFOLOGÍA
DE
LAS
CÉLULAS
TUMORALES.
11.1.- Morfología celular. Microscopio óptico.
El estudio mediante microscopio óptico permitió observar las características
morfológicas de las líneas A-549, MCF-7 y T-84 tras la transfección. La tres líneas
parentales se caracterizaron por presentar un típico crecimiento formando núcleos
cuya expansión progresiva y posterior contacto determinaba la formación de una
monocapa celular (crecimiento en monocapa). Morfológicamente, las células eran
predominantemente espiculadas y ligeramente alargadas con tendencia a
redondearse cuando entraban en contacto. Esta última característica fue más
evidente en las células derivadas de cáncer de colon.
Después del proceso de transfección, el hallazgo más característico fue la
presencia de “calvas” distribuidas de forma irregulara a lo largo del cultivo que se
fueron expandiendo progresivamente a lo largo de los días después de la
transfección. Dichas zonas sin células fueron más evidentes cuando la
transfección se realizó de forma continuada (Figura 28). El efecto no fue observado
cuando se utilizó el vehículo (partícula lipídica) sólo o con el vector sin gen
terapéutico.
11.2. - Morfología celular. Microscopio de Barrido y de transmisión.
Las células parentales aparecieron en su típica formación en monocapa con
evidentes zonas de contacto intercelular, perímetro poligonal y morfología
aplanada. Un hallazgo típico de este tipo celular que se repitió en la mayoría de las
células analizadas fue la presencia de una gran cantidad de microvellosidades que
se agrupaban en el exterior de su membrana celular (Figura 29A). Presentaron
irregularidades en la membrana y expansiones, encontrándose pocas zonas de
membrana sin vellosidades y de carácter más liso. Por otra parte, el análisis de las
células en las que no existía un total contacto con la superficie de frasco de cultivo,
demostró la presencia de estas vellosidades en una forma ahora de esfera casi
simétrica debido a la falta de contacto con el plástico (Figura 29C).
- 136 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
B
C
D
E
Figura 28. Morfología de la línea MCF-7 en cultivo antes y después de transfección
con pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E. Las células parentales (A y B) presentaron una morfología
espiculada y se fueron expandiendo con una formación típica de núcleos. La transfección
repetida con pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E originó la presencia de “calvas” indicativas de la
progresiva muerte celular (C, tres días; D; cinco días; E; siete días)
- 137 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
B
C
D
E
Figura 29. Microscopia de barrido y electrónica de la línea A-549 en cultivo antes y
después de transfección con pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E. Células parentales pegadas al
Falcon (A) o en suspensión (C). Células transfectadas con E pegadas al Falcon (B) o en
suspensión (D). La figura E muestra las alteraciones mitocondriales encontradas en A-549
después de la expresión de E.
Las células tratadas mediante la transfección de E fueron analizadas a
diferentes tiempos. No obstante en ellas no se pudo observar cambios relevantes
en la morfología externa. Como se aprecia en las imágenes de microscopia de
barrido (Figuras 29 B y D) tanto las células pegadas al falcon como las células en
- 138 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
suspensión presentaron una morfología similar a las parentales. No obstante, el
análisis mediante microscopio de transmisión reveló el hallazgo más relevante en
estas células en relación a las parentales y fue la presencia de mitocondrias
enormemente dilatadas, con perdida de la estructura de las crestas y en muchos
casos destruidas (Figura 29 E).
12.- ESTUDIO COMPARATIVO DE LAS MODIFICACIONES MORFOLÓGICAS
QUE INDUCEN DOS GENES SUICIDAS (Gef y E) EN CÉLULAS DE CÁNCER
DE PULMÓN.
Para determinar si los genes suicidas Gef y E pueden compartir su
mecanismo de acción, se realizó una primera aproximación comparando los
modificaciones morfológicas que ambos producían. Así, pudimos observar que al
microcopio óptico los cambios inducidos por Gef fueron muy similares en esta línea
Gen E
a los causados por E (ver previamente Figura 30).
B
C
D
E
F
Gen Gef
A
Figura 30. Comparación de los cambios morfológicos (microscopía óptica)
inducidos por los genes Gef y E en la línea A-549. Evolución de las células transfectadas
con E (A, B y C) y transfectadas con Gef (D, E y F).
Sin embargo, los análisis a microscopia electrónica demostraron diferencias
significativas. Así, los estudios mediante microscopio de barrido determinaron que
Gef inducía alteraciones en la membrana celular de A-549 que no fueron
observados con el gen E. Las células transfectadas con Gef perdieron la presencia
- 139 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
de microvellosidades presentando una membrana lisa lo que no ocurrió en las
transfectadas con E. Sin embargo, los estudios mediante microscopio de
transmisión demostraron que el número y las alteraciones de las mitocondrias en
las células transfectadas con E fueron mayores que en las transfectadas con Gef,
de forma que en las primeras la desestructuración de las crestas y la destrucción
de las organelas fue mayor (Figura 31).
A
B
C
D
E
F
E´
Figura 31. Comparación de los cambios morfológicos (microscopía de barrido y
electrónica) inducidos por los genes Gef y E en la línea A-549. Células transfectadas con E
mostrando su superficie (A, B) y la alteración a nivel mitocondrial (C). Células
transfectadas con Gef mostrando la presencia de dilataciones y perdida de vellosidades en
su superficie ( D, E, E´) y las alteraciones en sus mitocondrias (F).
Las diferencias entre ambos genes son reflejadas en los estudios de
proliferación, observándose un aumento de la inhibición de la proliferación de un
2.2% del gen Gef respecto a E (Figura 32).
- 140 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
A
30
VO L U MEN
25
20
Control
15
TOPO1
10
TOPO3
5
0
2
3
5
7
DÍ AS
B
1
2
Día 3
Día 5
Día 7
Figura 32. A. Gráfica de proliferación: Representa el efecto de la expresión
del gen Gef sobre la proliferación celular del esferoide de la línea MCF7. B.
Análisis del efecto de la transfección de Gef y doxorrubicina en esferoides de MCF7. 1. Control; 2. Esferoides tratados con doxorrubicina 10nM asociado a
pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Gef. La gráfica representa la modificación de los
esferocitos con las diferentes concentraciones de droga.
Al igual que en la terapia combinada con E, la transfección continua del gen
Gef en combinación con los fármacos aumenta la inhibición de la proliferación con
respecto al uso aislado del fármaco solo. Ésto puede observarse en la Figura 33,
donde al combinar Gef con Taxol 10nM, aumentándose la inhibición de la
proliferación respecto al tratamiento solo de Taxol 10 nM en un 30%.
La terapia combinada de Gef con Docetaxol 10nM aumenta la inhibición de
la proliferación respecto al uso aislado de Docetaxol a la misma concentración en
un 29%, muy similar a la inhibición, 27%, que produce la transfección continua de
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
Gef combinada con Docetaxol 1nM respecto al fármaco al administrase de forma
aislada.
Otra semejanza con el gen E es que la mayor inhibición de la proliferación
también la encontramos cuando transfectamos el gen Gef de forma continua en
combinación con Doxorrubicina. Esta inhibición es de 37% cuando Gef se combina
con Doxorrubicina 10nM, y alcanza valores de 30% al disminuir la dosis a 1 y
0.1nM (Figura 33).
A
B
120
120
100
100
30%
80
80
60
60
40
40
20
20
0
27%
29%
0
Pacl
10nM
Pacl
1nM
Pacl
0.1nM
Doce
10nM
Doce
1nM
Doce
0.1nM
C
120
100
30%
37%
29.8%
80
60
40
20
0
Doxo
10nM
Fármaco
Doxo
1nM
Fármaco + Gef
Doxo
0.1nM
Fármaco + Gef 3 transfecciones
Figura 33. Efecto de la terapia combinada del gen Gef con A. Paclitaxel (Taxol); B.
Docetaxol; C. Doxorrubicina; sobre la proliferación de los esferoides de la línea MCF7. Se
expresa en % de inhibición de proliferación del esferoide de la línea MCF-7 respecto al
fármaco. Se muestran sólo los datos del tratamiento realizado durante 7 días.
- 142 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
Estos datos apoyan la hipótesis de que la transfección de los genes E y Gef
puede adyuvar al tratamiento con citotóxicos permitiendo una reducción notable de
las dosis de fármaco a aplicar para alcanzar un efecto antitumoral efectivo en este
tipo de tumor.
En relación a la reducción de las dosis efectivas de los fármacos, Gef y E
se asemejan presentando una mayor inhibición de la proliferación al combinarse
con Doxorrubicina. Al transfectar Gef de forma continua en combinación con
Doxorrubicina 0.1nM se obtiene una inhibición de la proliferación de 53%, superior
a la inhibición que produce el uso aislado de Doxorrubicina 10nM, 42% (Figura 34).
A
B
120
120
100
100
37.1%
38%
47.6%
80
43.5%
80
60
60
40
40
20
20
0
0
Pacl
10nM
Pacl
1nM
Pacl
0.1nM
Doce
10nM
Doce
1nM
Doce
0.1nM
C
120
100
80
42%
53%
60
40
20
0
Doxo
10nM
Fármaco
Doxo
1nM
Fármaco + Gef
Doxo
0.1nM
Fármaco + Gef 3 transfecciones
Figura 34. Efecto de la terapia combinada del gen Gef con A. Paclitaxel (Taxol); B.
Docetaxol; C. Doxorrubicina; sobre la proliferación celular del esferoide de la línea MCF7.
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Resultados
Se expresa en % de inhibición de proliferación celular del esferoide de la línea MCF-7. Se
muestran sólo los datos del tratamiento realizado durante 7 días.
Con el uso de los otros fármacos la inhibición es algo menor. Podemos
observar en la Figura 34 una inhibición de la proliferación de 43.5% en terapia
combinada de Gef con Docetaxol 0.1nM y de 47.5% combinado Gef con Taxol
0.1nM, ambos superiores a la inhibición que produce únicamente el uso respectivo
de los fármacos a dosis 10nM (37% y 38% respectivamente).
Como podemos observar, el efecto de Gef inhibe la proliferación
aproximadamente un 9%, respecto al fármaco, y un 1.3%, respecto al control, más
que el gen E.
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V.DISCUSIÓN
Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
La aplicación de una estrategia por el que es posible modificar el material
génico de una célula tumoral con el objetivo de que ésta corrija su ilimitada
capacidad de proliferación, adquiera un mayor grado de diferenciación o
simplemente se destruya, ha pasado por varias etapas en el curso de los últimos
quince a veinte años. Aunque los primeros pasos de esta nueva estrategia
denominada “terapia génica del cáncer” fueron exitosos y prometedores, en los
últimos años han surgido limitaciones que han obligado a seleccionar nuevos
abordajes con el objetivo de hacer aplicable en la clínica lo que con cierta facilidad
ha podido demostrarse a nivel experimental. Así, inicialmente (a) el desarrollo de
técnicas de transferencia y expresión estable de genes heterólogos en células de
mamíferos en general, y humanas en particular; (b) la aplicación de protocolos de
terapia genética a la curación de enfermedades de origen monogénico, como en el
caso del reemplazo ex vivo del gen de la adenosina deaminasa (ADA) en
pacientes con síndrome de inmunodeficiencia combinada causado por la
deficiencia en dicho enzima y (c) la identificación y caracterización de genes
específicos implicados en el origen y desarrollo del cáncer humano, tales como los
oncogenes y los genes supresores de tumores, y de los mecanismos moleculares
de su participación en el proceso neoplásico, dieron lugar a expectativas que con
el paso del tiempo se demostraron inciertas no tanto por la imposibilidad de alterar
el material génico de las células tumorales en una dirección terapéutico sino más
bien por la dificultad de aplicarlo in vivo de forma eficaz y estable. Por ejemplo, la
inactivación de un oncogén concreto o añadir una copia normal de un gen supresor
de tumores alterados no parece ser hoy en día una limitación importante. Sin
embargo conseguir que ésto ocurra en un paciente afecto de cáncer de una forma
estable, alcanzando la totalidad de la población de las células tumorales y sin
causar efectos secundarios, a veces más lesivos que la patología tratada, es un
objetivo aún inalcanzado.
No obstante y a pesar de las dificultades, se han desarrollado innumerables
experimentos a nivel pre-clínico, utilizando células tumorales en cultivo o modelos
animales de carcinogénesis experimental, que han demostrado que es posible
revertir el fenotipo neoplásico de células tumorales y detener, o incluso revertir, el
desarrollo de tumores en animales. En conjunto, el saldo de estos experimentos ha
sido tremendamente positivo, no sólo porque en la mayoría de los casos los
- 149 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
resultados indicaban que se puede controlar el cáncer in vitro e in vivo, sino
también porque proporcionaron la oportunidad de probar y perfeccionar nuevos
métodos y vectores para la transferencia de genes. Hoy en día ya se dispone de
datos referentes a experimentos clínicos (protocolos de Fase 1) que incluyen
grupos de pacientes muy específicos y limitados en referencia a tumores en
estadíos muy avanzados que ante la falta de respuesta a otros tratamientos son
incluidos en estos ensayos. Ha sido en estos ensayos en donde se ha podido
determinar que aunque la estrategia es adecuada para controlar el problema de la
aparición y proliferación de células tumorales, desde un punto de vista técnico los
niveles de transferencia de los genes empleados son bajos, lo que implica una no
consecución de la desaparición de los tumores en los pacientes.
Ha sido precisamente el ingente número de ensayos realizados aplicando
diferentes protocolos de terapia génica en animales de experimentación y en
humanos lo que ha llevado a desarrollar por parte de los Institutos Nacionales de la
Salud (N.I.H.) de los Estados Unidos de América las directrices a seguir para
mejorar las perspectivas de esta estrategia en el cáncer entre las que cabe
destacar 1) “realizar un análisis más pormenorizado de los resultados obtenidos a
nivel pre-clínico”; 2) “realizar una mejor selección de los pacientes a tratar, de las
características de su tumor e incluso de su estado general de su salud”; 3)
“estandarizar las condiciones experimentales y permitir que los resultados
obtenidos se puedan interpretar de forma coherente”; 4) “definir de una forma clara
lo que se considera éxito del tratamiento entendiendo por tal la inhibición del
crecimiento tumoral, la regresión completa de los tumores, u otros parámetros
biológicos”; y 5) “avanzar en el desarrollo de vectores eficaces para el transporte
de los genes hacia las dianas tumorales y de nuevos genes terapéuticos que sean
capaces de lesionar por nuevas vías a las células cancerígenas”. Es precisamente
en este último punto, que comentaremos más adelante, donde se incluye el
desarrollo de nuestro Proyecto de Investigación.
El desarrollo neoplásico es un proceso progresivo, que resulta de la
acumulación escalonada de múltiples errores genéticos y epigenéticos, en que las
células adquieren niveles de malignidad cada vez mayores. De ahí la importancia
de seleccionar adecuadamente la muestra de pacientes donde realizar los ensayos
terapéuticos ya que la inclusión de pacientes con tumores en estado avanzado
- 150 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
implica probablemente la existencia de alteraciones genéticas acumuladas en
todas las células tumorales presentes en el tumor mismo o localizadas en
metástasis derivadas del tumor primario. Aunque el origen de la mayoría de los
tumores es clonal y derivan de una sola célula, las células tumorales adquieren un
alto grado de heterogeneidad durante el desarrollo tumoral, lo que implica que los
protocolos de terapia génica pueden no tener que ser unidireccionales en cuanto a
la estrategia diseñada sino más bien abarcar varias posibilidades terapéuticas. De
cualquier modo, el carácter multigénico del cáncer debe tenerse en consideración
a la hora de diseñar protocolos de terapia genética.
Por otra parte, es necesario insistir en la necesidad de aumentar el número
de ensayos en modelos experimentales in vitro y animales a pesar de la posible no
correlación en muchos casos con los humanos. Ya sabemos que la investigación
del cáncer, o de otras enfermedades humanas, basada en la utilización de
modelos animales, e incluso en el uso de líneas celulares tumorales humanas,
como alternativa experimental tiene el inconveniente de que los datos pueden no
reflejar lo que ocurriría en pacientes sometidos a los mismos tratamientos. Sin
embargo, los datos obtenidos de estas experiencias son fundamentales para
mejorar y seleccionar los protocolos de actuación en los ensayos clínicos. La
investigación básica dedicada a mejorar aspectos técnicos de la transferencia
genética que permitan alcanzar niveles de eficacia terapéutica en humanos
similares a los obtenidos en animales debe realizarse de forma que se obtenga
información detallada de las respuestas (molecular, inmunológica, etc.) del
organismo humano a la intervención terapéutica. La continuación y expansión de la
investigación básica y, especialmente, clínica en el área de la terapia genética del
cáncer está justificada, además de por las consideraciones anteriores, por lo que
hasta la actualidad se considera como el mayor logro de la misma: la demostración
de que la transferencia genética es claramente factible y, sobre todo, de que la
mayoría de las modalidades utilizadas no representan riesgos adicionales
significativos para la salud de los pacientes, habiendo resultados en efectos
secundarios mínimos.
Por último, uno de los mayores campos de investigación en esta área se
centra en el ensayo con nuevos agentes terapéuticos que posean mecanismos de
acción similares a los ensayados hasta la fecha o mecanismos distintos, pero que
- 151 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
en cualquier caso conduzcan hacia la muerte o la no proliferación de las células
tumorales. En es sentido, ensayos con nuevos genes están demostrando que es
posible que genes de otros organismos inferiores puedan tener utilidad si son
expresados y controlados de forma adecuada en células eucariotas. En los últimos
años, la posibilidad de introducir genes asesinos en células derivadas de cáncer ha
supuesto un enorme avance en el diseño de nuevas vías para abordar esta
patología. Dentro de éstos, un grupo de genes denominados de acción directa ha
cobrado un gran interés ya que prescinden del uso de prodrogas para su acción, lo
que evita las clásicas limitaciones de los genes que necesitaban transformar dicha
prodroga para poseer efecto.
En este contexto, nosotros estamos trabajando con sistemas de terapia
génica con genes suicidas y su aplicación en la destrucción de células tumorales.
En los últimos años hemos demostrado que genes procedentes de procariotas
(como gef) son capaces de inducir apoptosis en células de cáncer de mama y una
acumulación de células en fase S y por tanto una disminución significativa de la
proliferación en melanoma. Además, recientemente hemos demostrado que este
gen es capaz de actuar potenciando el efecto de los agentes citotóxicos (como
taxol) en una terapia combinada contra células de cáncer de pulmón cultivadas en
MTS (esferoides multicelulares) (Prados y cols., 2008). Un nuevo gen también
suicida, denominado E y de procedencia procariota (Haidinger y cols., 2003)
(cedido por el Dr. J. L. Ramos del Centro Superior de Investigaciones Científicas
(CSIC) del Zaidín (Granada)) es el objeto de nuestro trabajo de investigación. Su
mecanismo de acción es desconocido aunque conocemos que la proteína de E es
capaz de generar túneles transmembrana que conducen a la muerte o la lesión
celular. La posibilidad de que ejerza una acción similar en células tumorales abre
una nueva vía del tratamiento del cáncer y se engloba dentro de las estrategias
diseñadas y alentadas por la comunidad científica que trabaja en la aplicación de
la terapia génica en cáncer.
La destrucción de las células tumorales como estrategia terapéutica.
Las estrategias asesino-suicidas de tipo prodroga/droga son aquellas
en las que los genes suicidas codifican para enzimas que transforman una
prodroga no tóxica en un metabolito altamente tóxico. Así pues, la administración
- 152 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
de la prodroga después de un proceso de transfección provoca la producción de
una droga tóxica en el tumor. Como ejemplo podemos citar el sistema citosina
deaminasa. El gen de la citosina desaminasa, que se expresa en levaduras y
bacterias pero no en células de mamíferos, expresa una enzima capaz de
transformar citosina en uracilo. Al inyectar el profármaco 5 fluorocistina lo
transforma en el metabolito activo 5 fluoracilo, que actúa sobre la traducción del
ADN sustituyendo al uracilo en el ARN e inhibiendo la timidil sintetasa, lo que
provoca la biosíntesis de un ADN impar que induce muerte celular con mayor
eficacia que el sistema HSV-TK5 (Mazhar y cols., 2004).
Las estrategias asesino-suicidas de acción directa tienen como objetivo la
transfección de las células tumorales con un gen cuya expresión induce
directamente o la muerte o la disminución de la proliferación celular. Cabe destacar
el sistema de la linamarasa/linamarina. Dicho sistema estuvo asociado a las
intoxicaciones producidas en diversos países tropicales por el consumo de hojas
de raíces de la planta “casava” (Manihot esculenta). Al masticar las hojas de la
planta, se libera la enzima β-glucosidasa (linamarasa), localizada en la pared, que
hidroxila la “linamarina” (2-OH-isobutinonil.trilo-β-D-glucopiranósido), localizada en
el citoplasma, a glucosa y cianuro. Una vez infectadas las células mediante un
retrovirus que expresa el gen de la linamarasa, la linamarina se hidroxila
produciéndose la muerte celular por liberación de cianuro. Dicha liberación provoca
un efecto colateral importante que puede también afectar a células del tumor
temporalmente quiescentes.
Una novedosa vía de investigación explora las posibilidades de aplicar
genes derivados de organismos como las bacterias en la terapia antitumoral dado
su actividad lesiva para las membranas celulares. Estos genes han sido
identificados como miembros de una familia que codifica para la muerte celular
(Poulsin y cols., 1992). Esta familia está formada por los plásmidos que codifican
para los genes hok, flmA, srnB y pndA así como para los genes cromosómicos gef
y relF de Escherichia Coli. El producto del gen gef es una proteína de 50
aminoácidos que provoca la muerte celular mediante “agujeramiento” de su
membrana. En bacterias, la inducción de gef conlleva la muerte celular,
adquiriendo dicha célula un aspecto de fantasma tras una o dos horas (Poulsen y
cols., 1989).
- 153 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
Por otra parte, la proteína E es una proteína de membrana del X174
constituida por 91 residuos aminoacídicos (Sanger F y cols., 1977), que causa la
lisis celular mediante un mecanismo de crecimiento-dependiente igual que el de
los antibióticos en la pared celular, sugiriendo que la proteína E actúa inhibiendo la
síntesis de péptidoglicanos (Bernhardt y cols., 2000). La proteína E inhibe a la
translocasa MraY, que cataliza la primera etapa de las reacciones involucradas en
la biosíntesis de péptidoglicanos de la pared bacteriana (Mendel y cols., 2006). La
inhibición de la regeneración de la pared celular conlleva la lisis.
Sin embargo, Lubitz y sus compañeros de trabajo (Witte y cols, 1990)
observaron agujeros de 50-200-nm localizados en el tabique de la célula y de vez
en cuando en los polos, divulgándose otro mecanismo que induce la muerte la
celular por el que la proteína E oligomeriza para formar un "túnel transmembrana"
que atraviesa la célula causando la disminución rápida de la presión osmótica
celular, dando por resultado la expulsión del contenido citosólico, incluyendo los
virones de la progenie (Witte A y cols, 1990). Las células quedan vacías,
desprovistas del material citoplasmático y genómico, “células fantasma” (Haidinger
y cols., 2003).
Nuestro interés por este gen ha dado lugar a un estudio experimental con el
objetivo de transfectarlo a las líneas tumorales humanas de cáncer de mama
(MCF-7), de pulmón (A-549) y colon (T-84) para determinar su efecto sobre ellas y
así como en combinación con diversas drogas empleadas en quimioterapia.
La correcta y eficaz expresión del gen E en una célula eucariota depende
en gran medida del vector seleccionado. Para analizar el efecto del gen E como
gen terapéutico en cáncer de mama, pulmón y colon y poder desarrollar
experiencias de terapia combinada con agentes citotóxicos hemos utilizado el
plásmido pcDNA3.1/V5-His-TOPO, que posee un potente promotor de expresión
directa en células eucariotas (CMV) y un gen de resistencia a ampicilina, para
desarrollar una construcción que contiene insertado el gen E y con capacidad de
expresión en eucariotas de forma constitutiva. Este plásmido fue utilizado en varios
estudios entre los que podemos destacar los de Han TK y Dao ML (2007).y/o los
de Tang y cols., 2002. Una vez clonado el gen E en este vector, la transfección a
las células tumorales se realizó mediante liposomas, Fugene-6, un método
- 154 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
utilizado por muchos investigadores (Zou y cols., 2002) por su sencillez, pues no
necesita gran cantidad de ADN (1-2 µg) ni pone limitaciones a su tamaño.
Además, su baja inmunogenicidad y su alta eficiencia (hasta el 50%) representan
una gran ventaja con relación otros métodos de transfección.
La construcción de un vector de expresión basado en el plásmido
pcDNA3.1/V5-His-TOPO con el gen E como inserto, y su transfección mediante
liposomas en células tumorales humanas de cáncer de mama, pulmón y colon, nos
ha permitido determinar el potencial de este nuevo sistema, caracterizando su
acción sobre las células neoplásicas y sus posibilidades como nueva vía de terapia
génica antitumoral.
La expresión del gen E en MCF-7, A-549 y T-84 provoca cambios
morfológicos y modificaciones en la proliferación celular.
La acción de genes suicidas sobre células tumorales ha sido objeto de
varios estudios. Schepelmann y cols., 2007, combinan la expresión selectiva del
gen para la carboxipeptidasa G2 (CPG2) de la enzima profármaco activa en los
tumores de cáncer de colon usando el promotor humano de la telomerasa
(hTERT). En cáncer de mama, los recientes estudios llevados a cabo por Kong y
cols., 2008, demuestran que la transfección en células MCF7, de cáncer de mama,
mediante un adenovirus que media el sistema de doble genes suicidas, citosina
deaminasa y la timidita kinasa (CD/TK), tiene mayor eficacia inhibiendo la
proliferación que si se transfectasen los genes por separado. Por otra parte, hasta
le fecha la terapia génica con genes suicidas no ha demostrado su eficacia en el
cáncer de pulmón. Ensayos con otro tipo de genes como los que codifican para
factores antiangiogénicos, o genes proaoptóticos sólo han obtenido una respuesta
parcial (Toloza, 2006). Los ensayos realizados con agentes suicidas clásicos HSVtk/ganciclovir (GCV) sólo han mostrado ser parcialmente selectivos para las células
de cáncer de pulmón (Määttä y cols., 2004). Incluso el uso de promotores
específicos como INSM1 (Pedersen y cols., 2006) ha provocado en el uso de este
tipo de terapia una limitada respuesta. Una de las principales causas que provoca
este fallo en la inhibición de la proliferación de las células tumorales es la falta de
biodisponibilidad de la prodroga que es necesaria para que actúe eficazmente la
enzima (Dachs y cols, 2006). Además, el desarrollo de quimiorresistencia en
- 155 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
células de cáncer de pulmón como GLC4 frente a GCV reduce la eficacia de la
estrategia (Van Dillen y cols., 2005). Por tanto y dados los resultados expuestos,
son necesarios nuevos sistemas terapéuticos que no precisen de prodroga. En
este sentido el uso de genes bacterianos, virales o de plantas han demostrado ser
capaces de inducir muerte celular de células tumorales.
En el contexto planteado en nuestro trabajo, la posibilidad de utilizar genes
de acción lesiva directa evita la utilización de prodrogas y por tanto los problemas
derivados de su uso. Una de las características de casi todos los genes suicidas
utilizados en las investigaciones de terapia génica contra el cáncer es la aparición
de células alteradas con morfología y citoestructura desorganizadas. Dicho patrón
es característico del desarrollo de un proceso de apoptosis que conduce a lo que
se ha denominado “suicidio celular”. Ejemplos de este mecanismo de acción son
los estudios de Poulsen y cols., 1989, quienes observaron en bacterias que la
inducción del gen gef conlleva la muerte celular, adquiriendo dicha bacteria un
aspecto de fantasma tras una o dos horas. Algunas bacterias patogénicas
producen toxinas formadoras de poros o inhibidores de la síntesis de proteínas que
están asociados con apoptosis en las células diana (Fiorentini y cols., 2003;
Blanke, 2005). En células H5 (Zhang y cols., 2006) se ha comprobado que la
transfección de Cry, una toxina formadora de poros, conduce a la lisis celular por
procesos de osmólisis (de Maagd y cols., 2003) y activación de la Proteína Kinasa
A (PKA), observándose claros signos de muerte celular como son la hinchazón de
la célula, plegamiento de la membrana y la presencia de fantasmas nucleares.
(Zhang y cols., 2006). No se observó externalización de fosfatidilserina o
fragmentación del ADN en las células tratadas con la toxina Cry. Los cambios
morfológicos observados fueron similares a los asociados con la oncosis, lo cual
implica plegamiento celular, hinchamiento y el aumento de la permeabilidad de la
membrana (Fink y Cookson, 2005). Se comprobó que el segundo mensajero AMPc
está implicado en la modulación de las señales relacionadas con la muerte celular
en las células transfectadas con Cry (Skalhegg y Tasken, 2000; Tortora y
Ciardiello, 2002). Dado que Mg2+ es una llave componente de la citotxicidad de la
toxina Cry y que este ión es requerido para la muerte celular, Zhang y cols., 2006,
hipotetizan que la ruta del AMPc está inducido por la acción de la toxina Cry.
- 156 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
El análisis mediante microscopía óptica de las líneas A-549, MCF-7 y T-84
parentales mostró un típico crecimiento caracterizado por formar núcleos cuya
expansión progresiva y posterior contacto determinaba la formación de una
monocapa celular (crecimiento en monocapa). Morfológicamente, las células eran
predominantemente espiculadas y ligeramente alargadas con tendencia a
redondearse cuando entraban en contacto. Esta última característica fue más
evidente en las células derivadas de cáncer de colon.
Después del proceso de transfección, el hallazgo más característico fue la
presencia de “calvas” distribuidas de forma irregular a lo largo del cultivo que se
fueron expandiendo progresivamente a lo largo de los días después de la
transfección. Dichas zonas sin células fueron más evidentes cuando la
transfección se realizó de forma continuada. El efecto no fue observado cuando se
utilizó el vehículo (partícula lipídica) sólo o con el vector sin gen terapéutico. Esta
primera aproximación a la acción del gen E sobre células tumorales sugiere que es
un gen capaz de inducir muerte celular aunque no se observa cambios
morfológicos significativos.
Mediante microscopía de barrido las células parentales aparecieron en su
típica formación en monocapa con evidentes zonas de contacto intercelular,
perímetro poligonal y morfología aplanada. Un hallazgo típico de este tipo celular
que se repitió en la mayoría de las células analizadas fue la presencia de una gran
cantidad de microvellosidades que se agrupaban en el exterior de su membrana
celular.
Presentaron
irregularidades
en
la
membrana
y
expansiones,
encontrándose pocas zonas de membrana sin vellosidades y de carácter más liso.
Por otra parte, el análisis de las células en las que no existía un total contacto con
la superficie de frasco de cultivo, demostró la presencia de estas vellosidades en
una forma ahora de esfera casi simétrica debido a la falta de contacto con el
plástico. Las células tratadas mediante la transfección de E fueron analizadas a
diferentes tiempos. No obstante en ellas no se pudo observar cambios relevantes
en la morfología externa. Tanto las células pegadas al falcon como las células en
suspensión presentaron una morfología similar a las parentales.
Mediante el análisis con microscopio de transmisión se reveló el hallazgo
más relevante en estas células en relación a las parentales, y fue la presencia de
- 157 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
mitocondrias enormemente dilatadas, con pérdida de la estructura de las crestas y
en muchos casos destruidas. Como demuestran los recientes estudios de Xiao y
cols., 2008, la administración de Isociocianato de benzilo (BITC), agente
quimiopreventivo de cáncer, a las líneas MCF7 y MDA-MB-231 induce la
reactivación del sistema ROS que lesiona la mitocondria conduciendo a la muerte
celular. Se ha podido observar la ruptura de crestas mitocondriales en linfocitos de
pacientes sometidos a una alta terapia antirretroviral (Tolomeo y cols., 2003) lo que
inevitablemente conduce a la muerte celular.
La expresión del gen E en MCF-7, A-549 y T-84 modifica el patrón de
proliferación celular.
Al analizar el patrón de crecimiento de las tres líneas celulares, MCF7, A-549 y T-84, transfectadas con el gen E, pudimos observar una inhibición de la
proliferación que aumenta con la transfección continua. Además dicha inhibición se
perpetúa y aumenta con el tiempo, de forma que de los diferentes periodos
analizados la mayor inhibición se produce en el tiempo de exposición más largo.
En general podemos inferir de los resultados que la expresión de E inhibe dicha
proliferación fundamentalmente a partir del quinto día y que la inhibición es mayor
cuando los procesos de transfección se repiten en el tiempo.
Fue en la línea MCF-7 donde se produjo una mayor inhibición de la
proliferación al transfectar el gen E de forma continua. Así, los análisis de la línea
de cáncer de mama MCF-7 demuestran que tras una única transfección se
produce una inhibición de la proliferación de un 11% a los cinco días mientras que
a los 7 días este efecto se duplica alcanzando una inhibición del 22,7%. Cuando
las transfecciones se repitieron cada dos días la inhibición de la proliferación fue
de un 14,2% y se incrementó a un 33% a los 7 días.
Las experiencias realizadas en cáncer de pulmón (línea A-549) mostraron
unos efectos algo menores, alcanzándose la mayor inhibición de la proliferación,
25,3%, a los 7 días cuando las transfecciones se repitieron cada dos días, la
inhibición de la proliferación fue de un 16,7% y se incrementó a un 25,3% a los 7
días.
- 158 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
Por último, en las células T-84 procedentes de cáncer de colon no se
pudo observar una diferencia significativa entre la transfección única de E o la
transfección repita en varios días. Así, en el primer caso la inhibición de la
proliferación fue de 12,6% a los cinco días mientras que a los 7 días este efecto
fue mucho mayor alcanzando un 28,4%. Resultados similares e incluso menores
fueron detectados cuando las transfecciones se repitieron cada dos días. En este
caso la inhibición de la proliferación fue de un 19,4% a los cinco días y de un
19,4% a los 7 días.
En general nuestros resultados son iguales o superiores a la inhibición de la
proliferación obtenida por otros genes en células tumorales. Así, la utilización por
Narumi y cols., 1998, de la perforina induce una notable inhibición del crecimiento
en una de las líneas utilizadas en nuestro ensayo, A-549, aunque no se sabe bien
el mecanismo por el que este gen actúa. Por otra parte, células de cáncer de
mama tratadas con un gen obtenido de un bacteriófago (λ-holin) reducen su tasa
de proliferación de forma similar a la observada con nuestro gen E, actuando por
un mecanismo probablemente de acción similar ya que se ha demostrado que esta
proteína puede permeabilizar las membranas de las bacterias (Agu y col., 2007).
Estas células, 48 horas tras la transfección aparecen multinucleadas, vacuoladas y
finalmente mueren en el medio de cultivo.
La expresión del gen E en MCF-7, A-549 y T-84 induce modificaciones en
la distribución de las fases del ciclo celular.
Los resultados obtenidos mediante las pruebas de anexina sugieren que el
gen E actúa mediante un mecanismo de inducción de apoptosis en las tres líneas
celulares ensayadas aunque con diferente eficacia en cada una de ellas dada las
modificaciones en los valores correspondientes a apoptosis temprana y tardía. En
las tres líneas se observa una disminución de las células viables al transfectar E.
Esa viabilidad disminuye cuando combinamos la transafección con la actividad de
un fármaco antitumoral. Además, nuestros resultados demuestran que está
asociación es más o tan efectiva en cuanto a la inducción de apoptosis y por tanto
la proliferación celular, como el uso del mismo fármaco a dosis superiores. Las
células de cáncer de colón fueron las más sensibles a este efecto. De hecho, en
esta y en las otras líneas el número de células en fase apoptótica disminuye frente
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
al uso aislado del fármaco al transfectar con el gen E en las tres líneas. No
sabemos cuál es la causa de este hallazgo aunque se puede hipotetizar con la
rapidez y eficacia que una porina como E puede tener en las membranas
mitocondriales lo que se asemejaría a la acción demostrada de E sobre las
membranas bacterianas.
En la línea MCF7 el número de células en apoptosis tardía disminuye frente
al uso de Doxorrubicina 10nM cuando se transfecta el gen E de forma aislada o
combinado con Doxorrubicina 0.1nM. En cambio, en la línea A-549 se observa una
disminución de las células necróticas al transfectar el gen E frente al uso aislado
del fármaco. En T-84 no se observan cambios significativos a parte de la
disminución de las células viables.
La idea de que E es capaz de activar el mecanismo de destrucción celular
mediada por la lesión mitocondrial es apoyada en los datos de morfología en los
que se observan lesiones mitocondriales. Ésto hace pensar en una mediación de
la vía de la caspasa 9 (y posiblemente la caspasa 3) que son moléculas que
participan de la apoptosis vía mitocondrial. Por el contrario, la falta de presencia de
otro tipo de lesiones celulares sugiere una no activación de la caspasa 8. Los
datos obtenidos mediante western blot e inmunohistoquímica corroboran dicha
hipótesis, observándose una clara activación de la caspasa 3 y una liberación del
citocromo c al citoplasma 48 h después de la transfección con pcDNA3.1/V5-HisTOPO-E. Que la activación de las vías apoptóticas mediadas por caspasas es una
estrategia para inducir la destrucción de células tumorales, lo confirman los
experimentos de Jang y cols., 2008, que demuestran que la transfección de ANT1
induce apoptosis en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231, inactivando
NF-κB e incrementando la expresión de Bax. La inducción de poptosis de ANT1
fue acompañada por la interrupción del potencial de membrana mitocondrial, el
lanzamiento del citocromo c y la activación de la caspasas 9 y 3. Otros genes
suicidas, como Cry (Zhang y cols., 2006) y Gef (Prados y cols., 2008) sugieren la
formación de poros y activación de la Proteína Kinasa A (PKA).
Teniendo en cuenta la diferencia fundamental entre las membranas de
células eucariotas y procariotas y que la estructura de la membrana mitocondrial
se parece a la de las bacterias (Emelyanov, 2003) es aceptable hipotetizar con que
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
el efecto de E tenga lugar en estas organelas y no en la membrana celular cuya
estructura es más compleja.
La expresión del gen E en MCF-7, A-549 y T-84 en combinación con
fármacos modifica el patrón de proliferación.
Una de las principales posibilidades terapéuticas que esta surgiendo en
relación a la utilización de la terapia génica es la posible asociación a tratamiento
quimioterapéuticos convencionales o nuevos con el objeto de potenciar su efecto.
En este planteamiento, la terapia génica actúa como adyuvante permitiendo una
mayor eficacia del agente antitumoral y lo que es más importante poder reducir,
sólo en algunos casos, la concentración de droga a utilizar en el paciente.
Entre los estudios que han demostrado la utilidad de esta asociación
podemos citar los de Olijslagers y cols., 2006. En las líneas tumorales, U2OS,
Saos-2, Dul45, HTB-81 y A-549 estudiaron la influencia citotóxica del tratamiento
quimioterapéutico con paclitaxel y etopósido combinado con la sobreexpresión de
apoptina, demostrándose que las líneas celulares son significativamente más
sensibles que los agentes quimioterapéuticos cuando son cotratadas con apoptina,
alcanzándose un aumento de la inhibición de la proliferación en la línea U2OS de
35%, de 28% en Saos-2 y de 40% en la línea Du145, cuando son tratadas con
paclitaxel 5nM combinado con la transfección de apoptina frente al tratamiento
aislado de paclitaxel a la misma dosis. En cáncer de mama se está investigando el
uso combinado de agentes quimioterapéuticos con oligonucleótidos antisentido de
Bcl2 y Bcl-xL, ambas proteínas inhibidoras de la ruta de apoptosis mitocondrial
previniendo el lanzamiento del citocromo c y la activación de las caspasas (Huang,
2000; Kim y cols., 2002). La combinación de Bcl2 antisentido con Doxorrubicina y
los
taxanos,
Taxol
significativamente
la
y
Docetaxol,
sensibilidad
en
a
la
dichos
línea
MDA-MB-231
agentes
aumentó
quimioterapéuticos,
alcanzándose una adición 5.9 veces superior al uso aislado de Doxorrubicina (Emi
y cols., 2005). En cáncer de colon, los estudios de Arango y cols., 2001,
demuestran que la transfección de un vector que contenga el gen c-myc en células
de cáncer de colon, LoVo y DLD1, implica la sobreexpresión de éste y la
consecuente activación del gen p53, ambos relacionados con la sensibilidad a
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
fármacos como el 5-FU. Las líneas que sobreexpresaron c-myc/p53 aumentaron
su sensibilidad al 5-FU.
Cuando se valoró la modificación en la inhibición de la proliferación de las
líneas MCF-7, A-549 y T-84 sometidas a terapia combinada en relación a las
tratadas sólo con fármaco pudimos comprobar que: 1) en general, la expresión de
E en las células tumorales provoca una potenciación relevante del efecto del
fármaco aumentando significativamente la reducción en su proliferación, 2) que un
protocolo de transfección repetida facilita la acción del fármaco más que la
aplicación de una sola transfección y 3) que en general, el efecto de la expresión
de E es tiempo dependiente y por tanto es más visible después de un periodo largo
de expresión.
Así, en la línea MCF-7 los datos más relevantes con las dosis más altas de
taxol (10nM) fueron observados a los 7 días de tratamiento. La línea MCF-7 sufrió
una inhibición de la proliferación de un 22.09% y un 34.2% mayor (con
pcDNA3.1/V5-His-TOPO-E de forma única o de forma repetida, respectivamente)
que la obtenida con la utilización sólo del fármaco.
Resultados similares fueron obtenidos a los 7 días de tratamiento
combinado usando el docetaxol a la concentración 10nM, donde la inhibición de la
proliferación aumentó un 22.6% con una sola transfección de pcDNA3.1/V5-HisTOPO-E pero alcanzó una reducción de un 33.02% con la transfección continuada
del gen respecto al tratamiento sólo con docetaxol 10nM.
La terapia combinada gen E/doxorrubicina fue la más eficaz en
cuanto a la reducción de la proliferación de este tipo tumoral. La mayor inhibición
de la proliferación, 39.16%, fue obtenida con el tratamiento combinado que incluía
doxorrubicina a 10nM y la transfección continuada en la exposición más
prolongada (7 días). A diferencia de los casos anteriores, la disminución de la
proliferación obtenida con dosis menores de este agente ya fuera con una sola
transfección o varias de gen E, fue significativamente menor que la obtenida con la
máxima dosis (33.9% de inhibición respecto a la dosis 1nM y 34.9% respecto a la
dosis 0.1nM al transfectar respectivamente de forma continuada).
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
En la línea A-549, al igual que en la anterior, el efecto fue mayor cuando se
utilizó una transfección continua y la mayor inhibición de crecimiento fue observada
en los periodos de exposición más prolongados (7 días) y a las dosis más altas.
En concordancia con lo anterior citado, la combinación de la expresión de E
y una dosis de taxol de 100µM provocó una reducción en la proliferación de un
28.46% más, en relación a la inhibición que provoca el taxol sólo a dicha
concentración. Esta reducción fue sólo ligeramente menor (26.6%) cuando se
empleó una concentración de 50µM y considerando siempre el mismo tiempo de
tratamiento (7 días), sugiriendo de nuevo la posibilidad de que la asociación de las
dos terapias permita reducir la dosis de fármaco. Con dosis menores se obtuvieron
resultados más limitados (21% de inhibición del crecimiento).
Los resultados obtenidos mediante la combinación de transfección de E y
carboplatino demuestran que es la asociación con la que menos efecto
antiproliferativo se obtiene no sólo en A-549 sino también en comparación con los
resultados de MCF-7. La inhibición de la proliferación con carboplatino a 100µM a
los 7 días de tratamiento unido a la expresión de E fue sólo de un 20.3% más que
cuando se utilizó el fármaco sólo. Como en el caso del taxol, la actuación del
tratamiento asociado en las primeras fases fue muy reducida siendo en los 2 o 3
primeros días valorado como reducciones de los aumentos en la inhibición de la
proliferación de cerca de un 10%. Sin embargo es relevante constatar que también
en este caso se pudo observar el mismo efecto antiproliferativo de la dosis más
alta y la dosis media de carboplatino, lo que sugiere la facilitación que el gen E
provoca en la “actividad” antitumoral (en el sentido más amplio) del fármaco.
Por último, en las experiencias con gemcitabina 100µM asociada a terapia
génica continua con E se consigue una reducción de la proliferación de hasta
26.4% más que la utilización del fármaco de forma aislada en el periodo de 7 días.
Ésta fue el mayor incremento de inhibición observado, si bien es que a dosis 50µM
se obtuvieron reducciones de hasta un 24.3% a los 7 días en comparación con el
uso sólo del fármaco. Ésto corrobora nuevamente la posibilidad de trabajar con
dosis inferiores obteniéndose los mimos valores de inhibición de proliferación.
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
En la línea T-84, los resultados corroboran los obtenidos en las
líneas celulares anteriores: cuanto mayor es la dosis del fármaco y el número de
transfecciones, mayor es la inhibición de la proliferación.
Inicialmente se realizó el estudio con la asociación de fármacos 5Fluoruracilo/Ácido Folínico (5-FU/FA). Esta asociación es de uso habitual en la
práctica clínica y es uno de los tratamientos de elección para este tipo de cáncer.
Pudimos observar a los 7 días de tratamiento y con la dosis más alta de 5-FU/FA
(5000:5µM) combinada con la transfección continua de E una inhibición de la
proliferación de 30.3%, mayor que con el uso sólo del fármaco a dicha
concentración. Dicha inhibición es muy similar al resultado obtenido cuando se
utilizó la dosis 5:5µM en combinación con la transfección continua y expresión de
E, 27.8%.
Al añadirle a la mezcla 5-FU/FA el fármaco Irinotecán (IRI), la inhibición de
la proliferación se vio incrementada alcanzando su máxima (33%) el día 7 de
transfección continua del gen E combinado con la máxima dosis (500:5:200µM).
Esta inhibición es similar a la obtenida transfectando de forma continua en
combinación con la misma mezcla de fármacos a la concentración 5000:5:50µM
(32.2%) y 500:5:200µM (31.2%) a los 7 días de tratamiento respecto al uso aislado
de la correspondiente mezcla de fármacos.
La mayor inhibición de la proliferación en la línea T-84 (37.9%) se obtuvo
con la mezcla de fármacos 5-Fluoracilo/Ácido Folínico/Oxaliplatino (5-FU/FA/OXA)
con la dosis más elevada (5000:5:1000µM) cuando se combina con la transfección
continua del gen E respecto al uso aislado del fármaco a dicha concentración. A
diferencia de los casos anteriores, la disminución de la proliferación obtenida con
dosis menores de este agente, ya fuera con una sola transfección o varias de gen
E, fue significativamente menor que la citada. Sin embargo, la inhibición de la
proliferación al usar dicha mezcla de fármacos a la dosis 5000:5:10µM (33.5%) fue
similar a los resultados obtenidos a dosis 5000:5:0.5µM (32%) y 500:5:1000µM
(33%) a los 7 días en comparación con el uso respectivo de sus concentraciones
de forma aislada y con la transfección continua.
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
La expresión del gen E en esferoides de MCF-7 en combinación con
fármacos modifica el patrón de proliferación.
Para determinar si el potencial terapéutico de E se mantenía en un
sistema experimental más cercano a la actuación en un tumor, se realizaron
experiencias de terapia combinada utilizando esferoides multicelulares (MTS) que
se generaron tal y como se describe en material y métodos.
Estas experiencias han demostrado en otros tumores e incluso en
estos en los que nosotros trabajamos su utilidad, ya que permiten remedar de una
forma más real la situación en la que un tumor se desarrolla dentro de un tejido.
Recientes experiencias en este sentido, y en los tumores objeto de nuestro
estudio, son las experiencias de Prados y cols., 2008, en esferoides de la línea A549, en los que se la transfección del gen suicida Gef disminuye el volumen de
crecimiento del esferoide un 35.2% a las 96h.
Para realizar esta experiencia se seleccionó como sistema celular la
línea MCF-7 por su facilidad para formar esferoides.
Al igual que ocurrió con la línea MCF-7 cultivada en monocapa, la
determinación de la proliferación fue dependiente del tiempo de transfección y de
la cantidad de vector transfectado, corroborándose que la expresión del gen E
inhibe dicha proliferación fundamentalmente a partir del quinto día y que la
inhibición es mayor cuando los procesos de transfección se repiten en el tiempo.
El tratamiento combinado gen E y droga consiguió un aumento
significativo en cuanto a la reducción del volumen de los esferocitos de MCF-7.
Dicha disminución se situó a los 7 días próxima al 26.2%, cuando se transfectó de
forma continua en combinación con la dosis de taxol 10nM, respecto al uso solo de
taxol a esa misma dosis.
La disminución del volumen fue muy similar en el caso de la dosis 1nM,
25%, y algo más baja, 22.7%, con la dosis 0.1nM, referidos ambos a los 7 días
cuando se transfecta de forma continua en comparación con el uso aislado del
fármaco a su respectiva dosis. Esta semejanza indica la posibilidad de asociación
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
de terapia génica con E con la reducción de la dosis de fármaco obteniendo
resultados similares.
Resultados muy similares se obtuvieron al usar Docetaxol. Así, a los 7 días
de tratamiento combinado usando el fármaco a una concentración de 10nM, la
disminución del volumen del esferoide aumentó un 25.3% respecto al tratamiento
sólo con docetaxol 10nM. Por otra parte, a las dosis 1nM y 0.1nM, se consiguió
una reducción de volumen muy similar (25% y 22.2% respectivamente). Ésto
apoya la idea de la posible reducción del la dosis de fármaco en este tipo de tumor.
Al igual que en el cultivo en monocapa, la Doxorrubicina es el
fármaco que presenta una mayor disminución del volumen del esferoide,
observándose el dato más relevante a los 7 días de tratamiento con Doxorrubicina
10nM cuando transfectamos de forma continua (30.7%) respecto a la disminución
de volumen cuando se usa sólo doxorrubicina a la misma dosis. La disminución del
volumen del esferoide, nuevamente referido a los 7 días de tratamiento
transfectándose de forma continua y respecto al uso solo del fármaco a la dosis
1nM, es similar, 28%, a la dosis más alta. Corroborándose la posibilidad de
obtener similares resultados reduciendo la dosis del fármaco en combinación con
el gen E.
Estos resultados indican que el tratamiento fue eficaz en un sistema que
remeda al tejido tumoral ya que mantiene las interconexiones celulares.
Comparación entre el cultivo celular en monocapa y en esferoides de la
línea MCF7 de cáncer de mama.
Se pretende valorar la eficacia de la terapia combinada en sistemas
celulares de crecimiento tridimensional, que por sus características se asemejan al
tejido tumoral, y compararlos con los sistemas celulares de crecimiento monocapa.
Cuando transfectamos el gen E en el cultivo monocapa, la inhibición de la
proliferación máxima es de 30%, muy superior a la del esferoide, cuyo máximo fue
22%.
Los experimentos con modelos tridimensionales, como los esferoides,
proporcionan una mejor aproximación de los tumores sólidos in vivo, siendo
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
normalmente utilizados para estudios de resistencia multicelular. Ejemplo son los
estudios de L'Espérance y cols., 2008, en los que demuestran la resistencia a
citoplatino, paclitaxel y docetaxol que presentan los esferoides de 6 líneas de
cáncer de ovario respecto a su cultivo en monocapa. Con el uso de los fármacos,
la diferencia en la inhibición de la proliferación celular presenta una media de
12.1% superior en el cultivo monocapa que en el esferoide. Cuando el fármaco es
combinado con una única transfección, dicha diferencia presenta una media de
15.4% superior en cultivo monocapa, y de 13.1% combinado con la transfección
continua. En los tres casos, la máxima diferencia es con el uso de Docetaxol
0.1nM con una única transfección.
De dichos resultados se desprende que quizás ese aumento en la
diferencia de inhibición de proliferación de la línea MCF7 en cultivo laminar en
comparación con la del esferoide con el uso de terapia combinada se deba a las
dificultades que presenta transfectar el plásmido en la estructura tridimensional,
pues conforme penetramos hacia el interior del esferoide, la eficacia de
transfección disminuye, y nos encontramos con células en condiciones de hipoxia
o necróticas en las que el gen no tendría acción. Se comprueba también que el
aumento de transfecciones disminuye la diferencia entre el cultivo laminar y el
esferoide, corroborándose que la acción del gen E incrementa con el número de
transfecciones.
La expresión del gen E en MCF-7, A-549 y T-84 en combinación con
fármacos reduce las concentraciones efectivas de agentes citotóxicos.
Como indican los resultados de estudio de la proliferación, se puede reducir
la dosis de fármaco combinándola con la transfección de E obteniéndose
resultados similares a los de dosis superiores.
En la línea MCF7 de cáncer de mama, la Doxorrubicina es el fármaco que
presenta una mayor acción inhibiendo la proliferación y en combinación con el gen
E. A la dosis más elevada, 10nM, dicha inhibición es de 52%, ampliamente
superada por la dosis 0.1nM combinada con la transfección continua de E, 63.4%.
De esta forma podríamos obtener una mayor inhibición de la proliferación y
reduciríamos la dosis 100 veces.
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
En la línea A-549 la inhibición de la proliferación con el uso de Taxol
100µM, fármaco con mayor acción en esta línea, se puede igualar reduciendo la
dosis a la mitad, 50µM, al combinarlo con el la transfección continua del gen E,
84.6% y 84.4% respectivamente.
En la línea T-84 es donde mayor se refleja los efectos de la combinación de
los fármacos con el gen E para reducir la dosis de los fármacos. La máxima
inhibición de la proliferación es con el tratamiento de 5-Fluoracilo/ Ácido
Fólico/Oxaliplatino. El uso de la dosis 5000:5:0.5µM y 5:5:1000µM en combinación
con la transfección continua de E fue muy similar, 63.6% y 64% respectivamente.
Ambas superiores a la inhibición de la proliferación, 54%, de la dosis más elevada,
5000:5:1000µM, lo que nos permite obtener mejores resultados disminuyendo la
dosis de los fármacos Oxaliplatino o 5-Fluoracilo.
Comparación del gen E y el gen suicida Gef.
Por otra parte, para poder comparar los efectos del gen E con otros
genes suicidas, hemos realizado estudios similares con el gen Gef. Las
experiencias realizadas intentan determinar la diferencia entre el mecanismo y la
acción de ambos genes, su diferente eficacia ante diferentes tipos de tumores y lo
más importante, su diferente comportamiento cuando son asociados a diferentes
agentes para el tratamiento de diferentes patologías.
En cuanto a su mecanismo de acción se han realizado estudios de
las modificaciones morfológicas que ambos producen. Así, pudimos observar que
al microcopio óptico los cambios inducidos por Gef fueron muy similares en esta
línea a los causados por E (ver previamente Figura 30). Sin embargo, los análisis a
microscopia electrónica demostraron diferencias significativas. Así, los estudios
mediante microscopio de barrido determinaron que Gef inducía alteraciones en la
membrana celular de A-549 que no fueron observados con el gen E. Las células
transfectadas con Gef perdieron la presencia de microvellosidades presentando
una membrana lisa, lo que no ocurrió en las transfectadas con E. Sin embargo, los
estudios mediante microscopio de transmisión demostraron que el número y las
alteraciones de las mitocondrias en las células transfectadas con E fueron mayores
que en las transfectadas con Gef, de forma que en las primeras la
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
desestructuración de las crestas y la destrucción de las organelas fue mayor
(Figura 31).
Las diferencias entre ambos genes son reflejadas en los estudios de
proliferación, observándose un aumento de la inhibición de la proliferación de un
2.2% del gen Gef respecto a E (Figura 32). Además, al igual que en la terapia
combinada con E, la transfección continua del gen Gef en combinación con los
fármacos aumenta la inhibición de la proliferación con respecto al uso aislado del
fármaco solo. Ésto puede observarse en la Figura 33, donde al combinar Gef con
Taxol 10nM, aumentándose la inhibición de la proliferación respecto al tratamiento
solo de Taxol 10 nM en un 30%.
Por otra parte, la terapia combinada de Gef con Docetaxol 10nM
aumenta la inhibición de la proliferación respecto al uso aislado de Docetaxol a la
misma concentración en un 29%, muy similar a la inhibición, 27%, que produce la
transfección continua de Gef combinada con Docetaxol 1nM respecto al fármaco al
administrase de forma aislada.
Otra semejanza con el gen E es que la mayor inhibición de la
proliferación también la encontramos cuando transfectamos el gen Gef de forma
continua en combinación con Doxorrubicina. Esta inhibición es de 37% cuando Gef
se combina con Doxorrubicina 10nM, y alcanza valores de 30% al disminuir la
dosis a 1 y 0.1nM (Figura 33). Estos datos apoyan la hipótesis de que la
transfección de los genes E y Gef puede adyuvar al tratamiento con citotóxicos
permitiendo una reducción notable de las dosis de fármaco a aplicar para alcanzar
un efecto antitumoral efectivo en este tipo de tumor.
En relación a la reducción de las dosis efectivas de los fármacos, Gef
y E se asemejan presentando una mayor inhibición de la proliferación al
combinarse con Doxorrubicina. Al transfectar Gef de forma continua en
combinación con Doxorrubicina 0.1nM se obtiene una inhibición de la proliferación
de 53%, superior a la inhibición que produce el uso aislado de Doxorrubicina
10nM, 42% (Figura 34).
Con el uso de los otros fármacos la inhibición es algo menor.
Podemos observar en la Figura 34 una inhibición de la proliferación de 43.5% en
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
terapia combinada de Gef con Docetaxol 0.1nM y de 46% combinado Gef con
Taxol 0.1nM, ambos superiores a la inhibición que produce únicamente el uso
respectivo de los fármacos a dosis 10nM (37% y 38% respectivamente). Como
podemos observar, el efecto de Gef inhibe la proliferación aproximadamente un
5%, respecto al fármaco, y un 3%, respecto al control, más que el gen E.
Nuestro trabajo se enmarca dentro de las vías de investigación
abiertas para hacer avanzar la terapia génica como una herramienta eficaz y útil en
el tratamiento del cáncer. Una de las mayores críticas realizadas contra la
utilización clínica de técnicas de terapia genética es que los protocolos se han
usado sin rigor científico suficiente por la premura para obtener resultados y sin la
aplicación de conocimientos básicos sólidos acerca de la respuesta del organismo
humano a tratamientos de eficacia contrastada a nivel pre-clínico, en modelos
animales. Somos de la opinión de que no se puede rechazar todo lo alcanzado en
este campo, los experimentos realizados a nivel molecular y celular o en modelos
animales, la investigación básica que se ha llevado a cabo, el esfuerzo por el
desarrollo de nuevos vectores y nuevos genes más eficaces, por el hecho de que
los resultados finales, y nos referimos a los clínicos, no son todo lo satisfactorios
que se esperaba. Si la aplicación al organismo humano se realizó sin la
información suficiente, serán necesarias más experiencias que aporten información
más relevante.
Según la N.I.H. son necesarios más esfuerzos para comprender los
mecanismos moleculares del cáncer y desarrollar o mejorar técnicas de
transferencia de genes. El objetivo es probablemente cambiar su rumbo,
sugiriendo áreas que necesitan desarrollo y directrices para la definición y
consecución de objetivos a medio y largo plazo replanteando expectativas futuras
tanto de la comunidad científica como de la población en general. En concreto, la
investigación debe centrarse en modificar los vectores de origen viral para reducir
su toxicidad e inmunogenicidad, aumentar la eficiencia de los vectores de origen
no vírico para la transferencia genética, incrementar la especificidad de los
vectores por las células o tejidos diana, controlar los niveles y la duración de la
expresión de los genes en las células diana una vez transferidos y mejorar los
genes terapéuticos. Mientras tanto, la mejor opción para el avance de la terapia
genética del cáncer es la puesta en marcha de protocolos clínicos en que se
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Ana Rosa Rama Ballesteros
Discusión
combinen aspectos de terapia genética suficientemente contrastados a nivel preclínico con otras modalidades de tratamiento contra el cáncer. Existen datos que
apoyan el uso de protocolos de terapia genética combinada. Así, se ha
demostrado un claro sinergismo combinando la terapia basada en la transferencia
del gen supresor de tumores p53 y el cisplatino (CDDP) en el tratamiento de
tumores humanos de pulmón implantados en ratones desnudos, o la terapia
basada en la combinación de la transferencia de los genes HSV-tk o CD con la
radiación, en el control de varios tipos de tumores humanos en estadíos de
malignidad avanzados. La aplicación de este tipo de combinaciones de terapia
genética y otras modalidades terapéuticas podría, cuando menos, proporcionar
datos importantes sobre la respuesta del organismo humano al tratamiento, y si
"como se mencionó anteriormente" se aplicase a muestras de pacientes escogidos
utilizando criterios más adecuados que los seguidos hasta la actualidad, podrían
resultar, en efectos curativos, mucho más significativos que los obtenidos mediante
la aplicación de protocolos basados exclusivamente en técnicas de terapia
genética, sin combinarlas con otros tratamientos.
El objetivo de nuestra investigación ha tenido como referencia este contexto
ya que hemos estudiado un nuevo sistema de “gen suicida”, el gen E, de origen
procariota, que actúa induciendo apoptosis mediante lesión mitocondrial en las
células eucariotas transfectadas. Y hemos testado su posible utilización asociado a
agentes citotóxicos de uso habitual en el tratamiento de cáncer de mama, pulmón
y colon. Concluimos, destacando la gran importancia de estos nuevos sistemas
asesino-suicidas basados en genes procariotas en el tratamiento contra el cáncer
por ser potencialmente lesivos para las células tumorales. Nuestros resultados
abren una nueva vía de investigación y tratamiento sobre las posibilidades que E
puede tener como terapia selectiva y en combinación con fármacos de este tipo de
enfermedades. Serán los próximos estudios en el campo de la experimentación
animal y la fase de experimentación clínica sobre pacientes con determinados
tipos de cáncer, las que definitivamente determinarán las posibilidades de esta
nueva vía terapéutica.
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VI.CONCLUSIONS
Ana Rosa Rama Ballesteros
Conclusions
1. The transfection of the gene E based on a vector of constituent
expression in MCF-7, A-549 and T-84 cellular lines inhibits the proliferation of the
same, so it has antitumor effect.
2. The inhibition of the cellular growth is dose-dependent and is greater with
a continuous transfection of the gene E. It is also continuous and it increases with
time, thus in the analyzed periods the greatest inhibition is in the longest period of
exposition (7 days).
3. The inhibition of the cellular proliferation is greater with the combined
transfection of the gene E-drug that just with drugs. However, the results depend as
much on the class of the analyzed tumour, as on the type of drugs used.
4. The greatest effect was observed in the combined treatment with 10 nM
Doxorubicin in MCF-7 cellular line.
5. The combined therapy has an inhibition of the proliferation with lower
doses that with greater dose same. That suggests a possibility to reduce the dose
of cytotoxic agents applied in the tumours.
6. The gene E therapy is effective in the experimental system based in
spheroid, at least in MCF-7.
7. The gen E action mechanism is not known, so the results obtained
suggest the mitochondrial lesion as a way of cellular death.
8. The difference with Gef gene is that gene E does not cause great
alterations in the cellular membrane, but its action is more intense in the
mitochondrial structure.
- 174 -
VII.BIBILOGRAFÍA
Agu CA, Klein R, Lengler J, Schilcher F, Gregor W, Peterbauer T, Blasi U,
Salmons B, Gunzburg WH and Hohenadl C. (2007) Bacteriophage-encoded toxins:
the lambda-holin protein causes caspase- independent non-apoptotic cell death
of eukaryotic cells. Cell Microbiol 9: 1753-1765.
Alberts DS, Martínez ME, Roe DJ, Guillén-Rodríguez JM, Marshall JR, van
Leeuwen JB, Reid ME, Ritenbaugh C, Vargas PA, Bhattacharyya AB, Earnest DL,
Sampliner RE. (2000) Lack of effect of a high-fiber cereal supplement on the
recurrence of colorectal adenomas. Phoenix Colon Cancer Prevention Physician´s
Network. N Engl J Med; 342: 1156-62.
Andriani F, Perego P, Carenini N, Sozzi G, Roz L. (2006) Increased
sensitivity to cisplatin in non-small cell lung cancer cell lines after FHIT gene
transfer. Neoplasia; 8(1):9-17.
Aoki K, Taketo MM. (2007) Adenomatous polyposis coli (APC): a multifunctional tumor suppressor gene. J Cell Sci; 120(Pt 19):3327-35.
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Arango D, Corner GA, Wadler S, Catalano PJ, Augenlicht LH. (2001) cmyc/p53 interaction determines sensitivity of human colon carcinoma cells to 5fluorouracil in vitro and in vivo. Cancer Res; 61(12):4910-5.
Aretz S, Uhlhaas S, Caspari R, Mangold E, Pagenstecher C, Propping P,
Friedl W. (2004) Frequency and parental origin of de novo APC mutations in
familial adenomatous polyposis. Eur J Hum Genet; 12(1):52-8.
Barajas M, Mazzolini G, Genove G, Bilbao R, Narvaiza I, Schmitz V. (2001)
Gene therapy of orthotopic hepatocellular carcinoma in rats using adenovirus
coding for interleukin 12. Hepatology; 33: 52-61.
Bergstrom A, Pisani P, Tenet V, Wolk A, Adami HO. (2001) Overweight as
an avoidable cause of cancer in Europe. Int J Cancer; 91: 421-30.
Bernhardt TG, Roof WD, Young R. (2000) Genetic evidence that the
bacteriophage phi X174 lysis protein inhibits cell wall synthesis. Proc Natl Acad
Sci USA; 97:4297-4302.
Bernhardt TG, Struck DK, Young R. (2001) The lysis protein E of phi X174
is a specific inhibitor of the MraY-catalyzed step in peptidoglycan synthesis. J Biol
Chem; 2;276(9):6093-7.
Berrino F, Krogh V, Riboli E. (2003) Epidemiology studies on diet and
cancer. Tumori; 89: 581-5.
Blanke SR. (2005) Micromanaging the executioner: pathogen targeting of
mitochondria. Trends Microbiol;13:64–71.
Bläsi U, Lubitz W. (1985) J Gen Virol; 66:1209–1213.
Boulaiz H, Prados J, Marchal JA, Melguizo C, Concha A, Carrillo E, Vélez
C, Martínez A, Aránega A. (2005) Modulation of Ki-67 expression and
morphological changes induced by gef gene in MCF-7 human breast cancer cells.
Cell Mol Biol (Noisy-le-grand); 51(1):87-92.
Buckley K J, Hayashi M. (1986) Mol Gen Genet; 204:120–125.
- 178 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Burdelya LG, Komarova EA, Hill JE, Browder T, Tararova ND, Mavrakis L,
DiCorleto PE, Folkman J, Gudkov AV. (2006) Inhibition of p53 response in tumor
stroma improves efficacy of anticancer treatment by increasing antiangiogenic
effects of chemotherapy and radiotherapy in mice. Cancer Res; 66(19):9356-61.
Burgués JP, Pontones JL, Vera CD, Jiménez JF, Moragues O. (2005)
Mecanismos del ciclo celular y la apoptosis implicados en las resistencias a los
fármacos de uso intravesical en el cáncer superficial de vejiga. Actas Urol Esp; 29
(9): 846-859.
Bushman F, Lewinski M, Ciuffi A, Barr S, Leipzig J, et al. (2005) Genomewide analysis of retroviral DNA integration. Nat Rev Microbiol; 3:848–858.
Butt AJ, Sergio CM, Inman CK, Anderson LR, McNeil CM, Russell AJ,
Nousch M, Preiss T, Biankin AV, Sutherland RL, Musgrove EA. (2008) The
estrogen and c-Myc target gene HSPC111 is over-expressed in breast cancer and
associated with poor patient outcome. Breast Cancer Res; 10(2):R28.
Casey RC, Burleson KM, Skubitz KM, Pambuccian SE, Oegema TR Jr, Ruff
LE, Skubitz AP (2001) Beta1-integrins regulate formation and adhesion ovarian
carcinoma multicellular spheroids. Am J Pathol; 159:2071-2080.
Casimiro C. (2002) Factores etiopatogénicos en el cáncer colorrectal.
Aspectos genéticos y clínicos. Nutr. Hosp; XVII (2) 63-71.
Cayuela A, Rodríguez-Domínguez S, Otero R. (2006) Evolución de la
mortalidad por cáncer de pulmón en las provincias de Andalucía (1975-2002). Arch
Bronconeumol; 42:633-7.
Cho E, Smith-Warner SA, Ritz J, Van den Brandt PA, Colditz GA, Folsom
AR. (2004) Alcohol intake and colorectal cancer: A pooled analysis of 8 cohort
studies. Ann Intern Med; 140: 603-13.
Choi KS, Lee TH, Jung MH. (2003) Ribozyme-mediated cleavage of the
human survivin mRNA and inhibition of antiapoptotic function of survivin in MCF-7
cells. Cancer Gene Ther; 10(2):87-95.
- 179 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Cipollini G, Tommasi S, Paradiso A, Aretini P, Bonatti F, Brunetti I, Bruno M,
Lombardi G, Schittulli F, Sensi E, Tancredi M, Bevilacqua G, Caligo MA (2004)
Genetic alterations in hereditary breast cancer. Ann Oncol; 1:I7-I13.
Connelly-Frost A, Poole C, Satia JA, Kupper LL, Millikan RC, Sandler RS.
(2006) Selenium, apoptosis, and colorectal adenomas. Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev; 15(3):486-93.
Cote ML, Wenzlaff AS, Bock CH, Land SJ, Santer SK, Schwartz DR,
Schwartz AG. (2007) Combinations of cytochrome P-450 genotypes and risk of
early-onset lung cancer in Caucasians and African Americans: a population-based
study. Lung Cancer; 55(3):255-62.
Dachs GU, Tupper J and Tozer GM: From bench to bedside for genedirected enzyme prodrug therapy of cancer. Anticancer Drugs; 16: 349-359, 2005.
Dasgupta P, Kinkade R, Joshi B, Decook C, Haura E, Chellappan S. (2006)
Nicotine inhibits apoptosis induced by chemotherapeutic drugs by up-regulating
XIAP and survivin. Proc Natl Acad Sci U S A; 103(16):6332-7.
de Cos Escuín JS, Delgado IU, Rodríguez JC, López MJ, Vicente CD,
Miranda JA. (2007) Stage IIIA and IIIB non-small cell lung cancer: results of
chemotherapy combined with radiation therapy and analysis of prognostic factors.
Arch Bronconeumol; 43(7):358-65.
de Las Casas MP, Fernández Infante B.. (2005) Carcinoma de pulmón de
origen laboral. An Sist Sanit Navar; 28 Suppl 1:101-6.
de Maagd RA, Bravo A, Berry C, Crickmore N, Schnepf HE. (2003)
Structure,
diversity,
and
evolution
of
protein
toxins
from
spore-forming
entomopathogenic bacteria. Annu Rev Genet; 37:409-33.
Desoize B, Jardillier JC (2000) Multicellular resistance: a paradigm for
clinical resistance? Crit Rev Oncol Hematol; 36:193-207.
- 180 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Dulak J, Zagorska A, Wegiel B, Loboda A, Jozkowicz A. (2006) New
strategies for cardiovascular gene therapy: regulatable pre-emptive expression of
pro-angiogenic and antioxidant genes. Cell Biochem Biophys. 44(1):31-42.
Durand RE, Sham E. (1998) The lifetime of hypoxic human tumor cells. Int J
Radiat Oncol Biol Phys; 42(4):711-5.
Earp HS 3rd, Calvo BF, Sartor CI. (2003) The EGF receptor family--multiple
roles in proliferation, differentiation, and neoplasia with an emphasis on HER4.
Trans Am Clin Climatol Assoc; 114:315-33.
Eguchi M, Yamaguchi S. (2007) Double transfection in primary dissociated
neurons. J Biosci Bioeng; 103(5):497-9.
Eifel P, Axelson JA, Costa J, Crowley J, Curran WJ Jr, Deshler A, Fulton S,
Hendricks CB, Kemeny M, Kornblith AB, Louis TA, Markman M, Mayer R, Roter D.
(2001) National Institutes of Health Consensus Development Conference
Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J Natl Cancer Inst; 93: 979-89.
El Demellawy D, Khalifa MA, Ismiil N, Wong S, Ghorab Z. (2007) Primary
colorectal small cell carcinoma: A clinicopathological and immunohistochemical
study of 10 cases. Diagn Pathol; 2:35.
El-Bolkainy TN, Sakr MA, Nouh AA, El-Din NH. (2006) A comparative study
of rectal and colonic carcinoma: demographic, pathologic and TNM staging
analysis. J Egypt Natl Canc Inst; 18(3):258-63.
Emelyanov VV. (2003) Mitochondrial connection to the origin of the
eukaryotic cell. Eur J Biochem; 1599-1618.
Emi M, Kim R, Tanabe K, Uchida Y, Toge T. (2005) Targeted therapy
against Bcl-2-related proteins in breast cancer cells. Breast Cancer Res;
7(6):R940-52.
Engelman A, Cherepanov P. (2008) The lentiviral integrase binding protein
LEDGF/p75 and HIV-1 replication. PLoS Pathog; 4(3):e1000046.
- 181 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Eubank WB, Mankoff DA, Vesselle HJ, Eary JF, Schubert EK, Dunnwald
LK, Lindsley SK, Gralow JR, Austin-Seymour MM, Ellis GK, Livingston RB (2002).
Detection of locoregional and distant recurrences in breast cancer patients by using
FDG PET. Radiographics; 22(1):5-17.
Ferlay J, Autier P, Boniol M, Heanue M, Colombet M, Boyle P. (2007).
Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2006. Ann Oncol;
18:581-92.
Fink SL, Cookson BT. (2005) Apoptosis, pyroptosis, and necrosis:
mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun;
73:1907–1916.
Fiorentini C, Falzano L, Travaglione S, Fabbri A. (2003) Hijacking Rho
GTPases by protein toxins and apoptosis: molecular strategies of pathogenic
bacteria. Cell Death Differ; 10:147–152.
Fischel JL, Etienne MC, Formento P, Milano G. (1998) Search for the
optimal schedule for the oxaliplatin/5-fluorouracil association modulated or not by
folinic acid: preclinical data. Clin Cancer Res; 4(10):2529-35.
Fisher B, Anderson S, Bryant J. (2002) Twenty-year follow-up of a
randomized trial comparing total mastectomy, lumpectomy, and lumpectomy plus
irradiation for the treatment of invasive breast cancer. N Engl J Med; 347 (16):
1233-41.
Fisher B, Dignam J, Bryant J. (2001) Five versus more than five years of
tamoxifen for lymph node-negative breast cancer: updated findings from the
National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B-14 randomized trial. J Natl
Cancer Inst; 93 (9): 684-90
Frankel A, Man S, Elliott P, Adams J, Kerbel RS (2000) Lack of multicellular
drug resistance observed in human ovarian and prostate carcinoma treated with
the proteasome inhibitor PS-341. Clin Cancer Res; 6: 3719-3728.
Gallardo JC, Espinosa M, Meléndez J, Maldonado V. (2006) Esferoides
tumorales
multicelulares
en
la
evaluación
- 182 -
de
estrategias
terapéuticas
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
anticancerosas. Índice anual de la revista de educación Bioquímica (REB); 25(4):
101-107.
Ganten TM, Koschny R, Sykora J, Schulze-Bergkamen H, Büchler P, Haas
TL, Schader MB, Untergasser A, Stremmel W, Walczak H. (2006) Preclinical
differentiation between apparently safe and potentially hepatotoxic applications of
TRAIL either alone or in combination with chemotherapeutic drugs. Clin Cancer
Res. 12(8):2640-6.
García-Granero E. (2006) El factor cirujano y la calidad de la cirugía en el
pronóstico del cáncer de recto. Implicaciones en la especialización y organización.
Cir Esp; 79:75-7.
Ghosh S, Spagnoli GC, Martin I, Ploegert S, Demougin P, Heberer M.
(2005). Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene
expression profile: a high density oligonucleotide array study. J Cell Physiol;
204:522-531
Glasgow JN, Everts M, Curiel DT. (2006) Transductional targeting of
adenovirus vectors for gene therapy. Cancer Gene Ther. 13(9):830-44.
Glück S. (2005) Adjuvant chemotherapy fo early breast cancer: optimal use
of epirubicin. Oncologist;10(10):780-91.
Gómez Pérez L, Oliva Delgado FJ, Vera Donoso CD, Jimenez Cruz JF,
Herádndez Andreu JM. (2007) Gene therapy: is possible a vaccine for prostate
cancer? Actas Urol Esp; 31(7):705-13.
Green SK, Francia G, Isidoro C, Kerbel RS. (2004) Antiadhesive antibodies
targeting E-cadherin sensitize multicellular tumor spheroids to chemotherapy in
vitro. Mol Cancer Ther; 3:149-159.
Gregorevic P, Blankinship MJ, Allen JM, Crawford RW, Meuse L, Miller DG,
Russell DW, Chamberlain JS. (2004) Systemic delivery of genes to striated
muscles using adeno-associated viral vectors. Nat Med;10(8):782-3.
- 183 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Gruchala M, Roy H, Bhardwaj S, Yla-Herttuala S. (2004) Gene therapy for
cardiovascular diseases. Curr Pharm Des; 10:407–423.
Guo M, Jin S, Sun D, Hew CL, Pan SQ (2007) Recruitment of conjugative
DNA transfer substrate to Agrobacterium type IV secretion apparatus. Proc Natl
Acad Sci U S A; 104(50):20019-24.
Hackett CS, Geurts AM, Hackett PB. (2007) Predicting preferential DNA
vector insertion sites: implications for functional genomics and gene therapy.
Genome Biol; 8 Suppl 1:S12.
Haider HK, Elmadbouh I, Jean-Baptiste M, Ashraf MMol Med. (2008)
Nonviral vector gene modification of stem cells for myocardial repair. Mol Med;
14(1-2):79-86.
Haidinger W, Szostak MP, Jechlinger W, Lubitz W. (2003) Online monitoring
of Escherichia coli ghost production. Appl Environ Microbiol; 69(1):468-74.
Han TK, Dao ML (2007). Enhancement of salivary IgA response to a DNA
vaccine against Streptococcus mutans wall-associated protein A in mice by
plasmid-based adjuvants. J Med Microbiol; 56(Pt 5):675-80.
Harlozinska A. (2005) Progress in molecular mechanisms of tumor
metastasis and and angiogenesis. Anticancer Res; 25(5):3327-33.
Harrington K, Spitzweg A, Bateman J, Morris J, Vile R. (2001) Gene therapy
for prostate cancer: current status and future prospects. J Urol; 166(4):1220-1223.
Hernández IS, Alonso JL, Sánchez CA. (2006) Epidemiology of lung cancer
in Spain and forecast for the future; Arch Bronconeumol; 42(11):594-9.
Hinton CV, Avraham S, Avraham HK. (2008) Contributions of IntegrinLinked Kinase to Breast Cancer Metastasis and Tumorigenesis. J Cell Mol Med.
En Prensa.
Hirabayashi M. (2008) Technical development for production of genemodified laboratory rats. J Reprod Dev; 54(2):95-9.
- 184 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Hu WX, Zeng ZJ, Luo SQ, Chen Q. (2004) Suicide gene therapy of human
breast cancer in SCID mice model by the regulation of Tet-On. Chin Med J (Engl);
117(3):434-9.
Huang H, Groth J, Sossey-Alaoui K, Hawthorn L, Beall S, Geradts J. (2005)
Aberrant expression of novel and previously described cell membrane markers in
human breast cancer cell lines and tumors. Clin Cancer Res; 11(12):4357-64.
Huang Z. (2000) Bcl-2 family proteins as targets for anticancer drug design.
Oncogene; 19:6627–6631.
Huston JS, George AJ. (2001) Engineered antibodies take center stage.
Hum. Antibodies; 10, 127 –142
Jemal A, Siegel R, Ward E, Murray T, Xu J, Smigal C, Thun MJ.. (2006)
Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin; 56:106-30.
Jhabvala-Romero F, Evansm A, Guom S, Dentonm M, Clintonm GM. (2003)
Herstatin inhibits heregulin mediated breast cancer cell growth and overcomes
tamoxifen resistance in breast cancer cells that overexpress HER-2. Oncogene;
22:8178–86.
Katayama K, Yoshioka S, Tsukahara S, Mitsuhashi J, Sugimoto Y. (2007)
Inhibition of the mitogen-activated protein kinase pathway results in the downregulation of P-glycoprotein. Mol Cancer Ther; 6(7):2092-102.
Kawano K, Kantak SS, Murai M, Yao CC, Kramer RH. (2001) Integrin 3ß1
engagement disrupts intercellular adhesion. Exp Cell Res; 262:180-196.
Khalighinejad N, Hariri H, Behnamfar O, Yousefi A, Momeni A. (2008)
Adenoviral gene therapy in gastric cancer: a review. World J Gastroenterol;
14(2):180-4.
Kim CH, Yoo JS, Lee CT, Kim YW, Han SK, Shim YS, Yoo CG. (2006) FHIT
protein enhances paclitaxel-induced apoptosis in lung cancer cells. Int J Cancer;
118(7):1692-8.
- 185 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Kim K, Wilson SM, Abayasiriwardana, et al (2005) A novel in vitro model of
human mesothelioma for studying tumor biology and apoptotic resistance. Am J
Resp Cell Mol Biol; 33:541-548.
Kim R, Tanabe K, Uchida Y, Emi M, Inoue H, Toge T. (2002) Current status
of the molecular mechanisms of anticancer drug-induced apoptosis. The
contribution of molecular-level analysis to cancer chemotherapy. Cancer
Chemother Pharmacol; 50:343–352.
Köchling J, König-Merediz SA, Stripecke R, Buchwald D, Korte A, Von
Einsiedel HG, Sack F, Henze G, Seeger K, Wittig B, Schmidt M. (2003) Protection
of mice against Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia by
cell-based vaccination using nonviral, minimalistic expression vectors and
immunomodulatory oligonucleotides. Clin Cancer Res. 9(8):3142-9.
Kong H, Huang ZH, Li Q, Yang LC, Yu JL, Li Z (2008). Adenovirus-mediated
double suicide gene selectively kills breast cancer MCF-7 cells in vitro. Nan Fang
Yi Ke Da Xue Xue Bao; 28(6):907-10.
Lada PE, Taborda B, Martín JT, Rosso F, Gramática L, Alecha J, Echenique
M. (2007) Carcinoma adenoescamoso y epidermoide de la vesícula biliar. Cirugía
Española; 81:4
Laitala-Leinonen T. (2005) Unsatisfactory gene transfer into bone-resorbing
osteoclasts with liposomal transfection systems. J Negat Results Biomed; 4:5.
Larsen JE, Colosimo ML, Yang IA, Bowman R, Zimmerman PV, Fong KM.
(2005) Risk of non-small cell lung cancer and the cytochrome P4501A1 Ile462Val
polymorphism. Cancer Causes Control; 16:579–585.
Lechardeur D, Lukacs GL. (2002)Intracellular barriers to non-viral gene
transfer. Curr Gene Ther; 2:183–194.
Lee A, Park WC, Yim HW, Lee MA, Park G, Lee KY. (2007) Expression of cerbB2, cyclin D1 and estrogen receptor and their clinical implications in invasive
ductal carcinoma of the breast. Jpn J Clin Oncol;37(9):708-14.
- 186 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Levi F, Lucchini F, Negri E, La Vecchia C. (2007) Continuing declines in
cancer mortality in the European Union. Ann Oncol; 18:593-5.
Liu HF, Teng XC, Zheng JC, Chen G, Wang XW. (2008) Effect of NHE1
antisense gene transfection on the biological behavior of SGC-7901 human gastric
carcinoma cells. World J Gastroenterol; 14(14):2162-2167.
Liu L, Chavan R, Feinberg MB. (2008) Dendritic cells are preferentially
targeted among hematolymphocytes by Modified Vaccinia Virus Ankara and play a
key role in the induction of virus-specific T cell responses in vivo. BMC Immunol.
15;9:15.
Lledó S, Alfonso R, Aliño SF. (2005) Antisense gene therapy using anti-kras and antitelomerase oligonucleotides in colorectal cancer. Rev Esp Enferm Dig;
97(7):472-80.
López-Abente G, Pollán M, Aragonés N, Pérez-Gomez B. (2003) Informe
sobre la salud de los españoles. Cáncer. Centro Nacional de Epidemiología.
Instituto de Salud Carlos III.
Lubitz W, Harkness R E, Ishiguro E E. (1984) Requirement for a functional
host cell autolytic enzyme system for lysis of Escherichia coli by bacteriophage phi
X174. J Bacterio; 159:385–387.
Lukacs GL, Haggie P, Seksek O, Lechardeur D, Freedman N, Verkman AS.
(2000) Size-dependent DNA mobility in cytoplasm and nucleus. J Biol Chem;
275:1625–1629.
Määttä AM, Tenhunen A, Pasanen T, Mariläisen O, Pellinen R, Mäkinen K,
Alhava E and Wahlfors. (2004) A: Non-small cell lung cancer as a target disease
for herpes simplex type 1 thymidine kinase-ganciclovir gene therapy. Int J Oncol;
24: 943-949
Malamou-Mitsi V, Gogas H, Dafni U, Bourli A, Fillipidis T, Sotiropoulou M,
Vlachodimitropoulos D, Papadopoulos S, Tzaida O, Kafiri G, Kyriakou V, Markaki
S, Papaspyrou I, Karagianni E, Pavlakis K, Toliou T, Scopa C, Papakostas P,
Bafaloukos D, Christodoulou C, Fountzilas G. (2006) Evaluation of the prognostic
- 187 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
and predictive value of p53 and Bcl-2 in breast cancer patients participating in a
randomized study with dose-dense sequential adjuvant chemotherapy. Ann Oncol;
17(10):1504-11.
Martinez ME. (2005) Primary prevention of colorectal cancer: Lifestyle,
nutrition, exercise. Recent Results Cancer Res; 166: 177-211.
Marzo Castillejo M. (2007) Prevention of breast cancer 2007. New
evidence? Aten Primaria; 39(3):115-7.
Marzo M, Alonso-Coello P, Farquhar C, Moreno-Iribas C, Thompson E.
Chemoprevention agents for the primary prevention of breast Cancer. Cochrane
Review. En prensa.
Masuda K, Teshima-Kondo S, Mukaijo M, Yamagishi N, Nishikawa Y,
Nishida K, Kawai T, Rokutan K. (2008) A novel tumor-promoting function residing in
the 5' non-coding region of vascular endothelial growth factor mRNA. PLoS Med;
5(5):e94.
Mazhar D, Waxman J. (2004) Gene therapy for prostate cancer. BJU
Internacional; 93(4):465-469.
Mazzolini G, Prieto J. (2001) Terapia génica de los tumores hepáticos.
Medicina (Buenos Aires); 61: 364-8.
Mendel S, Holbourn JM, Schouten JA, Bugg TD. (2006) Interaction of the
transmembrane domain of lysis protein E from bacteriophage phiX174 with
bacterial translocase MraY and peptidyl-prolyl isomerase SlyD. Microbiology;
152(Pt 10):2959-67.
Merck B, Cansado P, Fernández-Frías A, Rodríguez-Lescure A, Costa D,
Lacueva FJ, Candela F, Calpena R. (2005) Application of the EUSOMA criteria in
breast units in countries of the European Union. Cir Esp; 77(2):65-9.
Mikkers H, Berns A. (2003) Retroviral insertional mutagenesis: tagging
cancer pathways. Adv Cancer Res;88:53–99
- 188 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Miller DG, Trobridge GD, Petek LM, Jacobs MA, Kaul R, et al. (2005) Largescale analysis of adeno-associated virus vector integration sites in normal human
cells. J Virol; 79:11434–11442.
Minchinton AI, Tannock IF. (2006). Drug penetration in solid tumors. Nat
Rev Cancer; 6:583-592.
Miravet L, Peláez S, Paradís A, Arnal M, Cabadés F. (2001) Estudio
epidemiológico del cáncer de pulmón en el norte de la provincia de Castellón. Arch
Bronconeumol; 37:298-301.
Misra S, Ghatak S, Toole BP. (2005) Regulation of MDR1 expression and
drug resistance by a positive feedback loop involving hyaluronan, phosphoinositide
3-kinase, and ErbB2. J Biol Chem; 280(21):20310-5.
Monazzam A, Razifar P, Simonsson M, Qvarnström F, Josephsson R,
Blomqvist C, Långström B, Bergström M. (2006) Multicellular tumour spheroid as a
model for evaluation of [18F]FDG as biomarker for breast cancer treatment
monitoring. Cancer Cell Int; 23;6:6.
Moreno
C,
Ardanaz
E.
(2004)
Supervivencia
de
los
pacientes
diagnosticados de cáncer en Navarra entre 1985-94. Monografía 3. Gobierno de
Navarra (Departamento de Salud. Servicio de Docencia, Investigación y Desarrollo
Sanitario).
Narumi K, Kojima A, Crystal RG. (1998) Adenovirus vector-mediated
perforin expression driven by a glucocorticoid-inducible promoter inhibits tumor
growth in vivo. Am J Respir Cell Biol; 19: 936-941.
Navolanic PM, Steelman, LS, McCubrey JA. (2003) EGFR family signaling
and its association with breast cancer
development and resistance to
chemotherapy. Int. J. Oncol; 22, 237 –252.
Nishiyama Y, Goshima F. (2007) Oncolytic virotherapy using replicationcompetent herpes simplex viruses. Uirusu; 57(1):57-65.
- 189 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Norat T, Bingham S, Ferrari P, Slimani N, Jenab M, Mazuir M. (2005) Meat,
fish and colorectal cancer risk: The European Prospective Investigation into Cancer
and Nutrition. J Natl Cancer Inst; 97: 906-16.
Novak JF, Tronka F (2005) Proenzyme therapy of cancer. Anticancer Res;
25:1157-1177.
Ogino S, Brahmandam M, Cantor M, Namgyal C, Kawasaki T, Kirkner G,
Meyerhardt JA, Loda M, Fuchs CS. (2006) Distinct molecular features of colorectal
carcinoma with signet ring cell component and colorectal carcinoma with mucinous
component. Mod Pathol; 19(1):59-68.
Olayioye, Monilola A.;Neve, Richard M.;Lane, Heidi A.; Hynes, Nancy E.
(2000) The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development
and cancer. EMBO J; 19(13):3159–3167.
Olijslagers SJ, Zhang YH, Backendorf C, Noteborn MH. (2007) Additive
cytotoxic effect of apoptin and chemotherapeutic agents paclitaxel and etoposide
on human tumour cells. Basic Clin Pharmacol Toxicol; 100(2):127-31.
O'Reilly KM, Mclaughlin AM, Beckett WS, Sime PJ. (2007) Asbestos-related
lung disease. Am Fam Physician; 75(5):683-8.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D, Bergkvist L, Berrino F, Van den Brandt
PA. (2005) Dietary fiber intake and risk of colorectal cancer: A pooled analysis of
prospective cohort studies. JAM; 294: 2849-57.
Parkin DM. (2004) International variation. Oncogene; 23:6329–40.
Pedersen N, Pedersen MW, Lan MS, Breslin MB and Poulsen HS. (2006)
The insulinoma- associated 1: a novel promoter for targeted cancer gene
therapy for small-cell lung cancer. Cancer Gene Ther; 13: 375-384,
Pedraza-Fariña LG. (2006) Mechanisms of oncogenic cooperation in cancer
initiation and metastasis. Yale J Biol Med; 79(3-4):95-103.
- 190 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Perez EA, Geeraerts L, Suman VJ, Adjei AA, Baron AT, Hatfield AK, Maihle
N, Michalak JC, Kuross SA, Kugler JW, Lafky JM, Ingle JN. (2002) A randomized
phase II study of sequential docetaxel and doxorubicin/cyclophosphamide in
patients with metastatic breast cancer. Ann Oncol; 13(8):1225-35.
Perry MC. (2003) Chemotherapy Source Book. Lippincott, Williams and
Wilkins; 566–582.
Prados J, Melguizo C, Rama A, Ortiz R, Boulaiz H, Rodriguez-Serrano F,
Caba O, Rodriguez-Herva JJ, Ramos JL, Aranega A. (2008) Combined therapy
using suicide gef gene and paclitaxel enhances growth inhibition of multicellular
tumour spheroids of A-549 human lung cancer cells. Int J Oncol; 33(1):121-7.
Price SA, Dent C, Duran-Jimenez B, Liang Y, Zhang L, Rebar EJ, Case CC,
Gregory PD, Martin TJ, Spratt SK, Tomlinson DR. (2006) Gene transfer of an
engineered transcription factor promoting expression of VEGF-A protects against
experimental diabetic neuropathy. Diabetes; 55(6):1847-54.
Prieto J, Qian C, Sangro B, Melero I, Mazzolini G. (2004) Biologic therapy of
liver tumors. Surg Clin North Am; 84: 673-696.
Ramón y Cajal S, Sánchez Preito R. Capítulo 9: Terapia génica en
procesos tumorales. Unidad de Patología Molecular. Departamento de Anatomía
Patológica Clínica Puerta de Hierro. Madrid.
Rodríguez V, Tardon A, Kogevinas M, Prieto CS, Cueto A, García M. (2000)
Lung cancer risk in iron and steel foundry workers: a nested case control studyin
Asturias, Spain. Am J Ind Med; 38:644-50.
Ronchera-Oms CL, González Valls JM. (1998) Casos clínicos en
farmacoterapia (VIII): Dolor oncológico. El Farmacéutico; (213):103-108
Ross JS, Fletcher JA, Bloom KJ, Linette GP, Stec J, Symmans WF, Pusztai
L, Hortobagyi GN. (2004) Targeted therapy in breast cancer: the HER-2/neu gene
and protein. Mol Cell Proteomics; 3(4):379-98.
- 191 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Ruiz Castellanos M, Sangro B. (2005) Gene therapy: what is it and what is
its use? An Sist Sanit Navar;28(1):17-27
Ruiz Ramos M, Escolar Pujolar A, Hermosín Bono T. (2005) Mortality from
colorectal cancer in Andalusia: findings in favor of mass screening. Rev Esp
Enferm Dig; 97(2):104-14.
Ruoponen M, Honkakoski P, Tammi M, Urtti A. (2004) Cell-surface
glycosaminoglycans inhibit cation-mediated gene transfer. J Gene Med; 6:405–
414.
Sangro B, Mazzolini G, Ruiz J, Herraiz M, Quiroga J, Herrero I. (2004)
Phase I trial of intratumoral injection of an adenovirus encoding interleukin-12 for
advanced digestive tumors. J Clin Oncol; 22: 1389-1397.
Santos-Martínez MJ, Currull V, Blanco ML, Maciá F, Mojal S, Vila J,
Broquetas JM. (2005) Características del cáncer de pulmón en un hospital
universitario. Cambios epidemiológicos e histológicos en relación con una serie
histórica. Arch Bronconeumol; 41:307-12.
Schepelmann S, Ogilvie LM, Hedley D, Friedlos F, Martin J, Scanlon I, Chen
P, Marais R, Springer CJ. (2007) Suicide gene therapy of human colon carcinoma
xenografts using an armed oncolytic adenovirus expressing carboxypeptidase G2.
Cancer Res; 67(10):4949-55.
Scripture CD, Figg WD, Sparreboom A. (2005) Paclitaxel chemotherapy:
from empiricism to a mechanism-based formulation strategy. Ther Clin Risk
Manag; 1(2):107-14.
Sharpe CR, Siemiatycki J, Rachet B. (2002) Effects of alcohol consumption
on the risk of colorectal cancer among men, by anatomical subsite (Canada).
Cancer Causes Control; 13(5):483-91.
Shimada T, Nishimura Y, Nishiuma T, Rikitake Y, Hirase T, Yokoyama M.
(2007) Adenoviral transfer of rho family proteins to lung cancer cells ameliorates
cell proliferation and motility and increases apoptotic change. Kobe J Med Sci;
53(3):125-34.
- 192 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Silva JM, Silva J, Sanchez A, Garcia JM, Dominguez G, Provencio M,
Sanfrutos L, Jareño E, Colas A, España P, Bonilla F. (2002) Tumor DNA in plasma
at diagnosis of breast cancer patients is a valuable predictor of disease-free
survival. Clin Cancer Res; 8(12):3761-6.
Sin DD, Cohen SB, Day A, Coxson H, Paré PD. (2007) Understanding the
biological differences in susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease
between men and women. Proc Am Thorac Soc; 4(8):671-4.
Skalhegg BS, Tasken K. (2000) Specificity in the cAMP/PKA signaling
pathway. Differential expression,regulation, and subcellular localization of subunits
of PKA. Front. Biosci; 5:D678–D693.
St George JA. (2003) Gene therapy progress and prospects: adenoviral
vectors. Gene Ther. 10:1135–1141.
Stanley R, Lauri A. (2000) Pathology and genetics of tumors of the digestive
system, WHO Classification of tumors. IARC; p 105.
Stasinopoulos I, O'Brien DR, Wildes F, Glunde K, Bhujwalla ZM. (2007)
Silencing of cyclooxygenase-2 inhibits metastasis and delays tumor onset of poorly
differentiated metastatic breast cancer cells. Mol Cancer Res; 5(5):435-42.
Sun LQ, Cairns MJ, Saravolac EG, Baker A, Gerlach WL. (2000) Catalytic
nucleic acids: from lab to applications. Pharmacol Re; 52: 325–47.
Sunde RA. Selenium. In: Stipanuk M, editor. (2000) Biochemical and
physiological aspects of human nutrition. London: W.B. Saunders Co; p. 782–809.
Tang TL; Dowbenko D; Jackson A; Toney L; Lewin DA; Dent AL; Lasky LA
(2002). The forkhead transcription factor AFX activates apoptosis by induction of
BCL-6 transcriptional repressor. J Biol Chem;277(16)14255-65.
Theodosopoulos TK, Marinis AD, Dafnios NA, Vassiliou JG, Samanides LD,
Carvounis EE, Smyrniotis VE. (2006) Aggressive treatment of metastatic squamous
cell carcinoma of the rectum to the liver: a case report and a brief review of the
literature. World J Surg Oncol; 4:49.
- 193 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Thrasher JF, Allen B, Reynales-Shigematsu LM, Anaya R, Lazcano-Ponce
E, Hernández-Avila M. (2006) Analysis of the impact of cigarette pack graphic
warnings on Mexican smokers. Salud Publica Mex;48 Suppl1:S65-74.
Tolomeo M, Mancuso S, Todaro M, Stassi G, Catalano M, Arista S,
Cannizzo G, Barbusca E, Abbadessa V. (2003) Mitochondrial disruption and
apoptosis in lymphocytes of an HIV infected patient affected by lactic acidosis after
treatment with highly active antiretroviral therapy. J Clin Pathol; 56(2):147-51.
Toloza EM. (2006) Gene therapy for lung cancer. Thorac Surg Clin; 16: 397419.
Toran-Allerand CD. (2004)Minireview: A plethora of estrogen receptors in
the brain: where will it end? Endocrinology; 145(3):1069-74.
Tortora G, Ciardiello F. (2002) Protein kinase A as target for novel
integrated strategies of cancer therapy. Ann NY Acad Sci; 968:139–147.
Tyczynski JE, Bray F, Parkin DM. (2002) Breast cancer in Europe. ENCR
Fact Sheets of the International Agency for Research on Cancer; Vol. 2.
Ulukaya E, Ozdikicioglu F, Oral AY, Demirci M. (2008) The MTT assay
yields a relatively lower result of growth inhibition than the ATP assay depending on
the chemotherapeutic drugs tested. Toxicol In Vitro; 22(1):232-9.
Van Dillen IJ, Mulder NH, Sluiter WJ, Meijer C, De Jong S, Loncarek J,
Mesnil M, De Vries EF, Vaalburg W and Hospers GA: Consequences of
chemoresistance for the herpes simplex virus thymidine kinase/ ganciclovirinduced bystander effect in a human small cell lung cancer cell line model.
Anticancer Res; 25: 255-261, 2005.
Vineis P, Hoek G, Krzyzanowski M, Vigna-Taglianti F, Veglia F, Airoldi L,
Overvad K, Raaschou-Nielsen O, Clavel-Chapelon F, Linseisen J, Boeing H,
Trichopoulou A, Palli D, Krogh V, Tumino R, Panico S, Bueno-De-Mesquita HB,
Peeters PH, Lund E E, Agudo A, Martinez C, Dorronsoro M, Barricarte A, Cirera L,
Quiros JR, Berglund G, Manjer J, Forsberg B, Day NE, Key TJ, Kaaks R, Saracci
R, Riboli E. (2007) Lung cancers attributable to environmental tobacco smoke and
- 194 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
air pollution in non-smokers in different European countries: a prospective study.
Environ Health; 6:7.
Walenta S, Schroeder T, Mueller-Klieser W. (2002) Metabolic mapping with
bioluminescence: basic and clinical relevance. Biomol Engineering; 18:149-262.
Weitz J, Koch M, Debus J, Höhler T, Galle PR, Büchler MW. (2005)
Colorectal cancer. Lancet; 365:153-165.
Winchester DP, Jeske JM, Goldschmidt RA. (2000) The diagnosis and
management of ductal carcinoma insitu of the breast. CA Cancer J Clin; 50(3):
184200.
Witte A, Wanner G, Bläsi U, Halfmann G, Szostak M, Lubitz W. (1990)
Endogenous transmembrane tunnel formation mediated by phi X174 lysis protein
E. J Bacteriol; 172:4109–4114.
Xi S, Grandis JR. (2003) Gene therapy for the treatment of oral squamous
cell carcinoma. J Dent Res; 82(1):11-6.
Xiao D, Powolny AA, Singh SV. (2008) Benzyl isothiocyanate targets
mitochondrial respiratory chain to trigger ros-dependent apoptosis in human breast
cancer cells. J Biol Chem; En prensa.
Zhang X, Candas M, Griko NB, Taussig R, Bulla LA Jr. (2006) A mechanism
of cell death involving an adenylyl cyclase/PKA signaling pathway is induced by the
Cry1Ab toxin of Bacillus thuringiensis. Proc Natl Acad Sci U S A; 103(26):9897902.
Ye X, Zhu T, Bastacky S, McHale T, Li J, Xiao X (2005) Prevention and
reversal of lupus in NZB/NZW mice by costimulatory blockade with adenoassociated virus-mediated gene transfer. Arthritis Rheum; 52(12):3975-86.
Yla-Herttuala S, Martin JF. (2000) Cardiovascular gene therapy. Lancet;
355:213-22.
- 195 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
Yoshimi I, Kaneko S. (2005) Comparison of cancer mortality (rectal cancer)
in five countries: France, Italy, Japan, UK and USA from WHO mortality database
(1960-2000). Jpn J Clin Oncol; 35(4):224-7.
Young KD, Young R. (1982) Lytic action of cloned phi X174 gene E. J Virol;
44(3):993-1002.
Yun HJ, Cho YH, Moon Y, Park YW, Yoon HK, Kim YJ, Cho SH, Lee YI,
Kang BS, Kim WJ, Park K, Seo W. (2008) Transcriptional targeting of gene
expression in breast cancer by the promoters of protein regulator of cytokinesis 1
and ribonuclease reductase 2. Exp Mol Med; 40(3):345-53.
Zaffaroni N, Pennati M, Daidone MG. (2005) Survivin as a target for new
anticancer interventions. J Cell Mol Med; 9(2):360-72.
Zamora P, Espinosa E, González M. (2001) Cáncer de Mama: Clasificación
y Concepto. Medicine; 8(57): 30413049.
Zhang X, Candas M, Griko NB, Taussig R, Bulla LA Jr. (2006) A mechanism
of cell death involving an adenylyl cyclase/PKA signaling pathway is induced by the
Cry1Ab toxin of Bacillus thuringiensis. Proc Natl Acad Sci U S A; 103(26):9897902.
Zhang Y, Ma CH, Liu H, Zhang XM, Sun WS. (2007) pVAX1 plasmid vectormediated gene transfer of soluble TRAIL suppresses human hepatocellular
carcinoma growth in nude mice. Acta Biochim Pol; 54(2):307-13.
Zhou R, Dean DA. (2007) Gene transfer of interleukin 10 to the murine
cornea using electroporation. Exp Biol Med (Maywood); 232(3):362-9.
Zhu J, Huang X, Yang Y. (2007) Type I IFN signaling on both B and CD4 T
cells is required for protective antibody response to adenovirus. J Immunol;
178(6):3505-10.
Zou Y, Peng H, Zhou B, Wen Y, Wang SC, Tsai EM, Hung MC (2002).
Systemic tumor suppression by the proapoptotic gene bik. Cancer Res; 62(1):8-12.
- 196 -
Ana Rosa Rama Ballesteros
Bibliografía
- 197 -