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Aplicación de una Colección de Cepas
para la Tipificación Bacteriana por Bacteriocinas
Hreñuk, Gabriela E. - Alonso, José M. - Merino, Luis A. - Ronconi, María C.
Instituto de Medicina Regional – Universidad Nacional del Nordeste
Av. Las Heras 727 - (3500) Resistencia - Chaco - Argentina
Tel.: +54 (03722) 428213 - Fax: +54 (03722) 422793 - E-mail: lmerino@bib.unne.edu.ar
INTRODUCCIÓN
Uno de los principales objetivos que se plantean al abordar el estudio de un brote endémico o epidémico de
etiología bacteriana es averiguar si se trata de una situación producida por la misma cepa o si, por el contrario,
se tratan de cepas similares de una misma especie aunque no idénticas. Además, se hace necesario también
estudiar la identidad o no entre cepas aisladas de enfermos y del sitio que se sospecha pueda ser el foco de
contaminación (1). Para intentar resolver este problema, actualmente se dispone en la actualidad de un elevado número de técnicas que proporcionan información de gran utilidad, y que permiten clasificar a las bacterias
mediante marcadores fenotípicos y/o genotípicos. Cada método tiene sus ventajas e inconvenientes y ello
influye no solo en la posibilidad de poder aplicarlos, sino también la situación en la que son utilizados (2).
La tipificación mediante bacteriocinas involucra tanto el estudio de la producción de bacteriocinas por una
cepa como la susceptibilidad del microorganismo a las producidas por otras bacterias. Es una técnica simple
pero poderosa para distinguir entre cepas de especies bacterianas y por su nivel de simplicidad no requiere de
gran cantidad de reactivos ni de cepas de referencia, aunque no alcanza la capacidad discriminatoria de técnicas más sofisticadas (3). La producción de bacteriocinas frecuentemente está asociada a la resistencia a determinados antibióticos, por lo que en ciertas ocasiones habría una coincidencia entre el antibiotipo y el bacteriocinotipo (4).
Para llevar a cabo las técnicas de tipificación por bacteriocinas es indispensable contar con una colección de
bacterias productoras y de bacterias susceptibles ya que deben enfrentarse las cepas problema con las cepas
indicadoras de producción y sensibilidad, respectivamente (5).
OBJETIVOS
Los objetivos del presente trabajo fueron aplicar la tipificación por bacteriocinas en casos de brotes infecciosos y compararla con otras técnicas de tipado (serotipo, antibiotipo).
M ATERIALES Y MÉTODOS
Origen de las cepas: se tipificaron 82 cepas distribuidas de la siguiente manera:
a) Con relación a la producción de bacteriocinas: se tipificaron 45 cepas de P. aeruginosa provenientes del
Hospital “Angela I. de Llano” de la ciudad de Corrientes; 17 cepas de S. sonnei de diferentes procedencias. Cada una de estas cepas se enfrentaron con 7 cepas de enterobacterias de la colección de sensibles.
b) En relación con la sensibilidad frente a bacteriocinas: se tipificaron 17 cepas de S. sonnei y 20 cepas de
S. flexneri tipo 2 de diferentes procedencias las que se enfrentaron con 5 cepas de Pseudomonas aeruginosa pertenecientes a la colección de productoras.
Identificación bioquímica de las cepas: se realizó sobre la base de pruebas bioquímicas (7).
Determinación del serotipo: las cepas se identificaron utilizando la técnica de aglutinación en placa mediante
el uso de antisueros comerciales (Sanofi Diagnostics Pasteur) La confirmación del grupo y determinación del
serotipo se realizó en el Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas “Dr. Carlos G. Malbrán”.
Determinación del antibiotipo: las pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos se realizaron por la técnica de
difusión en agar con monodiscos, según normas. Se probó la susceptibilidad de las cepas frente a trece antimicrobianos. Se eligieron diferentes antimicrobianos con el objeto de ser utilizados como marcadores epidemiológicos en función de los resultados obtenidos, es decir que no se consideraron aquellos antimicrobianos
frente a los cuales todas las cepas fueron sensibles o resistentes (8).
Determinación de la producción y sensibilidad a las bacteriocinas: se utilizó en ambos casos el método de
estrías cruzadas de Wahba (6)
Interpretación del bacteriocinotipo: Los bacteriocinotipos se definieron registrando como “positivo (+)” o
“negativo (–)“ la presencia o ausencia de inhibición del crecimiento, respectivamente. Cada patrón de producción y/o sensibilidad se designó utilizando letras o números romanos. La utilización de tales códigos
implica que debe utilizarse siempre la misma secuencia de cepas productoras o sensibles.
Interpretación de los antibiotipos: a cada perfil de susceptibilidad obtenido, se lo designó con un número arábigo seguido por la inicial de la especie estudiada.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Hace más de dos décadas que se conoce la existencia de sustancias antibacterianas de origen bacteriano a las
que se denominó genéricamente bacteriocinas. La tipificación por bacteriocinas se ha aplicado con éxito en
bacterias de variados géneros, como ser Pseudomonas, Klebsiella, Salmonella, Serratia y Shigella por mencionar a los que más frecuentemente se involucran en procesos endémicos y/o epidémicos, intra o extrahospitalarios y alguno de los cuales presentan multirresistencia a los antimicrobianos de uso común
(9,10,11,12,13).
En nuestro trabajo, sobre las 45 cepas P. aeruginosa estudiadas se encontraron 14 perfiles de producción de
bacteriocinas o piocinotipos (PCT) sobre los 128 posibles, y 15 perfiles de sensibilidad antibiótica diferentes.
El 85% de las cepas produjeron alguna bacteriocina inhibiendo entre 1 a 7 cepas indicadoras. Siete PCT
incluyeron una sola cepa cada uno mientras que el resto abarcó entre 2 y 11 cepas. Dentro de un mismo bacteriocinotipo se encontraron cepas con diferente antibiotipo y viceversa.
Entre las cepas de S. sonnei pudieron establecerse 6 piocinotipo y 3 marcescinotipos (MCT). Las cepas fueron clasificadas en 4 colicinotipos (CCT) diferentes. Se seleccionaron como marcadores epidemiológicos los
siguientes antimicrobianos: AMP, AMS, TET, CMP, TMS y CEF obteniéndose 7 perfiles de susceptibilidad
(Tabla I). En la tabla II se muestra la distribución de cepas según el marcador epidemiológico utilizado.
Entre las cepas de Shigella flexneri tipo 2, en función de la sensibilidad a bacteriocinas, se pudieron establecer
3 piocinotipos y 2 marcescinotipos. Se eligieron como marcadores epidemiológicos los siguientes antimicrobianos: GEN, NEO, COL, FUR, TMS y CEF obteniéndose 14 perfiles de susceptibilidad. En la tabla III se
presenta la distribución de cepas según el marcador epidemiológico considerado.
El análisis del conjunto de los resultados obtenidos permite subrayar que un bacteriocinotipo se define en
forma independiente del serogrupo y de la sensibilidad antimicrobiana de las cepas estudiadas.
La presencia de diferentes bacteriocinotipos dentro de cada especie de bacterias estudiadas demuestra que, a
pesar de compartir ciertas características comunes, poseen diferente origen clonal.
CONCLUSIONES
La tipificación por bacteriocinas ha permitido diferenciar numerosos perfiles de sensibilidad y producción
entre las cepas estudiadas, sin embargo los resultados no deben interpretarse en forma aislada sino con relación a otros marcadores epidemiológicos fenotípicos y como un paso inicial antes de encarar estudios que
involucren características genotípicas.
Tabla I: Perfiles de sensibilidad antimicrobiana en las cepas estudiadas
Especie (Serotipo)
S. sonnei
S. flexneri
Resistencia a antibióticos
ninguna
TET CMP TMS
AMS CMP CEF
AMS TET CEF
AMS TET CMP CEF
AMP AMS TET CMP CEF
AMP AMS TET CMP TMS CEF
TMS
NEO COL
NEO COL TMS
NEO COL TMS CEF
NEO COL FUR
NEO COL FUR CEF
GEN TMS
GEN NEO FUR TMS CEF
GEN NEO COL
GEN NEO COL CEF
GEN NEO COL TMS CEF
GEN NEO COL FUR
GEN NEO COL FUR CEF
GEN NEO COL FUR TMS CEF
Nro. de cepas
1
1
1
1
4
7
2
1
1
1
1
1
4
1
1
1
4
1
10
36
15
Antibiotipo
1s
2s
3s
4s
5s
6s
7s
1f
2f
3f
4f
5f
6f
7f
8f
9f
10f
11f
12f
13f
14f
Tabla II: Distribución de las cepas de S. sonnei según el marcador epidemiológico utilizado
Antibiotipo
1s
2s
3s
4s
5s
6s
7s
Piocinotipo
E
D
G
H
D,E, G
D,E,F,G,I
G
Marcescinotipo
B
A
A
B
A,B
A,B
B,C
Colicinotipo
IV
III
II
IV
I, II,IV
II ,IV
I,II
Nro de cepas
1
1
1
1
4
7
2
Tabla III: Distribución de las cepas de S. flexneri tipo 2 según el marcador epidemiológico utilizado
Antibiotipo
1f
2f
5f
6f
12f
13f
14f
Piocinotipo
M
M
M
O
M,P
M,N,O
M,O
Marcescinotipo
J
K
K
K
K,L
J,K
J,K
No de cepas
1
1
1
1
3
8
5
BIBLIOGRAFÍA
1.
Aber RC, Mackel DC. Epidemiologic typing of nosocomial microorganisms. Am J Med 1981; 70:
899-905.
2. Tompkins LS. The use of molecular methods in infections disease. New Engl J Med 1992; 29: 12901297.
3. Pitt TL, Gaston MA. Bacteriocin typing. Methods Mol Biol 1995; 46:5-14.
4. Braun B, Pilsl H, Gross P. Colicins structures, modes of action, transfer through membranes and
evolution. Arch Microbiol 1994; 161:199-206.
5. Hreñuk G E, Merino L A, Alonso J M & Ronconi M C. Obtención de una colección de cepas para
tipado epidemiológico por bacteriocinas. Comunicaciones Científicas y Tecnológicas. (EUDENE),
1998, Tomo II, 155-158.
6. Koneman EW, Allen SD y cols. Diagnóstico microbiológico. Editorial Médica Panamericana 1992 3ra
Ed. Pp.203-316.
7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance Standars for Antimicrobial Susceptibility Testing; M100-S7 Vol 17 No 1. NCCLS, Wayne, USA, 1997
8. Govan SRW. Piocin typing of P. aeruginosa. Bergan T and Norris R editors: Methods in Microbiology.
Vol 10 New York 1978.
9. Millemann Y. Les marqueur épidémiologiques des salmonelles. Vet Res 1998; 29: 3-19.
10. Zabransky RJ, Day FE. Piocine typing of clinicals strains of P. aeruginosa. Appl Microbiol 1969; 17:
293-296.
11. Carrión Pastor JA, Liébana Ureña JJ, Cueto Espinar A y cols. Klebsiella pneumoniae: estudio epidemiológico mediante la aplicación de la bacteriocinotipia. Laboratorio 1981; 72:109-117.
12. Vlajinac H, Krajinovic S. Colicine production as an epidemiological marker for Shigella sonnei. J
Hyg (Lond) 1983; 91:273-276.