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CARACTERIZACIÓN DE FENOTIPOS EMBRIONARIOS DEL GEN chem
Patiño González, B. I.(1); Riesgo Escovar, J. (1)(2); Zamudio Arroyo, J.M. (2);
(1)
Facultad de Ciencias Naturales
Universidad Autónoma de Querétaro
(2)
Instituto de Neurobiología.
Universidad Nacional Autónoma de México.
RESUMEN
El gen chem es un locus homocigoto letal embrionario. El objetivo del trabajo fue determinar el
índice de mortandad embrionario e identificar fenotipos mutantes característicos de alelos
mutantes del gen chem mediante preparaciones de cutículas. Los resultados fueron semejantes a
los esperados teóricamente en un cuadro de Punnett. El 50% de la F1 de cruzas entre
heterocigotos de chem son igualmente heterocigotos (chem/TM3). El otro 50% muere. Un 25%
es homocigoto al cromosoma homólogo que lleva mutaciones en chem y muere sin presentar
fenotipo embrionario. El 25% restante a chem/chem presenta fenotipos de cerrado dorsal e
involución de la cabeza. . Una pequeña proporción de homocigotos chem/chem mueren como
larvas de primer instar.
INTRODUCCIÓN
Drosophila melanogaster, debido a su rápido tiempo de generación y la facilidad de
manipulación, es un organismo modelo popular. El análisis de fenotipos mutantes puede llevarse
a cabo en un tiempo relativamente corto, sobre todo si se trata de fenotipos embrionarios.
El desarrollo embrionario de Drosophila es rápido consta de 17 atapas a partir de la fecundación
(Tabla 1), Brevemente en el estadio 5 ya se observa el blastodermo, y en el ocurre la gastrulación
con la invaginación del mesodermo y endodermo. Durante la gastrulación se forman las tres
capas germinales ectodermo, mesodermo y endodermo. Después inicia el estiramiento de la
banda germinal conformada por el ectodermo y mesodermo en una dirección posterior y dorsal.
Posterior a esta extensión ocurre la retracción de la banda germinal en dirección ventral. Durante
este proceso se observan por primera vez los segmentos que conformaran al embrión. Alrededor
de las doce horas ( a 25ºC) comienza el cerrado dorsal. Este proceso conlleva el estiramiento de
los epitelios laterales que envuelven al embrión en una dirección ventro-dorsal con la finalidad de
recubrirlo dorsalmente. Al finalizar el cerrado dorsal comienza la involución de la cabeza, para
después terminar con la organogénesis. Alrededor de las 22hrs emergerá una larva de primer
instar. (Greenspan ; 1997).(ver tabla 1)
Tabla1. Embriogénesis de Drosophila
Etapa
Tiempo
Eventos de
desarrollo
1- 4
0:00 2:10 h
Etapa inicial.
5
2:10 2:50 h
Blastodermo
6-7
2:50 3:10 h
Gastrulación
8 - 11
3:10 7:20 h
Elongación de la banda
germinal
1
12 - 13
7:20 10:20 h
Retracción de la banda
germinal
14 - 15
10:20 13:00 h
Involución de la cabeza
y cerrado dorsal
16 - 17
13:00 22:00 h
Diferenciación
EXPERIMENTAL
Los alelos chem 20, chem 21, chem 23 y chem58 cuentan con el balanceador TM3 Ser, Sb y para
chem 25 el balanceador TM6B Hu. Ambos balanceadores ayudan a evitar la recombinación del
cromosoma con su homologo y mantienen la mutación en heterocigosis, Dado que nuestra
mutación chem se encuentra en el tercer cromosoma empleamos los balanceadores TM3 y TM6 y
realizamos un cuadro de Punnett (tabla 2) para esquematizar los porcentajes de mutación.
Para la colecta de embriones, se tomaron moscas adultas portadoras de la mutación chem y se
colocaron en distintos vasos de precipitado invertidos y se taparon con una caja de Petri pequeña
con gelatina y grenetina, Con un poco de levadura y se incubaron 24 hrs. Al día siguiente se
retiraron los adultos de la puesta y se dejó incubando la placa con embriones otras 24 hrs. Al día
siguiente se retiraron todas aquellas larvas que eclosionaron y se contó el número de huevos
vacios. Para la preparación de cutículas, se colectaron los embriones de dichas cajas con pinzas
teniendo cuidando de no maltratarlos y se colocaron dentro de una placa excavada con 400µl de
cloro-agua 1-1, por cinco minutos para disolver el corion. Se retiró el exceso de cloro y se
enjuagaron los embriones con buffer de fosfato (PBS). Posteriormente se sacaron los embriones
con la ayuda de una micropipeta tomando la menor cantidad de líquido posible y se colocaron en
un portaobjetos, se secó el exceso de PBS y se colocó una gota de Poly Vinyl Alcohol (PVA).Se
colocó un cubre objetos sobre la muestra, se sellaron los bordes de la laminilla y se colocaron en
una parrilla a 55º por 24 horas. Las laminillas se observaron al microscopio a (10 X/ 0.25) y se
realizó la cuenta y clasificación de los fenotipos presentes.
Por último se determinó el porcentaje de mortandad para los alelos chem 21, chem25 y chem 58
( Ver tablas 3-5 y figuras 3-5). y se obtuvieron fotografía (tabla 6).
TABLA 2. Cuadro de Punnett correspondiente a la cruza de moscas adultas que portan el alelo mutante chem y el
balanceador TM3. Se muestra que de la descendencia F1 el 50% es heterocigoto a la mutación (chem/ TM3) por lo
tanto llegará a adulto y portará los marcadores quetas Stubble (Sb) y alas Serrate (Ser) (Figura1 y 2). El 50%
restante mueren por ser homocigoto a la mutación (chem/ chem) ó al balanceador (TM3/ TM3; 25%).
chem x chem
TM3
TM3
chem 58
TM3
chem58
chem58
chem
chem58
TM3
TM3
chem58
TM3
TM3
TM3
FIG 1. Quetas Stubble
(Sb)
FIG 2. Alas Serrate (Ser).
2
DISCUSION DE RESULTADOS:
Un porcentaje de embriones logró eclosionar y desarrollarse como larva siendo heterocigotos a la
mutación y portadores de los marcadores quetas Stubble (Sb) y alas Serrate (Ser) Esto significa
que son heterocigotos. Al analizar las cutículas de los embriones encontramos que los que no
mostraban fenotipo eran homocigotos al balanceador (TM3/TM3) y denominados silvestres ( Ver
tablas 3-5 y figuras 3-5). Los embriones portadores de fenotipos mutantes como involución de la
cabeza y hoyo dorsal (figura 6) morían por ser homocigotos a la mutación chem. Suponemos que
el porcentaje faltante en las graficas para los homocigotos a chem se debe a que estos embriones
lograron eclosionar como larvas de primer instar pero igualmente murieron después.
TABLA 3
FIGURA 3
n
Balanceador
TM6B
Cientos
chem 25
869
20.48%
Apertura Dorsal
Involución de la
cabeza.
10.47%
Larvas
62.49%
6.56%
Larvas
Involución de la
Cabeza
Apertura Dorsal
Temprano
TM3 (wt)
FIGURA 4
chem 21
n
1078
Balanceador TM3
16.51%
Apertura Dorsal
Involución de la
cabeza
Larvas
8.72%
Cientos
TABLA 4
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
6.86%
67.90%
Larvas
Involución de la
cabeza
Apertura
Dorsal
Balanceador
(Wt)
FIGURA 5
chem 58
n
Balanceador
TM3
336
17.26%
Apertura Dorsal
Involución de la
cabeza.
8.93%
Larvas
67.26%
6.55%
Cientos
TABLA 5
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Larvas
Involución de la
cabeza.
Apertura
Dorsal
Balanceador
(Wt)
3
TABLA 6
Los siguientes embriones se encuentran con una orientación antero posterior y dorso ventral.
fotografía
Alelo y Fenotipo embrionario
fotografía
Chem 58
Embriones con fenotipo
Hoyo dorsal presentando un
hoyo anterior (Izq) y a veces
en la región posterior (Der.).
Chem25
También muestran Apertura
dorsal, donde se señala.
Chem 58
Involución de la cabeza
muestra un hoyo en la región
anterior.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
Campos, O. J. ” The embrionic development of Drosophila melanogaster” , Springer-Verlag,
Berlin Heidelberg, 1985.
Greenspan, R. J., Fly pushing, The Theory and the practice of Drosophila Genetics, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York, 1972.
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