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Protocolo del Proyecto “Evaluación
de las Proteínas del Ciclo Celular en
el Cáncer de Pene”
PROCIENCIA 14-INV-323
Dirección de Investigación & Divulgación Cientifica
Protocolo 14-INV-323
Índice
Descripción
2
Equipo de investigadores
2
Investigador principal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Asistente de investigación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Objetivos del proyecto
2
Objetivos principales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Objetivos principales específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Antecedentes
2
Marco teórico
3
Plan de trabajo
3
Diagnóstico de las lesiones tumorales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
Evaluación de microarrays tisulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
Confección de la base de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
Análisis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
Redacción de informes de investigación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Relevancia
5
Relevancia social . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Relevancia científica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Relevancia contemporánea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Estrategia de divulgación
5
Referencias
6
1
Protocolo 14-INV-323
Descripción
Objetivos principales específicos
Este documento describe el protocolo a seguir para la
ejecución del Proyecto “Evaluación de las Proteínas
del Ciclo Celular en el Cáncer de Pene”, gestionado por la Dirección de Investigación & Divulgación
Científica de la Universidad del Norte. El Programa
se ejecuta dentro del Programa Paraguayo para el
Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología (PROCIENCIA), Proyecto 14-INV-323, con fondos adjudicados
por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACYT) de la República del Paraguay según
Resolución Nº 437/2014.
Los objetivos específicos de este proyecto pueden
agruparse en 2 categorías:
Equipo de investigadores
Evaluar visual y digitalmente la expresión inmunohistoquímica de proteínas relacionadas al
ciclo celular en carcinomas escamosos del pene,
determinando su asociación con características
histopatológicas y virales.
Entrenar efectivamente a la Asistente de Investigación en el diseño de proyectos de investigación, recolección de datos, morfología y
biología molecular del cáncer de pene, análisis
estadístico de datos, programación en R, utilización de RStudio, herramientas de ciencia de
datos, interpretación de resultados, y redacción
y publicación de informes de investigación.
Investigador principal
El Investigador Principal del proyecto es el
Prof. Dr. Alcides Chaux, Director de Investigación & Divulgación Científica de la Universidad
del Norte. El Investigador Principal está a cargo del
diseño y supervisión del proyecto, del análisis de
datos, y de la redacción de informes de investigación
y documentos relacionados.
Asistente de investigación
La Asistente de Investigación está a cargo de la recolección y análisis de datos y redacción de informes
de investigación y documentos relacionados. La Asistente de Investigación tiene una carga horaria de 15
(quince) horas semanales.
Objetivos del proyecto
Objetivos principales
Los objetivos principales de este proyecto pueden
agruparse en 2 categorías:
Incrementar el conocimiento acerca de la biología molecular del cáncer de pene, con énfasis
en la evaluación del ciclo celular.
Ofrecer un programa de entrenamiento efectivo en investigación científica, orientado a la
adquisición de habilidades concretas para el
diseño, gestión y ejecución de proyectos de investigación.
Antecedentes
Debido a factores aún no totalmente caracterizados
el cáncer de pene presenta una alta incidencia en
el Paraguay comparada con la observada en países
desarrollados.1 Esto permite la explotación de un
nicho de investigación centrado en la patología del
cáncer de pene en nuestro país. Tras varios años
de estar realizando investigaciones en la morfología,
características clínicas y epidemiológicas, y factores
pronósticos patológicos2 hemos incursionado en el
campo de la biología molecular del cáncer de pene.3–6
Uno de los problemas principales dentro de este tópico es la falta de información detallada y profunda
acerca de la biología molecular del cáncer de pene. El conocimiento acabado acerca de la biología
del cáncer de pene permitiría comprender cómo se
origina y por qué presenta las particularidades epidemiológicas observadas. Más aún, este conocimiento
podría ser útil para el desarrollo de estrategias clínicas más efectivas, con diagnósticos más significativos
y tratamientos mejor orientados.7
Dentro de nuestro programa de investigación en cáncer de pene hemos recolectado a lo largo de dos
décadas más de 100 muestras de tejido tumoral y
construido a partir de estas muestras 4 microarrays
tisulares (TMA, por tissue microarray). Utilizando
estos 4 TMA hemos iniciado hace 2 años nuestra
investigación en la biología molecular del cáncer de
pene, estudiando varias vías metabólicas tales como
las de blanco de rapamicina en mamíferos y la del
receptor epidérmico del factor de crecimiento .3,4
2
Protocolo 14-INV-323
Hemos estado publicando los resultados de estas investigaciones en revistas internacionales indexadas
evaluadas por pares, estableciéndonos firmemente en
el frente de avance de esta área de la Ciencia. Sin
embargo, aún quedan muchas vías metabólicas por
estudiar, sobre todo las directamente relacionadas
con el control del crecimiento y diferenciación de las
células tumorales.
Considerando la escasa tradición científica seria en el
campo de la biología molecular del cáncer en nuestro
país y la imperiosa necesidad de educar una generación de nuevos científicos, proponemos este proyecto
denominado “Evaluación de las Proteínas del Ciclo
Celular en el Cáncer de Pene”. Mediante este proyecto se entrenará a la Asistente de Investigación
en el diseño de estudios de investigación, recolección de datos, análisis estadístico y programación de
paquetes informáticos, interpretación de resultados,
y redacción y presentación de informes de investigación. Este entrenamiento estará centrado en la
ejecución específica de este proyecto, por lo que se
espera generar habilidades y capacidades efectivas
para la investigación científica.
Marco teórico
El cáncer de pene es un tumor infrecuente en países
desarrollados de Norteamérica y Europa, representando, sin embargo, un serio problema de salud pública
en países en vías de desarrollo.8,9 La incidencia es
particularmente alta en países como Brasil y Paraguay, donde las tasas son de hasta 4 veces mayores
a las observadas en países del primer mundo.1
No existen explicaciones satisfactorias para estas variaciones geográficas, pero factores de riesgo tales
como la falta de circuncisión, fimosis, tabaquismo,
antecedentes de desgarros peneanos, enfermedades
inflamatorias crónicas, pobre higiene genital, y ciertas infecciones virales podrían tener alguna influencia
en las regiones con mayor incidencia.1,9
La mayoría de los cánceres peneanos son carcinomas escamosos, reconociéndose un variado espectro de subtipos histológicos distintos, cada uno
con características clinicopatológicas y pronósticas
particulares.10 El desarrollo del cáncer de pene sigue
una vía patogénica bimodal, una asociada con la
infección por el virus del papiloma humano (HPV)
y otra independiente de la infección viral.11
A pesar de que el cáncer de pene es más frecuentemente una enfermedad loco-regional, se observa
diseminación sistémica y metástasis a distancia en
hasta el 40 % de los pacientes. En este contexto, la
muerte por cáncer diseminado aparece habitualmente dentro de los 2 a 3 años del diagnóstico inicial.12
Mientras que la cirugía y la radioterapia son las opciones de elección en pacientes con tumores localizados,
la quimioterapia es la opción principal para aquellos
con enfermedad diseminada. Desafortunadamente,
las tasas de respuesta al tratamiento quimioterapéutico están lejos de ser aceptables.13 Por lo tanto, se
requieren de otros enfoques, especialmente aquellos
que involucran el uso de terapias dirigidas.7
Las terapias dirigidas han cambiado significativamente el tratamiento del cáncer durante los últimos 10
años. Al involucrar mecanismos de acción distintos a
los de la quimioterapia citotóxica tradicional, suelen
ser mejor toleradas, asociándose con menos efectos
secundarios adversos. Estos fármacos son parte hoy
en día del tratamiento de muchos tumores malignos.7
Sin embargo, no existen protocolos de tratamiento
dirigido para pacientes con cáncer de pene diseminado, principalmente por dos razones. La primera está
relacionada con la rareza de estos tumores en países
desarrollados en los que estos fármacos están en evaluación o aprobados para su uso clínico. La segunda
se relaciona con la escasez de reportes de investigación estudiando la biología molecular del cáncer
de pene, buscando identificar alteraciones en vías
metabólicas que sean de interés para el desarrollo de
terapias dirigidas.
El propósito del presente proyecto es evaluar la expresión inmunohistoquímica de diversas proteínas
involucradas en el control del ciclo celular en tumores
peneanos, evaluando la asociación entre los niveles
de expresión, las características histopatológicas y la
presencia de HPV.
Plan de trabajo
El tiempo de duración del proyecto es de 12 meses,
desde julio de 2015 a junio de 2016. Se medirán los
niveles de expresión inmunohistoquímica de 5 proteínas relacionadas con el ciclo celular (p53, Ki67,
cyclin-D1, p16INK4a y MDM2) en 112 muestras
tisulares de carcinomas escamosos.
Las muestras tisulares fueron obtenidas de los casos
de consulta del Investigador Principal y consistieron
en tejido tumoral fijado en formol al 10 % y embebido en parafina. A partir de estas muestras tisulares
se confeccionaron 4 TMA en el TMA Lab Core de la
Johns Hopkins University (Baltimore, MD), siguiendo un protocolo previamente publicado.14
3
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A partir de estos bloques de TMA se obtuvieron
cortes tisulares que fueron teñidos con Hematoxilina
& Eosina (HE). Las tinciones inmunohistoquímicas
fueron llevadas a cabo siguiendo protocolos previamente publicados.15–18 Los TMA correspondientes
a las tinciones con HE e inmunohistoquímica se encuentran almacenadas en los archivos tisulares del
Investigador Principal.
La medición se realizará visualmente y mediante
análisis digital de imágenes. Posteriormente se analizarán estos niveles de expresión, evaluando su rol en
la alteración del ciclo celular de las células tumorales y su asociación con características morfológicas
del tumor. Este proceso requerirá el uso intensivo
de herramientas de ciencias de datos tales como
R/RStudio, ImageJ, GitHub, MarkDown, y similares.
La hipótesis básica de trabajo es que existen alteraciones específicas de vías metabólicas particulares
en las células tumorales del carcinoma escamoso
que son evidenciables de una forma más objetiva
mediante el análisis digital de imágenes. Asimismo,
existen correlaciones entre las expresiones inmunohistoquímicas de ciertas proteínas relacionadas al ciclo
celular y las características morfológicas del tumor,
lo que sugeriría mecanismos oncogénicos particulares
y posiblemente blancos terapéuticos específicos.
El uso de estos TMA para investigación fue aprobado
por el Institutional Board Review (IBR) de la Johns
Hopkins University (Baltimore, MD).
El Proyecto estará dividido en 5 fases: diagnóstico
de las lesiones tumorales, evaluación de microarrays
tisulares, confección de la base de datos, análisis estadístico, y redacción del informe de investigación.
Estas fases se describen a continuación.
Evaluación de microarrays tisulares
Una vez que todas las lesiones tumorales hayan sido
clasificadas se procederá a la evaluación visual de
la expresión inmunohistoquímica de proteínas relacionadas con el ciclo celular, incluyendo p53, cyclin
D1, Ki-67, p16INK4a, y MDM2. Esta evaluación se
llevará a cabo en un microscopio Zeiss AxioLab 2.
La Asistente de Investigación estimará visualmente
los niveles de expresión utilizando una escala semicuantitativa previamente desarrollada y validada.19
Esta estimación será controlada por el Investigador
Principal.
Tras la evaluación visual se procederá a digitalizar los
TMA, utilizando una técnica previamente descrita.15
Posteriormente se procederá al análisis de las imágenes utilizando un protocolo de análisis digital previamente desarrollado y publicado por el Investigador
Prinicpal.3 La Asistente de Investigación trabajará
activamente en la redacción de nuevos protocolos de
análisis digital y en la programación de algoritmos
para mejorar los protocolos ya existentes.
Confección de la base de datos
Tras la recolección de datos visuales y digitales la
Asistente de Investigación confeccionará una base
de datos en la que consignará toda la información
recolectada hasta el momento, incluyendo los datos
histopatológicos y la evaluación visual y digital de
cada uno de los casos de cáncer de pene. Dentro de
nuestra consigna de libertad de información haremos
que esta base de datos esté disponible gratuitamente
para todos los investigadores a través de repositorios
digitales internacionales.
Análisis estadístico
Diagnóstico de las lesiones tumorales
Primeramente se procederá a la clasificación de los
4 TMA disponibles conteniendo muestras tisulares
de 112 casos de cáncer de pene. Se identificarán las
láminas histológicas completas correspondientes a
estos casos y se procederá a la clasificación histopatológica de las lesiones tumorales, usando criterios
previamente establecidos.2,10 El AI trabajará bajo
la supervisión del IP para la correcta clasificación de
las lesiones tumorales y la adecuada identificación
de las características histopatológicas relevantes. Esta evaluación se realizará sobre muestras tisulares
teñidas con hematoxilina & eosina.
La Asistente de Investigación procederá al análisis estadístico de los datos bajo la supervisión del
Investigador Principal. El análisis de datos se realizará utilizando el lenguaje de programación R.20 La
Asistente de Investigación aprenderá las habilidades
necesarias para la programación en R y la utilización
de RStudio como interfaz de usuario.
Se espera además que la Asistente de Investigación
adquiera conceptos y habilidades para la aplicación
de técnicas estadísticas avanzadas, centradas principalmente en la construcción de modelos matemáticos
predictivos. Asimismo, dentro de nuestra política de
investigación reproducible, La Asistente de Investigación utilizará GitHub (https://github.com/) para
4
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publicar el código de su análisis estadístico, y pondrá
a disposición de la comunidad científica global sus
resultados a través de repositorios digitales internacionales.
Redacción de informes de investigación
Como fase final la Asistente de Investigación redactará el informe de investigación reportando los
resultados del proyecto. Este informe se enviará para
publicación en una revista internacional indexada
con evaluación por pares. La Asistente de Investigación redactará además todos los materiales para ser
utilizados en simposios, congresos, talleres, y conferencias en las cuales se divulguen los hallazgos del
Proyecto. El Investigador Principal supervisará todo
el proceso de redacción.
Relevancia
Relevancia social
La implementación de este Proyecto sobre la “Evaluación de las proteínas del ciclo celular en el cáncer
de pene” permitirá obtener un conocimiento más
acabado y preciso acerca de la biología molecular del
cáncer. Este Proyecto ayudará no sólo a comprender
mejor cómo se origina y progresa la enfermedad sino
también dará pistas acerca de cómo ofrecer mejores
opciones terapéuticas a los pacientes afectos.
Considerando que el Paraguay es uno de los países
con la incidencia más alta de cáncer de pene en el
mundo, la importancia social de este conocimiento
es evidente. Más aún, considerando que las muestras
de tejido tumoral corresponden a pacientes paraguayos, esto permitirá que los resultados sean aplicables
directamente a los pacientes afectos, ya que no se
trataría de información importada o llevada a cabo
en otras poblaciones.
Relevancia científica
Debido a la rareza del cáncer de pene en países
desarrollados el conocimiento disponible acerca de
su biología molecular es escaso. Este Proyecto sobre la “Evaluación de las proteínas del ciclo celular
en el cáncer de pene” permitirá estudiar los niveles de expresión inmunohistoquímica de proteínas
relacionadas al ciclo celular, investigando alteraciones metabólicas en células tumorales y evaluando su
asociación con características histopatológicas y virales. Todo esto permitirá incrementar el conocimiento
científico disponible acerca de la enfermedad.
Además, este Proyecto permitirá continuar con nuestra línea de investigación en el cáncer de pene, dentro
de un programa de iniciación científica, ofreciendo
un entrenamiento formal en ciencia de datos e incrementando por lo tanto el capital humano disponible
para realizar investigación.
Relevancia contemporánea
El conocimiento puramente morfológico o clínico ya
no es suficiente hoy en día para comprender una enfermedad, mucho menos para su adecuado diagnóstico
y tratamiento. Actualmente se requiere un conocimiento más profundo acerca de la biología molecular
de las enfermedades, buscando mejores modelos teóricos mediante los cuales desarrollar estrategias más
efectivas para el manejo de los pacientes.
Dentro de esta línea, este Proyecto sobre la “Evaluación de las proteínas del ciclo celular en el cáncer de
pene” evaluará uno de los aspectos más importantes
de la biología molecular del cáncer, el control del
ciclo celular.
Estrategia de divulgación
Este Proyecto acerca de la “Evaluación de las proteínas del ciclo celular en el cáncer de pene” incrementará el conocimiento que se tiene acerca de la
biología molecular del cáncer de pene. Este Proyecto
permitirá una mejor comprensión de la relación existente entre las características morfológicas y virales
de las células tumorales y el control del ciclo celular.
Mediante esto, este Proyecto permitirá evaluar y validar estudios similares que se han o se están llevando
a cabo centrados en el área de investigación del cáncer de pene. Todos estos resultados serán puestos
a disposición de la comunidad científica nacional e
internacional y del público en general interesado de
manera abierta y gratuita.
Se buscará la difusión de los resultados de esta investigación mediante canales académicos y no académicos. En el ámbito académico, los resultados se
divulgarán mediante Congresos y Simposios, ya sea
organizados por la Universidad del Norte u otras
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instituciones académicas, y el reporte de investigación final será enviado para publicación a una revista
científica internacional indexada evaluada por pares
y con opción de acceso libre al artículo publicado.
En el ámbito no académico, estos resultados se divulgarán al público en general mediante entrevistas
radiales y televisivas, además de medios impresos y
digitales, y redes sociales.
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