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Investigación original / Original research
Resistencia a carbapenemes en aislamientos
de Pseudomonas aeruginosa: un ejemplo de
interacción entre distintos mecanismos
Gisela Santella,1 Simona Pollini,2 Jean-Denis Docquier,2 Marisa Almuzara,3
Gabriel Gutkind,1 Gian Maria Rossolini 2 y Marcela Radice1
Forma de citar
Santella G, Pollini S, Docquier J, Almuzara M, Gutkind G, Rossolini GM, et al. Resistencia a carbapenemes en aislamientos de Pseudomonas aeruginosa: un ejemplo de interacción entre distintos mecanismos.
Rev Panam Salud Publica. 2011;30(6):545–8.
abstract
Objetivo. Identificar la proteína de membrana externa ausente en los aislamientos resistentes y
determinar tanto las causas de su ausencia en la membrana, como la presencia de otros mecanismos
de resistencia a carbapenemes en aislamientos clínicos de Pseudomonas aeruginosa.
Métodos. Se estudió un brote de 20 aislamientos de P. aeruginosa previamente
caracterizados como productores de la metalobetalactamasa IMP-13. Estos aislamientos
presentaron igual expresión de la enzima IMP-13, pero solo cinco de ellos fueron resistentes a
carbapenemes. En esos cinco aislamientos resistentes se confirmó la ausencia de una proteína
de membrana externa. Se secuenciaron oprD y ampC; se identificaron las proteínas de
membrana externa por desorción/ionización láser asistida por matriz/espectometría de masa
tiempo de vuelo (MALDI-TOF); se determinó el nivel de expresión de OprD, de AmpC y de los
sistemas de eflujo tipo Mex, por reacción en cadena de polimerasa en tiempo real, y por último,
se determinó la contribución del déficit de OprD a la resistencia a carbapenemes.
Resultados. La proteína de la membrana externa ausente en el grupo R (resistentes a
ambos carbapenemes) fue identificada como OprD-TS, pero no se observaron variaciones en su
expresión. El gen oprD presentó mutaciones en los cinco aislamientos resistentes. Se observó
la misma producción de la enzima tipo AmpC PDC-5 y del sistema de eflujo Mex AB-OprM
entre los aislamientos sensibles y resistentes a carbapenemes. Se analizó cómo la presencia
conjunta de IMP-13 y el déficit de OprD contribuyen al aumento de la resistencia.
Conclusiones. Distintos mecanismos contribuyen a la resistencia de aislamientos
productores de IMP-13 a carbapenemes. La posibilidad de no detectar estos aislamientos
productores de IMP-13 representa un riesgo latente de selección de mutantes con mecanismos
de resistencia que se suman para aumentar la resistencia a carbapenemes.
Palabras clave
El tratamiento de las infecciones nosocomiales causadas por cepas de Pseudomonas aeruginosa es actualmente un verdadero desafío terapéutico debido a los
1Universidad de Buenos Aires, Facultad de Farmacia
y Bioquímica, Buenos Aires, Argentina. La correspondencia debe dirigirse a Gabriel Gutkind. Correo
electrónico: ggutkind@ffyb.uba.ar
2
Universidad de Siena, Departamento de Biología
Molecular, Siena, Italia.
3Hospital Eva Perón, Buenos Aires, Argentina.
Rev Panam Salud Publica 30(6), 2011
Farmacorresistencia microbiana; Pseudomonas aeruginosa; Argentina.
múltiples mecanismos de resistencia presentes en este agente patógeno. Además,
es frecuente la ocurrencia de brotes nosocomiales de infecciones por Pseudomonas
aeruginosa (1). Se entiende por brote nosocomial un aumento repentino del número
de infecciones causadas, en este caso, por
un microorganismo que presenta un perfil de resistencia emergente, no descrito
previamente en el hospital Eva Perón de
Buenos Aires, Argentina.
La selección del antibiótico más apropiado para comenzar el tratamiento antibacteriano es fundamental cuando se
trata de optimizar los resultados clínicos
y lograr tanto la disminución de la morbilidad y mortalidad de los pacientes,
como reducir el período de estancia hospitalaria y la diseminación del agente patógeno en el hospital. Sin embargo, esa
elección no es sencilla, dada la extraordinaria habilidad de este germen pató-
545
Investigación original
geno oportunista de desplegar todos sus
mecanismos de resistencia para inactivar una variedad de antimicrobianos,
aun después de iniciado el tratamiento
antibiótico. Los carbapenemes, son los
antibióticos betalactámicos con mayor
espectro de acción, y en muchos casos
la última opción terapéutica frente a las
infecciones por P. aeruginosa. La resistencia adquirida a los carbapenemes resulta
de la presencia de distintos mecanismos,
que incluyen la inactivación enzimática
y la disminución de la concentración
del antimicrobiano en el sitio blanco. La
importancia relativa de cada mecanismo
de resistencia es variable y en muchos
casos coexisten más de un mecanismo.
La inactivación enzimática está mediada
por la sobreexpresión de enzimas de tipo
AmpC o por la producción de carbapenemasas, las que pueden ser serinoenzimas o metalobetalactamasas (MBL).
La alteración en la concentración en el
periplasma puede deberse al déficit en la
expresión de proteínas de la membrana
externa, OprD, o a la sobreexpresión de
sistemas de eflujo de tipo MexAB-OprM
y MexXY-OprM, habitualmente expresados en los aislados de P. aeruginosa, o
MexCD-OprJ y MexEF-OprN, que normalmente no se expresan (2).
En este trabajo se analizó la contribución de distintos mecanismos de resistencia a antibióticos carbapenémicos
(imipenem y meropenem) en 20 aislamientos clínicos de P. aeruginosa clónicamente relacionados y previamente
caracterizados como productores de la
metalocarbapenemasa IMP-13 (3, 4), pero
que muestran diferencias fenotípicas en
el grado de resistencia a carbapenemes.
Si bien en todos los aislamientos se comprobó previamente igual grado de expresión de metalobetacarbapenemasa, solo 5
de los 20 aislamientos estudiados fueron
resistentes a carbapenemes; el resto fue
sensible según los puntos de corte del
Instituto de Estándares Clínicos y de
Laboratorio (CLSI, por su sigla en inglés)
(5). Estudios del perfil de las proteínas
de membrana externa por electroforesis
en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) mostraron la
ausencia de una proteína de 46kDa en
los cinco aislamientos resistentes (3). El
objetivo principal del presente estudio
fue identificar la falta de una proteína de
membrana externa y determinar tanto las
causas de su ausencia en la membrana,
como la presencia de otros mecanismos
de resistencia. Un segundo objetivo fue
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Santella et al. • Resistencia a carbapenemes en aislamientos de Pseudomonas aeruginosa
evaluar si la ausencia de la proteína mencionada en la membrana externa de los
aislamientos resistentes a carbapenemes
era suficiente para conferirles resistencia
cuando se expresa la MBL IMP-13.
MÉTODOS
Aislamientos
Se realizó un estudio retrospectivo y
observacional que incluyó 20 aislamientos
de P. aeruginosa productores de la MBL
IMP-13. Estos aislamientos estaban clónicamente relacionados y fueron recuperados durante diciembre de 2004 y diciembre del 2005 en el hospital Eva Perón de
Buenos Aires, Argentina. Diecinueve de
los aislamientos estudiados se recuperaron de pacientes hospitalizados, y uno, de
un dispositivo médico identificado como
posible reservorio del microorganismo,
ya que se encontró relación clónica entre
los aislamientos por electroforesis en gel
de campo pulsado (PFGE) siguiendo el
protocolo descrito por Santella y colaboradores (3). De los 20 aislamientos, cinco
fueron resistentes a ambos carbapenemes
(Grupo R), y el resto presentó susceptibilidad disminuida a ellos (Grupo S) según
los puntos de corte establecidos por el
CLSI para las pruebas de sensibilidad a
los antibióticos (3).
Análisis de los mecanismos que
disminuyen la concentración del
antibiótico en el sitio activo
Dado que en el perfil de proteínas de
membrana externa resuelto por SDSPAGE se observó la ausencia de una
banda proteica de 46 kDa en los aislamientos pertenecientes al Grupo R al
compararlos con el Grupo S, se procedió
a identificar dicha proteína. Para ello se
purificó la banda proteica presente en
los aislamientos del Grupo S a partir de
los geles de poliacrilamida y se sometió
a espectrometría de masa MALDI-TOF
(desorción/ionización láser asistida por
matriz/espectometría de masa tiempo
de vuelo) (6).
El gen codificante de oprD fue amplificado empleando cebadores específicos
y el fragmento obtenido fue secuenciado
en forma completa. La expresión del gen
codificante de OprD en ambos grupos se
determinó por amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) en
tiempo real con cebadores específicos
(7). Se empleó el kit comercial Lightcy-
cler® DNA Master SYBR Green I (Roche
Applied Science) siguiendo las recomendaciones del fabricante y los controles
positivos correspondientes (7). La amplificación, cuantificación y análisis se realizaron por triplicado utilizando el instrumento y programa Lightcycler® (Roche
Molecular Biochemicals, version 3.5).
Para determinar la contribución del
déficit de OprD a la resistencia a carbapenemes en aislamientos productores
de esta metaloenzima, se clonó el gen
codificador de la enzima IMP-13 en el
vector de expresión de amplio rango
de huésped pME6001, y se transformó
en P. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa
PAO1 (pME-IMP-13)) y en P. aeruginosa
TNP065 deficiente en OprD (P. aeruginosa TNP065DOprD (pME-IMP-13)) (8).
Se determinó la concentración inhibitoria mínima de imipenem y meropenem
en los clones obtenidos, de acuerdo a las
normas del CLSI (5).
Los niveles de expresión de los distintos componentes de los sistemas de
eflujo de tipo Mex se determinaron por
amplificación por PCR en tiempo real empleando el kit comercial y las condiciones
mencionadas en el párrafo a­nterior. Se
amplificaron los genes mexB, mexC, mexE,
como marcadores de los sistemas MexAB,
MexCD, MexEF, ­respectivamente.
Análisis de las betalactamasas tipo
AmpC
El gen ampC fue clonado en el vector
pLBII (9) y posteriormente secuenciado.
Se determinó la expresión génica por PCR
en tiempo real en condiciones basales y
en presencia de concentraciones subinhibitorias de imipenem y meropenem.
RESULTADOS
Por espectrometría de masa se determinó que la proteína 46 kDa presente
en los aislamientos del grupo Grupo S
y ausente en los aislamientos del Grupo
R corresponde a OprD-TS, una variante
alélica del gen de oprD, previamente descrita en un aislamiento de P. aeruginosa
productor de VIM-2 (10). La expresión
del gen de oprD fue igual en ambos grupos, lo cual muestra que el déficit de esta
proteína en los aislamientos del Grupo R
no se debe a una alteración de la regulación de la transcripción. La secuencia
del gen codificador de OprD en los aislamientos del Grupo S correspondió a la
variante oprD-TS, en concordancia con lo
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observado por espectrometría de masa.
En los aislamientos del Grupo R, las
secuencias del gen oprD presentaron mutaciones en la secuencia de sus nucleótidos. En dos de cinco aislamientos se detectó una deleción puntual que convierte
el producto génico en una proteína de
finalización prematura, mientras que en
tres de cinco aislamientos se observó una
deleción de 27 pb, que si bien no afecta el
marco de lectura, probablemente afecte
la conformación funcional de la proteína
debido a la localización de esta deleción
sobre el extremo carboxilo terminal.
No se observaron diferencias en la
expresión de los distintos sistemas de
eflujo de tipo Mex en los aislamientos
del Grupo R en comparación con el
Grupo S. Los niveles de expresión de todas las bombas de eflujo analizadas, para
aislamientos tanto del Grupo R como del
Grupo S, fueron inferiores al del control
hiperproductor de sistemas de eflujo (7),
e iguales al de la cepa PAO1 utilizada
como control de expresión b
­ asal, excepto
para MexAB-OprM. En este último se
observó un ligero aumento en ambos
grupos, R y S (3:1), con respecto a la cepa
de referencia.
La concentración inhibitoria mínima
(CIM) de imipenem y meropenem de los
clones P. aeruginosa PAO1 (pME-IMP-13)
y P. aeruginosa TNP065 DoprD (pMEIMP-13), correspondientes a la transformación del vector pME-IMP13 en PAO1
y en la mutante TNP065 deficiente en
OprD (TNP065) respectivamente, se
muestran en el cuadro 1.
Respecto a la caracterización de la enzima de tipo AmpC, en los aislamientos
de ambos grupos se observó que el gen
codificador corresponde al de la enzima
PDC-5, una variante de AmpC, con actividad débil sobre los carbapenemes (11).
En condiciones basales, no se observaron
diferencias en la expresión de dicho gen
entre los aislamientos de los Grupos R
y S. Ante la presencia de antibióticos
carbapenémicos como inductores de la
expresión de AmpC, se observó un aumento de 9 y 90 veces con imipenem y
meropenen, respectivamente, pero sólo
en el Grupo S. Este resultado se debe probablemente a que el déficit de OprD en
la membrana externa de los aislamientos
del Grupo R restringe el ingreso de los
antibióticos inductores, lo cual sumado
a la hidrólisis mediada por la enzima
IMP-13, resulta en concentraciones que
no logran inducir la expresión de AmpC.
DISCUSIÓN
El análisis conjunto de los resultados
del presente trabajo y de las observaciones previas en párrafos anteriores no
sólo muestra la coexistencia de distintos
mecanismos de resistencia en un mismo
aislamiento, sino también la necesidad
de que se dé dicha coexpresión para
que los microorganismos presenten resistencia fenotípicamente observable. En
trabajos anteriores hemos demostrado
que la frecuencia de selección de mutantes resistentes a carbapenemes en los
aislamientos del Grupo S varía entre 2 ×
10–8 a 1,6 × 10–7 para cada uno de los antibióticos carbapenémicos (3), mientras
que no se logra obtener mutantes resistentes de P. aeruginosa ATCC 9027 ni de
aislamientos clínicos no productores de
metalobetalactamasa. Estos resultados
muestran el riesgo de selección de un
segundo mecanismo de resistencia en
presencia de un mecanismo preexistente,
y la consecuente posibilidad de selección de microorganismos resistentes que
podría llevar a falla terapéutica. En este
sentido, la adquisición y expresión de
la MBL IMP-13 no confiere resistencia a
carbapenemes según los puntos de corte
del CLSI, pero determina un aumento
CUADRO 1. Valores de la concentración inhibitoria mínima de carbapenemes en aislamientos
de Pseudomonas aeruginosa PAO1 y P. aeruginosa TNP065 y los respectivos transformados
productores de IMP-13
CIM (µg/ml)
Carbapenemes
Imipenem
Meropenem
P. aeruginosa
PAO1
P. aeruginosa
PAO1
(pME-IMP-13)
P. aeruginosa
TNP065
ΔoprD
P. aeruginosa
TNP065
ΔoprD (pME-IMP-13)
4
0,5
16
4
16
4
32
32
P. aeruginosa PAO1 (pME-IMP-13): P. aeruginosa PAO1 transformada con el plásmido de expresión pME, que contiene el
gen codificador de la enzima IMP-13.
P. aeruginosa TNP065 ΔoprD: P. aeruginosa TNP065, que contiene una deleción en el gen codificante de la porina oprD.
P. aeruginosa TNP065 ΔoprD (pME-IMP-13): P. aeruginosa TNP065 ΔoprD transformada con el plásmido de expresión pME
que contienen el gen codificador de la enzima IMP-13.
Rev Panam Salud Publica 30(6), 2011
Investigación original
de la CIM de esos antibióticos. A su
vez, podría considerarse un marcador de
prerresistencia que genera una situación
propicia para la selección de mutantes de permeabilidad. Las mutaciones
puntuales o microdeleciones en el gen
codificador de la proteína de membrana
externa OprD resultaron suficientes para
determinar el déficit de dicha proteína
en la membrana, aumentando el grado
de resistencia a ambos carbapenemes.
Por su parte el nivel de expresión del
sistema de eflujo MexAB ligeramente
superior, puede contribuir al aumento
del grado de resistencia.
La presencia de la enzima PDC-5, con
débil actividad carbapenemasa, no es capaz, por sí misma, de conferir resistencia
a los carbapenemes en estos aislamientos; sin embargo, podría contribuir a la
resistencia a los carbapenemes durante
el tratamiento, ya que hemos observado que en presencia de concentraciones subinhibitorias de estos antibióticos
aumenta la expresión y demuestra la
funcionalidad del sistema de inducción.
Además, permanece latente el riesgo de
selección de mutantes hiperproductores.
En este trabajo analizamos solamente
20 aislamientos de Pseudomonas aeruginosa
productores de IMP-13, clónicamente relacionados, por lo cual las conclusiones
no pueden hacerse extensivas a microorganismos productores de otras familias
de MBL ni a otras variantes de la misma
familia. Sin embargo, los resultados constituyen un antecedente importante, que
señala que las pruebas de laboratorio
cotidianas pueden no detectar todos los
mecanismos de resistencia presentes en
los aislamientos evaluados, y pone de
manifiesto la limitación de esas pruebas,
al menos en este caso. En consecuencia,
sería necesario extender el análisis a un
número mayor de aislamientos para poder llegar a conclusiones más generales,
aplicables a todas las MBL.
Los resultados obtenidos demuestran
sinergia entre el mecanismo de impermeabilidad y la producción de la MBL
IMP-13 para conferir resistencia fenotípica a los carbapenemes. Además advierte sobre la presencia de otros mecanismos de resistencia, como un ligero
aumento de MexAB-OprN y la presencia
de una enzima AmpC con actividad de
carbapenemasa, tanto en los aislamientos sensibles como en los resistentes a
carbapenemes. La detección incompleta
de mecanismos de resistencia cuando
se expresan individualmente podría fa-
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Santella et al. • Resistencia a carbapenemes en aislamientos de Pseudomonas aeruginosa
Investigación original
vorecer tanto su diseminación (4), como
la administración inadecuada de un tratamiento basado en la interpretación de
un antibiograma con los puntos de corte
actuales propuestos por el CLSI.
En nuestro país, la Subcomisión de
Antimicrobianos de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y
Parasitología Clínica (SADEBAC), a su
vez, parte de la Asociación Argentina de
­Microbiología (http://www.aam.org.ar/
sadebac.shtml), recomienda analizar la
presencia de mecanismos de resistencia
en aislamientos de bacilos gramnegativos
no fermentadores que presenten puntos
de corte de imipenem o meropenem o
ambos antibióticos ≤ 21 mm, e incluir
en el antibiograma inicial de rutina un
disco con ácido etilendiaminotetraacético
o EDTA (1 µg) a una distancia de 15 mm
del borde de los discos con imipenem y
meropenem. Esta fue una herramienta
fundamental para detectar y caracterizar
los microorganismos estudiados, ya que
15 de los 20 aislamientos correspondían
a la categoría sensible según los puntos
de corte de difusión en medio sólido del
CLSI. No obstante el agrandamiento del
halo de inhibición en presencia del quelante puso en evidencia la presencia de la
metaloenzima en todos los casos.
Agradecimientos. Agradecemos a Luca
Bini, por el servicio brindado en la identificación por MALDI-TOF de la banda
proteica.
REFERENCIAS
1.Rossolini GM, Luzzaro F, Migliavacca R,
Mugnaioli C, Pini B, De Luca F, et al. First
countrywide survey of acquired metallobeta-lactamases in gram-negative pathogens
in Italy. Antimicrob Agents Chemother.
2008;52(11):4023–9.
2. Lister PD, Wolter DJ, Hanson ND. Antibacterial-resistant Pseudomonas aeruginosa: clinical
impact and complex regulation of chromosomally encoded resistance mechanisms. Clin
Microbiol Rev. 2009;22(4):582–610.
3.Santella G, Cuirolo A, Almuzara M,
Palombarani S, Sly G, Radice M, et al. Full
resistance and decreased susceptibility to
­carbapenems in IMP-13-producing Pseudomonas
aeruginosa isolates from an outbreak. A
­ ntimicrob
Agents Chemother. 2010;54(3):1381–2.
4.Santella G, Pollini S, Docquier JD, Mereuta
AI, Gutkind G, Rossolini GM, et al. Intercontinental dissemination of IMP-13-producing
Pseudomonas aeruginosa belonging in sequence
type 621. J Clin Microbiol. 2010;48(11):4342–3.
abstract
Carbapenem resistance in
Pseudomonas
aeruginosa ­isolates: an
­example of ­interaction
between different mechanisms
Key words
548
5.CLSI. Performance Standards for Antimicrobial
Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. CLSI document M100-S21.
Clinical and Laboratory Standards Institute,
940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
Pennsylvania, 19087 USA, 2011. 2011.
6.Bini L, Pacini S, Liberatori S, Valensin S,
Pellegrini M, Raggiaschi R, et al. Extensive
temporally regulated reorganization of the lipid
raft proteome following T-cell antigen receptor
triggering. Biochem J. 2003;369(Pt 2):301–9.
7.Dumas JL, van Delden C, Perron K, Kohler
T. Analysis of antibiotic resistance gene expression in Pseudomonas aeruginosa by quantitative real-time-PCR. FEMS Microbiol Lett.
2006;254(2):217–25.
8.Yoneyama H, Yamano Y, Nakae T. Role
of porins in the antibiotic susceptibility
of Pseudomonas aeruginosa: construction of
mutants with deletions in the multiple porin genes. Biochem Biophys Res Commun.
1995;213(1):88–95.
9. Borgianni Luisa FJM, Rossolini GM, Docquier JD, editor. Mutational analysis of the
VIM-2 active site: role of position 64 and 87
in enzyme activity and stability. The 46th
Conference on Antimicrobial agents and Chemotherapy; 2006; San Francisco, California.
10. Edalucci E, Spinelli R, Dolzani L, Riccio ML,
Dubois V, Tonin EA, et al. Acquisition of different carbapenem resistance mechanisms by
an epidemic clonal lineage of Pseudomonas
aeruginosa. Clin Microbiol Infect. 2008;14(1):
88–90.
11. Rodriguez-Martinez JM, Poirel L, Nordmann
P. Extended-spectrum cephalosporinases in
Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents
Chemother. 2009;53(5):1766–71.
Manuscrito recibido el 10 de abril de 2011. Aceptado para
publicación, tras revisión, el 14 de noviembre de 2011.
Objective. To identify the outer membrane protein absent in the resistant isolates and
to determine both the causes of its absence in the membrane and the presence of other
mechanisms of carbapenem resistance in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa.
Methods. Twenty isolates from an outbreak of P. aeruginosa previously characterized
as metallo-beta-lactamase IMP-13 producers were studied. All the isolates exhibited
equal expression of the IMP-13 enzyme, but only five of them were carbapenemresistant. It was found that the five resistant isolates lacked a outer membrane protein.
The oprD and ampC genes were sequenced; the outer membrane proteins were identified
using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass
spectrometry; the OprD and AmpC expressions, as well as the Mex efflux system,
were assessed by real-time polymerase chain reaction; and finally, the contribution of
reduced OprD to carbapenem resistance was determined.
Results. The absent outer membrane protein in group R was identified as OprD-TS;
however, no variations in its expression were observed. The oprD gene presented
mutations in the five resistant isolates. The production of AmpC PDC-5-type enzyme
and the MexAB-OprM efflux system was the same in both carbapenem-sensitive and
‑resistant isolates. The contribution of the combined presence of IMP-13 and reduced
OprD to increased resistance was examined.
Conclusions. Different mechanisms contribute to carbapenem resistance in IMP13-producing isolates. The possibility that these IMP-13-producing isolates could
go undetected poses a latent risk when selecting mutants with added resistance
mechanisms in order to enhance carbapenem resistance.
Drug resistance, microbial; Pseudomonas aeruginosa; Argentina.
Rev Panam Salud Publica 30(6), 2011