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ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL
MANUAL DE LAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
Y DE LAS VACUNAS
PARA LOS ANIMALES TERRESTRES
(mamíferos, aves y abejas)
Volumen II
2004
Este Manual de animales terrestres ha sido editado por
la Comisión de Estándares Biológicos de la OIE y
adoptado por el Comité Internacional de la OIE
Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres
Quinta Edición, 2004 (Primera edición en español)
Manual of Recommended Diagnostic Techniques and Requirements for Biological Products:
Volumen I, 1989; Volumen II, 1990; Volumen III, 1991.
Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines:
Segunda Edición, 1992
Tercera Edición, 1996
Cuarta Edición, 2000
ISBN 92-9044-632-3
©
Copyright
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES, 2004
12, rue de Prony, 75017 Paris, FRANCE
Telephone: 33-(0)1 44 15 18 88
Fax: 33-(0)1 42 67 09 87
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Todas las publicaciones de la OIE (Organización mundial de sanidad animal) están protegidas por un Copyright
internacional. Extractos pueden copiarse, reproducirse, adaptarse o publicarse en publicaciones periódicas,
documentos, libros o medios electrónicos, y en cualquier otro medio destinado al público, con intención
informativa, didáctica o comercial, siempre y cuando se obtenga previamente una autorización escrita por parte
de la OIE.
Las designaciones y nombres utilizados y la presentación de los datos que figuran en esta publicación no
constituyen de ningún modo el reflejo de cualquier opinión por parte de la OIE sobre el estatuto legal de los
países, territorios, ciudades o zonas ni de sus autoridades, fronteras o limitaciones territoriales.
PRÓLOGO
El propósito de este Manual de animales terrestres es facilitar el comercio internacional de
animales y productos animales, así como contribuir a la mejora de los servicios de salud animal en
todo el mundo. Mediante la descripción de los métodos de laboratorio para el diagnóstico de
enfermedades y los requisitos para la producción y control de productos biológicos (principalmente
vacunas), ambos consensuados internacionalmente, se pone de manifiesto lo que constituye el
objetivo del Manual: la armonización de los elementos fundamentales de la prevención, vigilancia
y control de las enfermedades animales.
Este ambicioso objetivo ha requerido la cooperación de especialistas en salud animal de muchos
países. La OIE, Organización Mundial de Sanidad Animal, es, a todas luces, una de las
organizaciones más indicadas para acometer la mencionada tarea a nivel global. Las principales
actividades de la organización, que fue fundada en 1924 y en 2004 cuenta con 166 estados
miembros, son las siguientes:
1.
Asegurar la transparencia de la situación global relativa a la zoonosis y las enfermedades
animales.
2.
Recabar, analizar y difundir información científico-veterinaria.
3.
Ofrecer conocimiento experto y promover la solidaridad internacional para el control de las
enfermedades animales.
4.
Dentro de su mandato, sujeto al Acuerdo SPS con la OMC, salvaguardar el comercio
internacional mediante la publicación de estándares sanitarios para el comercio
internacional de animales y productos animales.
5.
Mejorar el marco legal y los recursos de los Servicios Nacionales de Veterinaria.
6.
Garantizar mejor la seguridad de los alimentos de origen animal y mejorar el bienestar
animal mediante procedimientos científicos.
El Manual de animales terrestres, que trata de las enfermedades infecciosas y parasitarias de los
mamíferos, aves y abejas, se publicó por primera vez en 1989. En cada nueva edición del Manual
se han ampliado y actualizado los contenidos del mismo. Esta quinta edición incluye capítulos
adicionales sobre infecciones zoonósicas, reflejando así la implicación creciente de la OIE en los
temas de salud pública. Como complemento al Código de sanidad animal, el Manual de animales
terrestres fija los estándares del laboratorio para todas las enfermedades de las listas A y B de la
OIE así como para otras varias enfermedades de importancia global. El Manual se ha venido
adoptando ampliamente como un texto de referencia de importancia crucial para los laboratorios
de veterinaria de todo el mundo. Las enfermedades de animales acuáticos se tratan por separado
en el Manual de animales acuáticos.
El Comité Internacional de la OIE asignó a la Comisión de Estándares Biológicos de la
Organización la tarea de encargar los capítulos y compilar el Manual de animales terrestres. Los
originales se solicitaron a expertos en cada una de las enfermedades o en otros temas incluidos
en el Manual. Después de su examen inicial por el Editor Técnico Consultor, los capítulos se
enviaron a los revisores científicos y a expertos de los laboratorios de referencia de la OIE.
También se enviaron a los países miembros, recabando su revisión y comentarios. Los
comentarios recibidos fueron examinados por la Comisión de Estándares Biológicos y el Editor
Técnico Consultor, quienes, en muchos casos, se los hicieron llegar a los autores para las
aclaraciones pertinentes, antes de dar forma definitiva a los capítulos. El texto final fue aprobado
por el Comité Internacional de la OIE.
Ante el incremento del volumen de contenidos del Manual de animales terrestres, ha sido
necesario publicar esta quinta edición en dos volúmenes. Es nuestro sincero deseo que este
Manual resulte de la mayor utilidad para los responsables de diagnóstico veterinario y para los
fabricantes de vacunas de todos los Países Miembros de la OIE.
Doctor Bernard Vallat
Director General de la OIE
Profesor Steven Edwards
Presidente de la Comisión de Estándares
Biológicos de la OIE
Enero 2004
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
iii
AGRADECIMIENTOS
Estoy sumamente agradecido a las muchas personas que han contribuido con su esfuerzo a la
preparación del presente Manual de animales terrestres. De forma especial, me gustaría expresar
mi agradecimiento a:
El Dr. B. Vallat, Director General de la OIE desde 2001 hasta el presente, por propiciar y
apoyar el proyecto de preparación de la nueva edición del Manual de animales terrestres,
Los Miembros de la Comisión de Estándares de la OIE, Prof. M. Truszczynski, Prof. S.
Edwards, Dr. B. Schmitt y Dr. A. Golovko, y los observadores en la reunión de la Comisión
de Estándares Biológicos, Dr. A. Diallo y Dr. P. Wright, quienes se responsabilizaron de
encargar los capítulos y, junto con el Editor Técnico Consultor, editar las contribuciones
hasta completar esta edición del Manual,
Los colaboradores relacionados en las páginas xxiv-xxxv, que aportaron su inestimable
tiempo y conocimiento experto en la redacción de los capítulos,
Los revisores y expertos de los laboratorios de referencia de la OIE, quienes dedicaron su
tiempo y conocimiento experto al examen de los capítulos,
Los países miembros de la OIE que aportaron comentarios sobre los borradores de los
capítulos que previamente se les había enviado. Esos comentarios resultaron esenciales
para hacer del Manual un texto internacionalmente aceptable,
Ms Sara Linnane, quien, como Editor Científico, organizó este complejo proyecto y
contribuyó de forma importante a mejorar la calidad del texto,
Los Doctores G.A. Cullen y J.E. Pearson, Editores Técnicos Consultores del Manual de
animales terrestres, que contribuyeron en gran medida a la edición y armonización de los
contenidos aportando la información requerida para subsanar cualquier laguna informativa,
Los miembros del Departamento Científico y Técnico de la OIE y del Departamento de
Publicaciones por su apoyo.
Dr. Abdoulaye Bouna Niang
Presidente del Comité Internacional de la OIE
Enero 2004
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
v
AGRADECIMIENTOS POR LA EDICIÓN ESPAÑOLA
Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a todos los que han posibilitado la primera edición en español
del Manual de las pruebas de diagnóstico y de las vacunas para los animales terrestres y a todos los que con su
trabajo han colaborado en la traducción al español, muy especialmente a:
El Dr. Vallat, por impulsar este Proyecto tan necesario para los veterinarios y técnicos y especialistas de
países de habla española.
Los gobiernos del Reino de España y de la República de Argentina, y en concreto al Ministerio de
Agricultura, Pesca y Alimentación (España) y al Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
(SENASA, Argentina), por sus contribución económica a este Proyecto.
Los miembros del “Comité Director para los proyectos de l´OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal)
de traducción del Manual of Standards for Diagnostics Tests and Vaccines al idioma español y Base
terminológica multilíngüe para el ámbito de la Sanidad Animal y ciencias afines”, los Doctores Angot
(Francia), Cabello Navarro (España), Acerbi (Argentina), Cruz de Urbina (Colombia), Serrano (Cuba), por
su colaboración y apoyo.
Los miembros del Grupo ad Hoc correspondiente, Profesores Doctores Rodríguez Ferri, Zepeda Seín,
Gimeno, León Vizcaíno, Cuello Gijón y Sánchez Vizcaíno por su participación activa en las correcciones
científicas y técnicas de los textos en español, así como por sus aportaciones, comentarios y críticas, que
han resultado fundamentales para la calidad de la traducción.
El Profesor Dr. Schudel, Jefe del Servicio Científico y Técnico de la OIE, que ha coordinado de forma
impecable las relaciones entre nuestra organización y el Comité Director y el Grupo ad Hoc.
El Profesor Dr. Gutiérrez Díez, miembro del Grupo ad Hoc, que ha llevado a cabo la coordinación
lingüística y traductológica de la versión española de este Manual y a su equipo de traductores.
El Profesor Dr. Crespo León, Secretario del Comité Director y del Grupo ad Hoc, que fue el coordinador
científico y técnico de este Proyecto.
Dr. Abdoulaye Bouna Niang
Presidente del Comité Internacional de la OIE
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
vii
CONTENIDOS
VOLUMEN II
Introducción: cómo usar el Manual de animales terrestres........................................
Lista de pruebas para el comercio internacional........................................................
Abreviaturas más comunes usadas en el Manual de animales terrestres
Glosario terminológico...............................................................................................
Colaboradores............................................................................................................
SECCCIÓN 2.4.
ENFERMEDADES OVINAS Y CAPRINAS - LISTA B
Capítulo 2.4.1.
Capítulo 2.4.2.
Capítulo 2.4.3.
Capítulo 2.4.4/5.
Capítulo 2.4.6.
Capítulo 2.4.7.
Capítulo 2.4.8.
Capítulo 2.4.9.
Capítulo 2.4.10.
Capítulo 2.4.11.
Epididimitis ovina (Brucella ovis)................................................................................
Brucelosis caprina y ovina (no debida a Brucella ovis)..............................................
Agalaxia contagiosa...................................................................................................
Artritis/encefalitis caprina y Maedi-visna....................................................................
Pleuroneumonia caprina contagiosa..........................................................................
Aborto enzoótico de las ovejas (Clamidiosis ovina) ..................................................
Prurigo lumbar............................................................................................................
Adenomatosis pulmonar ovina...................................................................................
Enfermedad de Nairobi* (ver capítulo 2.10.2)............................................................
Salmonelosis (S. abortusovis)* (ver capítulo 2.10.3)................................................
SECCIÓN 2.5.
ENFERMEDADES EQUINAS — LISTA B
Capítulo 2.5.1.
Capítulo 2.5.2.
Capítulo 2.5.3.
Capítulo 2.5.4.
Capítulo 2.5.5.
Capítulo 2.5.6.
Capítulo 2.5.7.
Capítulo 2.5.8.
Capítulo 2.5.9.
Capítulo 2.5.10.
Capítulo 2.5.11.
Capítulo 2.5.12.
Capítulo 2.5.13.
Capítulo 2.5.14.
Capítulo 2.5.15.
Metritis equina contagiosa .........................................................................................
Durina.........................................................................................................................
Encefalomielitis equina (del Este y del Oeste)...........................................................
Anemia infecciosa equina..........................................................................................
Gripe equina...............................................................................................................
Piroplasmosis equina.................................................................................................
Rinoneumonitis equina...............................................................................................
Muermo......................................................................................................................
Viruela equina............................................................................................................
Arteritis vírica equina..................................................................................................
Sarna equina* (ver capítulo 2.10.4)............................................................................
Encefalomielitis equina venezolana...........................................................................
Linfangitis epizoótica..................................................................................................
Encefalitis japonesa...................................................................................................
Tripanosomosis (Trypanosoma evansi)…..................................................................
SECCCIÓN 2.6.
ENFERMEDADES PORCINAS — LISTA B
Capítulo 2.6.1.
Capítulo 2.6.2.
Capítulo 2.6.3.
Rinitis atrófica porcina................................................................................................
Brucelosis porcina......................................................................................................
Encefalomielitis por enterovirus (anteriormente enfermedades de
Teschen/Talfan)…………………………………………………………………………..…
Capítulo 2.6.4.
Capítulo 2.6.5.
Capítulo 2.6.6.
Gastroenteritis transmisible........................................................................................
Síndrome reproductivo y respiratorio porcino............................................................
Cisticercosis porcina* (ver capítulo 2.10.1)................................................................
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xi
xiii
xvii
xix
xxiv
635
644
653
661
670
683
690
703
708
709
711
718
725
733
738
751
760
771
779
780
793
794
800
806
815
827
835
844
851
862
877
ix
Contenidos
SECCIÓN 2.7.
ENFERMEDADES DE LAS AVES - LISTA B
Capítulo 2.7.1.
Capítulo 2.7.2.
Capítulo 2.7.3.
Capítulo 2.7.4.
Capítulo 2.7.5.
Capítulo 2.7.6.
Capítulo 2.7.7.
Capítulo 2.7.8.
Capítulo 2.7.9.
Capítulo 2.7.10.
Capítulo 2.7.11.
Capítulo 2.7.12.
Bursitis infecciosa (Enfermedad de Gumboro)...........................................................
Enfermedad de Marek................................................................................................
Micoplasmosis aviar (Mycoplasma gallisepticum)......................................................
Clamidiosis aviar........................................................................................................
Pulorosis y tifosis aviar...............................................................................................
Bronquitis infecciosa aviar.........................................................................................
Laringotraqueitis infecciosa aviar...............................................................................
Tuberculosis aviar......................................................................................................
Hepatitis vírica del pato..............................................................................................
Enteritis vírica del pato...............................................................................................
Cólera aviar (Pateurelosis aviar)................................................................................
Viruela aviar...............................................................................................................
SECCIÓN 2.8.
ENFERMEDADES DE LOS LAGOMORFOS - LISTA B
Capítulo 2.8.1.
Capítulo 2.8.2.
Capítulo 2.8.3.
Mixomatosis...............................................................................................................
Tularemia...................................................................................................................
Enfermedad hemorrágica del conejo.........................................................................
SECCIÓN 2.9.
ENFERMEDADES DE LAS ABEJAS - LISTA B
Capítulo 2.9.1.
Capítulo 2.9.2.
Capítulo 2.9.3.
Capítulo 2.9.4.
Capítulo 2.9.5.
Capítulo 2.9.6.
Nota introductoria sobre las enfermedades de las abejas………………………….....
Acariosis de las abejas..............................................................................................
Loque americana.......................................................................................................
Loque europea………………………………………………………………………….…..
Nosemosis de las abejas...........................................................................................
Varroosis....................................................................................................................
Infestación de las abejas melíferas por Tropilaeps (Tropilaelaps clareae,
T. koenigerum)1..........................................................................................................
SECTION 2.10.
ENFERMEDADES NO INCLUIDAS EN LA LISTA A NI EN LA LISTA B2
Capítulo 2.10.1.
Capítulo 2.10.2.
Cisticercosis*..............................................................................................................
Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la Fiebre del Valle del
Rift)*…………………………………………………………………………………………..
Capítulo 2.10.3.
Capítulo 2.10.4.
Capítulo 2.10.5.
Capítulo 2.10.6.
Capítulo 2.10.7.
Capítulo 2.10.8.
Capítulo 2.10.9.
Capítulo 2.10.10.
Capítulo 2.10.11.
Capítulo 2.10.12.
Capítulo 2.10.13.
Capítulo 2.10.14.
Salmonelosis*............................................................................................................
Sarna*........................................................................................................................
Enfermedad de la frontera..........................................................................................
Diarrea vírica bovina..................................................................................................
Encefalitis del Oeste del Nilo.....................................................................................
Campylobacter Jejuni y Campylobacter Coli...........................................................
Criptosporidiosis........................................................................................................
Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah...........................................................
Gripe porcina.............................................................................................................
Toxoplasmosis...........................................................................................................
Escherichia coli Verocitotoxigénica...........................................................................
Listeria monocytogenes.............................................................................................
PARTE 3
EXPERTOS DE REFERENCIA DE LA OIE E ÍNDICE DE ENFERMEDADES
Lista de laboratorios de referencia de la OIE (Enero 2004).......................................................................
Lista de enfermedades por orden alfabético..............................................................................................
879
896
905
920
934
945
957
965
974
983
991
998
1005
1014
1020
1035
1036
1042
1051
1055
1060
1065
1069
1080
1092
1108
1116
1127
1141
1150
1161
1181
1192
1202
1210
1222
1241
1261
1
2
Esta enfermedad no se incluye en la Lista B
Las primeras cuatro enfermedades de esta lista, marcadas con un asterisco, están incluidas en algunas secciones de
especies individuales de la Lista B, pero estos capítulos incluyen varias especies y, por lo tanto, contienen un
descripción más amplia.
x
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
INTRODUCCIÓN
(Sobre la utilización del
Manual de animales terrestres)
•
Estructura del Manual de animales terrestres y sistema de numeración
La Parte I, al comienzo del Manual, contiene diez capítulos introductorios sobre diversos temas
generales de interés para los responsables de diagnóstico de los laboratorios de veterinaria. Cada
uno de los capítulos es una introducción al tema enunciado, y todos ellos contienen información
básica no estandarizada.
El cuerpo principal del Manual de animales terrestres (Parte 2) contiene los estándares para las
pruebas de diagnóstico y las vacunas para las enfermedades listadas en el Código sanitario de
animales terrestres de la OIE. Estas aparecen en el mismo orden y con el mismo sistema de
numeración que se utiliza en el Código Sanitario a fin de facilitar las referencias cruzadas entre los
dos libros. La Lista A contiene las enfermedades transmisibles que pueden propagarse
rápidamente, y con graves consecuencias, a través de las fronteras entre países. Son
enfermedades de consecuencias especialmente graves por su incidencia en la salud pública y sus
repercusiones socio-económicas. En la Lista B aparecen las enfermedades transmisibles de
consecuencias igualmente graves para la salud pública y el ámbito socio-económico, aunque
restringidas a ciertos países; tienen un impacto en el comercio internacional de animales y de
productos animales. La lista B se subdivide según la especie animal hospedadora.
Las cuatro primeras enfermedades de la Sección 2.10 se incluyen en algunas secciones de la
Lista B, que se refieren a especies individuales; pero en estos capítulos se tratan varias especies,
ofreciendo así una visión más amplia. En la Sección 2.10 se incluyen algunas otras enfermedades
que también son importantes para el comercio, y a las que no se les asigna un capítulo específico
en el Código sanitario de animales terrestres.
Los colaboradores de los distintos capítulos aparecen relacionados en las páginas xxiv–xxxviii,
pero la responsabilidad última en relación con los contenidos del Manual de animales terrestres
recae en el Comité Internacional de la OIE.
Al final del Volumen II se ofrece un índice alfabético de enfermedades.
• Formato de los capítulos
Cada capítulo se inicia con un resumen del contenido, a fin de proporcionar a los oficiales
veterinarios y a otros lectores una información sucinta sobre las pruebas y las vacunas disponibles
para el tratamiento de la enfermedad. A continuación del resumen, se ofrece el texto completo,
con información detallada para los operarios del laboratorio. En la Parte A de cada capítulo, se
ofrece una introducción general sobre la enfermedad; en la Parte B, se incluye el diagnóstico de la
enfermedad en el laboratorio; y en la Parte C (en los casos en que sea pertinente), se tratan los
requisitos para las vacunas y los productos biológicos para el diagnóstico in vivo. La información
sobre la producción y control de las vacunas o los materiales de diagnóstico se ofrecen a modo de
ejemplo: no siempre es necesario ajustarse a esa información, sobre todo en los casos en que
existan razones científicamente fundamentadas para la utilización de enfoques alternativos. Al
final de cada capítulo, se incluyen las referencias bibliográficas como fuente de información
adicional.
• Explicación de las pruebas descritas y del cuadro de las páginas xiii–xvi
En el cuadro de las páginas xiii–xvi aparece un listado de las pruebas de diagnóstico clasificadas
en dos categorías: “pruebas prescritas” y “pruebas alternativas”. Las prescritas son las pruebas
que se exigen en el Código sanitario de animales terrestres para ser aplicadas a los animales
antes de su transporte internacional. En el Manual de animales terrestres, tales pruebas aparecen
en tipo azul. En la actualidad no se dispone de pruebas prescritas para todas las enfermedades
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xi
Introducción
de las listas A y B. Las pruebas alternativas son aquellas que conviene aplicar para el diagnóstico
de la enfermedad en un ámbito geográfico local, y que también se pueden utilizar de cara a la
importación/exportación de animales previo acuerdo bilateral. Dentro de los capítulos, a menudo
se describen otras pruebas que pueden ser de utilidad práctica en situaciones de ámbito local o
que están todavía en proceso de desarrollo.
• Lista de laboratorios de referencia de la OIE
En la Parte 3 del presente Manual de animales terrestres se ofrece una lista de laboratorios de
referencia de la OIE. Dichos laboratorios han sido designados por la OIE como centros de
excelencia por su conocimiento experto en campos específicos. Tienen capacidad para asesorar a
otros laboratorios sobre cuestiones de metodología. En ocasiones pueden obtenerse de estos
laboratorios de excelencia cepas estándar de microorganismos o reactivos de referencia (por
ejemplo, antisueros o antígenos).
La lista de laboratorios de referencia será actualizada cada año por el Comité Internacional de la
OIE. Existe una lista actualizada en la página Web de la propia OIE.
*
* *
xii
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
LISTA DE PRUEBAS PARA EL COMERCIO
INTERNACIONAL
En el cuadro inferior aparece un listado de las pruebas de diagnóstico clasificadas según dos
categorías: “pruebas prescritas” y “pruebas alternativas”. Las prescritas se exigen en el Código
sanitario de animales terrestres de la OIE para el transporte internacional de animales y de
productos animales, y se consideran como las más adecuadas para determinar el estado de salud
de los animales. Tales pruebas aparecen impresas en letra azul en el Manual de animales
terrestres. En la actualidad no se dispone de pruebas prescritas para todas las enfermedades de
las listas A y B. Las pruebas alternativas son las adecuadas para el diagnóstico de la enfermedad
en un ámbito geográfico local, y también se pueden utilizar de cara a la importación/exportación
de animales, previo acuerdo bilateral. Dentro de los capítulos, se describen a menudo otras
pruebas que pueden ser de utilidad práctica en situaciones de ámbito local o que están todavía en
proceso de desarrollo.
Capítulo Nº
Nombre de la enfermedad
2.1.1.
Fiebre aftosa
2.1.2.
Estomatitis vesicular
2.1.3.
Enfermedad vesicular porcina
2.1.4.
Peste bovina
2.1.5.
Peste de los pequeños rumiantes
2.1.6.
Pleuroneumonía bovina contagiosa
2.1.7.
Pruebas prescritas
Pruebas alternativas
ELISA*, NV
FC
FC, ELISA, NV
–
NV
ELISA
ELISA
NV
NV
ELISA
FC, ELISA
–
Dermatosis nodular contagiosa
–
VN
2.1.8.
Fiebre del Valle del Rift
–
HI, ELISA, PRN
2.1.9.
Lengua azul
Id. agente, IGDA,
ELISA, PCR
NV
2.1.10.
Viruela ovina y viruela caprina
–
NV
2.1.11.
Peste equina africana
FC, ELISA
NV
2.1.12.
Peste porcina africana
ELISA
IFI
2.1.13.
Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
NPLA, FAVN, ELISA
–
2.1.14.
Gripe aviar muy virulenta
–
IGDA, HI
2.1.15.
Enfermedad de Newcastle
–
HI
2.2.1.
Carbunco
–
–
2.2.2.
Enfermedad de Aujeszky
ELISA, NV
–
2.2.3.
Equinococosis/Hidatidosis
–
–
2.2.4.
Leptospirosis
–
MAT
2.2.5.
Rabia
NV
ELISA
2.2.6.
Paratuberculosis (enfermedad de Johne
–
DTH, ELISA
2.2.7.
Cowdriosis
–
ELISA, IFI
2.2.8.
Larva perforada del Nuevo Mundo
(Cochliomyia hominivorax y del Viejo
Mundo (Chrysomya bezziana)
–
Id. agente
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xiii
Lista de pruebas para el comercio internacional
•
Hay que consultar los capítulos del Manual de animales terrestres para comprobar el método prescrito
Capítulo Nº
2.2.9.
Triquinelosis
2.2.10.
Pruebas prescritas
Pruebas alternativas
Id. agente
ELISA
Fiebre Q
–
CF
2.2.11.
Leishmaniosis
–
Id. agente
2.3.1.
Brucelosis bovina
–
2.3.2.
Campilobacteriosis genital bovina
BBAT, FC,
ELISA, FPA
Id. agente
2.3.3.
Tuberculosis bovina
2.3.4.
Leucosis bovina enzoótica
2.3.5.
2.3.6.
Rinotraqueitis bovina infecciosa
/vulvovaginitis pustular infecciosa
Tricomonosis
2.3.7.
Prueba de la
tuberculina
IGDA, ELISA
–
–
PCR
NV, ELISA, Id. agente
(sólo semen)
Id. agente
Agg. moco
Anaplasmosis bovina
–
FC, Agg. card
2.3.8.
Babesiosis bovina
–
ELISA, IFI
2.3.9.
Cisticercosis bovina
–
Id. agente
2.3.10.
Dermatofilosis
–
–
2.3.11.
Teileriosis
Id. agente, IFI
–
2.3.12.
Septicemia hemorrágica
–
Id. agente
2.3.13.
Encefalopatía espongiforme bovina
–
–
2.3.14.
Fiebre catarral maligna
–
NV, IFI, PCR
2.3.15.
Tripanosomosis (transmitida por la
mosca tsé-tsé)
Epididimitis ovina (Brucella ovis)
–
IFI
FC
ELISA
BBAT, FC
Prueba de la brucelina
–
–
IGDA, ELISA
–
FC
–
2.4.1.
2.4.2.
2.4.3.
2.4.4/5.
xiv
Nombre de la enfermedad
Brucelosis caprina y ovina
(no debida Brucella ovis)
Agalaxia contagiosa
Artritis/encefalitis caprina y Maedi-visna
–
2.4.6.
Pleuroneumonía caprina contagiosa
2.4.7.
–
FC
2.4.8.
Aborto enzoótico de las ovejas
(Clamidiosis ovina)
Prurigo lumbar
–
–
2.4.9.
Adenomatosis pulmonar ovina
–
–
2.4.10.
Enfermedad de Nairobi
–
–
2.4.11.
Salmonelosis (S. Abortus ovis)
–
Id. agente
2.5.1.
Metritis equina contagiosa
Id. agente
–
2.5.2.
Durina
FC
IFI, ELISA
2.5.3.
–
HI, FC, PRN
2.5.4.
Encefalomielitis equina (del Este y del
Oeste)
Anemia infecciosa equina
IGDA
ELISA
2.5.5.
Gripe equina
–
HI
2.5.6.
Piroplasmosis equina
ELISA, IFI
FC
2.5.7.
Rinoneumonitis equina
–
NV
2.5.8.
Muermo
Prueba de la maleína,
FC
–
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Lista de pruebas para el comercio internacional
Capítulo Nº
Nombre de la enfermedad
Pruebas prescritas
Pruebas alternativas
2.5.10.
Arteritis vírica equina
NV, Id. agente (en
muestras de semen)
–
2.5.11.
Sarna equina
–
Id. agente
2.5.12.
Encefalomielitis equina venezolana
–
HI, FC, PRN
2.5.13.
Linfangitis epizoótica
–
–
2.5.14.
Encefalitis japonesa
–
–
2.5.15.
Tripamosomosis (Trypansoma evansi)
–
–
2.6.1.
Rinitis atrófica porcina
–
–
2.6.2.
Brucelosis porcina
ELISA
BBAT, FPA
2.6.3.
Encefalomielitis por enterovirus
(anteriormente enfermedades de
Teschen/Talfan)
Gastroenteriris transmisible
–
NV
–
NV, ELISA
Síndrome reproductivo y respiratorio
porcino
Cisticercosis porcina
–
ELISA, IFI, IPMA
–
Id. agente
Bursitis infecciosa (Enfermedad de
Gumboro )
Enfermedad de Marek
–
IGDA, ELISA
–
IGDA
–
Agg., HI
2.7.4.
Micoplasmosis aviar
(Mycoplasma gallisepticum)
Clamidiosis aviar
–
–
2.7.5.
Pulorosis y taifosis aviar
–
Agg., Id. agente
2.7.6.
Bronquitis infecciosa aviar
–
NV, HI, ELISA
2.7.7.
Laringotraqueitis infecciosa aviar
–
IGDA, NV, ELISA
2.7.8.
Tuberculosis aviar
–
Prueba de la
tuberculina,
Id. agente
2.7.9.
Hepatitis vírica del pato
–
–
2.7.10.
Enteritis vírica del pato
–
–
2.7.11.
Cólera aviar (pasteulerosis aviar)
–
–
2.7.12.
Viruela aviar
–
–
2.8.1.
Mixomatosis
–
IGDA, FC, IFI
2.8.2.
Tularemia
–
Id. agente
2.8.3.
Enfermedad hemorrágica del conejo
–
HI
2.9.1.
Acariosis de las abejas
–
–
2.9.2.
Loque americana
–
–
2.9.3.
Loque europea
–
–
2.9.4.
Nosemosis de las abejas
–
–
2.9.5.
Varroosis
–
–
2.9.6.
Infestación de las abejas melíferas por
Tropilaelaps (Tropilaelaps clareae, T.
koenigerum)
–
–
2.10.1.
Cisticercosis
2.6.4.
2.6.5.
2.6.6.
2.7.1.
2.7.2.
2.7.3.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Id. agente
xv
Lista de pruebas para el comercio internacional
Capítulo Nº
Nombre de la enfermedad
Pruebas prescritas
Pruebas alternativas
2.10.2.
Enfermedades bunyavirales de
animales (excluyendo la Fiebre del
Valle del Rift)
–
–
2.10.3.
Salmonelosis
–
Id. agente
2.10.4.
Sarna
–
Id. agente
2.10.5.
Enfermedad de la frontera
Id. agente
–
2.10.6.
Diarrea vírica bovina
Id. agente
–
2.10.7.
Encefalitis del Oeste del Nilo
–
–
2.10.8.
Campylobacter jejuni and C. Coli
–
–
2.10.9.
Criptosporidiosis
–
–
2.10.10.
Enfermedades víricas de Hendra y de
Nipah
–
–
2.10.11.
Gripe porcina
–
–
2.10.12.
Toxoplasmosis
–
–
2.10.13.
Escherichia coli Verocitotoxigénica
–
–
2.10.14.
Listeria monocytogenes
–
–
Nota: Las pruebas prescritas por el Código sanitario de animales terrestres a efectos de comercialización
internacional se han impreso en letra azul en el Manual de animales terrestres.
Abreviaturas
Id. agente
Identificación del agente
HI
Inhibición de la hemaglutinación
Agg.
Prueba de aglutinación
IFI
Inmunofluorescencia indirecta
IGDA
Inmunodifusión en gel de agar
IPMA
Prueba de inmunoperoxidasa en
monocapa
BBAT
Prueba con antígeno tamponado de Brucella
MAT
Prueba de aglutinación microscópica
FC
(Prueba de) fijación del complemento
NPLA
Prueba de neutralización acoplada a la
peroxidasa
DTH
Hipersensibilidad retardada
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
ELISA
Prueba de enzimoinmunoensayo
PRN
Neutralización por reducción de calvas
FAVN
Neutralización vírica con anticuerpo
fluorescente
NV
Neutralización vírica
FPA
Prueba de polarización de la fluorescencia
–
Prueba por designar
xvi
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
ABREVIATURAS UTILIZADAS EN EL MANUAL DE
ANIMALES TERRESTRES
ABTS
ATCC1
BBAT
BFK
BGPS
BHK
BLP
BPAT
BSA
BSF
CAM
CEF
CFU
CIEP
CK
CPLM
CSY
DEAE
DEPC
DICT50
DMEM
DMSO
DTH
ECP
EGTA
EID
ELISA
EMTM
EYL
FAT
FAVN
FBS
FC
FITC
FLK
FPA
g
GIT
HA
ácido 2,2’-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)6-sulfónico
Colección americana de cultivos tipo
Prueba con antígeno tamponado de
Brucella
(Células de ) riñón fetal bovino
Medio con extracto de carne-glucosapeptona y suero
Línea celular de riñón de hamster
neonato
Lactosa y peptona tamponada
Prueba con antígeno tamponado en
placa
Albúmina de suero bovino
Factores del suero bovino
Membrana corioalantoidea
Fibroblasto de embrión de pollo
Unidad formadora de colonia
Contrainmunoelectroforesis
Células de riñón de ternero
Medio con cisteína-peptona-infusión de
hígado y maltosa
Medio con caseína-sacarosa y levadura
(con agar)
Dietilaminoetil
Dietil pirocarbonato
Dosis infectiva del 50% en cultivo celular
Medio de Eagle modificado por Dulbecco
Dimetil sulfóxido
Hipersensibilidad retardada
Efecto citopático
Ácido etilén glicol tetra-acético
Dosis infecciosa en huevo
Prueba de enzimoinmunoensayo
Medio de Tobie modificado por Evans
Solución salina equilibrada de Earle con
lactalbúmina y levadura
Prueba de anticuerpo fluorescente
Neutralización vírica con anticuerpo
fluorescente
Suero bovino fetal
(Prueba de) fijación del complemento
Isotiocianato de fluoresceína
(Células de) riñón de cordero fetal
Prueba de polarización de la
fluorescencia
Fuerza centrífuga relativa
Prueba de inhibición del crecimiento
Hemaglutinación
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
HAD
HBSS
HEP
HEPES
HI
HRPO
IB
ICFTU
ICPI
ID50
IFI
IGDA
IHA
IPMA
IVPI
LA
LD
LEP
MAb
MAT
MCS
MDT
MEM
MHC
MSV
NI
NV
OGP
OPD
OPG
PAGE
PAP
PAS
PBS
PCR
PD
PFU
PHA
PPD
PPLO
PRN
Hemadsorción
Solución salina equilibrada de Hanks
Alto número de pases en huevo (virus)
Ácido N-2-hidroxietilpiperazina, N-2etanosulfónico (tampón)
Inhibición de la hemaglutinación
Peroxidasa de rábano
Prueba de inmunodetección
Unidad internacional de la prueba de
fijación de complemento
Índice de patogenicidad intracerebral
Dosis infecciosa media
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
Inmunodifusión en gel de agar
Hemaglutinación indirecta
Prueba de inmunoperoxidasa en
monocapa
Índice de patogenicidad intravenosa
Aglutinación con látex
Dosis letal
Bajo número de pases en huevo (virus)
Anticuerpo monoclonal
Prueba de aglutinación microscópica
Stock de células iniciales
Tiempo letal medio
Medio mínimo esencial
Complejo mayor de histocompatibilidad
Virus inicial de siembra
Índice de neutralización
Neutralización viral
1-octil-beta-D-glucopiranósido (tampón)
Ortofenildiamina (tampón)
Solución conservante con oxalasa-fenol
y glicerina
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Peroxidasa–antiperoxidasa
(procedimiento de tinción)
Reacción de Schiff con ácido periódico
Solución salina tamponada con fosfato
Reacción en cadena de la polimerasa
Dosis protectora
Unidad formadora de calvas o halos
Prueba de hemaglutinación pasiva
Derivado de proteína purificada
Organismos semejantes a los causantes
de pleuroneumonía
Neutralización por reducción de calvas
xvii
Abreviaturas utilizadas en el Manual de animales terrestres
PSG
Solución salina tamponada con fosfato
más glucosa
RBC
Eritrocito
RFLP
Polimorfismo de fragmentos de
restricción
RK
Riñón de conejo
RPM
Revoluciones por minuto
RSA
Aglutinación sérica rápida
RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa
con transcripción inversa
SAT
Prueba de aglutinación sérica
SDS
Dodecil sulfato sódico
SNC
SPF
SPG
SRBC
TMB
TSI
UI
VB
VBS
Vero
Sistema nervioso central
Libre de patógeno específico
Sacarosa, fosfato y ácido glutámico
Eritrocito de oveja
Tetrametil benzidina
Medio de hierro y triple azúcar
Unidades internacionales
Tampón veronal
Solución salina tamponada con veronal
Células de riñón de mono verde african
ABREVIATURAS DE LOS NOMBRES DE ENFERMEDADES
AEC
AIE
APO
AVE
BI
BIA
CA
DNC
DVB
EA
EEB
EEE
EEO
EEV
EHC
EM
EV
EVP
EVP
FA
FCM
FVR
GAMV
1
Artritis/encefalitis caprina
Anemia infecciosa equina
Adenomatosis pulmonar ovina
Arteritis vírica equina
Bursitis infecciosa
Bronquitis infecciosa aviar
Clamidiosis aviar
Dermatosis nodular contagiosa
Diarrea vírica bovina
Enfermedad de la frontera
Encefalopatía espongiforme bovina
Encefalomielitis equina del este
Encelalomielitis equina del oeste
Encefalomielitis equina venezolana
Enfermedad hemorrágica del conejo
Enfermedad de Marek
Estomatitis vesícular
Enfermedad vesicular porcina
Enteritis vírica del pato
Fiebre aftosa
Fiebre catarral maligna
Fiebre del Valle del Rift
Gripe aviar muy virulenta
GET
HVP
LA
LBE
LPNM
LPVM
LTI
MV
NPO
PBC
PEA
PNCC
PPA
PPC
PPR
RBI/VPI
RE
SH
SRRP
Gastroenteritis transmisible
Hepatitis vírica del pato
Lengua azul
Leucosis bovina enzoótica
Larva perforada del nuevo mundo
Larva perforada del viejo mundo
Laringotraqueitis infecciosa aviar
Maedi-visna
Neumonía progresiva ovina de las
Ovejas
Pleuroneumonía bovina contagiosa
Peste equina africana
Pleuroneumonía caprina contagiosa
porcino
Peste porcina africana
Peste porcina clásica
Peste de los pequeños rumiantes
Rinotraqueitis bovina infecciosa/
Vulvovaginitis pustular infecciosa
Rinoneumonitis equina
Septicemia hemorrágica
Síndrome reproductivo y respiratorio
Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos de
América.
xviii
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
GLOSARIO DE TÉRMINOS
Las definiciones dadas a continuación se han seleccionado con el criterio restrictivo de incluir
solamente las que pueden ser de utilidad para los usuarios del Manual de animales terrestres.
•
Absorbancia/densidad óptica
Absorbancia y densidad óptica son términos utilizados para indicar la fuerza de la reacción. Se utiliza un
espectrofotómetro para medir la cantidad de luz de la longitud de onda específica absorbida por una muestra, y
la absorbancia es proporcional a la cantidad de material analizado que está presente.
•
Animal de referencia
Cualquier animal cuyo estatus infeccioso pueda definirse de forma inequívoca; puede incluir animales enfermos,
infectados, vacunados, inmunizados o animales sin ninguno de los rasgos anteriores.
•
Armonización
Calibración de métodos de prueba idénticos o similares frente a reactivos internacionales estándar y expresión
de los resultados cuantitativos o semi-cuantitativos de la prueba, que han sido normalizados frente a estándares
de trabajo incorporados en cada realización de la prueba.
•
Característica de la realización
Propiedad del método de prueba; puede incluir la sensibilidad y especificidad analíticas, la exactitud, la
precisión, y/o la sensibilidad y especificidad diagnósticas.
•
Célula maestra (línea, stock, inóculo)
Conjunto de alícuotas de células de un determinado número de pases, que se utilizan en la preparación o
prueba de un producto biológico, se distribuye dentro de recipientes en una operación individual, se procesa
conjuntamente y se almacena de forma que queda garantizada la uniformidad y la estabilidad, y se evita la
contaminación.
•
Células primarias
Grupo de células originales derivadas de tejido normal incluyendo el décimo subcultivo.
•
Centrifugación
En todo el texto del Manual, el promedio de centrifugación se expresa como la fuerza centrífuga relativa,
simbolizada por ‘g’. La fórmula es:
(rpm ‰ 0,10472)2
‰ radio (cm) = g
980
donde rpm es la velocidad del rotor en revoluciones por minuto, y donde radio (cm) es el radio del brazo del rotor
hasta la parte baja del tubo, en centímetros.
Puede ser necesario calcular el rpm necesario para alcanzar un valor dado de g, con un rotor específico. La
fórmula es:
rpm =
«g ‰ 980 /radio (cm)
0,10472
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xix
Glosario de términos
•
Comparación entre laboratorios (Ensayo en anillo)
Cualquier evaluación de la realización de una prueba y/o de la competencia de un laboratorio para ensayar
muestras determinadas, llevada a cabo por dos o más laboratorios; un laboratorio puede actuar como referencia
en la definición de los atributos de las muestras a ensayar.
•
Control del proceso
Los procedimientos de prueba llevados a cabo durante la fabricación de un producto biológico para garantizar
que el producto cumple con las normas de calidad acordados.
•
Controles internos
Todas las actividades tendentes a garantizar la calidad dentro de un laboratorio y que están directamente
relacionadas con el control, la validación, y el mantenimiento de las condiciones de realización y suficiencia
técnica de la prueba.
•
Diluciones
Cuando se dan diluciones para preparar reactivos líquidos, éstas se expresan como, por ejemplo, 1 en 4 partes
o una cuarta parte (1/4), lo que significa que una parte se añade a cuatro partes, es decir, un 20% de la solución
A en B.
•
•
v/v = volumen a volumen (dos líquidos)
•
w/v = peso a volumen (sólido añadido a líquido).
Diluciones utilizadas en las pruebas de neutralización vírica
Hay dos formas convencionales de expresar la dilución utilizada en las pruebas de neutralización vírica (NV). En
Europa es costumbre expresar la dilución antes de la adición del antígeno, pero en Estados Unidos y en otros
lugares, es común expresar las diluciones después de la adición del antígeno.
Estas convenciones alternativas se expresan en el presente Manual como “dilución inicial” o “dilución final”,
respectivamente.
•
Eficacia
Capacidad específica que tiene un producto biológico para producir el resultado esperado, cuando aquél se
utiliza bajo las condiciones recomendadas por el fabricante.
•
Ensayo
Sinónimo de prueba o método de prueba, como enzimoinmunoensayo o prueba de fijación de complemento.
•
Especificidad (analítica)
Grado en el que los materiales analizados distintos al material problema reaccionan en una prueba; cuanto más
alto sea el nivel de reacciones cruzadas, más baja será la especificidad analítica.
•
Especificidad (diagnóstica)
Proporción de animales de referencia no infectados que se sabe que presentan un resultado negativo en la
prueba; se considera que los animales infectados que presentan un resultado positivo tienen resultados
positivos falsos.
•
Especificidad (relativa)
Proporción de animales de referencia, definidos como negativos mediante un método de prueba o una
combinación de métodos, que también dan resultado negativo en el ensayo que se compara.
•
Espécimen
Material sometido a prueba.
•
Esterilidad
Ausencia de microorganismos contaminantes viables, que se establecerá mediante pruebas autorizadas y
adecuadas.
xx
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Glosario de términos
•
Exactitud
Nivel de concordancia entre el valor obtenido en la prueba y el valor esperado para un estándar de referencia
de actividad o título conocido.
•
Incidencia
Estimación del número de nuevas infecciones en una población susceptible durante un período de tiempo
determinado; no debe confundirse con la prevalencia.
•
Inóculo de producción
Un organismo en un determinado número de pases, que se utiliza, sin propagación adicional, para iniciar la
preparación de un lote de producción.
•
Inóculo de trabajo
Organismo con un número de pases comprendido entre el inóculo original y el inóculo de producción.
•
Inóculo original (agente, cepa)
Conjunto de alícuotas de un organismo de un determinado número de pases, del que se derivan todos los otros
pases del inóculo, que se obtienen de un lote individual, se distribuyen en recipientes en una operación
individual, se procesan conjuntamente y se almacenan de forma que queden aseguradas la uniformidad y la
estabilidad y se eviten la contaminación.
•
Laboratorio de referencia
Laboratorio de reconocido nivel de capacitación científica y diagnóstica en que concierne a una determinada
enfermedad animal y/o a la metodología de pruebas; incluye la capacidad para describir y evaluar los reactivos y
muestras de referencia.
•
Libre de patógenos específicos (SPF)
Animales de los que se ha demostrado, mediante el uso de pruebas adecuadas, que están libres de
microorganismos patógenos específicos; también se refiere a los huevos provenientes de aves SPF.
•
Línea celular
Línea de células transformada y estable que tiene una alta capacidad de multiplicación in vitro.
•
Lote
Todas las vacunas u otros reactivos, tales como antígeno o antisueros, derivados del mismo lote homogéneo e
identificados mediante un solo número de código.
•
Método de la prueba
Procedimiento técnico específico para la detección del material a analizar (sinónimo de ensayo).
•
Muestra
Material obtenido de un espécimen y utilizado en las pruebas.
•
Potencia
La potencia relativa de un producto biológico puesta de manifiesto por los métodos de prueba apropiados.
(Inicialmente, la potencia se mide utilizando una prueba de eficacia en animales. Más tarde aquella puede
correlacionarse con pruebas de contenido antigénico, o respuesta a anticuerpos, para pruebas rutinarias de
potencia de lotes.
•
Precisión
Grado de dispersión de los resultados para una muestra ensayada repetidamente.
•
Prevalencia
Estimación de la proporción de animales infectados dentro de una población en un momento dado. No debe
confundirse con la incidencia.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxi
Glosario de términos
•
Producto final(lote)
Todos los recipientes finales sellados, que se han llenado a partir de un mismo lote homogéneo de vacunas en
una sesión de trabajo, liofilizados conjuntamente en una operación continua (si es pertinente), sellados en una
sesión de trabajo e identificados con un número de código único.
•
Prueba de suficiencia
Medición de la competencia del laboratorio mediante la comparación entre laboratorios; esta definición implica
que los laboratorios participantes utilizan los mismos métodos de prueba, los mismos reactivos y controles y que
los resultados se expresan cualitativamente.
•
Pruebas
•
Pruebas alternativas
Métodos de prueba que aparecen en el Manual de Animales Terrestres, que se consideran adecuados
para el diagnóstico de las enfermedades en un ámbito local y que también pueden utilizarse para la
importación y exportación reguladas por convenios bilaterales.
•
Pruebas confirmativas
Métodos de prueba de alta especificidad diagnóstica que se utilizan para confirmar resultados,
generalmente resultados positivos, derivados de otros métodos de prueba.
•
Pruebas de criba
Pruebas de alta sensibilidad diagnóstica adecuadas para aplicación a gran escala.
•
Pruebas prescritas
Los métodos de prueba exigidos por el Código de Sanidad Animal de la OIE para el transporte
internacional de animales y productos animales, y que se consideran óptimos para determinar el estado
sanitario de los animales.
•
Pruebas de equivalencia
Determinación de ciertas características de realización de la prueba, propias de métodos de prueba nuevos y/o
diferentes, mediante la comparación con un método de prueba estándar llevada a cabo por varios laboratorios.
En esta definición está implícito que los laboratorios participantes utilizan sus propios métodos de prueba, sus
reactivos y controles, y que los resultados se expresan de forma cualitativa.
•
Punto de corte/umbral
Valor resultante de una prueba seleccionado para distinguir entre resultados positivos y negativos, y que puede
incluir zonas indeterminadas o sospechosas.
•
Pureza
Calidad de un producto biológico preparado hasta su forma final y:
a)
Relativamente libre de microorganismos y material (orgánico e inorgánico) extraños, lo que vendrá avalado
por métodos de prueba adecuados al producto; y
b)
Libre de microorganismos y material extraños que podrían afectar de forma adversa a la inocuidad, la
potencia o la eficacia del producto.
•
Reacción cruzada
Actividad detectable en un método de prueba, atribuible a un material a analizar procedente de, o producido por
otro organismo que da como resultado una reacción positiva falsa; los ensayos de este tipo tienen una
especificidad analítica baja.
•
Reactivos estándar
•
Reactivos estándar internacionales
Reactivos estándar por medio de los cuales se contrastan los demás reactivos y pruebas; preparados y
distribuidos por un Laboratorio Internacional de Referencia, para ser remitidos a los Laboratorios
Nacionales.
xxii
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Glosario de términos
•
Reactivos estándar nacionales
Los reactivos estándar contrastados mediante comparación con los reactivos estándar internacionales; son
preparados y distribuidos por los laboratorios de referencia nacionales para ser remitidos a las redes de
laboratorios nacionales.
•
Estándares de trabajo (reactivos)
Reactivos estándar contrastados mediante comparación con los reactivos estándar nacionales; se
incluyen en las pruebas de diagnóstico rutinarias como control y/o para normalización de los resultados de
la prueba.
•
Repetibilidad
Nivel de acuerdo entre las réplicas de una muestra, tanto dentro una aplicación como entre varias aplicaciones
del mismo método de prueba en un mismo laboratorio.
•
Reproducibilidad
La capacidad que una prueba tiene de proporcionar resultados consistentes cuando se aplica a las alícuotas de
la misma muestra en diferentes laboratorios.
•
Seguridad
Ausencia de propiedades causantes de reacciones locales indebidas o sistémicas, cuando se utilizan como
recomendadas o sugeridas por el fabricante, y sin riesgo conocido para los animales próximos, los humanos o el
medio ambiente.
•
Sensibilidad (analítica)
La cantidad más pequeña del material de prueba que se puede detectar; el material de prueba puede consistir
en anticuerpos, antígenos, ácidos nucleicos u organismos vivos.
•
Sensibilidad (diagnóstica)
Proporción de animales de referencia infectados que se sabe que dan resultado positivo en la prueba; se
considera que los animales infectados que presentan un resultado negativo tienen resultados negativos falsos.
•
Sensibilidad (relativa)
Proporción de animales de referencia, definida como positiva por un método o por una combinación de métodos
de prueba, que también presentan un resultado positivo en el ensayo que se compara.
•
Temperatura ambiente
El término “temperatura ambiente” se refiere a la temperatura de un entorno de trabajo confortable. No se
pueden fijar límites precisos para este término, pero las cifras de referencia son 18–25°C. Cuando en una
prueba se especifica la temperatura ambiente, ésta debería lograrse con aire acondicionado, si es preciso; de lo
contrario, los parámetros de la prueba pueden verse afectados.
•
Valor predictivo (negativo)
Proporción de animales con resultado negativo en una prueba sin estar realmente infectados; el valor predictivo
está influido por la sensibilidad y especificidad diagnóstica, así como por la prevalencia de la infección.
•
Valor predictivo (positivo)
Proporción de animales que están realmente infectados y presentan un resultado positivo en una prueba; el
valor de predicción está influenciado por la sensibilidad y especificidad diagnóstica, así como por la prevalencia
de la infección
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxiii
COLABORADORES
L IS T A DE C O L A BO RA DO RE S Y DIRE C C IO NE S P RO F E S IO NA L E S
Los capítulos del Manual de animales terrestres han sido confeccionados mediante invitación
expresa de la OIE a sus respectivos autores. Siguiendo el procedimiento estándar de esta
organización, los capítulos se distribuyen entre sus países miembros y entre expertos en la
enfermedad correspondiente a fin de recabar sus comentarios. A continuación, la Comisión de
Estándares Biológicos y el Editor Consultor de la OIE proceden a incorporar al texto las
modificaciones propuestas. Una vez completado el proceso de revisión del texto y finalizada su
redacción, el Manual de animales terrestres se presentó al Comité Internacional de la OIE durante
su Sesión General Anual para su aprobación antes de publicarse. De esta forma, el Manual se ha
convertido en un texto estándar de la OIE como fruto del consenso internacional. Por esta razón,
los nombres de los colaboradores no aparecen en la cabecera del correspondiente capítulo sino
que se ofrecen en un listado global. La Comisión de Estándares Biológicos valora enormemente el
trabajo de los siguientes colaboradores:
I.1.1. Métodos de muestreo
Dr J.E. Pearson
4016 Phoenix St., Ames, Iowa 50014, USA.
I.1.2. Gestión de calidad en los laboratorios de
pruebas veterinarias
Dr A. Wiegers
USDA, APHIS, VS, Center for Veterinary
Biologics, Policy, Evaluation, and Licensing,
Biotechnology, Immunology, and Diagnostics, 510
South 17th Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010,
USA.
I.1.3. Principios de validación para las pruebas de
diagnóstico de enfermedades infecciosas
Dr R. Jacobson (retired)
Formerly Diagnostic Laboratory, College of
Veterinary Medicine, Cornell University, Ithaca,
New York 14850-5786, USA.
I.1.4. Validación y control de calidad de los métodos
de la reacción en cadena de la polimerasa
utilizados para el diagnóstico de enfermedades
infecciosas
Dr S. Belak & Dr P. Thorén
Department of Virology, National Veterinary
Institute, Ulls väg 2B, SE-751 89 Uppsala,
Sweden
I.1.5. Pruebas para esterilidad y ausencia de
contaminación en materiales biológicos
Dr L. Elsken
USDA, APHIS, Center for Veterinary Biologics,
Suite 104, 510 South 17th Street, Ames, Iowa
50010, USA.
I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios
veterinarios de microbiología
Dr M. Best
Office of Laboratory Security, Centre for
Emergency Preparedness and Response, Health
Canada, Ottawa, Ontario K1A 0K9, Canada.
I.1.7. Principios de producción de vacunas
veterinarias
Dr D.A. Espeseth
Espeseth Consulting, 404 Long Leaf Drive,
Perkasie, Pennsylvania 18944, USA.
xxiv
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
I.1.8. La Biotecnología en el diagnóstico de las
enfermedades infecciosas y el desarrollo de
vacunas
Dr J. Gorham
College of Veterinary Medicine, Department of
Veterinary Microbiology and Pathology,
Washington State University, Pullman,
Washington 99164-7030, USA.
Dr D. Knowles & Dr H. Li
Animal Disease Research Unit, ARS, USDA,
Washington State University, Pullman,
Washington 99164-6630, USA.
Prof. P.-P. Pastoret
Institute for Animal Health, Compton Laboratory,
Compton, Newbury, Berkshire RG20 7NN, UK.
I.1.9. El papel de los organismos oficiales en la
regulación internacional de los productos
biológicos de uso veterinario
Dr Ph. Vannier
AFSSA Ploufragan, Laboratoire d’études et de
recherches avicoles et porcines, Zoopôle des
Côtes d’Armor-Les Croix, BP 53, 22440
Ploufragan, France.
Prof. P.-P. Pastoret
Institute for Animal Health, Compton Laboratory,
Compton, Newbury, Berkshire RG20 7NN, UK.
Dr D.A. Espeseth
Espeseth Consulting, 404 Long Leaf Drive,
Perkasie, Pennsylvania 18944, USA.
Dr O. Itoh
National Veterinary Assay Laboratory, JMAFF,
1-15-1 Tokura, Kokubunji, Tokyo 185-8511,
Japan.
I.1.10. Métodos de laboratorio para ensayos de
sensibilidad de bacterias frente a antimicrobianos
Dr D. White
Centre for Veterinary Medicine, Food and Drug
Administration, Office of Research, HFV-530,
8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708,
USA.
2.1.1. Fiebre aftosa
Dr R.P. Kitching
National Centre for Foreign Animal Disease,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba
R3E 3M4, Canada.
Dr P.V. Barnett & Dr D.K.J. Mackay
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
Dr A.I. Donaldson,
290 London Road, Burpham, Guildford, Surrey
GU4 7LB, UK
2.1.2. Estomatitis vesicular
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Dr B. Schmitt
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
xxv
Colaboradores
2.1.3. Enfermedad vesicular porcina
Dr R.P. Kitching
National Centre for Foreign Animal Disease,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba
R3E 3M4, Canada.
Dr D.K.J. Mackay
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
Dr A.I. Donaldson,
290 London Road, Burpham, Guildford, Surrey
GU4 7LB, UK
2.1.4. Peste bovina
Dr W.P. Taylor
8 South Terrace, Littlehampton, West Sussex
BN17 5NZ, UK.
Dr P. Roeder
Animal Health Service, Animal Production and
Health Division, FAO, Vialle delle Terme di
Caracalla, 00100 Rome, Italy.
2.1.5. Peste de los pequeños rumiantes
Dr A. Diallo
FAO/IAEA Centre for ELISA and Molecular
Techniques in Animal Disease Diagnosis,
International Atomic Energy Agency
Wagramerstrasse 5, P.O. Box 100, A-1400
Vienna, Austria.
2.1.6. Pleuroneumonía bovina contagiosa
Dr F. Thiaucourt
CIRAD-EMVT, Campus international de
Baillarguet, Montferriez-sur-Lez, B.P. 5035, 34032
Montpellier Cedex 1, France.
2.1.7. Dermatosis nodular contagiosa
Dr R.P. Kitching
National Centre for Foreign Animal Disease,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba
R3E 3M4, Canada.
Dr V. Carn
Highbury, Thornford, Sherborne, Dorset
DT9 6QD, UK.
2.1.8. Fiebre del Valle del Rift
Dr G.H. Gerdes
Onderstepoort Veterinary Institute, Private Bag
X05, Onderstepoort 0110, South Africa.
2.1.9. Lengua azul
Dr B. Eaton
Australian Animal Health Laboratory, CSIRO,
Livestock Industries, 5 Portarlington Road,
Geelong, Victoria 3220, Australia.
2.1.10. Viruela ovina y viruela caprina
Dr R.P. Kitching
National Centre for Foreign Animal Disease,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba
R3E 3M4, Canada.
Dr V. Carn
Highbury, Thornford, Sherborne, Dorset
DT9 6QD, UK.
xxvi
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
2.1.11. Peste equina africana
Prof. J.M. Sánchez-Vizcaíno
Catedrático del Área de Sanidad Animal,
Universidad Complutense, Facultad de
Veterinaria, Avda. Puerta de Hierro s/n, 28040
Madrid, Spain.
2.1.12. Peste porcina africana
Dr P.J. Wilkinson (retired)
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
Dr D.J. Paton
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
2.1.13. Peste porcina clásica (cólera del cerdo)
Dr D.J. Paton
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
Dr T. Drew
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.1.14. Gripe aviar muy virulenta
2.1.15. Enfermedad de Newcastle
Dr D.J. Alexander
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone,
Surrey KT15 3NB, UK.
2.2.1. Carbunco
Dr P.R. Coker
Biological Safety Officer, Office of University
Research Compliance, Oklahoma State
University, Stillwater, Oklahoma 74078, USA.
2.2.2. Enfermedad de Aujeszky
Prof. B. Toma & Prof. N. Haddad
Ecole nationale vétérinaire d’Alfort, 7 avenue du
Général de Gaulle, 94704 Maisons-Alfort Cedex,
France.
Dr Ph. Vannier
AFSSA Ploufragan, Laboratoire d’études et de
recherches avicoles et porcines, Zoopôle des
Côtes d’Armor-Les Croix, BP 53, 22440
Ploufragan, France.
2.2.3. Equinococosis/Hidatisodis
Prof. P.S. Craig
Division of Biological Sciences, School of
Environment & Life Sciences, University of
Salford, Salford M5 4WT, UK.
2.2.4. Leptospirosis
Prof. C.A. Bolin
Diagnostic Center for Population & Animal Health,
College of Veterinary Medicine, A3 Veterinary
Medical Center, Michigan State University, East
Lansing, Michigan 48824, USA.
2.2.5. Rabia
Dr F. Cliquet & Dr J. Barrat
AFSSA Nancy, Domaine de Pixérécourt, BP 9,
F-54220 Malzeville, France.
2.2.6. Paratuberculosis (enfermedad de Johne)
Dr M.-F. Thorel
AFSSA Alfort, Laboratoire d’Études et de
Recherches en Pathologie Animale et Zoonoses,
22 rue Pierre Curie, BP 67, 94703 Maisons-Alfort
Cedex, France.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxvii
Colaboradores
Dr E. Camus
CIRAD-EMVT, Campus International de
Baillarguet – TA/30B, 34398 Montpellier Cedex 5,
France.
2.2.7. Cowdriosis
Dr D. Martinez
CIRAD-EMVT, Domaine de Duclos, Prise d’Eau,
97170 Petit-Bourg, Guadeloupe.
Prof. F. Jongejan
Department of Parasitology & Tropical Veterinary
Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht
University, P.O. Box 80.165, 3508 TD Utrecht,
The Netherlands
AND
Department of Veterinary Tropical Diseases,
Faculty of Veterinary Science, University of
Pretoria, Onderstepoort 0110, South Africa.
2.2.8. Larva perforada del Nuevo Mundo (Cochliomyia
hominivorax) y del Viejo Mundo (Chrysomya
bezziana)
Dr M.J.R. Hall
Department of Entomology, The Natural History
Museum, Cromwell Road, London SW7 5BD, UK.
2.2.9. Triquinelosis
Dr H.R. Gamble
Director, Fellowships Office, National Research
Council, 500 Fifth Street NW, Washington DC
20001, USA.
2.2.10. Fiebre Q
Dr E. Rousset, Dr P. Russo, Dr M. Pépin,
& M.F. Aubert
AFSSA Sophia Antipolis, Laboratoire d’Études et
de Recherches sure les Petits Ruminants et les
Abeilles, Les Templiers, 105 route des Chappes,
BP 111, 06902 Sophia Antipolis Cedex, France.
2.2.11. Leishmaniosis
Dr L. Gradoni & Dr M. Gramiccia
Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio
di Parassitologia, Viale Regina Elena 299,
I-00161 Rome, Italy.
2.3.1. Brucelosis bovina
Dr K. Nielsen
Canadian Food Inspection Agency, Animal
Diseases Research Institute, P.O. Box 11300,
Station H, Nepean, Ontario K2H 8P9, Canada.
Dr D.R. Ewalt
Mycobacteria and Brucella Section, Diagnostic
Bacteriology Laboratory, National Veterinary
Services Laboratories, 1800 Dayton Road, Ames,
Iowa 50010, USA.
Y la importante contribución del Grupo Ad hoc de la
OIE en Brucelosis:
Dr B. Garin-Bastuji
AFSSA Alfort, Unité Zoonoses Bactériennes, Lab.
OIE/FAO de référence pour la brucellose, 22 rue
Pierre Curie, BP 67, 94703 Maisons-Alfort Cedex,
France.
Dr A.P. MacMillan
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
Dr Peter Wright
Canadian Food Inspection Agency, National
Centre for Foreign Animal Disease, 1015
Arlington Street, Winnipeg, Manitoba R3E 3M4,
Canada
2.3.2. Campilobacteriosis genital bovina
xxviii
Dr J.A. Wagenaar & M.A.P. Van Bergen, BSc
Animal Sciences Group, P.O. Box 65, 8200 AB
Lelystad, The Netherlands.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
2.3.3. Tuberculosis bovina
Dr N.M.A. Palmer
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.3.4. Leucosis bovina enzoótica
Dr L. Renström
National Veterinary Institute, Department of
Virology, SE-751 89 Uppsala, Sweden.
2.3.5. Rinotraqueitis bovina infecciosa /vulvovaginitis
pustular infecciosa
Prof. J.T. van Oirschot
Animal Sciences Group - Wageningen UR, P.O.
Box 65, 8200 AB, Lelystad, The Netherlands.
2.3.6. Tricomonosis
Prof. M. Taylor
Veterinary Surveillance Unit, Central Science
Laboratory, Sand Hutton, York YO41 1LZ, UK.
Dr A.A. Gajadhar & Dr S. Parker
Canadian Food Inspection Agency, Saskatoon
Laboratory, 116 Veterinary Road, Saskatoon,
Saskatchewan S7N 2R3, Canada.
2.3.7. Anaplasmosis bovina
Prof. T.F. McElwain
Washington State University, Animal Disease
Diagnostic Laboratory, 155 Bustad Hall, Pullman,
Washington 99164-7034, USA.
2.3.8. Babesiosis bovina
Dr R.E. Bock
Queensland Department of Primary Industries,
Animal and Plant Health Service, Tick Fever
Research Centre, 280 Grindle Road, Wacol,
Queensland 4076, Australia.
Dr W.K. Jorgensen & Mr J.B. Molloy
Queensland Department of Primary Industries,
Agency for Food & Fibre Sciences, 665 Fairfield
Rd, Yeerongpilly, Queensland 4105, Australia.
2.3.9. Cisticercosis bovina (ver capítulo 2.10.1.)
Dr S. Lloyd
Department of Clinical Veterinary Medicine,
University of Cambridge, Madingley Road,
Cambridge CB3 0ES, UK.
2.3.10. Dermatofilosis
Prof. D.H. Lloyd
Dept of Veterinary Clinical Sciences, Royal
Veterinary College, Hawkshead Lane, North
Mymms, Hatfield, Hertfordshire AL9 7TA, UK.
2.3.11. Teileriosis
Prof. E. Pipano
Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew
University of Jerusalem, P.O. Box 12 Rehovot,
Israel.
Dr S. Morzaria
FAO Regional Office for Asia and the Pacific,
39 Phra Athit Road, Bangkok 10200, Thailand.
Dr P. Spooner
International Livestock Research Institute,
Naivasha Road, Nairobi 00100, Kenya.
Dr V. Shkap
Division of Parasitology, Kimron Veterinary
Institute, P.O. Box 12, Beit Dagan, 50250 Israel.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxix
Colaboradores
2.3.12 Septicemia hemorrágica
Dr S. Chandrasekaran
Veterinary Research Institute, 59 Jalan Suntan
Azlan Shah, P.O. Box 369, 31400 Ipoh, Perak,
Malaysia.
Dr K. Townsend
Diagnostic Bacteriology Laboratory, Veterinary
Pathology and Anatomy, School of Veterinary
Science, The University of Queensland, Brisbane
QLD 4072, Australia.
2.3.13. Encefalopatía espongiforme bovina
Dr D. Matthews, Dr M. Jeffrey, Dr M.M. Simmons,
Mr M. Stack, Mr G.A.H. Wells & Prof. J.W.
Wilesmith
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone,
Surrey KT15 3NB, UK.
2.3.14. Fiebre catarral maligna
Dr H.W. Reid
Moredun Research Institute, International
Research Centre, Pentlands Science Park, Bush
Loan, Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.
2.3.15. Tripanosomosis (transmitida por la mosca tsé
tsé)
Dr J. Schlater
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
Dr P. Van Den Bossche
Veterinary Department, Institute of Tropical
Medicine, Nationalestraat 155, 2000 Antwerpen
Belgium
AND
Faculty of Veterinary Science, University of
Pretoria, Post Bag X04, Onderstepoort 0110,
South Africa
2.4.1. Epididimitis ovina (Brucella ovis)
2.4.2. Brucelosis caprina y ovina (excluyendo la
infección por Brucella ovis)
Dr B. Garin-Bastuji
AFSSA, Unité Zoonoses Bactériennes, OIE
Reference Laboratory/FAO Collaborating Centre
for Brucellosis, BP 67, F-94703 Maisons-Alfort
Cedex, France.
Dr J.M. Blasco
Dpt Sanidad Animal, Servicio de Investigacion
Agraria/DGA, Apartado 727, 50080 Zaragoza,
Spain.
2.4.3. Agalaxia contagiosa
Dr R. Nicholas
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone,
Surrey KT15 3NB, UK.
2.4.4/5. Artritis/encefalitis caprina y Maedi-visna
Dr D. Knowles & Dr L.M. Herrmann
Animal Disease Research Unit, ARS, USDA,
Washington State University, Pullman,
Washington 99164-6630, USA.
2.4.6. Pleuroneumonía caprina contagiosa
Dr F.R Rurangirwa
Department of Veterinary Microbiology and
Pathology, Washington State University, Pullman,
Washington 99164-7040, USA.
Dr J.H. Kinyili
Kenya Veterinary Vaccines Production Institute,
P.O. Box 53260, Nairobi, Kenya.
2.4.7. Aborto enzoótico de las ovejas (Clamidiosis
ovina)
xxx
Prof. I.D. Aitken & and Dr D. Longbottom
Moredun Research Institute, International
Research Centre, Pentlands Science Park
Bush Loan, Penicuik EH26 0PZ, UK.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
2.4.8. Prurigo lumbar
Dr D. Matthews, Dr M. Jeffrey Dr M.M. Simmons,
Mr M. Stack & Mr G.A.H. Wells
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.4.9. Adenomatosis pulmonar ovina
Dr J.M. Sharp
VLA, Pentlands Science Park, Bush Loan,
Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.
2.4.10. Enfermedad de Nairobi (ver capítulo 2.10.2.)
Dr G.H. Gerdes
Onderstepoort Veterinary Institute, Private Bag
X05, Onderstepoort 0110, South Africa.
2.4.11. Salmonelosis (S. abortus ovis)
(ver capítulo 2.10.3.)
Dr R. Davies
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
Prof. M. Truszczynski
National Veterinary Research Institute,
57 Partyzantow St., 24-100 Pulawy, Poland.
2.5.1. Metritis equina contagiosa
Dr N. Chanter
Intervet UK Ltd, Walton Manor, Walton, Milton
Keynes MK7 7AJ, UK.
2.5.2. Durina
Dr J.B. Katz
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
2.5.3. Encefalomielitis equina (del Este y del Oeste)
2.5.4. Anemia infecciosa equina
Dr E.N. Ostlund
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
2.5.5. Gripe equina
Dr J. Daly
Animal Health Trust, Lanwades Park, Kentford,
Newmarket, Suffolk CB8 7UU, UK.
2.5.6. Piroplasmosis equina
Dr D.T. de Waal
University College Dublin, Faculty of Veterinary
Medicine, Department of Veterinary Microbiology
& Parasitology, Belfield, Dublin 4, Ireland.
2.5.7. Rinoneumonitis equina
Dr G.P. Allen
Department of Veterinary Science,
College of Agriculture, University of Kentucky, 108
M.H. Gluck Equine Research Center, Lexington,
Kentucky 40546-0099, USA.
2.5.8. Muermo
Dr N.K. Bookova,
All-Russian State Centre for Quality and
Standardisation of Veterinary Drugs and Feeds,
Ministry of Agriculture of the Russian Federation,
5, Zvenigorodskoye shosse, 123022 Moscow,
RUSSIA.
2.5.10. Arteritis vírica equina
Dr P.J. Timoney
University of Kentucky, Department of Veterinary
Science, 108 Gluck Equine Research Center,
Lexington, Kentucky 40546-0099, USA.
2.5.12. Encefalomielitis equina venezolana
Dr E.N. Ostlund
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
2.5.13. Linfangitis epizoótica
Dr J.A.W. Coetzer
Department of Veterinary Tropical Diseases,
Faculty of Veterinary Science, University of
Pretoria, Private Bag X04, Onderstepoort 0110,
South Africa.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxxi
Colaboradores
2.5.14. Encefalitis japonesa
Dr I. Takashima
Laboratory of Public Health, Department of
Environmental Veterinary Sciences,
Graduate School of Veterinary Medicine,
Hokkaido University, Sapporo 060-0818, Japan.
2.5.15. Tripanosomosis (Trypanosoma evansi)
Dr A.G. Luckins
Centre for Tropical Veterinary Medicine, Easter
Bush Veterinary Centre, Roslin, Midlothian,
Scotland EH25 9RG, UK.
2.6.1. Rinitis atrófica porcina
Dr K. Register
USDA, ARS, National Animal Disease Center,
2300 Dayton Avenue, Ames, Iowa 50010, USA.
2.6.2. Brucelosis porcina
Dr Steve Olsen,
USDA, ARS, National Animal Disease Center,
2300 Dayton Avenue, Ames, Iowa 50010, USA.
2.6.3. Encefalomielitis por enterovirus (anteriormente
enfermedades de Teschen/Talfan)
Dr V. Mádr
Hudcova 66, 62100 Brno, Czech Republic.
2.6.4. Gastroenteritis transmisible
Dr D.J. Paton
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
Dr L.J. Saif
The Ohio State Universtiy, Ohio Agricultural
Research and Development Center, Food Animal
Health Research Program, 1680 Madison
Avenue, Wooster, Ohio 44691-4096, USA.
2.6.5. Síndrome reproductivo y respiratorio porcino
Dr L.R. Ludemann
USDA, APHIS, Center for Veterinary Biologics,
Laboratory, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
Dr R. Magar
Agence canadienne d’inspection des aliments,
Laboratoire d’hygiène vétérinaire et alimentaire,
3400 Casavant ouest, Saint-Hyacinthe, Québec
J2S 8E3, Canada.
2.6.6. Cisticercosis porcina (ver capítulo 2.10.1.)
Dr S. Lloyd
Department of Clinical Veterinary Medicine,
University of Cambridge, Madingley Road,
Cambridge CB3 0ES, UK.
2.7.1. Bursitis infecciosa (Enfermedad de Gumboro)
Dr N. Eterradossi
AFSSA Ploufragan, Unité de virologie,
immunologie et parasitologie aviaires et
cunicoles, BP 53, 22440 Ploufragan, France
2.7.2. Enfermedad de Marek
Dr J.M. Sharma
Veterinary PathoBiology, College of Veterinary
Medicine, University of Minnesota, St Paul,
Minnesota 55127, USA.
2.7.3. Micoplasmosis aviar
(Mycoplasma gallisepticum)
Dr S.H. Kleven
University of Georgia, College of Veterinary
Medicine, Department of Avian Medicine, Athens,
Georgia 30602-4875, USA.
Dr F.T.W. Jordan & Dr J.M. Bradbury
University of Liverpool, Department of Veterinary
Pathology, Veterinary Field Station, Leahurst,
Neston, South Wirral CH64 7TE, UK.
2.7.4. Clamidiosis aviar
xxxii
Dr A.A. Andersen
USDA, ARS, National Animal Disease Center,
P.O. Box 70, Ames, Iowa 50010, USA.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
2.7.5. Pulorosis y tifosis aviar
Dr R. Davies
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.7.6. Bronquitis infecciosa aviar
Dr R. Gough (retired) & Dr D.J. Alexander
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.7.7. Laringotraqueitis infecciosa aviar
Dr R.C. Jones
University of Liverpool, Department of Veterinary
Pathology, Jordan Building, Veterinary Field
Station, ‘Leahurst’, Neston, South Wirral
CH64 7TE, UK.
2.7.8. Tuberculosis aviar
Dr M.-F. Thorel
AFSSA Alfort, Laboratoire central de recherches
vétérinaires, 22 rue Pierre Curie, BP 67, 94703
Maisons-Alfort Cedex, France.
2.7.9. Hepatitis vírica del pato
2.7.10. Enteritis vírica del pato
Dr P.R. Woolcock
California Animal Health and Food Safety
Laboratory System – Fresno Branch, School of
Veterinary Medicine, University of California,
Davis, 2789 South Orange Avenue, Fresno,
California 93725, USA.
2.7.11. Cólera aviar (Pasteurelosis aviar)
Dr R. Kunkle,
National Animal Disease Center, P.O. Box 70,
Ames, Iowa 50010, USA.
2.7.12. Viruela aviar
Dr D.N. Tripathy
University of Illinois at Urbana-Champaign,
College of Veterinary Medicine, Department of
Veterinary Pathbiology, 2001 South Lincoln
Avenue, Urbana, Illinois 61802, USA.
2.8.1. Mixomatosis
Prof. J. Chantal (retired) & Prof. S. Bertagnoli
École Nationale Vétérinaire, 23 Chemin de
Capelles, 31076 Toulouse Cedex 03, France.
2.8.2. Tularemia
Dr T. Mörner
Department of Wildlife, The National Veterinary
Institute, 751 89 Uppsala, Sweden
Dr G. Sandström
Department of Clinical Immunology, Infectious
Diseases, Umeå University and National Defence
Research Establishment, SE-901 82 Umeå,
Sweden.
2.8.3. Enfermedad hemorrágica del conejo
Dr A. Lavazza & Dr L. Capucci
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della
Lombardia e dell’Emilia Romagna, Via Bianchi
7/9, 25124 Brescia, Italy.
2.9.1. Acariosis de las abejas
Dr W. Ritter
CVUA-Freiberg, Animal Health, Am Moosweiher
2, D79018 Freiberg, Germany.
2.9.2. Loque americana
Prof. D.C. de Graaf
Laboratory of Zoophysiology, University of Gent,
K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium.
2.9.3. Loque europea
Dr B.V. Ball
Plant and Invertebrate Ecology Division,
Rothamstead Research, Harpenden,
Hertfordshire AL5 2JQ, UK.
2.9.4. Nosemosis de las abejas
Dr A. de Ruijter
Research Centre for Insect Pollination and
Beekeeping, Ambrosiusweg 1, 5081 NV
Hilvarenbeek, The Netherlands.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxxiii
Colaboradores
2.9.5. Varroosis
Dr W. Ritter
CVUA-Freiberg, Animal Health, Am Moosweiher
2, D79018 Freiberg, Germany.
2.9.6. Infestación de las abejas melíferas por
Tropilaelaps (Tropilaelaps clareae, T. koenigerum)
Dr D. Sammataro
Carl Hayden Honey Bee Research Center,
2000 East Allen Road, Tucson, Arizona 857191596, USA.
2.10.1. Cisticercosis
Dr S. Lloyd
Department of Clinical Veterinary Medicine,
University of Cambridge, Madingley Road,
Cambridge CB3 0ES, UK.
2.10.2. Enfermedades bunyavirales de animales
excluyendo la Fiebre del Valle del Rift
Dr G.H. Gerdes
Onderstepoort Veterinary Institute, Private Bag
X05, Onderstepoort 0110, South Africa.
2.10.3. Salmonelosis
Dr R. Davies
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.10.4. Sarna
Dr P. Bates
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.10.5. Enfermedad de la frontera
Dr P.F. Nettleton
Moredun Research Institute, International
Research Centre, Pentlands Science Park, Bush
Loan, Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.
2.10.6. Diarrea vírica bovina
Dr T. Drew
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.10.7. Encefalitis del Oeste del Nilo
Dr E.N. Ostlund
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
United States of America.
2.10.8. Campylobacterosis
Dr Diane Newell
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
Dr W.F. Jacobs-Reitsma & Dr J.A. Wagenaar
Animal Sciences Group, Wageningen UR, P.O.
Box 65, 8200 AB Lelystad, The Netherlands.
2.10.9. Criptosporidiosis
Prof. H. Smith
Scottish Parasite Diagnostic Laboratory, Stobhill
General Hospital, Glasgow G21 3UW, UK.
2.10.10. Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
Dr B.T. Eaton & Dr P. Daniels
Australian Animal Health Laboratory, CSIRO,
Livestock Industries, 5 Portarlington Road,
Geelong, Victoria 3220, Australia.
Dr M. Narasiman
Veterinary Research Institute, 59, Jalan Sultan
Azlan Shah, 31400 Ipoh, Perak, Malaysia.
2.10.11. Gripe porcina
Dr S.L. Swenson
National Veterinary Services Laboratories, P.O.
Box 844, Ames, Iowa 50010, USA.
Dr P.L. Foley
Center for Veterinary Biologics, 510 S. 17th St.,
Suite 104, Ames, IA 50010 USA
2.10.12. Toxoplasmosis
xxxiv
Dr D. Buxton & Dr S.W. Maley
Moredun Research Institute, Pentlands Science
Park, Bush Loan, by Edinburgh EH26 0PZ,
Scotland, UK.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Colaboradores
2.10.13. Escherichia coli Verocitotoxigénica
Dr F.A. Clifton-Hadley
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.10.14. Listeria monocytogenes
Dr Jose Lopez
Canadian Food Inspection Agency,
National Centre for Foreign Animal Disease,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba
R3E 3M4, Canada.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
xxxv
C O MIT É D IRE C T O R P A RA L O S P RO YE C T O S DE L A OIE DE T RA DUC C IÓ N A L E S P A ÑO L
DE L M A NUA L O F D IA GNO S T IC T E S T S A ND V A C C INE S F O R T E RRE S T RIA L A NIMA L S Y
E L A BO RA C IÓ N DE UNA B A S E T E RMINO L Ó GIC A M UL TIL INGÜE PA RA E L Á MBITO DE
L A S A NIDA D A NIMA L .
Presidente
Vicepresidente
Excmo. Sr. D. Bernard Vallat
Ilmo. Sr. D. Jean-Luc Angot
Director General
Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE
12, rue de Prony – 75017 Paris. France.
Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88
Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87
Correo electrónico: b.vallat@oie.int
Jefe del Servicio Administrativo y Financiero
Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE
12, rue de Prony – 75017 Paris. France.
Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88
Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87
Correo electrónico: l-l.angot@oie.int
Vocales
Ilmo. Sr. D. Arnaldo Cabello Navarro
Dra. Dña. Luz Alba Cruz de Urbina
Subgerente de Prevención y Control
Instituto Colombiano Agropecuario (ICA)
Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural
Calle 37 nº 8-43 PISO 4 Y 5.
Apartado Aéreo 7984 y 1511123
El Dorado
Santa Fe de Bogotá. Colombia.
Tfno: (57-1) 32 o 3654
Fax: (57-1) 232 4695
Correo electrónico: savinal@elsitio.net.co
Subdirector General de Sanidad Animal.
Dirección General de Ganadería.
Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación.
Corazón de María nº 8
28002 Madrid.
Tfno: 34 91 3 47 83 24
Fax: 34 91 3 47 82 99
Correo electrónico: acabello@mapya.es
Dr. D. Rodolfo César Acerbi
Dr. D. Emerio F. Serrano Ramírez
Coordinador Relaciones Internacionales e
Institucionales
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria SENASA
Avda. Paseo Colón. 367 – 5º p.cont.
1063 Buenos Aires.
Republica Argentina
Tfno: 00 (54) 11 4331-6041/9 INT. 1323
Fax: 00 (54) 11 4334-4738
Correo electrónico: relint@inea.com.ar
Director General del Instituto de
Medicina Veterinaria.
Ministerio de Agricultura.
Calle 12 nº 355, entre 17 y 17ª
El Vedado.
Zona Postal 10400
Ciudad de la Habana. Cuba.
Tfno: (53-7) 83 06 6 15
Fax: (53-7) 830 35 37
Correo electrónico: dnimv@infoued.sld.cv
Secretario
Coordinador de la OIE
Profesor Dr. D. Fernando Crespo León
Profesor Dr. D. Alejandro Schudel.
Experto de la OIE
Organización Mundial de Sanidad Animal
y de la Unión Europea
Investigador del Departamento de
Ganadería y Acuicultura del Instituto Murciano
de Investigación y Desarrollo Agrario
y Alimentario. (IMIDA)
Calle mayor s/n. 30150 La Alberca. Murcia.
España.
Tfno: 00 34 968 36 67 99
Fax: 00 34 968 36 67 92
Correo electrónico: fernando.crespo@carm.es
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Jefe del Servicio Científico y Técnico
Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE
12, rue de Prony – 75017 Paris. France
Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88
Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87
Correo electrónico: a.schudel@oie.int
xxxvi
Colaboradores
C O O RDINA C IÓ N
C IE NT ÍF IC O - T É C NIC A
DE L A TRA DUC C IÓ N
Profesor Dr. D. Fernando Crespo León
Experto de la OIE
Organización Mundial de Sanidad Animal
y de la Unión Europea
Investigador del Departamento de Ganadería y
Acuicultura del Instituto Murciano
de Investigación y Desarrollo Agrario
y Alimentario.(IMIDA)
Calle mayor s/n. 30150 La Alberca. Murcia.
España.
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C O O RDINA C IÓ N
L INGÜÍS T IC A Y
TRA DUC TO L Ó GIC A
Profesor Dr. D. Francisco Gutiérrez Díez
Catedrático de Filología Inglesa
Director del Máster de Traducción
e Interpretación de la Universidad de Murcia
Dpto. de Filología Inglesa
C/ Santo Cristo nº 1. 30071. Murcia, España
Tfno: 00 34 968 36 31 79
Fax: 00 34 968 36 31 85
Correo electrónico: fgut@um.es
G RUPO A D HO C PA RA L O S P RO YE C T O S DE L A OIE DE T RA DUC C IÓ N A L E S P A ÑO L
DE L M A NUA L O F D IA GNO S T IC T E S T S A ND V A C C INE S Y E L A BO RA C IÓ N DE L A B A S E
T E RMINO L Ó GIC A M UL TIL INGÜE PA RA E L Á MBITO DE L A S A NIDA D A NIMA L .
Profesor Dr. D. Elías Fernando Rodríguez Ferri
Catedrático de Microbiología e Inmunología de la
Facultad de Veterinaria
Departamento de Sanidad Animal
Universidad de León
Campus de Vagazana. 24071 León. España
Tfno: 00 34 987 29 12 97
Fax: 00 34 987 29 11 94
Correo electrónico: dsaerf@isidoro.unileon.es
Profesor Dr. D. Luis León Vizcaíno
Catedrático de Patología Infecciosa de la
Facultad de Veterinaria
Universidad de Murcia, España.
Departamento de Sanidad Animal
Campus de Espinardo. 30100 Murcia, España
Tfno: 00 34 968 36 47 32
Fax: 00 34 968 36 41 47
Correo electrónico: lleonvi@um.es
Profesor Dr. D. Emilio J. Gimeno
Coordinator of OIE Representation for the
Americas (RR/AA)
Cerviño 3101
1425 Buenos Aires. República de Argentina
Tfno: (54-11) 48 03 48 77
Fax: (54-11) 48 03 36 88
Correo electrónico: rr.americas@oie.int
Profesor Dr. D. José Joaquín Cerón Madrigal
Profesor Titular del Departamento de Medicina y
Cirugía Animal
Facultad de Veterinaria
Universidad de Murcia
Campus de Espinardo. 30100 Murcia. España
Tfno: 968 36 47 22
Fax: 968 36 41 47
Correo electrónico: jjceron@um.es
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Profesor Dr. D. Francisco Gutiérrez Díez
Catedrático de Filología Inglesa
Director del Máster de Traducción e
Interpretación de la Universidad de Murcia.
Dpto. de Filología Inglesa. C/ Santo Cristo nº 1.
30071. Murcia, España.
Tfno: 00 34 968 36 31 79
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Correo electrónico: fgut@um.es
Profesor Dr. Pascual Cantos Gómez
Profesor Titular de Filología Inglesa.
Departamento de Filología Inglesa
Universidad de Murcia
Campus La Merced. C/ Santo Cristo nº 1.
30071. Murcia España.
Tfno: 00 34 968 36 43 65
Fax: 00 34 968 36 31 85
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Profesor Dr. D. Alejandro Schudel
Jefe del Servicio Científico y Técnico
Organización Mundial de Sanidad Animal, OIE
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Profesor Dr. D. Francisco Gutiérrez Díez
Catedrático de Filología Inglesa
Director del Máster de Traducción e
Interpretación de la Universidad de Murcia.
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xxxvii
Colaboradores
T RA DUC TO RE S
Profesor Dr. D. Mariano Gacto Fernández
Catedrático de Microbiología
Universidad de Murcia
Dpto. de Microbiología y Genética, Campus de
Espinardo, 30071-Murcia, España
Fax. 00 34 968 36 39 63
Tfno: 00 34 968 36 71 32
Correo electrónico: maga@um.es
Profesora Dra. Dña. Purificación Sánchez
Hernández
Profesora Titular de Filología Inglesa
Universidad de Murcia
Profesora del Máster de Traducción e
Interpretación
Dpto. Filología Inglesa, C/ Santo Cristo, 1.30071-Murcia, España
Tfno: 00 34 968 36 48 67
Fax: 00 34 968 36 31 85
Correo electrónico: purisan@um.es
Profesora Dra. Dña. Jerónima Vicente Soler
Profesora Titular de Microbiología
Universidad de Murcia
Dpto. de Microbiología y Genética,
Campus de Espinardo, 30071-Murcia,
España
Tfno: 00 34 968 43 03 29
Fax: 00 34 968 36 39 63
Correo electrónico: jerovic@um.es
Profesor Dr. D. José Cansado Vizoso
Dña. Elena Cuadrado Caparrós
Licenciada en Biología y Máster en
Traducción e Interpretación
Tfno: 00 34 968 21 55 24
Correo electrónico: islaplana@telefónica.net
Dña. Ruth Elena Pérez
Licenciada en Filología Inglesa y Máster en
Traducción e Interpretación
C/ Olor Palme, 1, 7º B.- 30009-Murcia, España
Tfno: 00 34 968 29 45 93
Correo electrónico: rutelena@ono.com
Profesor Titular de Microbiología
Universidad de Murcia
Dpto. de Microbiología y Genética, Campus de
Espinardo, 30071-Murcia, España
Fax: 968-363963
Tfno: 00 34 968 36 49 53
Correo electrónico: jcansado@um.es
*
* *
xxxviii
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
SECCIÓN 2.9.
ENFERMEDADES DE LAS ABEJAS DE LA LISTA B
NOTA PRELIMINAR SOBRE LAS ENFERMEDADES
DE LAS ABEJAS
Las abejas son insectos estrechamente relacionados con las hormigas y las avispas. Existen
varios miles de especies de abejas, la mayor parte de las cuales no son insectos sociales sino
individuos solitarios. La abeja melífera, de la especie Apis, vive en colonias, que son familias de
insectos sociales. Hay varias especies, subespecies, razas y subrazas de abejas melíferas que
están adaptadas a su medio ambiente.
Dos especies son importantes para la apicultura: la abeja melífera occidental Apis mellifera y la
abeja melífera oriental A. cerana. La abeja africanizada, que se encuentra en Sudamérica y
Centroamérica y en algunos Estados de los Estados Unidos de América, es un cruce entre dos
subespecies de la abeja melífera occidental: las abejas europeas y la abeja sudafricana. Apis
cerana es importante en el Asia meridional y suroriental. Las colonias son pequeñas y dóciles,
pero tienen bajo rendimiento de miel. En condiciones climáticas adecuadas, a veces se prefiere la
abeja melífera occidental, A. mellifera, por su mayor rendimiento.
Se piensa que todas las abejas son susceptibles a las enfermedades conocidas de las abejas,
pero las distintas razas pueden variar en su susceptibilidad. Por ejemplo, A. cerana es menos
susceptible a la varroosis. Cuando se procede al muestreo de una colonia de abejas para fines de
diagnóstico de enfermedades, primero hay que matar las abejas vivas usando éter dietílico o
haciéndolas pasar la noche en un ultracongelador (–20°C). Otro método es la inmersión en
alcohol etílico al 70%, utilizado, por ejemplo, para el diagnóstico de la acariosis (Acarapis).
Cuando se efectúan pruebas de diagnóstico con las crías, se deben hacer frotis de las larvas y las
pupas, o enviar al laboratorio un pedazo de panal con cría que presente signos visibles de
enfermedad.
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1035
SECCIÓN 2.10.
ENFERMEDADES NO CONSIDERADAS
EN LA LISTA A Y B1
CAPÍTULO 2.10.1.
CISTICERCOSIS
RESUMEN
La cisticercosis de animales domésticos y salvajes está causada por las formas larvarias
(metacestodos) de los cestodos (tenias), cuyas fases adultas se encuentran en el intestino del
hombre y de los perros y cánidos salvajes. La cisticercosis bovina (principalmente en músculos) y
la cisticercosis porcina (principalmente en los músculos y el sistema nervioso central) están
causadas por los metacestodos (cisticercos) de los cestodos humanos Taenia saginata y
T. solium, respectivamente. También los cisticercos de T. solium se desarrollan en el sistema
nervioso central y en la musculatura del hombre. Los cisticercos de T. saginata asiatica se
presentan en el hígado del cerdo. La cisticercosis y la cenurosis de las ovejas y cabras (en
músculos, cerebro, hígado y cavidad peritoneal) se deben a T. ovis, T. multiceps y T. hydatigena,
cuyos adultos se encuentran en el intestino de los perros y cánidos salvajes.
La mayoría de las infecciones debidas a las formas larvarias o adultas de las tenias causan una
enfermedad leve o, en ocasiones, ninguna enfermedad. Las excepciones son la neurocisticercosis
humana (NCC), que es grave y potencialmente fatal y está causada por T. solium, y
ocasionalmente la neurocenurosis causada por T. multiceps en humanos. Estos parásitos
provocan también signos musculares y oculares en el hombre. La “modorra” causada por
T. multiceps en rumiantes puede requerir el sacrificio del animal. La cenurosis debida a
T. hydatigena es inusual en ovejas y cabras. La cisticercosis ocasiona pérdidas económicas por el
rechazo de las carnes y despojos infectados.
Identificación del agente: Los gusanos planos Taenia tienen forma de cinta en el sentido
dorsoventral, están segmentados y son grandes, alcanzando de 20 a 50 cm (la especie que afecta
al perro) hasta varios metros (la especie de humanos). En la parte anterior, el escólex (cabeza)
tiene cuatro ventosas musculares y puede tener un rostelo, con frecuencia armado con una doble
corona de ganchos, cuya longitud y cantidad es una característica relativa de la especie. Después
del escólex tienen un cuello al que le siguen segmentos inmaduros, a continuación segmentos
reproductivos maduros y finalmente segmentos grávidos llenos de huevos. La estructura de los
segmentos, aunque de manera poco fiable, puede ayudar en el diagnóstico. Las especies de
Taenia no pueden diferenciarse por la estructura de los huevos. Los metacestodos están
constituidos por una vesícula llena de líquido con uno o más protoescólices invaginados. Estos
“gusanos vesiculares” están cada uno de ellos contenidos dentro de una pared quística en la
interfase parásito-hospedador. Esta estructura comprende el cisticerco o cenuro.
El gusano Taenia adulto se reconoce en examen post mortem o mediante pases de los
segmentos o de los huevos. Los metacestodos son claramente visibles en examen post mortem y
después de una inspección de carnes, pero a menudo las infecciones leves pasan
desapercibidas. La NCC puede diagnosticarse mediante técnicas de imagen.
1
Las cuatro primeras enfermedades de esta lista se incluyen en algunas secciones de especies individuales de la Lista B,
pero estos capítulos abarcan diversas especies y así proporcionan una descripción más amplia.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1069
Capítulo 2.10.1. — Cisticercosis
Pruebas inmunológicas: Las infecciones con Taenia adulta se pueden reconocer mediante la
detección de coproantígenos de Taenia en heces empleando un enzimoinmunoensayo de captura
antigénica, pero la prueba no diferencia especies y no está disponible a nivel comercial. El empleo
de sondas específicas de especie sigue siendo experimental.
Pruebas serológicas: Actualmente las pruebas de detección de anticuerpos en el suero no se
utilizan para el diagnóstico de la cisticercosis; el diagnóstico se realiza mediante la inspección de
la carne.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se han identificado antígenos
vacunales para el metacestodo, pero no para las fases adultas de T. ovis, T. saginata y T. solium.
En Nueva Zelanda se ha registrado una vacuna de T. ovis pero no se encuentra disponible
comercialmente.
A. INTRODUCCIÓN
Los metacestodos (o cestodos larvales) de Taenia spp, los gusanos planos del hombre y de los cánidos, son la
causa de la cisticercosis de varios animales domésticos y silvestres. Las tenias adultas se encuentran en el
intestino delgado de los hospedadores definitivos carnívoros: humanos, perros y cánidos silvestres. Taenia
saginata causa la cisticercosis bovina, que prácticamente tiene lugar por todo el mundo, pero tiene una
prevalencia particularmente alta en África, se encuentra en los países de la zona caucásica, sur y centro de Asia
y de la región este del Mediterráneo; la infección se presenta en varios países de Europa. La Taenia solium del
hombre causa la cisticercosis porcina y la neurocisticercosis humana (NCC). Se encuentra principalmente en el
centro y sur de América, en África sudsahariana, en zonas de los Estados Independientes de la Commonwealth
(CIS), en la República Popular China y en países no islámicos de Asia donde hay cerdos en libertad que se
alimentan de desechos. En el sudeste de Asia los cisticercos de T. saginata asiatica del hombre se encuentran
en el hígado de los cerdos. Los perros y cánidos silvestres son los hospedadores definitivos de los
metacestodos de ovejas, cabras y otros rumiantes, que se presentan en la mayor parte del mundo, aunque
T. multiceps ha desaparecido de los EE. UU. y de Nueva Zelanda. Taenia ovis se encuentra en los músculos de
las ovejas, T. multiceps en el cerebro (ocasionalmente en los músculos) de ovejas y cabras, a veces de otros
rumiantes y raramente del hombre, y T. hydatigena se encuentra en la cavidad peritoneal y el hígado de los
rumiantes. Habitualmente, el diagnóstico se basa en el hospedador y en la localización de los metacestodos
cuando se identifican en una inspección de la canal. Los adultos se adquieren mediante la ingestión de los
metacestodos presentes en la carne y en los despojos que no se han cocinado o congelado de forma adecuada
para destruir al parásito.
Los segmentos grávidos que se separan de las tenias adultas emigran espontáneamente desde el ano y caen al
suelo donde liberan los huevos, o bien los segmentos y los huevos libres salen al exterior con las heces. Sin
embargo, los segmentos de Taenia solium salen encadenados. Los huevos al salir son infectivos de inmediato.
Los animales adquieren la infección al ingerir los segmentos y huevos que contaminan la hierba o las heces.
Los humanos pueden infectarse con T. solium mediante los huevos presentes en las verduras, etc., que se
contaminan con las heces o por transmisión fecal-oral, por las manos sucias, o a través de retro-peristalsis y la
incubación interna de los huevos. El diagnóstico continúa basándose principalmente en la morfología del gusano
adulto y en la presencia de huevos o segmentos en las heces de los hospedadores definitivos infectados.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
Taenia saginata (tenia bovina): El adulto es grande, de 4–8 metros de longitud y puede sobrevivir muchos años,
normalmente de forma individual, en el intestino delgado del hombre. El escólex (o cabeza) no presenta rostelo
ni ganchos. El Cuadro 1 recoge unas técnicas útiles para su diagnóstico (23, 24). Habitualmente los segmentos
grávidos abandonan el hospedador uno a uno y con frecuencia salen espontáneamente a través del ano.
Los huevos son típicos huevos “ténidos” que no se pueden diferenciar de los huevos de otras especies de
Taenia o de Echinococcus. Los huevos ténidos miden aproximadamente 30–45 µm de diámetro, contienen una
oncosfera (o embrión hexacanto) que porta tres pares de ganchos; tienen un embrióforo o “cáscara” radialmente
estriado, marrón y grueso, formado por bloques; y tienen una capa membranosa oval más externa, la verdadera
cáscara del huevo, que no está presente en los huevos fecales.
Los metacestodos (o cisticercos) de T. saginata se encuentran normalmente en los músculos estriados del
ganado vacuno (solitaria bovina), pero también en búfalos, renos y ciervos. Son ovales, de aproximadamente
0.5–1 ‰ 0.5 cm de longitud, translúcidos y contienen un único escólex blanco, cuya morfología es similar al
1070
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.1. — Cisticercosis
escólex del futuro gusano adulto. Están contenidos en una cápsula delgada y fibrosa producida por el
hospedador. En ocasiones los quistes se encuentran en el hígado, los pulmones, los riñones y la grasa.
Taenia solium (tenia porcina) es más pequeña que T. saginata y llega a medir 3–5 metros. El escólex tiene un
rostelo armado con una doble corona de ganchos; el número y tamaño de ganchos puede ayudar a diferenciarla
de otras especies de Taenia (Cuadro 1). Los segmentos grávidos tienen 7–13 (<17) ramas uterinas y
habitualmente no abandonan el hospedador espontáneamente, pero pueden hacerlo en cadenas de forma
pasiva con las heces.
Los metacestodos se encuentran en los músculos y el sistema nervioso central de los cerdos (solitaria porcina),
los osos o los perros y en los músculos, los tejidos subcutáneos y el sistema nervioso central del hombre. Los
quistes son enormemente similares a los de T. saginata, pero pueden ser mayores que los quistes de
T. saginata. Tienen un escólex que porta un rostelo y unos ganchos que son similares a los del adulto.
Ocasionalmente, se desarrollan en el cerebro humano como quistes racemosos de hasta 2 cm o más de un lado
a otro, que carecen de escólex.
Cuadro 1. Características útiles para la identificación de los escólices y los segmentos de Taenia spp.
Especie
parásita
Número
de
ganchos
Longitud de los
ganchos (µm)
Ganchos
grandes
Ganchos
pequeños
Número
de
testículos
Número de
El saco del
Capas de
ramas
cirro se
los
uterinas
testículos extiende hacia
los vasos
longitudinales
T. hydatigena
28–36
(26–44)
191–218
(170–235)
118–143
(110–168)
600–700
1
Si
6–10 que
se
subdividen
Los lóbulos del ovario
son de tamaño
desigual. No tienen
esfínter vaginal. Los
testículos se extienden
hacia el vitelario, pero
no confluyen por
detrás.
T. ovis
30–34
(24–38)
170–191
(131–202)
111–127
(89–157)
350–750
1
No
11–20 que
se
subdividen
Los lóbulos del ovario
son de tamaño
desigual. El esfínter
vaginal está bien
desarrollado. Los
testículos se extienden
hacia el borde posterior
del ovario.
T. multiceps
22–30
(20–34)
157–177
(120–190)
98–136
(73–160)
284–388
2
Si
14–20 que
se
subdividen
Los lóbulos del ovario
son de igual tamaño.
Poseen un paquete
muscular en la pared
anterior de la vagina.
Los testículos se
extienden hacia el
vitelario, pero no
confluyen por detrás.
T. saginata
–
–
–
765–1200
1
No
14–32 que
se
subdividen
Los lóbulos del ovario
son de tamaño
desigual y presentan
un pequeño esfínter
bien desarrollado. Los
testículos se extienden
hacia el vitelario, pero
no confluyen por
detrás.
22–36
139–200
93–159
375–575
1
Si
7–16 que
se
subdividen
Los lóbulos del ovario
son de tamaño
desigual con un lóbulo
pequeño accesorio. No
tienen esfínter vaginal.
Los testículos
confluyen por detrás
del vitelario
T. solium
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1071
Capítulo 2.10.1. — Cisticercosis
Taenia saginata asiatica (Taenia de Asia y Taiwan): Está estrechamente relacionada pero se distingue
genéticamente de T. saginata (2), el adulto en humanos tiene un ovario con un músculo del esfínter vaginal y un
saco del cirro como los que presenta T. saginata, pero T. s. asiatica tiene un rostelo y protuberancias
posteriores en los segmentos y 11–32 brotes uterinos. Los segmentos se liberan uno a uno y con frecuencia de
modo espontáneo. Los metacestodos son pequeños, de aproximadamente 2 mm, y poseen un rostelo y una
doble corona de ganchos primitivos, siendo los de la corona externa numerosos y menudos. Se presentan
principalmente en el parénquima y en la superficie del hígado de cerdos domésticos y salvajes; se pueden
encontrar en el omento y, raramente, en los pulmones y la serosa del colon. Ocasionalmente se presentan en
vacas, cabras y monos.
Taenia ovis: los adultos en el intestino de perros y carnívoros salvajes alcanzan 1–2 metros de longitud y tienen
un rostelo armado (Cuadro 1). Los metacestodos que se encuentran en la musculatura de ovejas y menos
comúnmente de cabras alcanzan 3,5–1,0 ‰ 0,2–0,4 cm. Frecuentemente, los cisticercos degeneran a formas
con el centro calcificado o caseificado, de color crema o verde. Un parásito similar se encuentra en carnívoros
salvajes y perros y en los músculos de renos y ciervos de las regiones del norte.
Taenia hydatigena: Los adultos son de 1–5 metros de longitud, se encuentran en el intestino de
perros y carnívoros salvajes y tienen un rostelo armado (Cuadro 1). Los metacestodos son grandes, de 1 cm
hasta 6–7 cm, y el escólex presenta un cuello largo. Aparecen fijados al omento, al mesenterio y ocasionalmente
a la superficie del hígado, en particular de ovejas, pero también de otros rumiantes domésticos y silvestres y de
cerdos. En las latitudes del norte existe un ciclo en el lobo y en el reno/ciervo, en el que los metacestodos se
encuentran en el hígado de los hospedadores intermediarios; los perros también se infectan como
hospedadores definitivos.
Taenia multiceps: Los adultos son de 40–100 cm de longitud, se encuentran en el intestino de carnívoros y
tienen un rostelo armado (Cuadro 1). Los metacestodos son del tipo gran-cenuro, quistes rellenos de líquido
blanco y que contienen varios cientos de escólices invaginados y fijos a la pared formando grupos. Crecen hasta
más o menos 5 cm en el cerebro de ovejas, en el cerebro y tejidos intramusculares de cabras y también en el
cerebro de vacas, de rumiantes silvestres y, ocasionalmente, del hombre. En el tejido nervioso los quistes no
son encapsulados. Los quistes inducen signos neurológicos que en las ovejas se denominan “modorra”,
“torneo”, etc.
a)
Diagnóstico de los parásitos adultos en humanos y perros
Toda la materia fecal o que contenga parásitos procedentes de personas con posibles infecciones debidas
a T. solium debe manejarse con las adecuadas medidas de seguridad para prevenir infecciones
accidentales con los huevos. Asimismo, Taenia multiceps y Echinocccus spp. infectan a humanos y, como
los huevos ténidos de perros no se pueden diferenciar a nivel de especie o género, en las áreas donde son
endémicos, se aplican algunas medidas de precaución. Además de Taenia spp., el hombre se puede
infectar de Diphyllobothrium y Hymenolepis spp., si bien está documentada la infección ocasional de
humanos debida a otros seis géneros de cestodos. Lo describe Lloyd (13) y todos se pueden diferenciar de
Taenia spp. mediante la morfología del huevo/proglótide. Sin embargo, recientemente, en un niño se ha
notificado la presencia de T. taeniaeformis con huevos ténidos morfológicamente indistinguibles. En
cánidos, los huevos de Echinococcus spp. no se pueden diferenciar de los de Taenia, pero se puede
determinar la presencia del primero mediante el tamaño del gusano y, más recientemente, por un
enzimoinmunoensayo de captura antigénica (AG-ELISA) específico a nivel de especie para Echinococcus.
Otros gusanos, Dipylidium, Diplopylidium, Mesocestoides y Diphyllobothrium spp. presentan huevos y
proglótides morfológicamente diferentes (13, 19).
Los cestodos adultos se pueden expulsar del hombre empleando un antihelmíntico seguido de una purga
salina y se identifican por la morfología del escólex y los proglótides. En animales, es útil la purga con
arecolina; de nuevo, los gusanos recogidos se identifican morfológicamente. La arecolina ya no está
disponible como antihelmíntico, pero se puede obtener a partir de empresas de suministros químicos. Al
tener efectos adversos, se deberían excluir de su tratamiento los animales viejos, débiles y gestantes. Una
dosis de 4 mg/kg debería conseguir la purga en menos de 30 minutos. El paseo y el masaje abdominal en
los casos recalcitrantes o la administración de enemas a los perros estreñidos puede evitar la utilización de
una segunda dosis (2 mg/kg), que sólo se debería dar cuidadosamente. Afortunadamente, la purga con
arecolina se está reemplazando rápidamente por un AG-ELISA para Echinococcus spp. y quizás en el
futuro también lo será para el caso de Taenia spp.
Verster (23) y Loos-Frank (14) han elaborado descripciones para el diagnóstico parasitológico de todas las
Taenia spp. de humanos y animales, sus hospedadores y sus distribuciones geográficas. Mayta et al. (15)
y Loos-Frank (14) describen métodos de montaje, inclusión, sección y tinción de los proglótides. La técnica
siguiente de tinción es la de Loos-Frank (14). Los gusanos, después de su relajación en agua, se pueden
teñir directamente, aunque los gusanos pequeños se deberían fijar con etanol durante unos pocos minutos.
Alternativamente, los gusanos se pueden fijar y conservar en etanol al 70% que contiene ácido láctico al
10%, conservándose por separado el escólex y el gusano. Los ganchos rostelares de los escólices o
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Capítulo 2.10.1. — Cisticercosis
protoescólices se deberían separar y montar en face en líquido de Berlese (se prepara disolviendo 15 g de
goma arábiga en 20 ml de agua destilada y añadiendo 10 ml de jarabe de glucosa y 5 ml de ácido acético,
a continuación la mezcla se satura con clorhídrico, hasta 100 g). El colorante es carmín en ácido láctico: se
disuelven 0,3 g de carmín hasta el punto de ebullición en 42 ml de ácido láctico y 58 ml de agua destilada,
después de enfriar se adicionan 5 ml de una solución al 5% de cloruro ferroso (FeCl2.4H2O) y se puede
utilizar de nuevo para refrescar soluciones más viejas. Las muestras se sumergen en el colorante dentro
de viales y después de varios minutos se lavan con agua corriente de 1 día hasta que tengan color azul. A
continuación se fijan en etanol al 50–70% y se deshidratan bajo una ligera presión de una lámina plástica.
Para aclarar se emplea el éster metílico del ácido siálico.
Cuando los segmentos se rompen desde el extremo final del gusano, se expulsan algunos huevos en el
intestino y se pueden encontrar en las heces. La emigración espontánea de T. saginata o de T. s. asiatica
desde el ano es probable que sea percibida por el paciente (> 95%). Cuando los segmentos se desplazan,
los huevos adheridos se depositan en la zona perianal y se pueden detectar por la aplicación y el examen
de cintas adhesivas. Estos signos son mucho menos probables para el caso de las cadenas de T. solium
(1). Los segmentos de los tres tipos se pueden encontrar en las heces, pero salen intermitentemente. En
los perros, aproximadamente el 50% de los segmentos sale espontáneamente desde el ano. Estos
segmentos, cuando caen al suelo, emigrarán liberando huevos. El resto de los segmentos se expulsa con
las heces, pero habitualmente, los segmentos se mueven y vacían la mayoría de sus huevos dejando
rastros sobre la superficie de las heces y del área circundante. Incluso si un segmento que emigra vacía
todos sus huevos, se puede identificar como un cestodo por los numerosos corpúsculos calcáreos
concéntricos contenidos en sus tejidos. Las heces, después de mezclarse para reducir la agregación, se
pueden examinar para detectar la presencia de huevos. Se utilizan varias técnicas en todo el mundo que
incluyen la extracción con acetato de etilo y la flotación. Para esto último, el NaNO3 o la solución de azúcar
de Sheather (500 g de azúcar, 6,6 ml de fenol, 360 ml de agua), con su mayor densidad, son superiores a
la solución saturada de NaCl como medio de flotación para los huevos ténidos. La flotación se puede
llevar a cabo en cámaras de flotación cuantitativas o cualitativas disponibles comercialmente o mediante
una técnica de flotación por centrifugación que comprende una modificación de la técnica de Wisconsin
(heces, diluidas en agua, se tamizan y centrifugan, el precipitado se resuspende en azúcar o en solución
de Sheather y se centrifuga a 300 g durante 4 minutos). Entonces, pueden detectarse los huevos
adheridos al cubreobjetos. El examen de los huevos fecales será menos sensible para T. solium que para
otras especies. La determinación de las especies no se puede realizar mediante la morfología de los
huevos, pero las sondas de ADN, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el análisis por PCR del
polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) la han demostrado ser útiles para la
diferenciación en el laboratorio. Se han empleado mucho a nivel experimental para diferenciar los huevos
fecales de T. solium, T. saginata y T. s asiatica (2, 5–7, 9). Aunque son igualmente aplicables para la
diferenciación en perros, no se han realizado los mismos exámenes.
Ya no se dispone comercialmente de un AG-ELISA para detectar coproantígenos de Taenia en heces. Se
puede obtener información acerca de su disponibilidad para estudios epidemiológicos o para una
utilización en colaboración, del Profesor P.S. Craig, Experto de Referencia de la OIE en Equinococosis
(véase el Cuadro de la Parte 3 de este Manual de animales terrestres). Esta técnica AG-ELISA la
desarrollaron experimentalmente Allan et al. (1) para detectar coproantígenos en los perros, de modo que,
con los controles adecuados, podría utilizarse para detectar las infecciones de Taenia en esta especie. La
técnica, no obstante, sólo es específica de género. La prueba consiste en un ensayo en fase sólida con
micropocillos recubiertos con anticuerpo policlonal de conejo específico anti-Taenia (TSA). La técnica
básica es la siguiente:
i)
Se recogen los sobrenadantes fecales a partir de muestras fecales frescas, congeladas o
formalinizadas (formalina al 5% a 4°C). La muestra se agita vigorosamente hasta formar un
compuesto acuoso en una relación igual peso/volumen de solución salina tamponada con fosfato
0,15 M (PBS) que contenga Tween 30 al 0,3%. El sobrenadante se recoge mediante centrifugación a
2.000 g durante 30 minutos.
ii)
La porción soluble de los proglótides no grávidos de Taenia se obtiene después de la emulsión en
PBS y la centrifugación.
iii)
Se prepara el antisuero hiperinmune de conejo frente al extracto soluble de los proglótides y se aisla
la fracción IgG por pases y elución de la IgG unida a partir de Proteína A-Sepharosa CL 4B
(Pharmacia). Parte de la fracción de IgG se conjuga a peroxidasa tipo VI (Sigma). Los sueros se
conservan en pequeñas cantidades congeladas a –20°C. Puede ser necesario que los sueros sean
absorbidos mediante heces empacadas normales de perro en una relación de 2/1 mezclándolos
durante 1 hora y recuperándolos por centrifugación.
iv)
Se cubren placas de microtitulación de fondo plano (Dynatech) con IgG de conejo anti-Taenia (el
contenido proteico debe ser de 5–25 µg/ml y se determina por espectrofotometría UV) empleando
100 µl/pocillo, los antisueros se diluyen en tampón NaHCO3/Na2CO3, 0,05 M pH 9,6. Las placas se
incuban toda la noche a 4°C, los pocillos se lavan tres veces con PBS/Tween al 0,1%, se bloquean
con PBS/Tween al 0,3% durante 1 hora y se lavan de nuevo. Se adicionan 100 µl de sobrenadante
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fecal que contenga suero fetal de ternero al 50% y las placas se incuban durante 1 hora y
seguidamente se lavan tres veces. Se adicionan 100 µl de IgG anti-Taenia conjugada a peroxidasa
(diluida 1/100 o 1/200) y se incuban las placas durante 1 hora antes de lavarlas tres veces. La
solución de sustrato (100 µl de ácido 5-amino-salicílico [Sigma] y H2O2 al 0,005% en tampón fosfato
0,1 M que contenga Na2EDTA 1 mM [ácido etilendiamino tetra-acético] a pH 6,0) se añade durante
25 minutos y el resultado se lee a 450 nm. Los valores de corte son la media más tres desviaciones
estándar de los valores de las heces normales de perro.
b)
Diagnóstico de metacestodos
En los animales vivos, los metacestodos de T. solium o de T. saginata pueden ser palpables en la lengua
pero, en el animal vivo y en el examen post mortem o en la inspección de canales, la palpación de la
lengua sólo es de valor diagnóstico en cerdos o vacas muy infectados por metacestodos; además serán
difíciles de diferenciar de los sarcocistos.
Œ
Inspección de la canal — el procedimiento principal de diagnóstico
Al principio los metacestodos son visibles como quistes muy pequeños, de aproximadamente 1 mm, pero
la detección de estos quistes requiere el corte fino de órganos en el laboratorio. Muchos quistes jóvenes
tienen a su alrededor una capa o cápsula de células inflamatorias (histológicamente destacan células
mononucleadas y eosinófilos). Más tarde pueden degenerar, pero la capacidad de los parásitos de evadir
la respuesta inmune significa que en la etapa posterior de la infección, cuando maduran los quistes, están
presentes pocas células inflamatorias en las proximidades y los cisticercos en su localización intermuscular
están rodeados de una delicada cápsula de tejido fibroso.
En teoría, los quistes se pueden visualizar o detectar en tejidos tales como la lengua de los animales
fuertemente infectados tan sólo después de 2 semanas del inicio de la infección. Los quistes son visibles
claramente a las 6 semanas y, cuando maduran, a menudo son ovales, de aproximadamente 10 ‰ 5 mm o
mayores, con una membrana del parásito blanca y delicada, bastante traslúcida y una cápsula del
hospedador; un líquido claro en el interior del quiste y el escólex, que es visible como un punto blanco
dentro del quiste y que habitualmente se invagina en medio de una larga pared.
En la inspección cárnica muchos de los quistes detectados, con frecuencia el 85%, están muertos. La tasa
a la que los quisten envejecen y mueren y así degeneran varía con la especie de parásito y también con el
tejido dentro del cual se incrusta el quiste. Normalmente, la muerte de vacas adultas con T. saginata se
produce dentro de los 9 meses de infección. Sin embargo, los quistes pueden permanecer viables durante
varios años si las vacas jóvenes se infectan a los pocos días del nacimiento. Se ha descrito que los quistes
de T. hydatigena en la cavidad peritoneal de ovejas y también los de T. solium sobreviven en ovejas y
cerdos durante largos periodos de tiempo. Los quistes de Taenia solium permanecen durante muchos
años en el cerebro del hombre, y frecuentemente los síntomas comienzan sólo cuando los quistes
empiezan a degenerar. En general, los quistes tienden a morir más rápidamente en las zonas de
predilección. Se sugiere que esto se debe a la mayor circulación sanguínea en dirección a estos músculos.
Por el contrario, la tasa más alta de actividad en estos músculos (lo cual explica la mayor circulación)
puede dañar a los parásitos, lo que permite el escape de líquidos y quizás trastorna la capacidad del
parásito para evadir la respuesta inmune. Los quistes se pueden encontrar en el mismo hospedador en
diferentes fases de viabilidad y degeneración.
Los quistes degenerados varían en apariencia. La cápsula de tejido fibroso del hospedador se engruesa y
se hace opaca, pero inicialmente el quiste permanece en el interior con apariencia normal. Gradualmente
el líquido se vuelve coloide y se infiltran las células inflamatorias. La cavidad quística se llena de un
material caseificado verdoso (eosinófilo) y después amarillo, que es muy desagradable a la vista,
normalmente presenta un tamaño grande y claramente es más evidente en la carne que el quiste viable
original. Más tarde el quiste se puede calcificar. Si bien los ensayos de PCR se han utilizado
principalmente para diferenciar los ténidos adultos en el hombre, pueden ser útiles para identificar sin
ambigüedades los metacestodos.
Después de el tratamiento de T. saginata o de T. solium en vacas o cerdos con drogas tales como
albendazol u oxfendazol, los quistes pueden perder su líquido y colapsar. La lesión resultante es mucho
menor que las lesiones observadas después de la muerte natural del quiste. Sin embargo, los quistes que
han muerto antes del tratamiento del animal permanecerán grandes y visibles.
En el caso de que sea necesario diferenciar quistes muy jóvenes (sin escólex) o degenerados respecto a
otras lesiones, se comprime el quiste, se prepara un frotis de los contenidos caseificados y se realiza el
examen histológico de las secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H&E). El examen microscópico
puede revelar los corpúsculos calcáreos (concreciones concéntricas de sales que tienen un tamaño
aproximado de 5–10 µm). Estos indican un origen cestódico del tejido y diferencian, por ejemplo, un quiste
inmaduro de un quiste simple. La presencia de ganchos y su longitud junto con el conocimiento del
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Capítulo 2.10.1. — Cisticercosis
hospedador y tejido pueden ayudar en la identificación de la especie de cestodo. Sería de utilidad para
descubrir un cestodo nuevo en una especie hospedadora o en un área geográfica en la que,
históricamente, está ausente el parásito.
Los procedimientos de inspección de carnes varían según el parásito y el hospedador implicados, a saber,
si hay zoonosis o no, el tejido afectado y las normativas del país. Los exámenes tienden a ser más amplios
con las infecciones zoonósicas debidas a T. saginata y a T. solium.
En general, los procedimientos de inspección de carnes son como sigue:
i)
Se inspecciona visualmente la canal, sus superficies de corte y los órganos internos. Esta inspección
puede revelar la presencia de T. saginata, T. solium o T. ovis en los músculos, de T. hydatigena en el
hígado o los mesenterios y omento, o de T. multiceps en el cerebro.
ii)
Se deben examinar Los maséteros internos y externos y cada uno de los músculos pterigoideos y
realizar una o dos incisiones en cada uno, los cortes deben ser paralelos al hueso y justo a lo largo
del músculo.
iii)
La lengua separada se examina visualmente y se palpa.
iv)
El pericarpio y el corazón se examinan visualmente. Normalmente el corazón se corta una vez a lo
largo a través del ventrículo izquierdo y el septo interventricular de modo que se expone para examen
el interior y las superficies de corte. Los cortes pueden ir desde la base al ápice y los reglamentos
pueden exigir también cortes en profundidad adicionales, quizás cuatro, en el ventrículo izquierdo.
Alternativamente, el corazón puede examinarse externamente y después internamente después de
cortar a lo largo del septo interventricular y darle la vuelta.
v)
Los músculos del diafragma, habitualmente después de eliminar el peritoneo, se examinan
visualmente y se pueden cortar.
vi)
Se examina visualmente el esófago .
vii)
En particular en los países africanos, el músculo tríceps del brazo de la vaca se corta en profundidad
unos 5 cm por encima del codo. Se pueden hacer cortes internos adicionales. Asimismo se puede
cortar el músculo grácil paralelo a la sínfisis púbica. Normalmente estos cortes se realizan también en
cerdos para detectar T. solium. En África tales incisiones se realizan en las patas porque se sospecha
que en animales de trabajo y campo que andan largas distancias se alojan más parásitos en estos
músculos debido al ejercicio y el consiguiente flujo sanguíneo elevado. De igual modo otros países
pueden exigir tales cortes en las patas. Sin embargo, como esto devalúa la carne, tales incisiones se
realizan normalmente una vez que se han encontrado uno o más quistes en los lugares de
predilección con el fin de determinar la extensión de la infección.
En general, el corte inicial en el tejido es el más importante, pero los reglamentos pueden exigir incisiones
adicionales o estas pueden ser necesarias si se encuentran los quistes en la(s) incisión(es) inicial(es).
Para parásitos específicos pueden ser necesarios procedimientos adicionales o menos procedimientos y
los juicios clínicos a cerca de la canal, las vísceras, los despojos o la sangre variarán dependiendo de la
especie de Taenia y los reglamentos del país. Los criterios sobre las canales infectadas se encuadran en
tres categorías: i) se aprueba el consumo humano; ii) se declara parcialmente no apta para el consumo y
se aprueba el resto de la canal, pero en el caso de zoonosis por T. saginata o T. solium, deben tratarse
tanto la canal como la carne y las vísceras; y iii) se declara totalmente no apta para el consumo debido a
que las canales presentan una infección severa o proceden de animales enfermos demacrados.
Taenia saginata: normalmente no se examinan vacas de menos de 6 semanas o de < 32 Kg. Los sitios
preferidos son el corazón, la lengua, los maséteros y el diafragma, presumiblemente porque estos sitios
reciben un mayor aporte sanguíneo. No obstante, los quistes se pueden encontrar en cualquier músculo
del cuerpo. Si se encuentra una canal infectada en un lote, todas aquéllas del mismo lote se pueden
mantener retenidas hasta que se obtenga la confirmación del laboratorio. Si se confirma la infección por
T. saginata, normalmente se realizan cortes adicionales en las canales del lote; todas las lesiones
sospechosas encontradas en el resto del lote se consideran debidas a T. saginata sin que se necesite la
confirmación del laboratorio. Puede que sea necesario diferenciar las lesiones por T. saginata de los
sarcocistos de Sarcocystis o de las lesiones de la actinobacilosis.
Juicio clínico: Si se considera que una canal está infectada fuertemente, entonces se declaran no aptos
para el consumo la canal, la carne, los despojos y la sangre. La descripción de una infección severa varía,
pero, generalmente, consiste en la detección de los quistes en dos de los lugares predilectos más dos
lugares en las patas. En el caso de una infección menor, las partes infectadas y los tejidos circundantes se
eliminan y se declaran no aptas para consumo. A continuación, se deben tratar la canal y las vísceras
comestibles; el tratamiento varía según el país y los medios disponibles e incluye: i) la congelación a
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temperatura inferior a –10°C durante >10 a 14 días, o inferior a –7°C durante 21 días; ii) las
cajas de carnes con hueso se congelan a menos de –10°C durante >20 días; iii) el tratamiento de la
totalidad a una temperatura aproximada de 60°C; iv) el tratamiento a vapor a una presión moderada
(0,49 kg/cm2); v) el calentamiento a 95–100°C durante 30 minutos; o vi) el encurtido en solución salina
durante 21 días a 8–12°C. La congelación por corriente de aire necesita un control; generalmente se indica
que una caja de 30 kg requiere 2 ciclos de 24 horas a –30,9°C seguido de la conservación en frío durante
72 horas a –23,3°C para conseguir la muerte de los escólices. Con frecuencia se puede exportar la carne
no tratada aunque en algunos países se puede exportar de forma enlatada. Incluso si sólo se encuentran
quistes muertos durante la inspección de la carne, todavía es justificable un tratamiento de la canal porque
en la disección de aproximadamente el 10% de las canales con infecciones leves se ha comprobado que
tienen tanto parásitos muertos como viables en su interior.
Taenia solium: Los lugares predilectos son los mismos que los de T. saginata aunque hay informes de una
prevalencia superior en la paletilla y el muslo. Comúnmente se necesita hacer uno o más cortes a 2,5 cm
por encima de la articulación del codo. Se dice que esto permite detectar un 13% de las canales infectadas
que de otra manera pasarían desapercibidas.
Juicio clínico: En algunos países, cualquier cerdo infectado, ya sea leve o gravemente, junto con sus
vísceras y sangre será rechazado para consumo. En las regiones donde es frecuente la infección, se
pueden aceptar las canales con infección leve para cocinar y encurtir y a veces congelar.
Taenia hydatigena: el desplazamiento del parásito en el hígado deja rastros hemorrágicos que después
adquieren un color verde/marrón acompañado de una inflamación y que posteriormente se vuelven blancos
debido a la fibrosis. A efectos de registro, deben diferenciarse éstos de los tremátodos. Si es posible,
mediante la identificación de los cisticercos o de los tremátodos adultos. La mancha blanca debida a la
infección por Ascaris se distingue por las lesiones que aparecen como pequeños focos aislados de un
color pálido a blanco. Algunos quistes permanecen atrapados por debajo de la cápsula del hígado.
Habitualmente éstos son pequeños y degeneran pronto y posteriormente se calcifican en lesiones con
aspecto de coliflor. Normalmente Taenia hydatigena es superficial en la subserosa, mientras que los
quistes hidatídicos de Echinococcus granulosus se encuentran a más profundidad en el parénquima. Si es
viable, el primero tiene un único escólex de cuello largo, mientras que el segundo, si es fértil, tiene muchos
escólices. Pueden ser necesarias pruebas histológicas para la diferenciación. Las secciones teñidas con
H&E revelarán la membrana laminada sobre los quistes hidatídicos jóvenes de carácter uniforme. Su
presencia o ausencia se puede confirmar mediante la tinción de ácido periódico de Schiff ya que las
proteínas altamente glicosiladas de la membrana laminada se colorearán de rojo. Las lesiones de Taenia
hydatigena en vacas y cerdos pueden ser similares a las de la tuberculosis. Sin embargo, no están
implicados los ganglios linfáticos portales, se desprenden de un modo más fácil los contenidos de los
quistes parasitarios y se pueden ver el resto de los ganchos y corpúsculos calcáreos o bien la tinción de
Ziehl–Neelsen puede revelar la presencia de la bacteria.
Juicio clínico: Normalmente sólo están presentes unos pocos quistes o rastros y pueden ser eliminados por
recorte. Se rechazan los hígados fuertemente infectados y el omento. Es raro apreciar que las infecciones
agudas con cantidades grandes de parásitos migratorios produzcan hepatitis traumática, ascitis, edema,
etc., y esto provocaría un rechazo secundario de la canal.
Taenia multiceps: Los parásitos tienen como lugares de predilección el cerebro y el cordón espinal.
Los parásitos que se desplazan pronto pueden causar rastros purulentos rojizos, que posteriormente se
tornan grises en el cerebro, y, en infecciones severas, las ovejas pueden mostrar meningoencefalitis. Los
quistes maduros provocan signos clínicos derivados de la atrofia por presión que varían de acuerdo a la
localización en el cerebro y de forma gradual la oveja puede ser incapaz de alimentarse de modo que
llegará a un estado demacrado. En infecciones severas, los parásitos emigran y comienzan su desarrollo
en otros tejidos, pero mueren pronto. Producen pequeñas lesiones, de 1 mm aproximadamente, que
primero contienen un quiste encapsulado y a continuación un material caseificado eosinófilo que más tarde
puede calcificarse.
Juicio clínico: En principio sólo se rechaza para el consumo la cabeza o se eliminan por recorte los quistes
inusuales en los lugares intermusculares o subcutáneos. Puede que más tarde el animal, al no haberse
podido alimentar, sea rechazado por su estado de desnutrición, etc.
Taenia ovis: Los lugares preferidos son los mismos que los de T. saginata. Sus quistes se pueden
confundir con los sarcocistos grandes de Sarcocystis gigantea.
Juicio clínico: Comúnmente la detección de hasta 2–5 quistes conlleva la eliminación por recorte y se
acepta la canal. Esto no impide la presencia antiestética de parásitos vivos o degenerados en otros tejidos.
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Capítulo 2.10.1. — Cisticercosis
Se están probando los ultrasonidos y los rayos X para tratar de detectarlos. En infecciones graves se
rechaza la canal.
Los procedimientos de inspección de la carne únicamente detectan el 50% aproximado de los animales
que están infectados realmente. Es fácil que las infecciones leves pasen desapercibidas en un examen de
palpación e inspección de la carne (en un estudio, se detectó el 78% de las canales infectadas con
>20 quistes, aunque sólo se detectó el 31% de las que presentaban menos quistes) (24). La eficacia de la
inspección variará con la cantidad y localización de las incisiones. Por ejemplo, en Zimbabwe, el 58% de
las vacas dieron positivo sólo en la cabeza, el 20% sólo en la paletilla y el 8% sólo en el corazón, aunque,
en conjunto el 81% se encontraba infectado si se consideran los tres órganos. En Kenia, Walther y Koske
(24) también hallaron que los lugares predilectos no necesariamente resultaban infectados en el 57% de
las vacas consideradas positivas después de la disección. Asimismo estos autores confirmaron la
importancia de realizar las incisiones en la paletilla para detectar la infección en África ya que el 20% de
las vacas en las que se encontró infección únicamente daban resultado positivo en la paletilla.
En el hombre, los signos más comunes presentados en la NCC debida a T. solium son ataques repentinos
seguidos de dolor de cabeza, pero se pueden observar varios signos, tales como vómitos, psicosis, etc,
dependiendo de la cantidad, localización y viabilidad o nivel de degeneración de los cisticercos (viable, en
transición a la muerte, calcificación) (3, 12). En el hombre, para detectar las localizaciones exactas y la
viabilidad de los metacestodos de T. solium y T. multiceps se utiliza la evaluación clínica y, o bien la
exploración topográfica computerizada (CT) (lo mejor para los quistes calcificados) o bien la imagen
obtenida por resonancia magnética (detecta quistes tanto en localización parenquimal como
extraparenquimal y permite seguir el desarrollo de la lesión). Estos siguen siendo los medios más eficaces
para el diagnóstico, pero en áreas endémicas puede que no esté disponible el acceso a los servicios de
imagen.
2.
Pruebas serológicas
El desarrollo de una prueba de diagnóstico específica y sensible automatizada reduciría en gran medida los
costes que supone el rechazo de la canal y también los costes de trabajo. Las pruebas serológicas para los
animales no han alcanzado la fase en la que es posible la comercialización para el diagnóstico individual o la
detección de las canales infectadas a gran escala en mataderos. Todos los ensayos probados – AG-ELISA,
ELISA para anticuerpo, enzimoinmunoelectrotransferencia (EITB) e inspección de la lengua – muestran una baja
sensibilidad en cerdos de campo infectados de forma natural con niveles reducidos de T. solium (18). Esto
contrasta con su elevada sensibilidad y especificidad cuando se aplican a cerdos criados con fines comerciales
que están libres de infección y que se infectan de forma experimental con T. solium (17, 18). Este hallazgo
también es válido para las infecciones de T. saginata en vacas (16, 22). Así, sólo un porcentaje pequeño (13–
22%) de vacas que llevan menos de 30–50 cisticercos viables se detecta mediante la técnica AG-ELISA. Por el
contrario, los anticuerpos han resultado ser lo más útil para detectar quistes que ya no son viables. No obstante
las técnicas AG-ELISAs tienen aplicación en estudios epidemiológicos basados en el medio natural para
demostrar la transmisión de la enfermedad. Por ejemplo, la detección de infecciones viables en vacas o cerdos
podría indicar las fuentes puntuales de infección, la estación de transmisión y la edad de los animales de riesgo.
El ensayo EITB para T. solium (empleado para detectar anticuerpos frente a glicoproteínas unidas a lentil-lectina
en el líquido cerebroespinal o en el suero) se utiliza ampliamente en humanos (20, 21) en muchos laboratorios y
también está disponible a nivel comercial (Immunetics, Cambridge, Massachusetts, EE.UU.). Una técnica AGELISA que utiliza anticuerpos policlonales o monoclonales (empleado para detectar antígeno en el líquido
cerebroespinal) tiene una especificidad y sensibilidad hasta del 86% en pacientes seleccionados (8). La
especificidad de estas pruebas tiende a ser muy alta pero su sensibilidad es menor, lo que está en parte
relacionado con la cantidad de quistes. Brutto et al (4) han publicado estudios de imagen, de la jerarquía de los
síntomas clínicos y las pruebas serológicas.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
La identificación inmunoquímica de los antígenos protectores y su producción mediante la tecnología del ADN
recombinante únicamente han tenido éxito en el caso de los Taeniidae si se compara con otros eucariotas y han
sido descritas por Lightowlers y Gauci (11). La vacunación con los productos resultantes ha sido muy eficaz. En
general el éxito se debe al hecho de que, después de la infección natural, se produce una fuerte inmunidad
protectora, se inducen altos niveles de inmunidad protectora mediante antígenos presentes en los extractos
oncosferales, existe una buena inmunidad cruzada entre las especies de Taenia y la inmunidad está mediada en
gran parte por los anticuerpos, como se pone de manifiesto mediante la transferencia de inmunidad pasiva y
maternal; por todo esto, los anticuerpos se pueden emplear para investigar los antígenos protectores.
Inicialmente se desarrolló la vacuna de T. ovis. El antígeno 45W de T. solium se aisló como una proteína
recombinante a partir de Escherichia coli. El antígeno, que es una proteína de fusión glutation-S-transferasa es
muy eficaz mientras que las proteínas de fusión beta-galactosidasa no lo son. El control de potencia se realiza
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Capítulo 2.10.1. — Cisticercosis
mediante una técnica AG-ELISA y pruebas de inmunogenicidad in vivo, y la vacuna proporciona protección
durante un periodo de al menos un año en ensayos en el medio natural. Se han aislado y clonado otros dos
antígenos (To16K y To18K), y cada proteína individual de T. ovis muestra un efecto protector. Aprovechando la
ventaja de la reacción cruzada y ensayando con el ADNc de T. ovis, se identificaron en el ADN de T. saginata,
TSA9 y TSA18, equivalentes a To45W y To18, y se clonaron a partir del mRNA de las oncosferas de
T. saginata. En contraste con los antígenos individuales de T. ovis, se requirió la inmunización con ambos
antígenos de T. saginata para proporcionar un alto nivel de protección. Los ADNc 45W y 18 K de T. ovis se han
empleado también para clonar los antígenos equivalentes TSO45 y TSOL18 de T. solium. Tanto la vacuna de
T. ovis como la de T. saginata dan una protección >94% y 98% en vacas y ovejas, respectivamente. La vacuna
de T. ovis fue registrada en 1994 por New Zealand Animal Remedies Board. Sin embargo, debido a los cambios
de mercado en Nueva Zelanda, no se dispone de la vacuna comercial. Los costes de la producción de
antígenos a gran escala, las condiciones de procesamiento y las variedades potenciales en cuanto a expresión
de antígenos los han descrito Lightowlers y Gauci (11). Péptidos sintéticos obtenidos a partir de las secuencias
de estos antígenos ténidos inducen la formación de anticuerpos pero no la protección, lo que indica que los
epitopos protectores parecen ser conformacionales. Recientemente, sin embargo, se han inducido de manera
experimental niveles razonables de protección en lechones expuestos a infección natural con T. solium
empleando péptidos sintéticos basados en las secuencias proteicas del parásito murino T. crassiceps (10). Es
posible que los análisis de costes/beneficios concernientes al empleo de la vacuna de T. saginata impidan su
utilización en muchos países, ya que el coste de la vacuna es muy elevado para las industrias ganaderas. La
importancia de T. solium en el hombre incrementa los costes de la enfermedad, pero queda por ver si el impacto
de la enfermedad en los países endémicos será suficiente para impulsar la producción comercial de la vacuna
para uso ganadero.
REFERENCIAS
1.
ALLAN J.C., VELASQUEZ-TOHOM M., TORRES-ALVAREZ R., YURRITA P. & GARCIA-NOVAL J. (1996). Field trial of the
coproantigen-based diagnosis of Taenia solium taeniasis by enzyme-linked immunosorbent assay. Am. J.
Trop. Med. Hyg., 54, 352–356.
2.
BOWLES J. & MCMANUS D.P. (1994). Genetic characterisation of the Asian Taenia, a newly described taeniid
cestode of humans. Am. J. Trop. Med. Hyg., 50, 33–44.
3.
CARPIO A., PLACENCIA M., SANTILLAN F. & ESCOBAR A. (1994). A proposal for classification of
neurocysticercosis. Can. J. Neurol. Sci., 21, 43–47.
4.
DEL BRUTTO O.H., RAJSHEKHAR V., W HITE A.C. JR, TSANG V.C., NASH T.E., TAKAYANAGUI O.M., SCHANTZ P.M.,
EVANS C.A., FLISSER A., CORREA D., BOTERO D., ALLAN J.C., SARTI E., GONZALEZ A.E., GILMAN R.H. & GARCIA
H.H. (2001). Proposed diagnostic criteria for neurocysticercosis. Neurology, 57, 177–183.
5.
GASSER R. & CHILTON N.B. (1995). Characterisation of taeniid cestode species by PCR-RFLP of ITS2
ribosomal DNA. Acta Trop., 59, 31–40.
6.
GASSER R.B., ZHU X. & W OODS W. (1999). Genogyping Taenia tapeworms by single-strand confirmation
polymorphism of mitochondrial DNA. Electrophoresis, 20, 2834–2837.
7.
GOTTSTEIN B., DEPLAZES P., TANNER I. & SKAGGS J.S. (1991). Diagnostic identification of Taenia saginata with
the polymerase chain reaction. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 85, 248–249.
8.
GOTTSTEIN B., ZINI D. & SCHANTZ P.M. (1987). Species-specific immunodiagnosis of Taenia solium
cysticercosis by ELISA and immunoblotting. Trop. Med. Parasitol., 38, 299–303.
9.
HARRISON L.J., DELGADO J. & PARKHOUSE R.M. (1990). Differential diagnosis of Taenia saginata and Taenia
solium with DNA probes. Parasitology, 100, 459–461.
10. HUERTA M., DE ALUJA A.S., FRAGOSO G., TOLEDO A., VILLALOBOS N., HERNANDEZ M., GEVORKIAN G., ACERO G.,
DIAZ A., ALVAREZ I., AVILA R., BELTRAN C., GARCIA G., MARTINEZ J.J., LARRALDE C. & SCIUTTO E. (2001).
Synthetic peptide vaccine against Taenia solium pig cysticercosis: successful vaccination in a controlled
field trial in rural Mexico. Vaccine, 20, 262–266.
11. LIGHTOWLERS M.B. & GAUCI C.G. (2001). Vaccines against cysticercosis and hydatidosis. Vet. Parasitol.,
101, 337–352.
1078
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.1. — Cisticercosis
12. LLOYD S. (1998). Cysticercosis and taeniosis Taenia saginata, Taenia solium and Asian Taenia. En:
Zoonoses. Biology, Clinical Practice, and Public Health Control, Palmer S.R., Lord Soulsby E.J.L. &
Simpson D.I.H., eds. Oxford University Press, Oxford, UK, 635–649.
13. LLOYD S. (1998). Other cestode infections. Hymenoleposis, diphyllobothriosis, coenurosis, and other adult
and larval cestodes. En: Zoonoses. Biology, Clinical Practice, and Public Health Control, Palmer S.R., Lord
Soulsby E.J.L. & Simpson D.I.H., eds. Oxford University Press, Oxford, UK, 651–663.
14. LOOS-FRANK B. (2000). An up-date of Verster’s (1969) ‘Taxonomic revision of the genus Taenia’ (Cestoda)
in table format. Syst. Parasitol., 45, 155–183.
15. MAYTA H., TALLEY A., GILMAN R.H., JIMENEZ J., VERASTEGUI M., RUIZ M., GARCIA H.H. & GONZALEZ A.E. (2000).
Differentiating Taenia solium and Taenia saginata infections by simple haematoxylin–eosin staining and
PCR-restriction enzyme analysis. J. Clin. Microbiol., 38, 133–137.
16. ONYANGO-ABUJE J.A., HUGHES G., OPICHA M., NGINYI K.M., RUGUTT M.K., W RIGHT S.H. & HARRISON L.J. (1996).
Diagnosis of Taenia saginata cysticercosis in Kenyan cattle by antibody and antigen ELISA. Vet. Parasitol.,
61, 221–230.
17. SCIUTTO E., HERNANDEZ M., GARCIA G., DE ALUJA A.S., VILLALOBOS A.N., RODARTE L.F., PARKHOUSE M. &
HARRISON L. (1998). Diagnosis of porcine cysticercosis: a comparative study of serological tests for
detection of circulating antibody and viable parasites. Vet. Parasitol., 78, 185–194.
18. SCIUTTO E., MARTINEZ J.J., VILLALOBOS N.M., HERNANDEZ M., JOSE M.V., BELTRAN C., RODARTE F., FLORES I.,
BOBADILLA J.R., FRAGOSO G., PARKHOUSE M.E., HARRISON L.J. & DE ALUJA A.S. (1998). Limitations of current
diagnostic procedures for the diagnosis of Taenia solium cysticercosis in rural pigs. Vet. Parasitol., 79, 299–
313.
19. SOULSBY E.J.L. (1982). Helminths, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animals, Seventh Edition.
Balliere Tindall, London, UK, 809 p.
20. TSANG V.C., BRAND J.A. & BOYER A.E. (1989). An enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay and
glycoprotein antigens for diagnosing human cysticercosis (Taenia solium). J. Infect. Dis., 159, 50–59.
21. TSANG V.C., PERALTA J.M. & SIMONS A.R. (1983). Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot techniques
(EITB) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis. Methods
Enzymol., 92, 377–391.
22. VAN KERCKHOVEN I., VANSTEENKISTE W., CLAES M., GEERTS S. & BRANDT J. (1998). Improved detection of
circulating antigen in cattle infected with Taenia saginata metacestodes. Vet. Parasitol., 76, 269–274.
23. VERSTER A. (1969). A taxonomic revision of the genus Taenia Linnaeus 1758 s. str. Onderstepoort J. Vet.
Res., 37, 3–58.
24. W ALTHER M. & KOSKE J.K. (1980). Taenia saginata cysticercosis: a comparison of routine meat inspection
and carcass dissection results in calves. Vet. Rec., 106, 401–402.
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1079
CAPÍTULO 2.10.2.
ENFERMEDADES BUNYAVIRALES DE ANIMALES
(excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
RESUMEN
De los más de 537 arbovirus conocidos, unos 250 pertenecen a la mayor familia – la Bunyaviridae.
Una enfermedad bunyaviral de importancia veterinaria ya ha sido descrita, la denominada fiebre
del Valle del Rift, cuyo agente causal es un miembro del género Phlebovirus (véase Capítulo
2.1.8.). Otros géneros de importancia veterinaria de la familia son el género Nairovirus, que
incluye el virus de la enfermedad ovina de Nairobi patógeno de rumiantes (NSD), y el género más
amplio, Bunyavirus, que se subdivide en 18 grupos antigénicos. Este género comprende sólo unos
pocos virus patógenos significativos de animales, entre ellos el virus del Valle de Cache (CVV) y el
virus Akabane. A pesar de que estos dos virus están clasificados en diferentes grupos
antigénicos, manifiestan tropismo para los tejidos fetales y son responsables de enfermedades
congénitas en rumiantes domésticos. Los miembros de los géneros Nairovirus y Bunyavirus son
virus con envuelta y RNA monocatenario, y se han descrito con más detalle en el Capítulo 2.1.8.
Fiebre del Valle del Rift.
Identificación del agente: El CVV se puede aislar a partir de animales adultos virémicos o
febriles. Los intentos de aislarlo a partir de fetos recién nacidos son generalmente infructuosos por
el reducido número de virus debido a la respuesta inmune fetal. Para aislar el virus se emplean
líneas celulares derivadas de riñón de mono o de cría de hámster o, alternativamente, se puede
utilizar la inoculación intracerebral de cría de ratón. El virus se identifica mediante la prueba de
fijación del complemento (FC) o la prueba de neutralización. Se han desarrollado técnicas que
emplean la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específicas de grupo y de virus para los
Bunyavirus. El virus Akabane puede aislarse a partir de sangre de animales virémicos y
ocasionalmente a partir de material fetal. Se emplean líneas celulares de mono, cría de hámster y
mosquito. El virus produce deformaciones en el embrión de pollo en desarrollo. Se utiliza la
inoculación del vitelo, tanto como la inoculación intracerebral de ratones lactantes. El virus se
identifica mediante la prueba FC y la de neutralización. Se han desarrollado técnicas PCR
específicas de grupo y de virus para los virus del grupo Simbu. El virus de la NSD se aísla mejor
de plasma procedente de animales febriles, ganglios linfáticos mesentéricos o bazo. Para el
aislamiento primario se pueden emplear ovejas criadas en el laboratorio, ratones lactantes de 2–
4 días de edad inoculados intracerebralmente o cultivos celulares. Para estos ensayos los
animales más sensibles son las ovejas mientras que las células más sensibles son una línea
celular de riñón de cría de hámster y cultivos celulares de riñón de cordero o hámster. También se
recomienda la subinoculación de cultivos celulares o ratones con plasma procedente de ovejas
infectadas experimentalmente. La identificación del virus se puede realizar mediante
inmunofluorescencia directa de cultivos de tejidos inoculados o de frotis de cerebro de ratón. La
prueba de inmunodifusión en gel de agar también se puede emplear para demostrar la presencia
del antígeno de la NSD en tejidos. Se pueden utilizar cultivos de tejidos infectados o suspensiones
de cerebro de ratón como fuentes de antígeno para pruebas de fijación del complemento o de
enzimoinmunoensayo (ELISA).
Pruebas serológicas: Para detectar anticuerpos frente al CVV y al virus Akabane se emplean las
pruebas de inhibición de la hemaglutinación, la prueba FC y la de neutralización del suero.
También se ha descrito una técnica ELISA basada en una empleada para la fiebre del Valle del
Rift. Para la NSD la prueba más adecuada es la de inmunofluorescencia indirecta. Igualmente se
utilizan las pruebas FC y la de hemaglutinación indirecta para confirmar los brotes de la NSD en el
medio natural. En las pruebas de neutralización viral se obtienen resultados equívocos, un rasgo
1080
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.2. — Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
que comparte con otros miembros del grupo Nairovirus. Se están evaluando ELISAs para la NSD.
Se puede utilizar bazo infectado como fuente antigénica en las pruebas de inmunodifusión.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Actualmente no se dispone de
vacuna para el CVV. Las vacunas para uso doméstico contra el virus Akabane se están
produciendo tanto en Japón como en Australia. Para la NSD, se está experimentando una vacuna
consistente en el virus vivo atenuado y, por otra parte, una vacuna muerta de cultivo de tejidos ha
demostrado ser inmunogénica.
A. INTRODUCCIÓN
Œ
El virus del Valle de Cache
El virus del Valle de Cache (CVV) es un virus de rumiantes transmitido por artrópodos, endémico de
Norteamérica. Es miembro del serogrupo Bunyamwera del género Bunyavirus de la familia Bunyaviridae. Es el
Bunyavirus más ampliamente distribuido en Norteamérica. Los registros de anticuerpos han demostrado la
presencia de anticuerpos contra el CVV en rumiantes domésticos, ciervos y caballos. Aunque la mayoría de las
infecciones son subclínicas y es relativamente raro que se produzca la enfermedad, la infección del feto provoca
artrogriposis, hidranencefalia, nacidos muertos, momificación y abortos. La infección con el CVV o con
bunyavirus estrechamente relacionados debe sospecharse si aparece artrogriposis y/o hidranencefalia en
rebaños de ovejas después de una temporada húmeda con abundancia de vectores. Los brotes se caracterizan
por la aparición de abortos, corderos débiles, y el nacimiento de corderos con rigidez articular, hipoplasia del
músculo esquelético y deformaciones de la columna vertebral, tales como escoliosis y tortícolis.
Œ
El virus Akabane
El virus Akabane es un miembro del serogrupo Simbu del género Bunyavirus de la familia Bunyaviridae. Es un
virus de rumiantes transmitido por insectos, endémico en ciertos países, particularmente en Japón y Australia
donde se puede considerar como una enfermedad epizoótica regular. El virus Akabane está también
ampliamente distribuido en África, Oriente Medio y Asia, y se han encontrado anticuerpos en vacas, ovejas,
cabras, camellos, caballos y en varias especies de caza africanas. La infección en animales adultos es
subclínica pero puede conducir a pérdidas fetales, particularmente de vacas, aunque también son vulnerables
las ovejas y las cabras. La presencia del virus Akabane debería sospecharse cuando se producen brotes de
abortos, nacidos muertos, artrogriposis congénita e hidranencefalia en temporadas de lluvias por encima de la
media con abundancia de insectos vectores. Tales brotes se caracterizan por abortos, nacidos muertos y la
aparición de terneros débiles y torpes y con defectos esqueléticos en sus miembros y en la columna vertebral,
incluyendo tortícolis y escoliosis.
Œ
La enfermedad ovina de Nairobi
La enfermedad ovina de Nairobi (NSD) está causada por un Nairovirus de la familia Bunyaviridae; es una
enfermedad transmitida por garrapatas que no es contagiosa. Se debería sospechar la NSD cuando en la
población de ovejas y cabras se produce una tasa de mortalidad de entre el 40% y el 90%, especialmente
cuando esto sucede después de el movimiento desde áreas libres hacia áreas enzoóticas. La enfermedad se
caracteriza por pirexia (41.5°C), desmayos y diarrea. También es característico el aborto. Los animales que
mueren en los estadios tempranos de la enfermedad muestran congestión de la mayoría de órganos y tejidos,
con ganglios linfáticos edematosos y agrandados; el bazo puede también agrandarse. Se observan fácilmente
por todo el animal muerto hemorragias petequiales y equimóticas en las superficies serosas de los órganos y
especialmente en los ganglios linfáticos. Al final del curso de la enfermedad puede hacerse más evidente la
inflamación del tracto gastrointestinal. La infestación con garrapatas, sobre todo por Rhipicephalus
appendiculatus, sustancia la sospecha acerca del agente responsable. Hay un recuento bajo del número total de
leucocitos en las etapas febriles tempranas. Se cree que el virus Ganjam de la India es una cepa del virus de la
NSD y causa un síndrome similar. El virus de la NSD es un agente zoonótico aparentemente inusual en el medio
natural, causando una enfermedad del tipo de la gripe en humanos, pero se han descrito al menos siete
infecciones aerosólicas en laboratorios debidas al virus Ganjam.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
Œ
El virus del Valle de Cache
El CVV es un Bunyavirus teratogénico de Norteamérica que afecta principalmente a ovejas. Es un miembro del
serogrupo Bunyamwera del género Bunyavirus, de la familia Bunyaviridae y es también el más común de los
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1081
Capítulo 2.10.2. — Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
Bunyaviruses de Norteamérica (2). El CVV se aisló por primera vez de una charca de mosquitos en Utah,
Estados Unidos de América (USA) en 1956 (16), pero sólo se asoció con la enfermedad a partir de la aparición
de una pérdida neonatal y epizoótica y de corderos malformados en un rebaño de ovejas en Tejas en 1987 (6).
También se ha aislado el virus a partir de un caballo y de una vaca clínicamente sana.
Las determinaciones serológicas muestran una amplia prevalencia de anticuerpos en rumiantes domésticos y
salvajes y en caballos. La seroprevalencia hacia el CVV es elevada en ciervos y la viremia al 1–3 día es
suficiente para infectar vectores por lo que estos hospedadores actúan como amplificadores (1). Los vectores
incluyen moscas pequeñas del género Culicoides y mosquitos de los grupos Aedes, Anopheles, Coquillettidia y
Culiseta.
La infección por el CVV de animales adultos es, en la mayoría de los casos, subclínica y las ovejas infectadas
experimentalmente muestran sólo una respuesta febril transitoria, pero con una viremia detectable.
El CVV fue el primer Bunyavirus de Norteamérica asociado a artrogriposis fetal e hidranencefalia; sin embargo,
experimentalmente se ha demostrado que otros virus relacionados tienen el mismo potencial. La infección fetal
con el CVV depende de la edad en sus consecuencias. Las malformaciones tienen lugar entre los días 27 y
45 de la gestación, con infección durante el periodo del 28–36 días se producen defectos musculoesqueléticos y
del sistema nervioso central (CNS), y la infección entre los días 37–42 produce sólo deformaciones
musculoesqueléticas. La infección después de 50 días de gestación no provoca lesiones y después de 76 días
el feto es inmunocompetente y se producen anticuerpos. La mayoría de las muertes fetales por el CVV ocurren
entre los días 27 y 35 de la gestación. Sin embargo, el feto es susceptible a cualquier edad, lo que demuestra el
tropismo de muchos bunyavirus por los tejidos fetales (3).
La patología global del sistema musculoesquelético incluye artrogriposis de uno o más miembros, tortícolis,
escoliosis de la columna vertebral e hipoplasia muscular. Las lesiones del CNS comprenden hidranencefalia,
hidrocéfalo, porencefalia, microencefalia, hipoplasia cerebral y cerebelar y micromelia (3, 15). También se
encuentran embriones muertos y corderos nacidos muertos o momificados con defectos inapreciables. Se
aprecia anasarca, así como oligohidramnios. Se cree que esta reducción del líquido amniótico contribuye a la
restricción del movimiento fetal y a las deformaciones esqueléticas que se observan. Los defectos en los
miembros son debidos también a cambios degenerativos vistos histopatológicamente como áreas de necrosis y
pérdida del neurópilo paraventricular del cerebro junto con una reducción del número de neuronas motoras. Los
cambios en el músculo esquelético acarrean miocitos miotubulares escasamente desarrollados (15).
Œ
El virus Akabane
El virus Akabane es un Bunyavirus teratogénico ampliamente distribuido por todo el mundo pero no en los
países del Nuevo Mundo. Afecta principalmente al ganado vacuno. Es un miembro del serogrupo Simbu del
género Bunyavirus, familia Bunyaviridae (18). Además de los dos grupos de virus Simbu japoneses y los siete
australianos, se consideran también patógenos potenciales los virus Aino, Peaton, Douglas y Tinaroo. Si
embargo, el virus Akabane es el mejor estudiado y el más patogénico de los virus Simbu y la causa principal de
artrogriposis e hidranencefalia.
El virus Akabane fue aislado por primera vez en Japón en 1961, inicialmente a partir de una charca de
mosquitos y después de una charca de moscas Culicoides. A esto le siguieron, en 1972, aislamientos a partir de
Culicoides en Australia y de charcas de mosquitos en África. Se ha demostrado la presencia de anticuerpos
contra el virus Akabane en el suero de vacas, ovejas, cabras, caballos, búfalos y camellos. Muchas especies de
caza autóctonas del África subsahariana tienen anticuerpos neutralizantes del virus Akabane. El radio de acción
del virus Akabane incluye Oriente Medio, Asia, Chipre y África, pero es en Australia y Japón donde la
enfermedad del virus Akabane se presenta como una epizootia regular. Las condiciones favorables para tales
brotes son animales susceptibles en etapas tempranas de gestación y un incremento repentino en las
poblaciones de vectores, particularmente cuando el virus ha estado ausente del área durante varios años.
La infección por el virus Akabane en animales adultos es habitualmente subclínica, pero se han relacionado
recientemente casos de encefalitis con infecciones de vacas adultas por el virus Akabane. Después de 3–4-dias
de viremia, las vacas se seroconvierten.
En áreas endémicas, los anticuerpos de la hembra previenen la infección fetal, pero el virus Akabane es capaz
de provocar infecciones persistentes de la placenta en bóvidos y ovinos susceptibles. En el caso de la oveja
esto ocurre entre los días 30 y 70 de gestación, y en la vaca entre los días 30 y 150. El virus Akabane tiene
predilección por células del cerebro, de la médula espinal y de los músculos, donde la necrosis no inflamatoria
interfiere con la morfogénesis.
La infección por el virus Akabane se ha estudiado experimentalmente en ovejas y cabras y se aprecia
artrogriposis/hidroencefalia, cifosis, escoliosis, micro- y porencefalia, nacidos muertos y abortos (25). La
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.2. — Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
infección natural del feto ovino se ha descrito en Australia, donde lo más frecuentemente observado ha sido
mortalidad del cordero perinatal y microencefalia congénita.
Los estudios experimentales con el virus Akabane se han llevado a cabo con vacas preñadas, y de ellos se
extrae la conclusión de que el tipo de anormalidad depende de la edad de gestación del feto, observándose
hidroencefalia entre los días 76–104 de la gestación y artrogriposis entre los días 103–174 (19). La diferencia en
el tiempo de aparición de las anormalidades se ha visto claramente en fetos bovinos mientras que en ovejas,
con un periodo de gestación más corto, las lesiones esqueléticas y cerebrales aparecen simultáneamente en el
mismo feto. La secuencia de sucesos durante una epizootia de pérdida fetal inducida por el virus Akabane
comienza con el nacimiento de vacas descoordinadas, seguido de casos de artrogriposis y cambios musculares
displásticos y por último vacas con hidrocéfalo y otras lesiones severas del CNS. Estos sucesos pueden estar
precedidos de nacidos muertos y abortos (26). El virus Akabane es responsable de severas anormalidades
musculares y neuronales y las lesiones se caracterizan por encefalomielitis no purulenta, por encefalomielopatía
degenerativa cerebral focal, porencefalia, microencefalia, hidrocéfalo, pérdida de axones y neuronas motoras del
asta ventricular, agotamiento de la mielina del tracto motor de la médula espinal, necrosis y polimiositis en los
miotúbulos con degeneración parenquimal de los músculos esqueléticos. Las anormalidades de la médula
espinal incluyen escoliosis y cifosis y la artrogriposis puede afectar casi a cualquier articulación esquelética.
Œ
La enfermedad ovina de Nairobi
La NSD es una enfermedad de ovejas y cabras causada por un Nairovirus de la familia Bunyaviridae (8). Se
caracteriza por una tasa de mortalidad de entre el 40% al 90%, y debería sospecharse siempre que los animales
hayan sido trasladados recientemente desde un área libre de enfermedad a una donde sea endémica. Los
brotes también se producen por incursiones de garrapatas en áreas previamente libres, particularmente
después de lluvias fuertes (9). Los síntomas clínicos son similares en ovejas y cabras, aunque hay diferencias
en la susceptibilidad entre crías y cepas en su respuesta a la infección con el virus de la NSD, algunos son más
susceptibles que otros. Algunas crías autóctonas tienden a ser más susceptibles mientras que las foráneas
pueden recuperarse después de una enfermedad prolongada. Las vacas y animales de caza son refractarios a
la infección por el virus de la NSD (30). El periodo de incubación para la enfermedad varía de 2 a 5 días cuando
se desarrolla una reacción de temperatura de 41–42°C. Hay una hiperventilación acompañada de una depresión
severa, anorexia y aversión al movimiento. Los animales aparecen con la cabeza bajada y muestran conjuntivitis
y descarga nasal serosanguínea. Algunos nódulos linfáticos superficiales, tales como el preescapular y/o
precrural, se hacen palpables. La diarrea se desarrolla normalmente a las 36–56 horas del comienzo de la
reacción febril. Al principio es profusa, acuosa y fétida, más tarde hemorrágica y mucoide y acompañada por
dolores cólicos y tenesmo rectal. El aborto es una secuela común de la infección. El examen de los lugares
preferidos de ataque de las garrapatas, tales como las orejas, la cabeza y el cuerpo, es probable que revele la
presencia de la garrapata de la familia Ixodidae Rhipicephalus appendiculatus.
Las muertes pueden suceder en casos peragudos en las 12 horas del inicio de la fiebre y en cualquier momento
durante la reacción febril, mientras el animal está seriamente enfermo. Después de las muertes, esta etapa
continúa entonces con un descenso de la temperatura en los posteriores 3–7 días asociado con diarrea severa y
deshidratación.
La patología global de la NSD puede ser equívoca, ya que la mayoría de las muertes probablemente suceden
durante el periodo de viremia, etapa en la que los únicos síntomas presentes pueden ser linfadenitis con
hemorragias petequiales y equimóticas en las superficies serosas del tracto digestivo, bazo, corazón y otros
órganos. Ninguno de estos síntomas permite realizar un diagnóstico específico de la NSD e incluso de que se
sospeche, ya que son compartidos con muchas otras enfermedades febriles de ovejas en áreas endémicas de
la NSD. Entre las enfermedades con las cuales la NSD puede confundirse se incluye la fiebre del Valle del Rift,
la peste de los pequeños rumiantes, la peste bovina (rinderpest), la salmonelosis y la cowdriosis (heartwater). Al
final del curso de la enfermedad se hace más patente una gastroenteritis hemorrágica con hemorragias en la
mucosa del abomaso, especialmente a lo largo de los pliegues de la región de la válvula íleo-cecal, y más
comúnmente en el colon y recto. En éste último se aprecia frecuentemente un rayado de tipo cebra. La vejiga
biliar está normalmente agrandada y hemorrágica. Las lesiones inflamatorias pueden verse en el tracto genital
femenino, si ha habido aborto. Sin embargo, en muchos animales muertos por la NSD, puede no haber ninguna
lesión gastroentérica y raramente es posible hacer un diagnóstico tentativo basándose en los síntomas postmortem. Las lesiones histopatológicas comunes son degeneración miocardial, nefritis y necrosis de la vejiga
biliar.
Los síntomas post-mortem en las etapas tempranas son cambios inespecíficos asociados con la muerte en la
fase virémica de la NSD, con congestión y hemorragias petequiales y equimóticas en las superficies serosas, en
los ganglios linfáticos, el bazo y otros órganos tales como riñones, pulmones e hígado. Más tarde, se hacen
evidentes los síntomas de gastroenteritis hemorrágica, con ulceración del abomaso, duodeno, ciego y colon. El
virus se transmite principalmente mediante garrapatas de la especie Rhipicephalus appendiculatus, y cualquier
infestación con tales parásitos debería hacer sospechar la presencia de la enfermedad. El virus de la NSD
también se puede transmitir por otras especies del género Rhipicephalus y mediante la garrapata ixódida
africana tropical Ambylomma variegatum.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.2. — Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
El virus de la NSD es un agente zoonótico aparentemente raro en el medio natural, que causa una enfermedad
leve similar a la gripe en humanos. La infección en laboratorios se ha asociado con fiebre y dolor de
articulaciones (30).
1.
Identificación del agente
Œ
El virus del Valle de Cache
El virus CVV no puede aislarse del feto durante el nacimiento, pero sí se ha aislado de charcas de mosquitos y
de la sangre de animales adultos virémicos. Se ha realizado en cultivo de tejidos utilizando líneas celulares de
riñón de hámster y de mono incluyendo riñón de cría de hámster (BHK), riñón de mono verde africano (Vero) y
LLC-MK2. El virus puede aislarse a partir de un animal febril empleando una suspensión al 10% de capa
leucoplaquetaria en medio mínimo esencial (MEM) y el co-cultivo con células Vero en medio MEM suplementado
con suero bovino fetal al 2%.
El aislamiento viral se realiza también comúnmente empleando ratones recién nacidos o destetados mediante
inoculación intracerebral o intraperitoneal.
Muchos Bunyavirus se han secuenciado debido a que son patógenos de importancia médica asociados a casos
de encefalitis en humanos, tanto en Norteamérica como en Sudamérica. Se ha aplicado la tecnología de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección y vigilancia de charcas de mosquitos, en vez del
tradicional aislamiento a partir de crías de ratón, y se ha descrito que la sensibilidad es de un mosquito positivo
de grupos de 100, lo cual resulta indetectable por el método tradicional de titulación en placa utilizando cultivos
celulares.
Se han diseñado cebadores específicos de grupo y de virus y, empleando la PCR de transcripción inversa (RTPCR), pueden distinguirse los serogrupos Bunyamwera (BUN) y California (CAL). Utilizando una RT-PCR
combinada pueden distinguirse los virus del serogrupo CAL y la mayoría de los del serogrupo BUN de otros
miembros del género Bunyavirus (20).
Œ
El virus Akabane
El diagnóstico de la infección raramente se realiza mediante el aislamiento del virus, es preferible el análisis
histopatológico y serológico. Sin embargo, el virus se ha aislado a partir de animales centinela virémicos
empleando suspensiones de capa leucoplaquetaria, a partir de grupos de vectores y ocasionalmente a partir de
material fetal. Se ha descrito una RT-PCR para detectar el virus Akabane y diferenciarlo respecto del virus Aino.
Esto puede contribuir al diagnóstico, pero la diversidad del serogrupo Simbu requiere una validación para
confirmar la especificidad de la prueba porque hay evidencias de recombinaciones entre los Bunyavirus.
Se utilizan ratones lactantes de 1–2 días de edad y se inoculan intracerebralmente con 0,01 ml de una
suspensión al 10% clarificada del material a probar. Para el aislamiento del virus en cultivo de tejidos se
emplean frecuentemente las líneas celulares Vero, BHK-21 y HmLu-1. Si se utilizan las células de mosquito
C6/36, los cultivos se llevan hasta fase estacionaria de crecimiento durante 7 días y se hace un nuevo pase del
material utilizando hámster o la línea celular Vero hasta que los cambios citopáticos sean visibles en los cultivos.
Se ha descrito la detección del antígeno en material fijado con formalina mediante la tinción basada en
peroxidasa del material fetal bovino y ovino. Se han desarrollado también métodos de detección de ácidos
nucleicos para diferenciar los virus Aino y Akabane empleando una RT-PCR combinada.
Œ
El virus de la enfermedad ovina de Nairobi
El virus de la NSD se puede aislar a partir de material recogido de muestras de campo mediante el uso de
animales de laboratorio o cultivos celulares (13). Se deben adoptar medidas de seguridad contra las posibles
infecciones por aerosoles cuando se trabaja con este agente. Sangre no coagulada, ganglios linfáticos
mesentéricos y tejido procedente del bazo mantenido en hielo son las muestras óptimas que deben recogerse a
partir de animales febriles o muertos, respectivamente. Como inóculo se puede utilizar directamente plasma, y
los ganglios linfáticos y el bazo deben homogeneizarse hasta preparar una suspensión al 10% (w/v) en un
medio de transporte. Este medio puede ser medio Hanks con hidrolizado de lactoalbúmina al 0,5% o
seroalbúmina bovina al 0,75%, conteniendo penicilina (500 Unidades Internacionales/ml), estreptomicina sulfato
(500 µg/ml), y micostatina (50 units/ml) o fungizona (2.5 µg/ml).
Un procedimiento inicial recomendado consiste en inocular una oveja, susceptible a la NSD y mantenida
aislada, con 1–2 ml de suspensiones de tejido o de plasma. Cualquier síntoma de pirexia o enfermedad clínica
que desarrolle permite un diagnóstico tentativo y, al mismo tiempo, proporciona muestras excelentes para el
1084
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.2. — Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
aislamiento del virus. Esto es de especial valor en los casos en los cuales las muestras originales de campo se
transportan en climas cálidos, produciéndose inevitablemente alguna pérdida de virus. Las ovejas son al menos
100 veces más sensibles que los ratones a la infección por el virus de la NSD.
Las crías de ratón, de 2–4 días de edad, pueden inocularse intracerebralmente con 0,01 ml de una
dilución 1/10 de plasma o de suspensión de tejido. Para cada muestra deben utilizarse dos camadas,
cada unade 8–10 ratones lactantes, y rutinariamente realizar un pase ciego. Los ratones se debilitan y mueren
en 5–9 días después de la inoculación. Sus cerebros se recogen asépticamente, se juntan y se hacen diluciones
1/100 para los pases en nuevos ratones.
Pueden emplearse cultivos celulares conjuntamente con la inoculación de ratones para el aislamiento del virus
de la NSD porque muestran niveles de sensibilidad similares a los de la inoculación intracerebral de ratones
lactantes. La línea celular BHK-21-C13 es especialmente valiosa; y también se ha empleado la línea celular
Vero (30) y cultivos primarios y secundarios de riñón de hámster o de cordero. La mayoría de las cepas del virus
de la NSD produce un efecto citopático (ECP) en el primer pase empleando células BHK; hay otras que
producen un ECP más evidente sólo después de una subinoculación. La aparición de un ECP no es un hecho
habitual en células de riñón o testículo de cordero, aunque se observa con frecuencia en el segundo pase en
células de riñón de cordero. Se deben utilizar cultivos en tubo tanto con como sin cubreobjetos, o si se emplean
botellas de plástico para el aislamiento, deben prepararse cultivos en portas con micropocillos. Se deben
inocular aproximadamente 0,2 ml y se deja transcurrir un periodo de 1–2 horas para permitir la adsorción. El
ECP se aprecia en cultivos en botellas rotatorias como focos de células redondeadas granulares después de
24–48 horas cuando se trata de células BHK, y después de 24–48 horas más en otros tipos de células. El ECP
no es específico del virus de la NSD, el cual se identifica en cultivos sobre cubreobjetos por
inmunofluorescencia o mediante tinción con hematoxilina y eosina. Este último método revela inclusiones
intracitoplasmáticas eosinofílicas pleomórficas peculiares en forma de huso; otras inclusiones son bipolares, o
rodean el núcleo.
El virus puede identificarse específicamente por inmunofluorescencia, que puede ser positiva en tan sólo 24–
48 horas después de la inoculación, cuando todavía no es evidente ningún ECP. Los conjugados para la
immunofluorescencia pueden prepararse a partir de fluidos ascíticos de ratón hiperinmune, y a partir de
antisueros de conejo u oveja inmunes mediante métodos estándar. Puede producirse alguna fluorescencia
cruzada con otros Nairoviruses a bajas diluciones del conjugado, pero estos virus normalmente no se asocian
con enfermedades de ovejas o cabras.
La prueba de inmunodifusión en gel de agar (IGDA) puede ser una valiosa herramienta de diagnóstico primario
para la detección del antígeno de la NSD en tejidos. Esta prueba se puede realizar en laboratorios sin medios
adecuados para el cultivo de tejidos y en laboratorios de investigación de campo. Los tejidos de elección
para utilizar en estas pruebas son de bazo y de ganglios linfáticos mesentéricos. Se homogenizan alícuotas de
0.5–1 g con arena estéril en un mortero o en un homogenizador hasta conseguir suspensiones al 10–20% en
tampón fosfato salino (PBS) o solución salina. La suspensión se centrifuga 10–15 minutos a aproximadamente
1.000 g y el sobrenadante se emplea en la prueba. Esta prueba también puede utilizarse para la identificación
del antígeno viral de la NSD en cerebro de ratón recogido a partir de ratones infectados experimentalmente
(véase antes). El suero hiperinmune de conejo contra la NSD puede prepararse mediante la inoculación repetida
de cerebro de ratón infectado por la NSD. Una suspensión de cerebro de ratón al 2–5 % (w/v) se prepara como
se ha indicado anteriormente y se centrifuga a 3–5.000 g durante 15 minutos. Entonces se mezclan alícuotas
con igual volumen del adyuvante completo de Freund. Se pueden emplear distintos regimenes de inoculación
pero pueden utilizarse volúmenes de 1-ml por vía subcutánea y/o intramuscular a intervalos de 7-días durante
3–5 semanas, o en puntos de inoculación múltiple utilizando volúmenes de 0,1-ml durante un periodo similar. El
suero se debe recoger 5–7 días después de la última inyección y almacenarlo en alícuotas a –20°C.
En la prueba debe utilizarse agar Difco Noble u otro agar adecuado y emplear cloruro sódico al 0,85% a pH
7,2. Se preparan portas para conseguir capas de agar de aproximadamente 2 mm de profundidad. Se deben
situar seis pocillos hexagonalmente alrededor de uno central. El suero del conejo hiperinmune se sitúa en el
pocillo central y el antígeno control positivo en los pocillos 1 y 4. El tejido a probar se coloca en los pocillos 2 y
5. El tejido control negativo se sitúa en los pocillos 3 y 6. Los pocillos con el tejido a probar que den una línea de
precipitina de continuidad con la línea formada entre el antígeno positivo y el suero hiperinmune se considerarán
positivos.
Pueden utilizarse suspensiones de cerebro de ratón o sobrenadantes de cultivo de tejido infectado como
antígenos para la identificación del virus en las pruebas de fijación del complemento (FC). Ambos han
demostrado ser adecuados después de una purificación parcial con fluorocarbono; también se puede utilizar
cerebro de ratón en forma de suspensión en una solución tamponada de borato.
Con el propósito de identificar el virus mediante la técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) se puede preparar
el antígeno a partir de un cultivo en botella del tejido infectado. Las células se recogen con una pipeta Pasteur
en el momento en el que aproximadamente el 20% de la monocapa de células muestre ECPs. Se precipitan y
lavan tres veces en tampón borato salino, pH 9. Entonces las células se lisan y solubilizan con SDS
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.2. — Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
(dodecilsulfato sódico) y Triton X100 al 1%, se diluyen aproximadamente 1/5 en tampón borato salino y se
sonican; de esta forma se consigue un antígeno para la técnica ELISA. El antígeno control negativo se prepara
de la misma forma pero a partir de células no infectadas. Los antígenos se adsorben directamente a las placas
ELISA y la prueba se lleva a cabo con suero normal y suero inmune a la NSD enfrentándolos a ambos tipos de
antígeno.
Se ha descrito una RT-PCR. El empleo de la PCR ha permitido detectar el virus de RNA Dugbe en órganos y
hemolinfa de garrapatas de la especie Amblyoma vaiegatum. (El virus Dugbe es un miembro no patogénico del
serogrupo de la NSD y se ha aislado a partir de sangre de vacas en Africa.) Esta prueba es menos sensible que
el aislamiento a partir de ratones, pero los resultados pueden conseguirse en tan sólo 48 horas en vez de 8 días
que es lo que tarda un ensayo biológico (27).
2.
Pruebas serológicas
Pueden ser pruebas de inhibición de la hemaglutinación (HI), de FC y de neutralización viral (NV) y ELISA.
Œ
El virus del Valle de Cache
a)
Prueba de neutralización viral
Las pruebas NV para el CVV pueden realizarse mediante el método de neutralización por reducción de
placas, pero actualmente se emplea con más frecuencia el método de inhibición del ECP utilizando células
Vero en placas de microtitulación (4).
Œ
Procedimiento de la prueba
i)
El suero problema se inactiva a 56°C durante 30 minutos en un baño con agua.
ii)
Se realizan diluciones seriadas al doble del suero en MEM desde la dilución 1/2 a la 1/16 y se incuban
a 37°C durante 60 minutos con un volumen igual0 de 100 DICC50 (dosis infectiva 50% en cultivo
celular) por ml de virus. Los controles estándar se preparan de manera similar.
iii)
Se vierte el medio en una placa de microtitulación con 96 pocillos de fondo plano para cultivo de
tejidos conteniendo una monocapa de células Vero de 24-horas.
iv)
Se adicionan las mezclas suero/virus a la placa, 50 µl en cada pocillo, utilizando tres pocillos por
dilución.
v)
Para titular de nuevo el virus usado en la prueba se realizan tres diluciones a la décima utilizando
50 µl por pocillo y cuatro pocillos por dilución.
vi)
Se cubren las placas y se vuelven a incubar durante 60 minutos a 37°C.
vii)
Se adicionan 50 µl de medio de mantenimiento MEM a cada pocillo.
viii) Se incuban las placas a 37°C durante 6 días en un incubador de CO2 con atmósfera humidificada.
b)
ix)
Después del examen microscópico de las placas, se evalúa el ECP y se determina el 50% a punto
final.
x)
El control viral debe dar un valor de 100 DICC50 y no debe haber neutralización con el suero control
negativo a las diluciones menores ensayadas. El control positivo debe dar un título dentro del rango
esperado de la media predeterminada.
Técnica de enzimoinmunoensayo
Para las determinaciones serológicas del CVV se utiliza una técnica ELISA modificada y basada en una
descrita por Meegan et al. para la fiebre del Valle del Rift (23). Las modificaciones incluyen una dilución
1/400 de fluido ascítico de ratón para cubrir las placas, seguido de una dilución 1/25 de antígeno de
cerebro de ratón en sacarosa/acetona en un formato de ELISA tipo sandwich. El diluyente empleado es
PBS con Tween 20 al 0,5%, suero equino al 5% y 500 µg de sulfato dextrano por ml. Se utiliza un sistema
de detección conjugado a peroxidasa de rábano y el sustrato ABTS (ácido 2,2’-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina]-6-sulfónico) (23).
c)
Otras pruebas
No todos los miembros del grupo Bunyamwera producen hemaglutininas, pero se ha descrito una prueba
HI para el CVV utilizando de antígeno cerebro de ratón lactante en sacarosa/acetona y empleando
eritrocitos de ganso a pH 6,2. Se dice que la prueba carece de sensibilidad si se compara con una prueba
NV, proporcionando sólo el 50% de detección de anticuerpos. La prueba FC se utiliza poco debido a la
extensa reactividad cruzada dentro del grupo Bunyamwera.
1086
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.2. — Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
Œ
El virus Akabane
a)
Prueba de inmunodifusión en gel de agar
La prueba IGDA presenta una amplia reacción cruzada con el grupo Simbu, es menos sensible que la
prueba NV, pero se empleó en el pasado para chequear gran número de muestras de suero. Se concentra
el sobrenadante de cultivo de tejido infectado utilizando una bolsa de diálisis y PEG
20.000 (polietilenglicol). Se usa agarosa al 1% en tampón borato salino, pH 8,6, en un modelo estándar de
siete pocillos (hexagonal). Después de incubar en una cámara húmeda, la lectura de esta prueba se realiza
después de 48–72 horas, empleando controles adecuados.
b)
Prueba de inhibición de la hemaglutinación
La prueba HI es una modificación de la de Clarke & Casals 1958 (5) y se consigue una mejor
hemaglutinación con una mayor molaridad de NaCl. La prueba también depende del valor de pH. Los
sueros se pretratan con caolín o acetona y después se inactivan por calor a 56°C durante 30 minutos. La
prueba se realiza utilizando cuatro unidades de antígeno de cerebro de ratón extraído en sacarosa/acetona
y eritrocitos al 0,3% en tampón borato, pH 9 (17).
c)
Prueba de neutralización viral
Las pruebas NV se han descrito utilizando células HmLu-1 en cultivos en tubo o células Vero o BHK en
placas de microtitulación con 96 pocillos de fondo plano (7). Se han descrito dos técnicas, una con un
periodo de incubación de suero/virus de 1 hora y otra con una incubación a lo largo de la noche antes de
adicionar las células.
Œ
Procedimiento de la prueba
i)
Se inactiva el suero problema a 56°C durante 30 minutos en un baño con agua.
ii)
Se realizan diluciones seriadas al doble del suero en medio de Eagle desde la dilución 1/2 a la
1/16 en una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano empleando pocillos por duplicado y
25 µl por pocillo. Los controles estándar se preparan de manera similar.
iii)
En cada pocillo se adicionan 25 µl de virus en medio de Eagle diluido hasta conseguir 200 DICC50 por
cada 50 µl.
iv)
Se cubren y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.
v)
Se incluye un control para titular de nuevo el virus por triplicado, preparando tres diluciones a la
décima y empleando 25 µl por pocillo.
vi)
Se adicionan 100 µl por pocillo de células Vero en medio de Eagle con suero al 2%, a una densidad
de 5 ‰ 105 células/ml.
vii)
Las placas se incuban a 34–37°C durante 5 días en un incubador de CO2 con atmósfera
humidificada.
viii) Después del examen al microscopio de las placas, el título se calcula como el inverso de la mayor
dilución que inhibe completamente el ECP.
ix)
Los controles del virus y del suero deben dar los resultados esperados.
Cuando se realice la incubación durante toda la noche, se preparan por duplicado diluciones seriadas al
doble del suero inactivado que se mezclarán con 100 DICC50 del virus utilizando volúmenes de 100 µl en
cada caso. Después de una incubación de 1 hora a 37°C y durante la noche a 4°C, se adicionan 50 µl de
células BHK a la prueba. La placa se examina a los 3 y 5 días de la incubación a 37°C para detectar ECP.
d)
Técnica de enzimoinmunoensayo
Se han descrito ELISAs para el virus Akabane, que emplean IgG e IgM, y se ha encontrado que son más
específicos y sensibles que la prueba NV. El antígeno de revestimiento es 106 DICC50 por ml de virus
crecido en células HmLu-1 diluidas en 0,05 M tampón carbonato/bicarbonato, pH 9,6. El medio de lavado
es PBS conteniendo Tween 20 y fosfatasa alcalina. Se utilizan conjugados de IgG e IgM de conejo antibovina (28).
También se ha descrito una técnica ELISA similar que emplea IgG de conejo anti-bovina conjugada a
peroxidasa de rábano.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.2. — Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
e)
Prueba de fijación del complemento
La prueba FC, no descrita aquí, es una prueba específica de grupo y se emplea principalmente para
estudiar las relaciones entre los distintos virus Simbu.
Œ
La enfermedad ovina de Nairobi
a)
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
La prueba de inmunofluorescencia indirecta (FAT) es la prueba idónea para ser utilizada con los miembros
del grupo Nairovirus. Sin embargo, hay algunas reacciones cruzadas, particularmente con el virus Dugbe y
también con otros miembros del grupo, tales como el virus de la fiebre hemorrágica del Congo–Crimea
(10). Los títulos de anticuerpos de la NSD por este método oscilan entre 1/640 y 1/10.240, y estos títulos
no se obtienen con suero inmune frente a otros miembros del grupo (11).
Este método se ha utilizado en estudios epidemiológicos y para averiguar la respuesta a vacunas
experimentales. No parece que existan diferencias serológicas entre los 40–50 aislados que han sido
examinados. La cepa I-34 1 es el virus habitualmente utilizado para preparar el antígeno, y ha sido
adaptado a crecer en células BHK-21-C13, después de una serie de pases.
Para la prueba el antígeno viral sobre el sustrato de elección puede crecerse en cubreobjetos, en portas
multipocillos, en portas cubiertos de Teflon o en placas de microtitulación. A continuación se describe un
método que emplea portas cubiertos de Teflon.
•
Preparación de los portas con antígeno
i)
Se lavan y esterilizan portas cubiertos de Teflon. Esto se realiza brevemente en caliente con un
detergente que se usa para material de vidrio en los laboratorios de cultivo de tejidos; posteriormente
durante 30 minutos se enjuagan tres veces bajo agua corriente, seguido en cada ocasión por
enjuagues similares en agua destilada/desionizada. A continuación se sumergen en alcohol al 70%
durante 10 minutos, se sacan con unas pinzas estériles y se envuelven en papel a prueba de grasa.
Entonces los portas podrán esterilizarse y para ello se recomienda utilizar un microondas aplicando
dos ciclos de 5 minutos cada uno.
ii)
Se colocan estos portas en placas estériles empleando pinzas estériles; es preferible un tipo
cuadrado de poliestireno que la variedad redonda.
iii)
Se mezcla una suspensión de células BHK conteniendo aproximadamente 25.000 células/ml en
medio de crecimiento para BHK (normalmente es medio de Eagle para las células BHK), y se añaden
por cada mililitro 1000 DICC50 de la cepa I-34 de la NSD. Se mezcla con la pipeta. Se preparan
algunos portas no infectados como control negativo.
iv)
Se adicionan las células infectadas en volúmenes de 50 µl (para el tamaño de pocillo 12) o el
volumen apropiado al tamaño de los pocillos de Teflon. Se vuelven a colocar las tapas en las placas y
se colocan en un incubador de CO2 con atmósfera humidificada o en una cámara de anaerobios.
v)
Se deja toda la noche para permitir que se desarrolle la monocapa. Posteriormente se sacan las
placas del incubador y se introducen en una cabina de flujo laminar, y se adiciona medio de
mantenimiento con una pipeta cubriendo los portas hasta una profundidad de 2–3 mm. Se vuelven a
introducir en el incubador.
vi)
Se recogen los portas con antígeno justo cuando comienzan a detectarse focos de ECP. Esto se
producirá en 36–56 horas (una determinación más precisa del tiempo óptimo de recogida puede
hacerse fijando y tiñendo un porta después de 24, 36 y 48 horas).
vii)
Los portas se lavan tres veces con PBS y se secan. A continuación se fijan con calor seco (mínimo
80°C) o con acetona enfriada en hielo durante 10 minutos. Los portas se envuelven y se pueden
conservar a 4°C durante 2–3 meses, o a –20°C durante 1–2 años. Los portas conservados a –20°C
deben ser mantenidos a 4°C durante toda la noche previamente a su uso.
Se pueden seguir procedimientos similares para preparar el antígeno en cubreobjetos o en portas de
cultivo multipocillo. Sin embargo, cuando se emplean placas multipocillo para cultivo de tejidos Nunc, la
fijación debe realizarse con acetona al 75%.
1
La cepa I-34 era un aislado virulento de la NSD procedente de Kenia que se utilizó ampliamente como cepa de
referencia en el Laboratorio Kabete – Instituto de Investigaciones Agrícolas de Kenia, P.O. Box 58137, Kabete, Nairobi,
Kenia.
1088
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.2. — Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
•
Procedimiento de la prueba
i)
Los portas se hidratan adicionando una gota de PBS a los pocillos con una pipeta Pasteur. El número
de portas debe concordar con el número de sueros a ensayar. Se incluyen en las series sueros
control positivo y negativo con cultivos de células infectadas y no infectadas.
ii)
Se elimina el PBS y se adicionan las diluciones 1/80–1/2.560 del suero de una manera
predeterminada en los pocillos 1 a 6. Es preferible duplicar cada dilución en el mismo porta.
iii)
Se disponen los portas en placas y se mantienen a 37°C en un incubador con ambiente húmedo
durante 40 minutos.
iv)
Se lavan los portas colocados en gradillas realizando tres cambios de PBS, 5 minutos por lavado.
v)
Se adiciona el conjugado antiespecie (normalmente anti-oveja o anti-cabra) conjugado a fluoresceína
a una dilución de trabajo predeterminada; se puede añadir una gota a cada pocillo con una pipeta
Pasteur u otro tipo de pipeta.
vi)
Se incuban como antes durante 30 minutos.
vii)
Los portas se lavan tres veces con PBS y se secan.
viii) Los portas se examinan al microscopio de fluorescencia. El antígeno viral de la NSD se encuentra en
el citoplasma celular, y se verán focos de agregados de células BHK fluorescentes. El antígeno se
apreciará principalmente en finas partículas fluorescentes, pero pueden producirse grandes acúmulos
de antígeno de forma irregular, a menudo rodeando al núcleo o pueden observarse masas en forma
de huso ocupando el citoplasma hasta el polo de las células. Estas partículas no se verán con sueros
negativos o en los cultivos control no inoculados.
ix)
b)
Los sueros que muestren esta fluorescencia a las diluciones 1/640 o 1/1.280 serán indicativos de
infección reciente por el virus de la NSD (11).
Otras pruebas
Las pruebas FC se complican por la marcada actividad anticomplementaria de muchos sueros ovinos.
Las pruebas de inmunodifusión se han utilizado con éxito empleando antígenos crudos preparados a partir
de tejido de oveja infectada, sobrenadantes de cultivo de tejidos o material de cerebro de ratón. Los sueros
hiperinmunes se pueden preparar en ovejas, ratones o conejos para ser utilizados en la prueba,
empleando bazo infectado procedente de ovejas muertas por la NSD como fuente antigénica para la
inmunización. Deben establecerse sistemas de prueba control negativo empleando bazos de oveja (u otras
fuentes antigénicas) no infectados negativo y positivo, con sueros negativos conocidos para la NSD. Estos
reactivos pueden prepararse en cualquier laboratorio y no requieren el soporte de un laboratorio virológico.
Esta prueba es útil aunque relativamente poco sensible.
Se ha descrito una técnica ELISA que utiliza un antígeno de cultivo de tejidos parcialmente purificado para
analizar sueros y que es adecuado para utilizar en determinaciones serológicas. El FAT indirecto, sin
embargo, se emplea para chequear resultados dudosos (24).
Se han desarrollado anticuerpos monoclonales para los antígenos de la cepa I-34 del virus de la NSD y se
han evaluado para su aplicación como reactivos de diagnóstico.
Se han sintetizado sondas de RNA a partir de los segmentos S (pequeños, small) y M (medios, medium)
del genoma del virus Dugbe y se han utilizado para demostrar que el serogrupo NSD del género Nairovirus
está más estrechamente relacionado al serogrupo de la fiebre hemorrágica del Congo-Crimea que
cualquier otro de los restantes serogrupos (22, 29). Estas sondas también son potenciales herramientas de
aplicación diagnóstica.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Œ
El virus del Valle de Cache
Debido a la naturaleza espontánea de los brotes de la enfermedad, no se ha desarrollado ninguna vacuna.
Œ
El virus Akabane
La principal epizootia de la enfermedad del virus Akabane sólo se ha descrito en Japón y Australia, aunque a
intervalos irregulares, no obstante la vacunación se observa que tiene utilidad para prevenir pérdidas fetales.
Las vacunas para uso doméstico se han producido en Japón y Australia.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.2. — Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
En Japón se utiliza una vacuna inactivada para inmunizar vacas y cabras. Es una preparación intramuscular
inactivada con formalina y un gel adyuvante de fosfato de aluminio. Se dan dos dosis de 3 ml a intervalos de
4 semanas y se recomiendan dosis de refuerzo anuales. Es una vacuna segura para ser utilizada en hembras
preñadas. En los ensayos de campo el 88% de los animales desarrollan un alto número de anticuerpos NV
después de la primera inoculación y hay una respuesta del 100% después de la segunda dosis (21). De manera
similar, en Australia se ha producido una vacuna inactivada para uso intramuscular suministrándose dos dosis a
intervalos de 4 semanas antes del apareamiento.
En Japón el virus Akabane también se ha atenuado como candidato para una vacuna potencial. Se inocularon
vacas gestantes y terneras por vía subcutánea, intramuscular e intracerebral; no se apreció leucopenia, viremia
o pirexia y se produjo una buena respuesta de anticuerpos NV. Una vacuna viva del virus Akabane, segura en
vacas, se ha probado en ovejas gestantes. Durante los ensayos, algunas ovejas se hicieron virémicas y se
encontró el virus en los órganos de diversos fetos. Aunque no se produjeron deformaciones fetales, la vacuna se
considera inadecuada para ser usada en ovejas.
Œ
La enfermedad ovina de Nairobi
Las investigaciones epidemiológicas han demostrado que en estado de estabilidad enzoótica, no se encuentran
problemas con la NSD. La enfermedad surge de los movimientos de los animales de áreas libres a áreas
endémicas y puede evitarse cuando tales áreas están bien definidas. Los cambios medioambientales que
permitan la propagación de la garrapata que actúa de vector resultarán en extensiones de estas áreas.
Se han preparado vacunas experimentales para tales situaciones. Una vacuna consiste en el virus atenuado por
35 pases en ratones adultos, pero estas vacunas pueden producir severas reacciones en algunas crías de
oveja, y no se consideran seguras para uso general. En Entebbe se preparó una vacuna similar mediante pases
posteriores en cerebro de ratón, pero después no ha sido desarrollada para su uso en el medio natural de
Uganda u otro sitio.
Una cepa del virus de la NSD adaptada al cultivo de tejidos se ha crecido hasta alcanzar un título elevado en
cultivo en botellas rotatorias. Cuando se precipita con metanol, se inactiva y administra con un adyuvante, se
observa que proporciona una buena protección después de dos inoculaciones a intervalos de 14 días. Ninguna
de estas vacunas se produce rutinariamente debido a la escasa demanda para uso de campo (12, 14).
REFERENCIAS
1.
BLACKMORE C.G. & GRIMSTAD P.R. (1998). Cache Valley and Potosi viruses (Bunyaviridae) in white-tailed
deer (Odocoileus Virginianus) experimental infections and antibody prevalence in natural populations. Am.
J. Trop. Med. Hyg., 59, 704–709.
2.
CALISHER C.H., FRANCY D.B., SMITH G.C., MUTH D.J., LAZUICK T.S., KARABASTOS N., JAKOB W.L. & MCLEAN R.J.
(1986). Distribution of Bunyamwera serogroup viruses in North America 1956–1984. Am. J. Trop. Med.
Hyg., 35, 429–443.
3.
CHUNG S.I., LIVINGSTON C.W. JR, EDWARDS J.F., CRANDELL R.W., SHOPE R.E., SHELTON M.J. & COLLISSON E.W.
(1990). Evidence that Cache Valley virus induces congenital malformations in sheep. Vet. Microbiol., 21,
297–307.
4.
CHUNG S.I., LIVINGSTON C.W. JR, EDWARDS J.F., GAUGER B.B. & COLLISSON E.W. (1990). Congenital
malformations in sheep resulting from in utero inoculation of Cache Valley virus. Am. J. Vet. Res., 51,
1645–1648.
5.
CLARKE D.H. & CASALS J. (1958). Techniques for haemagglutination and haemagglutination inhibition with
arthropod-borne viruses. Am. J. Trop. Med. Hyg., 7, 561–573.
6.
CRANDELL R.A., LIVINGSTON C.W. JR & SHELTON M.J. (1989). Laboratory investigation of a naturally occurring
outbreak of arthrogryposis-hydrancephaly in Texas sheep. J. Vet. Diagn. Invest., 1, 62–65.
7.
DA COSTA MENDES V.M. (1984) The isolation and importance of Simbu group viruses in South Africa. Thesis
for M. Med. Vet (Vir.) University of Pretoria, South Africa.
8.
DAVIES F.G. (1988). Nairobi sheep disease. En: The Ecology of Arboviruses, Vol. 3, Monath T.P., ed. CRC
Press, Boca Raton, Florida, USA, 191–203.
9.
DAVIES F.G. (1997). Nairobi sheep disease. Parasitologia, 39, 95–98.
10. DAVIES F.G., CASALS J., JESSETT D.M. & OCHIENG P. (1978). The serological relationships of Nairobi sheep
disease virus. J. Comp. Pathol., 88, 519–523.
1090
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.2. — Enfermedades bunyavirales de animales (excluyendo la fiebre del Valle del Rift)
11. DAVIES F.G., JESSETT D.M. & OTIENO S. (1976). The antibody response of sheep following infection with
Nairobi sheep disease virus. J. Comp. Pathol., 86, 497–502.
12. DAVIES F.G., MUNGAI J. & SHAW T. (1974). A Nairobi sheep disease vaccine. Vet. Rec., 94, 128.
13. DAVIES F.G., MUNGAI J. & TAYLOR M. (1977). The laboratory diagnosis of Nairobi sheep disease. Trop. Anim.
Health Prod., 9, 75–80.
14. DAVIES F.G., OTIENO S. & JESSETT D.M. (1977). The antibody response in sheep vaccinated with
experimental Nairobi sheep disease vaccines. Trop. Anim. Health Prod., 9, 181–183.
15. EDWARDS J.F., KARABASTOS N., COLLISSON E.W. & DE LZ CONCHA BER MEILLO A. (1997). Ovine fetal
malformations induced by in utero inoculation with Main Drain, San Angelo and La Crosse viruses. Am. J.
Trop. Med. Hyg., 56, 171–176.
16. HOLDEN P. & HESS A.D. (1959). Cache Valley Virus, a previously undescribed mosquito-borne agent.
Science, 130, 1187–1188.
17. GOTO Y., INABA Y., MIURA Y., KUROGI H., TAKAHSHI E., SATO K., OMORI T., HANAKI T., SAZAWA H. & MATUMOTO M.
(1978). Haemagglutination-inhibition test applied to the study of Akabane virus infection in domestic
animals. Vet. Microbiol., 3, 89–99.
18. KARABASTOS N. (ED.) (1985). International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of
Vertebrates, Third Edition. American Society for Tropical Medicine and Hygiene, San Antonio, Texas, USA.
19. KIRKLAND P.D., BARRY R.D., HARPER P.A.W. & ZELSKI R.Z. (1988). The development of Akabane virus
induced congenital abnormalities in cattle. Vet. Rec., 122, 582–586.
20. KUNO G., MITCHELL C.J., CHANG G.J. & SMITH E.C. (1996). Detecting Bunyaviruses of the Bunyamwera and
California serogroups by a PCR technique. J. Clin. Microbiol., 34, 1184–1188.
21. KUROGI H., INABA Y., TAKAHSHI E., SATO K., GOTO Y., SATODA K. & OMORI T. (1978). Development of inactivated
vaccine for Akabane disease. Natl Inst. Anim. Health Q., 18, 97–108.
22. MARRIOTT A.C., W ARD V.K., HIGGS S. & NUTTALL P.A. (1990). RNA probes detect nucleotide sequence
homology between members of two different nairovirus serogroups. Virus Res., 16, 77–81.
23. MEEGAN J.M., YEDLOUTSCHING R.J., PELEQ B.A., SHY J., PETERS C.J., W ALKER J.C. & SHOPE R.E. (1987).
Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to RVF virus in ovine and bovine sera. Am.
J. Vet. Res., 48, 1138–1141.
24. MUNZ E., REIMANN M., FRITZ T. & MEIER K. (1984). An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the
detection of antibodies to Nairobi sheep disease virus in comparison with an indirect immunofluorescent
and haemagglutination test II. Results observed with sera of experimentally infected rabbits and sheep and
with African sheep sera. Zentrabl. Veterinarmed. [B], 31, 537–549.
25. PARSONSON I.M., DELLA-PORTA A.J. & SNOWDON W.A. W.A. (1975). Congenital abnormalities in newborn
lambs after infection of pregnant sheep with Akabane virus. Infect. Immun., 15, 254–262.
26. SHEPHERD N.C., GEE C.D., JESSEP T., TIMMINS G., CARROLL S.N. & BONNER R.B. (1978). Congenital bovine
epizootic arthropgryposis and hydranencephaly. Aust. Vet. J., 54, 171–177.
27. SPARAGANO O.A., ALLSOPP M.T., MANK R.A., RIJPKEMA S.G., FIGUEROA J.V. & JONGEJAN F. (1999). Molecular
detection of pathogen DNA in ticks (Acari: Ixodidae): a review. Exp. Appl. Acarol., 23, 929–960.
28. UNGAR-W ARON H., GLUCKMAN A. & TRAININ Z. (1989). ELISA test for the serodiagnosis of Akabane virus
infection cattle. Trop. Anim. Health Prod., 21, 205–210.
29. W ARD V.K., MARRIOTT A.C., POLYZONI T., EL GHORR A.A., ANTONIADIS A. & NUTTALL P.A. (1992). Expression of
the nucleocapsid protein of Dugbe virus and antigenic cross-reactions with other nairoviruses. Virus Res.,
24, 223–229.
30. ZELLER H. & BOULOY M. (2000). Infections by viruses of the families Bunyaviridae and Filoviridae. Rev. sci.
tech. Off. int. Epiz., 19, 79–91.
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1091
CAPÍTULO 2.10.3.
SALMONELOSIS
RESUMEN
La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y los animales causada por
microorganismos de dos especies de Salmonella (Salmonella enterica y S. bongori). Aunque
fundamentalmente son bacterias intestinales, las salmonelas están muy distribuidas en el ambiente
y se encuentran con frecuencia en vertidos de granjas, en las aguas residuales humanas y en
cualquier material con contaminación fecal. En el hombre, los organismos del género Salmonella
son agentes etiológicos de infecciones intestinales y sistémicas, por lo general, como
contaminantes secundarios de los alimentos, de origen ambiental o como consecuencia de
septicemias en animales de consumo. La salmonelosis humana es la enfermedad zoonósica más
frecuente e importante causada por estos organismos. Tales agentes se encuentran también en
los alimentos y originando enfermedades infecciosas en los animales, particularmente en aves y en
cerdos. En todos los países existe salmonelosis, pero parece ser más prevalente en áreas de
producción animal intensiva, especialmente de cerdos, de terneros y de algunos tipos de aves
criadas en confinamiento. Con frecuencia, los reptiles son portadores asintomáticos de Salmonella.
La enfermedad puede afectar a todas las especies de animales domésticos; los más susceptibles
son los animales jóvenes, en estado de gestación, o lactantes. La manifestación más común de la
enfermedad es la entérica, pero se puede observar un espectro muy amplio de síntomas clínicos
que incluye septicemia aguda, aborto, artritis y enfermedad respiratoria. Muchos animales, en
especial los cerdos y las aves, pueden estar infectados sin manifestar la enfermedad clínica. Tales
animales pueden ser importantes en la difusión de la enfermedad entre explotaciones y como
fuentes de contaminación alimentaria y de infección humana.
La tifosis aviar y la pulorosis, que son otras enfermedades aviares causadas por Salmonella, se
presentan en el Capítulo 2.7.5. de este Manual.
Identificación del agente: El diagnóstico se basa en el aislamiento del organismo a partir de
tejidos recogidos asépticamente en necropsias o de las heces, de frotis rectales o muestras
ambientales, de productos alimenticios o de pienso. Cuando aparece infección en los órganos
reproductores, en el embrión o en caso de aborto, es necesario cultivar el contenido del estómago
fetal, de los frotis placentarios y vaginales y, en el caso de las aves, de los huevos embrionados.
Las salmonelas pueden aislarse utilizando varias técnicas, una de las cuales es un preenriquecimiento para recuperar salmonelas con daño subletal, medios de enriquecimiento que
contienen sustancias inhibidoras para evitar microorganismos competidores, y medios sólidos
selectivos en placa para diferenciar las salmonelas de otras enterobacterias.
Para obtener una confirmación definitiva de la cepa aislada, se pueden aplicar varias pruebas
bioquímicas y serológicas a los cultivos puros. Las salmonelas poseen antígenos llamados
somáticos (O), flagelares (H) y de virulencia (Vi), que pueden identificarse por sueros específicos
de tipo, y después puede determinarse el serotipo por referencia a la fórmula antigénica del
esquema de Kauffman–White. Muchos laboratorios necesitan enviar los aislados a un laboratorio
de referencia para confirmar por completo la identidad serológica y determinar, cuando sea
posible, el fagotipo y el genotipo de la cepa.
Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas deben realizarse en una muestra de la población
que sea estadísticamente significativa, pero estas pruebas son de valor limitado si se utiliza
vacunación. En el diagnóstico rápido de S. Pullorum/Gallinarum en aves en granjas avícolas se
utiliza la prueba de sangre completa, que es una prueba diagnóstica relativamente fiable en
determinadas circunstancias. En el laboratorio, el método de elección para la exportación y el
1092
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
diagnóstico de muestras de todos los animales de granja es la prueba de aglutinación en tubo.
Existen enzimoinmunoensayos para algunos serotipos, y pueden utilizarse para el diagnóstico
serológico y el control, especialmente, en el caso de aves y cerdos. La vacunación contribuye al
limitado valor diagnóstico de las pruebas serológicas.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Contra la salmonelosis se utilizan
muchas vacunas inactivadas y hay comercializadas algunas vacunas vivas. Debido a la baja
eficacia de las vacunas inactivadas, se utilizan adyuvantes con aceite o hidróxido de aluminio para
mejorar sus propiedades inmunógenas. A menudo se carece de datos sobre la eficacia en
condiciones de campo, aunque las pruebas de laboratorio pueden servir como indicadoras. Las
pruebas sobre inocuidad se realizan en animales de laboratorio y, en el caso de las vacunas
inactivadas, se llevan a cabo pruebas de esterilidad con medios bacteriológicos de
enriquecimiento. Para las vacunas producidas por manipulación genética se necesita más
seguridad, por ejemplo en lo que respecta a impacto ambiental y a estabilidad. Para reducir las
infecciones por Salmonella en las aves y otras especies animales se emplea la exclusión
competitiva.
A. INTRODUCCIÓN
La clasificación de las salmonelas ha sido objeto de controversia durante muchos años. De acuerdo con la actual
nomenclatura, que refleja avances recientes en la taxonomía (33), el género Salmonella incluye sólo dos
especies: S. enterica y S. bongori (21, 32). Salmonella enterica se divide en seis subespecies, que se distinguen
por algunas características bioquímicas, y algunas de ellas se corresponden con subgéneros anteriores. Estas
subespecies son:
•
•
•
•
•
•
Nomenclatura Anterior
Subespecie I
Subespecie II
Subespecie IIIa
Subespecie IIIb
Subespecie IV
Subespecie VI
=
=
=
=
=
=
Nomenclatura Actual
subespecie enterica
subespecie salamae
subespecie arizonae
subespecie diarizonae
subespecie houtenae
subespecie indica
El símbolo V se reserva para los serotipos de S. bongori a fin de evitar confusiones con el nombre de serotipo de
S. enterica subesp. enterica. Las cepas de Salmonella se clasifican en serotipos según la gran diversidad de los
antígenos (O) del lipopolisacárido (LPS) y de los antígenos proteicos de los flagelos (H) según la clasificación de
Kauffmann–White; en la actualidad se reconocen aproximadamente 2.500 serotipos (32, 33). Este número está
en constante aumento. Los serotipos más comunes que causan infección en humanos y en animales de
consumo pertenecen a la subespecie enterica. Los serotipos de las otras subespecies son frecuentes en
animales poiquilotermos (de sangre fría) y en el ambiente, aunque algunos serotipos de S. arizonae y
S. diarizonae se han asociado con enfermedades en pavos y en ovejas.
Sólo se conservan los nombres para los serotipos de la subespecie enterica. Estos nombres no deben escribirse
en cursiva. La primera letra es mayúscula. En la práctica clínica no es necesario indicar el nombre de la
subespecie, ya que solamente llevan nombre los serotipos de la subespecie enterica, por ejemplo Typhimurium,
London, o Montevideo son serotipos de la subespecie enterica. En la práctica rutinaria se puede usar el nombre
de Salmonella Typhimurium.
En este capítulo se siguen las nuevas convenciones establecidas de forma abreviada; es decir, se usa
S. Typhimurium en lugar de la nomenclatura más completa S. enterica, subesp. enterica serotipo Typhimurium.
La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y de los animales causada por microorganismos de
las dos especies de Salmonella (S. enterica y S. bongori). Aunque fundamentalmente son bacterias intestinales,
las salmonelas están muy distribuidas en el ambiente y se encuentran con frecuencia en vertidos de granjas, en
las aguas residuales humanas y en cualquier material con contaminación fecal. En todos los países existe
salmonelosis, pero parece ser más prevalente en áreas de producción animal intensiva, especialmente de aves y
cerdos.
La enfermedad puede afectar a todas las especies de animales domésticos, siendo más susceptibles los más
jóvenes y los animales gestantes. La manifestación clínica más común es la enfermedad entérica, que a menudo
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1093
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
se presenta como una diarrea sanguinolenta y muy acuosa acompañada de fiebre, pero se puede observar un
amplio espectro de síntomas clínicos, como septicemia aguda, aborto, artritis, necrosis de las extremidades y
enfermedad respiratoria. Los síntomas y las lesiones no son patognomónicos. Muchos animales, especialmente
las aves y los cerdos, pueden estar infectados pero no mostrar enfermedad clínica (46). Tales animales pueden
ser importantes en la diseminación de la enfermedad entre explotaciones y ser causa de intoxicación alimentaria
humana. En el último caso, esto puede suceder cuando estos animales entran en la cadena alimentaria y
originan productos alimenticios contaminados (45, 46).
El curso de la infección, los síntomas clínicos, los hallazgos post–mortem y los modelos epidemiológicos varían
según el serotipo y la especie animal implicada. Algunos serotipos sólo afectan a determinados hospedadores,
por ejemplo S. Gallinarum a aves y S. Cholerasuis a cerdos, aunque la mayor parte pueden causar enfermedad
en un amplio rango de especies animales (37). Se ha visto que muchos serotipos (incluyendo los que están
adaptados a hospedadores) originan intoxicaciones alimentarias en humanos, y los trabajadores que asisten a
los animales, los veterinarios y los empleados de mataderos, pueden infectarse directamente en el trabajo, así
como el personal de laboratorio.
Normalmente, la enfermedad se describe como salmonelosis, aunque se puede usar el término de fiebre
paratifoidea, por ejemplo, la paratifoidea porcina. En la industria avícola, la pulorosis o diarrea blanca bacilar y la
tifosis aviar designan a menudo las infecciones causadas por S. Pullorum y S. Gallinarum, respectivamente (37).
La tifosis aviar y la pulorosis se describen con detalle en el Capítulo 2.7.5 del presente Manual.
Para las investigaciones epidemiológicas detalladas es necesario identificar las cepas, y tales investigaciones
han descansado tradicionalmente en métodos bioquímicos y serológicos, en el fagotipado de algunos serotipos y
en los antibiogramas. En los últimos años se ha utilizado con éxito el análisis genotípico de los microorganismos
mediante la determinación molecular de las huellas del ADN. Los análisis del perfil de plásmidos suponen un
método rápido y relativamente fácil para caracterizar cepas, y se han empleado para estudiar la dispersión de
Salmonella tanto en medicina humana como veterinaria. Esta técnica presenta limitaciones, pues no todas las
cepas de Salmonella presentan plásmidos, y los plásmidos se pueden adquirir con facilidad o ser de un tamaño
similar pero genéticamente diferentes. Para suplementar los estudios del perfil de los plásmidos se han utilizado
otras técnicas genéticas alternativas, como la electroforesis en gel de campo pulsante o el ribotipado (25, 39). El
genotipado es un campo de trabajo en expansión y, en los últimos años se han desarrollado muchos métodos
nuevos. Debe tenerse en cuenta que un único método puede no servir para todos los aislamientos y que puede
ser necesario evaluar diferentes técnicas hasta encontrar un método o combinación de métodos que resulte
satisfactorio y capaz de diferenciar clones de un serotipo o fagotipo particular.
El aislamiento de salmonelas y su posterior identificación depende no sólo de la calidad de la muestra sino
también del medio de cultivo y de las características de crecimiento del serotipo, particularmente, en aquellos
casos en que están adaptados a una especie hospedadora. Se ha publicado recientemente una revisión
completa de la infección de animales domésticos por Salmonella (46).
En muchos países se han llevado a cabo programas nacionales para controlar las infecciones animales por
Salmonella con vistas a proteger al consumidor. En la Unión Europea, la Directiva de Zoonosis 92/117/EEC
establece el control respecto a S. Enteritidis y S. Typhimurium de las explotaciones de más de 250 aves y de
las incubadoras (9). El mismo día de la llegada se realiza el cultivo de los revestimientos de las jaulas de reparto
de las aves, de las aves muertas y de algunas al azar. A las 4 semanas de edad y 2 semanas antes de la puesta
de huevos, se cultivan las heces de hasta 60 muestras, dependiendo del tamaño de la explotación. Después, los
adultos se muestrean cada 2 semanas. También cada 2 semanas, en las incubadoras donde eclosionan los
huevos, se cultiva el meconio y los animales muertos dentro del cascarón. Se permite el control por métodos
serológicos si las pruebas serológicas pueden ofrecer una garantía equivalente al sistema de inspección de las
incubadoras y si no se utiliza vacunación. En Dinamarca se utiliza control serológico de Salmonella en
explotaciones porcinas y en explotaciones comerciales de aves ponedoras. A la hora de escribir este capítulo la
Directiva de Zoonosis está siendo revisada, de modo que los requisitos del muestreo pueden cambiar.
Las infecciones de animales de abasto por Salmonella tienen un papel importante en la salud pública y
particularmente en la seguridad alimentaria, ya que los alimentos de origen animal se consideran como la fuente
principal de infecciones por Salmonella en el hombre (45). Se han realizado programas especiales para el control
de aves, cerdos y ganado bovino, que incluyen el control de animales sanos que pueden ser portadores
subclínicos de estos microorganismos. También se controla la contaminación cruzada durante el procesamiento
de los alimentos, ya que puede ocurrir contaminación por manipuladores de alimentos sanos (46).
El pienso contaminado con Salmonella es la fuente más frecuente de infección en animales. Como la
contaminación del pienso se debe a menudo a serotipos de importancia para la salud pública, los piensos,
sobre todo la harina de carne y huesos, deben analizarse para investigar la presencia de salmonelas (46).
Las muestras de pienso y de comida analizadas para investigar presencia de Salmonella deben ser
representativas. Se deben tomar medidas adecuadas para evitar deterioros durante el transporte o el
1094
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
almacenamiento (17, 18). Debido a la amplia variedad de alimentos y de productos alimenticios no hay un único
método de muestreo que sea apropiado para todos los casos. Por lo tanto, se deben utilizar métodos diferentes
que sean específicos para el producto (10, 19).
La Organización Mundial de la Salud proporciona información sobre el desarrollo de medidas adecuadas para la
prevención y el control de las enfermedades transmitidas por alimentos, incluyendo las infecciones del hombre
por Salmonella. Los vehículos más comunes de infección son los huevos y sus productos derivados, la carne de
pollo y de otros animales, así como los derivados cárnicos. Los serotipos más frecuentes en los países europeos
son S. Enteritidis y S. Typhimurium, mientras que el serotipo dominante en Norteamérica es S. Typhimurium (45).
Una política de control de Salmonella a efectos de la salud pública debe cubrir todas las etapas desde "el establo
a la mesa". Debe incluir la declaración obligatoria de todos los brotes de la enfermedad (12), y el control del
pienso (46). El control de alimentos debe incluir el muestreo de los alimentos compuestos y de las materias
primas, los materiales crudos de origen animal, así como el muestreo durante el procesamiento de la comida.
Deben realizarse investigaciones epidemiológicas a nivel mundial para analizar la transmisión de Salmonella y
para apoyar las políticas de control de Salmonella.
Son esenciales los controles sanitarios en los mataderos, y se deben tomar precauciones especiales durante el
sacrificio de poblaciones potencialmente infectadas. Deben practicarse medidas de descontaminación durante el
procesamiento.
Otro elemento esencial en la profilaxis de la salmonelosis humana es la educación del consumidor, en particular,
la concienciación sobre el manejo y almacenamiento seguro del alimento, la higiene en la cocina y el tratamiento
culinario adecuado para limitar el riesgo de infección.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
La frecuencia del muestreo y el tipo de muestras obtenidas dependerán en gran medida de los hallazgos clínicos,
los servicios de laboratorio, los datos epidemiológicos y los objetivos.
Las muestras individuales para pruebas bacteriológicas se recogen antes de comenzar cualquier tratamiento
antibiótico y tan asépticamente como sea posible. Con preferencia, las muestras se recogen durante la fase
aguda de la enfermedad o muy pronto después de la muerte. En el caso de explotaciones avícolas intensivas, las
muestras ambientales, como cama y basura, barridos o frotis de las superficies del suelo, pueden ser el modo
más eficaz, en cuanto a coste, de identificar granjas infectadas (4). Se deben tomar precauciones para evitar la
contaminación cruzada de muestras durante el desplazamiento y en el laboratorio. Los envíos deben mantenerse
en frío y estar acompañados de una información adecuada. Si es posible, en el caso de especies animales
pequeñas, es preferible enviar al laboratorio un número representativo de animales enfermos o recién muertos
(44). Los serotipos adaptados al hospedador son más difíciles de aislar de las heces, de modo que, si se
sospecha esta situación, se deben cultivar tejidos infectados siempre que sea posible.
Se debe prestar una atención particular al aislamiento de salmonelas de animales con infecciones subclínicas, ya
que éstos pueden liberar bacterias sólo de modo intermitente y en cantidades bajas. Se puede lograr aumentar la
sensibilidad diagnóstica incrementando el tamaño de las muestras y el número de las muestras para que
representen más individuos, todo ello combinado con la mezcla de las muestras y la repetición de los muestreos.
En tales situaciones los métodos bacteriológicos o serológicos se deben utilizar para identificar poblaciones
infectadas más que para identificar animales individuales infectados.
•
Cultivo
Existen muchos métodos para aislar Salmonella que son de uso universal (8, 13, 16, 23, 34, 44). Más adelante
se describen algunos de los métodos más comunes. Todos los medios de cultivo preparados deben someterse a
controles de calidad y permitir el crecimiento del microorganismo sospechoso a partir de un inóculo pequeño.
Debe cultivarse la cepa de referencia en paralelo con las muestras sospechosas para asegurarse de que las
pruebas funcionan correctamente.
a)
Medios de pre—enriquecimiento
El número de salmonelas es normalmente bajo en las heces de los animales asintomáticos, en muestras
ambientales, en la comida de los animales y en los alimentos, por lo que es necesario utilizar medios de
pre–enriquecimiento para facilitar el aislamiento, tal como el agua de peptona tamponada o el caldo
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1095
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
universal de pre–enriquecimiento. Esto puede permitir que las escasas salmonelas se multipliquen sin que
mueran por los efectos tóxicos de los medios de enriquecimiento, o puede ayudar a la recuperación de
salmonelas que presentan daños subletales, como los debidos a la congelación, el calentamiento, la
exposición a substancias microbicidas o por desecación. El pre–enriquecimeinto puede no ser el mejor
método para aislar cepas poco vigorosas de Salmonella de las heces, como el caso de las cepas
adaptadas al hospedador, debido al sobre–crecimiento de microorganismos competidores durante el pre–
enriquecimiento no selectivo.
b)
Medios de enriquecimiento
Los medios de enriquecimiento son medios líquidos o semisólidos que contienen substancias que permiten
el crecimiento selectivo de las salmonelas a la vez que inhiben el crecimiento de otras bacterias. Algunos,
sin embargo, son también relativamente tóxicos para algunos serotipos de Salmonella, por ejemplo, el
selenito inhibe S. Cholerasuis, y el colorante verde brillante es tóxico para muchas cepas de S. Dublin.
También se han utilizado las temperaturas elevadas para aumentar la selectividad del medio de
enriquecimiento. En algunos laboratorios se utiliza una temperatura de 43°C, aunque con algunos medios
puede resultar inhibidora; por ejemplo, los medios de tetrationato y de Rappaport–Vassiliadis inhiben las
cepas termosensibles, especialmente S. Dublin, y ahora se recomienda 41.5°C para incubación en caldo de
Rappaport–Vassiliadis. También se puede emplear el enriquecimiento selectivo por movilidad para
aumentar la sensibilidad del aislamiento de Salmonella y la utilización de medios de enriquecimiento
semisólidos, como el semisólido modificado de Rappaport–Vassiliadis o el medio semisólido para
diagnóstico de Salmonella (DIASALM), que pueden proporcionar mayor sensibilidad (42). La composición
del medio, la temperatura y la duración de la incubación, y el volumen de las muestras utilizadas como
inóculo del medio, pueden servir para mejorar la tasa de aislamiento, y se debe tener siempre en cuenta a
estas variables. Ejemplos de medios selectivos de enriquecimiento son el de tetrationato sódico, como en el
caldo de Muller–Kauffman, los caldos con selenito F, con selenito cisteína, con verde brillante, el de
Rappaport–Vassiliadis o el medio semisólido de Rappaport–Vassiliadis. Se pueden añadir a los medios
selectivos substancias como la Ferrioxamina E para mejorar el aislamiento de Salmonella en muestras con
limitación de hierro o de nutrientes como los huevos, agua o suelo (34).
c)
Medios selectivos en placa
Estos son medios selectivos solidificados con agar que permiten un crecimiento diferencial en varios
aspectos. Inhiben el crecimiento de bacterias distintas a Salmonella y suministran información sobre
algunas de las principales características bioquímicas diferenciales –normalmente la incapacidad de
fermentar de la lactosa y la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S). Los resultados se obtienen después
de 24 y 48 horas de cultivo a 37°C. En dichos medios las salmonelas forman colonias características que
son distintas de las producidas por otras bacterias en la placa, con la posible excepción de Proteus,
Pseudomonas y Citrobacter. En ocasiones, se pueden aislar salmonelas fermentadoras de lactosa y la
producción de H2S puede ser variable. Se pueden detectar de modo más eficaz tales cepas atípicas cuando
se utilizan medios selectivos semisólidos. A este respecto, el medio DIASALM es particularmente útil ya que
se puede realizar una confirmación provisional por aglutinación en porta utilizando antisueros polivalentes
anti–O, anti–H o específicos, con líquido de la zona de crecimiento de la placa. Salmonella Abortusovis es
un serotipo de crecimiento lento, y es normal incubar las placas durante 72 horas y utilizar el medio no
selectivo de agar–sangre. Ejemplos de medios selectivos sólidos son el agar verde brillante, el agar xilosa–
lisina–desoxicolato, el agar desoxicolato/citrato, el agar Rambach, y el agar sulfito de bismuto, aunque en
la literatura y en los catálogos de medios pueden encontrarse muchos más.
•
Identificación de colonias sospechosas
Las colonias sospechosas se subcultivan en medios sólidos selectivos y no selectivos para asegurar la ausencia
de posibles contaminantes como Proteus spp. Si hay un crecimiento abundante en cultivo puro, las colonias
sospechosas se pueden probar por aglutinación en porta con sueros polivalentes para tipado de Salmonella
(22, 32). En algunos casos, la colonia sospechosa puede no aglutinar, y es necesario entonces utilizar pruebas
bioquímicas para confirmar la identificación. Estas pruebas se pueden realizar con azúcares en agua de peptona
o con sistemas comerciales (tales como el sistema Índice de Perfil Analítico [API]) o en medios compuestos
(tales como el agar triple azúcar–hierro [TSI]) (11).
La identificación de los antígenos O y H, y, en circunstancias especiales, del antígeno Vi, se realiza por
aglutinación directa en porta o por aglutinación en tubo utilizando antisueros específicos. En el caso de
organismos bifásicos, es necesario identificar ambas fases por inversión de fase lo que implica el pase por medio
semisólido que contenga antisuero contra la fase conocida. La detección se facilita por la disponibilidad de
antisueros dirigidos contra varios factores, y puede mejorarse utilizando sueros monovalentes de tipificación.
Aunque la mayoría de los laboratorios puede identificar los serotipos más comunes, se necesita utilizar los
servicios de un laboratorio de referencia para confirmar la identidad de un aislamiento y, posiblemente, para
obtener información sobre la fagotipia, si existe una clasificación disponible, y sobre el perfil genético.
1096
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
Se pueden necesitar pruebas bioquímicas adicionales para identificar algunas variantes serotípicas, por ejemplo
la del d–tartrato que permite diferenciar S. Paratyphi B var. Java de S. Paratyphi B. Los aislados se deben probar
en cuanto a su sensibilidad a un conjunto de agentes antimicrobianos.
•
Métodos de reconocimiento inmunológicos y de ácidos nucleicos
Se usan y comercializan numerosos métodos alternativos de detección de Salmonella (3, 5, 7, 27, 35, 36, 38, 40,
47). Éstos incluyen métodos basados en la conductancia/impedancia eléctrica, en la separación
inmunomagnética, en los enzimoinmunoensayos (ELISA) y en la reacción en cadena de la polimerasa con
sondas génicas, incluyendo la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) (15). Muchos
de estos métodos no han sido validados para muestras fecales y ambientales, y resultan más adecuados para el
análisis de alimentos humanos (31). Los métodos rápidos suelen ser más costosos que los cultivos
convencionales, pero pueden resultar económicamente viables para analizar materiales donde se espera una
prevalencia baja de contaminación o donde los materiales, como los alimentos, están pendientes de una prueba
negativa. En la actualidad, ninguno de los métodos rápidos se ha mostrado adecuado para la detección directa
de Salmonella, de modo que se necesitan etapas de enriquecimiento selectivo o no selectivo (29). Esto introduce
más pasos en el proceso de detección y requiere más tiempo para el operador. En los métodos basados en el
ADN, la inhibición de la reacción de la PCR por elementos de la matriz de la muestra resulta problemática y
requiere técnicas adecuadas de extracción del ADN (20). Los métodos de aislamiento rápido pueden también
estar ligados a sistemas de detección sofisticados, como biosensores (30). En los métodos rápidos para
detección de Salmonella hay muchas variaciones y avances, pero ninguno parece reemplazar satisfactoriamente
al cultivo de las muestras veterinarias en todas las circunstancias. Por tanto, no es posible dar detalles de todos
los métodos en este capítulo o hacer recomendaciones, pero los artículos de revisión citados más arriba
contienen información adicional. Las búsquedas en Internet son también una fuente útil de más información.
Actualmente se están haciendo esfuerzos para estandarizar a nivel internacional el empleo de algunos métodos
rápidos (24), pero todavía existe una cantidad considerable de trabajo pendiente.
•
Ejemplo de procedimiento de un método para aislar Salmonella de alimentos, piensos, muestras
fecales y ambientales.
i)
Añadir una muestra de 10–25 g a x10 volúmenes de agua de peptona tamponada a temperatura
ambiente. (NB: en el caso de muchos serotipos adaptados a un hospedador, y algunos serotipos
arizonae, es preferible añadir la muestra a un medio selectivo de enriquecimiento, como caldo
selenito–cisteína, y probar muestras de tejido cuando sea posible [incluyendo la siembra directa; ver el
método de cultivo para S. Pullorum/Gallinarum en el Capítulo 2.7.5 de este Manual].
ii)
Incubar el agua de peptona tamponada durante 16–20 horas a 37°C.
iii)
Inocular, con 0,2 ml del agua de peptona tamponada incubada, 20 ml de medio semisólido modificado
de Rappaport–Vassiliadis o DIASALM en una placa de Petri.
iv)
Inocular, con 1ml del agua de peptona tamponada incubada, 10 ml de caldo de tetrationato.
v)
Incubar el medio semisólido modificado de Rappaport–Vassiliadis o DIASALM a 41,5°C y el caldo de
tetrationato a 37°C ( se ha de estar seguro de que se utiliza una marca fiable de tetrationato para uso
a 37°C).
vi)
Después de 24 y 48 horas de enriquecimiento selectivo, se resiembra del medio semisólido modificado
de Rappaport-Vassiliadis tomando material del borde de la zona turbia con el asa de 1 µl y
extendiéndolo por siembra en estría sobre una placa con agar de Rambach o agar verde brillante y
sobre una placa con agar xilosa-lisina-desoxicolato más novobiocina.
vii)
Resembrar 10 µl del caldo de tetrationato sobre agar de Rambach o agar verde brillante y sobre agar
xilosa-lisina-desoxicolato más novobiocina.
viii) Incubar las placas a 37°C durante 24 horas.
ix)
Examinar cinco colonias sospechosas (rojas/rosas con enrojecimiento del medio en el caso de agar
verde brillante, carmesí con bordes pálidos o naranjas/sin color en agar Rambach, rojas con centro
negro en agar xilosa–lisina–desoxicolato) utilizando antisuero poli “O” y poli “H” (fase 1 y fase 2) o
medios bioquímicos compuestos.
x)
Subcultivar las colonias muy sospechosas que no aglutinen con antisueros poli H en medios no
selectivos y repetir después las pruebas. Si se obtiene una aglutinación fuerte con poli O y poli H, esto
es suficiente para una confirmación preliminar. Tales aislados se pueden luego seroagrupar. Si los
resultados de la aglutinación no son claros, hay que realizar más pruebas bioquímicas utilizando
medios compuestos como el TSI o emplear ONPG (o–nitrofenil–beta–d–galactopiranósido) y urea o
pruebas bioquímicas comerciales, como el API ID 32 E.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
2.
Pruebas serológicas
•
Identificación serológica de animales y explotaciones infectadas
Se han desarrollado varias pruebas serológicas para diagnosticar las infecciones por Salmonella en animales. En
aves, para la identificación de granjas infectadas con S. Pullorum/Gallinarum, se han utilizado con éxito durante
más de 50 años la prueba de sangre completa, que utiliza un antígeno teñido, y la prueba de aglutinación sérica
(SAT). Como S. Enteridis posee el mismo antígeno somático del grupo D que S. Pullorum/Gallinarum, la prueba
de sangre completa y otras relacionadas pueden utilizarse en el diagnóstico de la infección, pero la sensibilidad
es baja. Recientemente se han desarrollado otras pruebas, como las de tipo ELISA (2, 41), para el diagnóstico
de las infecciones por S. Enteritidis y S. Typhimurium y para otros serotipos de animales de granja. Los ensayos
ELISA se han utilizado con eficacia para identificar serológicamente ganado portador de S. Dublin y se pueden
aplicar a la leche sin tratar, para analizar ganado estabulado de producción láctea. En Dinamarca se utiliza un
ELISA mixto con suero o fluido tisular liberado por congelación y descongelación de muestras de músculo para
detectar infecciones de Salmonella en cerdos (26). Se utiliza una prueba similar para detectar anticuerpos contra
S. Enteritidis y S. Typhimurium en la yema de huevo de explotaciones comerciales de ponedoras (12).
Algunas pruebas ELISA son ahora de uso rutinario y se han comercializado varias. La finalidad de esta sección
es considerar las pruebas serológicas que se han evaluado por completo y que son de uso rutinario en el
diagnóstico de la salmonelosis en animales. Por tanto, no se considerarán otras pruebas que están aún en fase
de desarrollo. Con frecuencia se presentan nuevas pruebas para el diagnóstico de Salmonella, de modo que una
búsqueda en Internet es a menudo el mejor modo de obtener una información actualizada.
•
Factores que influyen en el diagnóstico serológico
1.
Los métodos serológicos deben utilizarse para identificar poblaciones infectadas más que para identificar
animales individuales infectados, aunque se pueden emplear pruebas repetidas en la explotación como una
ayuda para seleccionar los animales portadores crónicos. Normalmente, las pruebas serológicas se diseñan
para detectar un número limitado de serotipos o serogrupos de Salmonella.
2.
Se sabe que algunos animales con respuesta serológica positiva no pueden ser infectados de nuevo por
Salmonella. De modo similar, animales que excretan activamente salmonelas pueden ser serológicamente
negativos. También se aplican consideraciones similares a los métodos de cultivo bacteriológico, y así, los
cultivos fecales con resultados negativos no indican necesariamente que el animal no está infectado. Sin
embargo, ninguna de estas situaciones debe considerarse un problema importante si se realizan suficientes
pruebas. Los animales que son serológicamente positivos pueden haber cesado de excretar salmonelas
aunque las concentraciones de inmunoglobulinas circulantes pueden permanecer altas. Otros animales de
la granja pueden estar todavía infectados. Los animales serológicamente negativos pueden ser el resultado
de una infección reciente que origine la excreción antes de que la producción de inmunoglobulinas sea
máxima, o de una infección con serotipos menos invasivos. Con toda probabilidad, los animales que han
sido infectados recientemente serán detectados serológicamente por un programa adecuado de análisis a
lo largo de la vida de la explotación.
3.
Los animales recién nacidos son inmunológicamente inmaduros y no responden serológicamente al
antígeno somático LPS hasta las 2–3 semanas de edad. Sin embargo, sí producen una respuesta
serológica a los antígenos de la proteína flagelar. El ganado bovino puede no responder serológicamente
hasta las 10–12 semanas de edad.
Los pollos pueden también adquirir pasivamente anticuerpos anti–salmonella de sus progenitores a través
del saco vitelino; esto puede indicar que la población de los padres estaba infectada. Los mamíferos
pueden adquirir anticuerpos de la madre a través del calostro.
4.
Después de las infecciones por Salmonella, las concentraciones de inmunoglobulinas permanecen altas
durante 2–3 meses. Una respuesta de IgM indica una infección reciente.
5.
Durante muchos años se ha utilizado la inmunización para controlar las infecciones por Salmonella en
animales de granja y, si se emplea serología en el diagnóstico, es necesario diferenciar entre la respuesta a
la vacuna y a una infección real. Muchas vacunas vivas que se administran oralmente no proporcionan una
respuesta de anticuerpos séricos significativa.
6.
El efecto de la terapia con antibióticos en la respuesta serológica no está claro. Algunos investigadores
encuentran títulos reducidos después de la terapia, mientras que otros no detectan efecto alguno. No
obstante, si se ha empleado terapia antimicrobiana, la serología puede ser una técnica de diagnóstico para
la salmonelosis más útil que el cultivo.
1098
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
7.
Existen aproximadamente 2500 serotipos diferentes de Salmonella. Dependiendo del antígeno y de la
prueba utilizada, pueden ocurrir reacciones serológicas cruzadas entre diferentes serotipos, por ejemplo
entre S. Typhimurium y S. Enteritidis.
8.
En las aves, la yema del huevo se puede probar para detectar inmunoglobulinas frente a Salmonella, y los
huevos representan, por tanto, un método para analizar explotaciones. En Dinamarca se emplea esta
estrategia para controlar explotaciones comerciales de ponedoras. En el ganado bovino, se puede utilizar la
leche para la detección de anticuerpos anti–Salmonella para analizar las explotaciones de producción
láctea.
9.
La utilización de discos de papel de filtro para recoger suero elimina la necesidad de separar el suero. Los
discos también permiten la conservación a largo plazo y reducen los costes de transporte al laboratorio. La
sensibilidad de la prueba puede resultar levemente reducida en comparación con las pruebas realizadas con
suero fresco.
a)
La prueba de sangre completa
La prueba de sangre completa es una prueba rápida para la tifosis aviar y la pulorosis, que puede utilizarse
en la granja. La sensibilidad de esta prueba es baja y, sin experiencia, se pueden registrar muchos
resultados como falsos positivos y falsos negativos.
Para una descripción detallada de la prueba de sangre completa, véase el Capítulo 2.7.5. Tifosis aviar y
Pulorosis.
b)
Prueba rápida de aglutinación en porta
El suero (0,02 ml) se mezcla con antígeno polivalente teñido con cristal violeta (0,02 ml). El porta se mueve
cuidadosamente durante 2 minutos, tras los cuales se ve el resultado de la prueba. Los componentes de la
prueba se guardan a 4°C y antes de usarlos deben alcanzar la temperatura ambiente.
Los sueros problema deben estar libres de contaminantes y de hemolisis. Puede ser conveniente
centrifugar las muestras de suero que se hayan mantenido guardadas por algún tiempo.
Si se sospecha la existencia de reacciones falsas positivas inespecíficas, los sueros positivo/sospechosos
deben probarse de nuevo después de una inactivación térmica a 56°C durante 30 minutos.
c)
Prueba de aglutinación sérica
La SAT es relativamente poco sensible, y muchos animales viejos tienen niveles bajos de aglutininas en sus
sueros debido a enterobacterias distintas a Salmonella. Las muestras aisladas carecen de valor excepto
como pruebas de rebaño o en pruebas analíticas preliminares. Se necesitan muestras pareadas como
requisito mínimo para confirmar una infección activa. La prueba es relativamente barata; los antígenos se
pueden preparar con facilidad y no se requiere un equipo costoso. La SAT se puede adaptar a formato de
microtitulación y se puede utilizar para determinar títulos somáticos o flagelares. Se recomienda disponer
para SAT de un suero estándar para el control de calidad de las preparaciones de antígeno(s).
•
Preparación del antígeno somático
i)
Resembrar Salmonella, desde el cultivo apropiado de mantenimiento, a una placa con medio agarsangre base (BAB), u otro medio adecuado, para crecimiento de colonias aisladas. Incubar durante
toda la noche a 37°C (+2° C).
ii)
Seleccionar una colonia lisa y realizar una prueba de aglutinación en porta para confirmar que está
presente el antígeno somático requerido.
iii)
Mediante un asa estéril, inocular con la colonia seleccionada un tubo de agar nutritivo inclinado.
iv)
Incubar el cultivo durante 8–12 horas a 37°C (+2°C).
v)
Con una pipeta Pasteur, retirar el crecimiento, preferentemente en una cabina de seguridad, con
aproximadamente 2 ml de alcohol absoluto y transferir el contenido a un tubo estéril.
vi)
Dejar el antígeno a temperatura ambiente durante 4–6 horas para que el alcohol mate las bacterias y
suelte los flagelos.
vii)
Centrifugar el tubo en una centrífuga de mesa durante 5 minutos a 1.000 g. Verter el líquido y añadir
suficiente solución salina con fenol para conseguir que el antígeno alcance una opacidad equivalente
8
a la de un tubo No. 2 en la escala de Braun (aproximadamente 10 unidades formadoras de
colonias/ml) u otro estándar apropiado.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1099
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
viii) Realizar una titulación estándar con suero conocido para confirmar que el antígeno es positivo para el
factor requerido.
d)
ix)
Guardar en un refrigerador a 4° C hasta su utilización.
•
Preparación de antígenos flagelares
i)
Resembrar Salmonella, desde el cultivo apropiado de mantenimiento, a una placa con medio BAB, u
otro medio adecuado. Incubar durante toda la noche a 37°C (+2°C).
ii)
Realizar un pase en medio semisólido (con aproximadamente 0,3% de agar) en un tubo de Craigie, u
otro contenedor adecuado, para inducir la expresión óptima del antígeno flagelar apropiado. Si el
serotipo es bifásico, se añade al medio antisuero H que corresponda a la fase a suprimir.
iii)
Utilizar la aglutinación en porta para comprobar que la Salmonella está en la fase requerida. Si es así,
inocular con un asa de cultivo 20 ml de caldo nutritivo. Incubar durante 12–18 horas a 37°C (+2°C)
para un crecimiento óptimo. (Si la fase es incorrecta, volver a pasar por el medio semisólido).
iv)
Pipetear en la suspensión de antígeno 250 µl de formaldehido al 40% (usar guantes y trabajar
preferiblemente en una cabina de seguridad), y dejar toda la noche.
v)
Probar el antígeno por SAT utilizando el suero de tipado apropiado.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Es más fácil analizar los sueros a una dilución de 1/20; se añaden 0,25 ml de antígeno a 0,25 ml de
suero prediluido a 1/10 en solución salina normal.
ii)
Las mezclas se incuban en un baño de agua a 50°C durante 24 horas en el caso de los antígenos
somáticos, y durante 4 horas, para los antígenos flagelares. La dilución y el tiempo de incubación
puede variar dependiendo del antisuero usado.
iii)
Los sueros que dan reacción positiva se diluyen luego de 1/20 a 1/320 y se vuelven a probar con el
antígeno apropiado.
Técnica de enzimoinmunoensayo para Salmonella Enteritidis
Para la detección de IgG (IgY) específica para S. Enteritidis, existen dos sistemas básicos principales: el
ELISA indirecto (2) y el ELISA competitivo " tipo sandwich" (41).
El ELISA indirecto supone el uso de un antígeno detector que recubre los pocillos de una placa de
microtitulación. Después de aplicar un reactivo bloqueante para reducir uniones inespecíficas, se añaden a
los pocillos las muestras problema. El anticuerpo de la muestra que se une específicamente se detecta con
un conjugado anticuerpo/enzima. Se han utilizado varios antígenos, incluyendo LPS, flagelos, fimbrias SEF
14, proteínas de la membrana externa y preparaciones de antígenos celulares totales.
El ELISA sándwich competitivo emplea un reactivo específico – un anticuerpo monoclonal (MAb) o
policlonal– para recubrir los pocillos de antígeno. Luego se añade una preparación pura o cruda de
antígeno. Después se aplican las muestras problema seguidas por el anticuerpo conjugado, que no se unirá
al antígeno si la muestra contiene anticuerpos específicos. El tiempo de ensayo se puede acortar
añadiendo simultáneamente la muestra problema y el conjugado. Se han preparado MAbs de LPS, flagelos
y SEF14 de S. Enteritidis.
Ambos sistemas presentan ventajas y desventajas. El ensayo indirecto es más simple y hay reactivos
disponibles para todos los serotipos de Salmonella de pollos, pavos, patos y mamíferos. El ELISA
competitivo se puede aplicar a todas las especies animales y, en general, muestra mayor especificidad. Sin
embargo, no hay reactivos comercializados para todos los serotipos. También hay algunos problemas de
afinidad y puede ser menos sensible que las técnicas indirectas. En condiciones de campo, ambos sistemas
han producido reacciones positivas falsas y en algunos casos el análisis con un ELISA indirecto con LPS
puede confirmarse después con un ELISA competitivo flagelar.
Ambos tipos de ensayo pueden utilizarse con suero, yema de huevo o sangre seca reconstituida eluida de
discos de papel de filtro. En Dinamarca se emplea un ELISA mixto (o ELISA de jugo de carne) para detectar
infecciones de Salmonella en cerdos (28). Este ELISA contiene los antígenos "O" de tipo 1, 4, 5, 6, 7 y
12 del LPS de S. Typhimurium y S. Cholerasuis, lo que capacita al ensayo para detectar serológicamente el
95% de los serogrupos de Salmonella que se encuentran en los cerdos daneses. El suero se utiliza para
analizar granjas de producción y multiplicación, mientras que, para cerdos en el matadero, se realiza el
ensayo con el fluido tisular ("jugo de carne") que se libera cuando se descongelan 10 g de muestra de
músculo congelado.
1100
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
Con algunos ELISA se puede diferenciar entre las infecciones producidas por serotipos de Salmonella de
diferentes serogrupos. Entre los grupos B y D y otros serotipos invasivos se produce alguna reacción
cruzada. Sin embargo, normalmente hay una mayor respuesta de anticuerpos cuando en el ELISA se utiliza
LPS del serotipo homólogo. Aún no se ha decidido ni existe acuerdo internacional sobre cuál es el mejor
método para establecer un valor de "corte" en la absorbancia, por encima del cual los sueros se designan
como procedentes de una población afectada por S. Enteritidis, sin que se produzca un nivel inaceptable de
resultados positivos falsos.
Los ELISAs están adaptados a la automatización y, por tanto, a programas de muestreo a gran escala. Un
problema importante es que se necesita un equipo costoso, y muchos de los reactivos son también caros.
Hay varias preparaciones ELISA y ELISA–mixtas comercializadas para S. Enteritidis, S. Typhimurium y
Grupo B/C. En teoría, éstas deberían validarse mediante ensayos internacionales coordinados antes de
adoptarse a efectos de control.
Un ejemplo de un ELISA validado es el desarrollado por el Laboratorio de Referencia de la OIE de VLA
Weybridge (ver dirección en el Cuadro de la Parte 3 de este Manual). Los requisitos se indican a
continuación.
•
Equipo
Placas de PVC, tipo Falcon microprueba III; pipetas apropiadas y cilindros de medida; lavador de placas de
microprueba; lector de placas ELISA; filtro de prueba de 405–410 nm y filtro de referencia de 630 nm.
•
Antígeno
i)
El LPS de S. Enteritidis extraido con fenol está comercialmente disponible (Catálogo Sigma No.
L6011). Éste se reconstituye en 1 ml de agua desionizada y se guarda a –20°C en alícuotas de 100 µl
en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.2, a una concentración de 2,5 mg/ml. Para su
uso, el antígeno debe ser descongelado en tampón de recubrimiento a la concentración apropiada.
ii)
El antígeno LPS también se puede preparar por la técnica de Westphal & Luderitz (43) y estandarizar,
en lo que respecta a su concentración en carbohidrato, por el método de Gerhardt (14) a una
concentración ajustada a 1.000 µg/ml.
•
Diluyente del suero y del conjugado
Añadir seroalbúmina bovina (BSA) (2 g) y Tween 20 (0,05 ml) a PBS (100 ml) (Alternativamente, la leche en
polvo [1 g] puede reemplazar a la BSA). Guardar a 4° C y hacer soluciones frescas cada semana.
Tampón de recubrimiento: Añadir carbonato sódico (1.59 g) y bicarbonato sódico (2.93 g) a agua
desionizada (1 litro) y ajustar a pH 9,6. (Alternativamente, disolver una tableta de tampón 0,05 M
carbonato/bicarbonato de Sigma [No. Catálogo C–3041] en agua desionizada [100 ml]). Guardar a 4°C y
renovar cada 2 semanas.
Tampón de substrato: Hacer una solución de dietanolamina al 10% (v/v) en agua desionizada. La
dietanolamina debe precalentarse a 37° C antes de distribuirse, y el pH de la solución debe ajustarse a pH
9,8 con ácido clorhídrico 1 M. Guardar a 4°C y renovar cada 2 semanas.
Conjugado enzimático: Inmunoglobulina anti–pollo de cabra conjugada a fosfatasa alcalina (por ejemplo,
ICN Immunobiologicals, o como suministro alternativo de Sigma: A9171) o globulina anti–pollo de otras
especies. Guardar a 4°C diluida en diluyente a la concentración apropiada y renovar cada semana.
Substrato del enzima: Disolver una tableta de p–nitrofenil fosfato disódico (5 mg) en tampón de substrato
(5 ml) no antes de 30 minutos de su uso, y mantener en la oscuridad.
•
Estándares
i)
Antisuero control positivo preparado por inoculación intramuscular de cuatro pollos libres de patógenos
6
específicos (SPF) de 1 semana de edad con un inóculo que contenga 10 S. Enteritidis. El suero se
obtiene 3–4 semanas después, cuando los títulos de anticuerpo son máximos.
ii)
Suero control negativo A de cuatro aves SPF de 1 semana de edad.
iii)
Suero control negativo B de 58 productoras de 1 semana de edad que estén libres de infecciones por
Salmonella. Juntar los sueros y guardar en volúmenes de 100 µl a –20°C.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Se utilizan muchas vacunas inactivadas contra la salmonelosis causada por serotipos diferentes en varias
especies animales, incluyendo una vacuna combinada contra S. Enteritidis y S. Typhimurium para empleo en
aves. La inactivación se realiza normalmente por calentamiento o por tratamiento con formalina y se suele utilizar
un adyuvante, como el hidróxido alumínico. En varios países también se han utilizado vacunas vivas; éstas
incluyen las cepas semi–rugosas, tales como la 9R para la tifosis aviar y la HWS51 para las infecciones por S.
Dublin (26). Otras vacunas atenuadas incluyen mutantes auxotróficos, que se usan en Alemania para evitar
infecciones por Salmonella en animales de granja y en el Reino Unido para S. Enteritidis. Se han desarrollado
vacunas mutantes, atenuadas racionalmente por delección de genes mediante técnicas de biología molecular
con, para aves de corral y para otras especies; éstas comprenden los mutantes aroA y las cepas con mutaciones
en los genes que codifican la adenilato ciclasa (cya) y la proteína receptora del adenosín monofosfato cíclico
(crp) (6), disponibles en los EE.UU. Normalmente, en Europa no se permite el uso como vacunas de organismos
genéticamente modificados.
Las normas para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las directrices que se indican aquí y en el Capítulo I.1.7 son de carácter
general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Para vacunas vivas o muertas, la cepa bacteriana debe de estar lo más estrechamente relacionada que sea
posible con las cepas salvajes de circulación actual. Debe escogerse cuidadosamente de casos de
enfermedad clínica grave y debe determinarse su virulencia y la producción de antígeno. Es mejor evaluar
varias cepas potenciales de este modo antes de probar la selección+ final. Las cepas vacunales finales
deben identificarse por documentación histórica y caracterizarse por marcadores fenotípicos y/o genéticos
estables. Las cepas de vacunas vivas deberán poseer caracteres estables que permitan su distinción de las
cepas salvajes. Se pueden usar marcadores de resistencia a antimicrobianos, por ejemplo a rifampicina. La
atenuación de la virulencia debe ser estable y lograrse preferiblemente por dos mutaciones independientes
definidas.
b)
Método de cultivo
El cultivo de inóculo se propaga y mantiene utilizando medios adecuados, muchos de los cuales se han
descrito (en libros de texto) para el crecimiento de Salmonella. Los medios empleados no deben contener
suero ni tejidos animales. El cultivo puede ser en medio sólido, en botellas Roux, o en medio líquido, en
cuyo caso se puede utilizar un equipo de fermentación a gran escala. La limitación de hierro o la incubación
a baja temperatura en un medio mínimo puede aumentar la producción de antígeno LPS por la cepa
vacunal.
c)
Validación como una vacuna
i)
Pureza
La cepa vacunal debe comprobarse del siguiente modo:
ii)
•
Tinción de un frotis de suspensión bacteriana en un porta de vidrio empleando la tinción de
Gram.
•
Homogeneidad del cultivo en medios no selectivos.
•
Requerimientos metabólicos indicados por pruebas bioquímicas.
•
Detección de marcadores, y fagotipia.
•
Aglutinación con antisuero específico.
Inocuidad
Se debe determinar en ratones la LD50 (dosis letal 50%) o la ID50 (dosis infectiva 50%). A la especie a
vacunar se le debe suministrar diez veces la dosis de campo de vacuna viva, o el doble de la dosis de
vacuna inactivada, a la edad y por la ruta recomendadas. Los animales se observan para comprobar
la ausencia de reacciones adversas. Para vacunas vivas debe demostrarse, después de pases
seriados en especies susceptibles, la estabilidad y la ausencia de reversión a la virulencia. También es
necesario considerar vacunaciones repetidas. Debe demostrarse que las vacunas vivas no persisten
por mucho tiempo en los animales vacunados o que no se transmitan a la leche o a los huevos que
puedan consumirse, y el método de aplicación no debería presentar riesgos a los operadores.
1102
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
iii)
Eficacia
Para demostrar que la vacuna es eficaz deben utilizarse experimentos de laboratorio y ensayos de
campo. Los experimentos de laboratorio consisten en pruebas de vacunación e inoculaciones de
desafío en la especie a vacunar, a las dosis y edad recomendadas. Los datos sobre eficacia también
pueden utilizarse como base para la prueba de potencia de los lotes. Los ensayos de campo para
probar la eficacia son más difíciles de realizar, debido a las dificultades para estandarizar las
condiciones del desafío y disponer de los controles apropiados.
iv)
Aspectos ambientales
Las vacunas vivas deben probarse respecto a su capacidad para persistir en el ambiente e infectar
otras especies, como roedores o aves salvajes que puedan resultar expuestas. La supervivencia
prolongada de algunas vacunas vivas en las heces y en las camas puede representar un riesgo
ambiental inaceptable cuando el material se extrae de los habitáculos animales.
2.
Método de producción
Las vacunas deben producirse en habitaciones limpias y adecuadas a las que sólo tenga acceso personal
autorizado. Se debe tener cuidado en evitar la contaminación cruzada entre áreas donde se procesan
microorganismos vivos y otras zonas. Debe evitarse la contaminación de los operadores y del medio, y la
preparación de las vacunas debe tener lugar en una zona separada de la de trabajo con cultivos para
diagnóstico. Los operadores no deben manejar la vacuna mientras estén enfermos y no deben estar sometidos a
condiciones inmunosupresoras o a medicación. En las áreas de producción y en las habitaciones para animales
se debe suministrar ropa protectora al personal.
A partir del cultivo del inóculo primario se preparan lotes de cultivos de siembra, y el número de pases depende
de la validación del proceso. La vacuna se puede preparar por inoculación de un medio adecuado, como caldo
nutritivo, con un cultivo reciente y mediante incubación en un agitador a 37°C durante 24 horas, con o sin
aireación. Los microorganismos se recogen por sedimentación o centrifugación. Alternativamente, los
microorganismos se pueden cultivar y recoger de medios sólidos, como agar nutritivo. En el caso de vacunas
vivas, la suspensión se diluye en PBS, pH 7,0, y se puede liofilizar.
El tiempo de inactivación para una vacuna muerta debe ser al menos un 33% superior al necesario para reducir
el número de viables a un nivel indetectable. El proceso de inactivación se debe aplicar a todo el volumen de
células recogidas como vacuna.
Los conservantes, excipientes para la liofilización, estabilizadores para recipientes multidosis y otras substancias
añadidas o en combinación con las vacunas no deben tener efecto perjudicial sobre la potencia inmunizante del
producto.
3.
Control interno
Los siguientes aspectos requieren atención:
•
Control visual de la suspensión, homogeneidad por la tinción de Gram, cultivo en medio no selectivo.
•
Aglutinación en porta con antisueros específicos.
•
Titulación de bacterias por turbidimetría y/o recuento en placa.
•
Prueba de inactivación eficaz (vacunas muertas) sembrando en medio no selectivo o utilizando un medio
que proporcione óptimo crecimiento, por ejemplo, medio de producción con la neutralización del compuesto
inactivante.
•
Titulación de bacterias viables (vacunas vivas) antes y después de la liofilización.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos se encuentran en el
Capítulo I.1.5.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1103
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
b)
Inocuidad
Se puede utilizar una prueba de laboratorio en ratones, que previamente se haya visto que se correlaciona
con la seguridad en la especie a vacunar, para determinar la LD50 y/o la ID50. Cada lote se debe probar en
la especie a vacunar, a la edad y por la ruta recomendada, utilizando al menos dos veces la dosis de
campo para vacunas muertas y diez veces la dosis para vacunas vivas.
c)
Potencia
La potencia se prueba utilizando ensayos de vacunación–desafío en ratones y otras especies, incluyendo
(si es posible) la especie a vacunar y la respuesta inmunológica en la especie a vacunar.
d)
Duración de la inmunidad
La duración de la inmunidad suele variar considerablemente según los productos, los regímenes de
vacunación y los animales individuales vacunados. La inmunidad a Salmonella es normalmente específica
de serogrupo. Las consultas entre colegas sugieren que las vacunas muertas proporcionan protección
durante 6 meses, mientras que las vivas inducen una inmunidad más fuerte, que puede persistir durante
1 año o más. Debe recordarse, sin embargo, que un desafío fuerte como el asociado a granjas de
ocupación continua o a roedores infectados puede superar la inmunidad vacunal.
e)
Estabilidad
Se carece de información sobre la estabilidad de las vacunas muertas. La estabilidad está afectada por las
condiciones de conservación y por la presencia de microorganismos contaminantes creciendo en el
producto. La estabilidad se determina por pruebas de potencia repetidas a intervalos temporales
adecuados. La estabilidad de las vacunas vivas se puede determinar realizando un recuento del número de
microorganismos viables de modo repetitivo a intervalos temporales adecuados.
f)
Conservantes
En las vacunas bacterianas muertas se incluyen a menudo compuestos con actividad antimicrobiana como
conservantes, del tipo del tiomersal, fenol o cristal violeta.
g)
Precauciones
En ocasiones, algunas vacunas muertas pueden causar aborto en hembras preñadas debido a su
contenido en LPS, y las vacunas vivas deben utilizarse también con precaución en estos animales. A veces,
sin embargo, es necesario vacunar hembras preñadas para proporcionar inmunidad maternal a su
descendencia. Puede resultar útil incluir en el programa de pruebas de seguridad un ensayo de
endotoxinas, de modo que se puedan comparar los niveles con aquellos que se muestran seguros en las
pruebas de doble dosis. Las vacunas también pueden causar inflamación en el sitio de la inyección.
5.
Pruebas del producto final.
a)
Inocuidad
Las vacunas muertas se ensayan en una prueba de dosis doble y las vacunas vivas en una prueba que
utiliza diez veces la dosis, en la especie a vacunar.
b)
Potencia
Si es posible, la prueba de potencia debe relacionarse con la eficacia de la vacuna en la especie a la que va
dirigida, y se deben aplicar criterios adecuados para aprobar los lotes. Es posible estimar las vacunas
muertas por la respuesta producida de anticuerpos anti O–H, aunque debe tenerse en cuenta que los
anticuerpos séricos son solamente una parte de los mecanismos de protección del hospedador contra
Salmonella. Alternativamente, la potencia de la vacuna se puede estimar por su efecto sobre la LD50 en
ratones.
D. EXCLUSIÓN COMPETITIVA
En las aves de corral, la susceptibilidad a la infección por Salmonella puede reducirse notablemente por
tratamiento oral o en aerosol –antes de su exposición al microorganismo (idealmente en la rotura o eclosión del
huevo)– con un cultivo de microflora anaeróbica del ciego, que inhibe la colonización de Salmonella. En algunos
países este tratamiento se utiliza con frecuencia, pero en otros sólo se emplea como ayuda para descontaminar
granjas con infección persistente (1, 27).
1104
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
AGRADECIMIENTOS
Algunas partes de este capítulo fueron tomadas o basadas en el capítulo sobre salmonelosis de ediciones
anteriores a este Manual .
REFERENCIAS
1.
ANDREATTI R.L., SAMPAIO H.M., BARROS M.R., GRATAO P.R. & CATANEO A. (2003). Use of caecal microflora
cultured under aerobic or anaerobic conditions in the control of experimental infection of chicks with
Salmonella Enteritidis. Vet. Microbiol., 92, 237–244.
2.
BARROW P.A. (1994). Serological diagnosis of Salmonella serotype Enteritidis infections in poultry by ELISA
and other tests. Int. J. Food Microbiol., 21, 55–68.
3.
BLACKBURN C DE W. (1993). A Review: Rapid and alternative methods for the detection of salmonellas in
foods. J. Appl. Bacteriol., 75, 199–214.
4.
CALDWELL D.J., HARGIS B.M., CORRIER D.E. & DELOACH J.R. (1998). Frequency of isolation of Salmonella from
protective foot covers worn in broiler houses as compared with diagnostic sampling. Avian Dis. 42, 381–384.
5.
COOK N. (2003). The use of NASBA for the detection of microbial pathogens in food and environmental
samples. J. Appl. Microbiol., 53, 165–174.
6.
COOPER G.L. (1994). Salmonellosis – infections in man and the chicken: pathogenesis and the development
of live vaccines – a review. Vet. Bull., 64, 123–143.
7.
DE BOER E. & BEUMER, R.R. (1999). Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int.
J. Food Microbiol., 50, 119–130.
8.
ELLIS E.M., W ILLIAMS J.E., MALLINSON E.T., SNOEYENBOS G.H. & MARTIN W.J. (1976). Culture Methods for the
Detection of Animal Salmonellosis and Arizonosis. Iowa State University Press, Ames, USA.
9.
EUROPEAN UNION (1992). Council Directive 92/117/EEC of 17 December 1992 concerning measures for
protection against specified zoonoses and specified zoonotic agents in animals and products of animal
origin in order to prevent outbreaks of food–borne infections and intoxications.
10. EUROPEAN UNION (1995). Council Directive 95/53/EEC of 25 October 1995 fixing the principles governing the
organisation of official inspection in the field of animal nutrition.
11. EWING W.H. (1986). Edwards and Ewing’s Identification of Enterobacteriaceae, Fourth Edition. Elsevier, New
York, USA, London, UK, and Amsterdam, The Netherlands.
12. FELD N.C., EKEROTH L., GRADEL K.O., KABELL S. & MADSEN M. (2000). Evaluaton of a serological Salmonella
mix–ELISA for poultry used in a national surveillance programme. Epidemiol. Infect., 125, 263–268.
13. FRICKER C.R. (1987). The isolation of salmonellas and campylobacters. J. Appl. Bacteriol., 63, 99–116.
14. GERHARDT P. (1981). Manual of Methods for General Microbiology. American Society for Microbiology,
Washington DC, USA, 332–334.
15. GOODING C.M. & CHOUDARY P.V. (1999) Comparison of different primers for rapid detection of Salmonella
using the polymerse chain reaction. Mol. Cell. Probes, 13, 341–347.
16. HARVEY R.W.S. & PRICE T.H. (1974). Isolation of Salmonellas. Public Health Laboratory Service. Monograph
Series 8. Her Majesty’s Stationery Office, London, UK.
17. INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) (1996). ISO 7218 Microbiology of food and animal
feeding stuffs – General rules for microbiological examinations. International Organization for
Standardization, 1, rue de Varembé, Case postale 56 CH–1211 Geneva 20, Switzerland.
18. INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) (1999). ISO 6887–1: Microbiology of food and
animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1105
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
microbiological examination – Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal
dilutions. International Organization for Standardization, 1, rue de Varembé, Case postale 56 CH–1211
Geneva 20, Switzerland.
19. INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) (2000). ISO 6579: Microbiology of food and animal
feeding stuffs – Horizontal method for the detection of Salmonella spp. International Organization for
Standardization, 1, rue de Varembé, Case postale 56 CH–1211 Geneva 20, Switzerland.
20. JENSEN A.N. & HOORFAR J. (2003). Optimal purification and sensitive quantification of DNA from fecal
samples. J. Rapid Meth. Automat. Microbiol., 10, 231–244.
21. LE MINOR L. & POPOFF M.Y. (1987). Request for an opinion. Designation of Salmonella enterica sp. nov. nom.
rev, as the type and only species of the genus Salmonella. Int. J. Syst. Bacteriol., 37, 465–468.
22. LINDBERG A.A. & LE MINOR L. (1984). Serology of Salmonella. En: Methods in Microbiology, Vol. 15, Bergman
T.E., ed. Academic Press London, UK, 1–14.
23. MALLINSON E.T. & SNOEYENBOS G.H. (1989). Salmonellosis. En: Isolation and Identification of Avian
Pathogens, Third Edition, Purchase H.G. et al., eds. American Association of Avian Pathologists. Kendall
Hunt Publishing, Iowa, USA, 3–11.
24. MALORNY B., HOORFAR J., BUNGE C. & HELMUTH R. (2003). Multicenter validation of the analytical accuracy of
Salmonella PCR: towards an international standard. Appl. Environ. Microbiol., 69, 290–296.
25. MALORNY B., SCHROETER A., BUNGE C., HOOG B., STEINBECK A. & HELMUTH R. (2000). Evaluation of molecular
typing methods for Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 isolated in Germany from healthy pigs.
Vet. Res., 32, 119–129.
26. MASTROENI P., CHABALGOITY J.A., DUNSTAN S.J., MASKELL D.J. & DOUGAN G. (2001). Salmonella: Immune
responses and vaccines. Vet. J., 161, 132–164.
27. MEAD G.C. (2000). Prospects for competitive exclusion treatment to control Salmonellas and other foodborne
pathogens in poultry. Vet. J., 159, 111–123.
28. NIELSEN B., EKEROTH L., BAGER F. & LIND P. (1998). Use of muscle fluid as a source of antibodies for serologic
detection of Salmonella infection in slaughter pig herds. J. Vet. Diagnostic Investigation, 10, 158–163.
29. OLIVEIRA S.D., RODENBUSCH M.C. CE, ROCHA S.L.S. & CANAL C.W. (2003). Evaluation of selective and non–
selective enrichment PCR procedures for Salmonella detection. Lett. Appl. Microbiol., 36, 217–221.
30. OLSEN E.V., PATHIRANA S.T., SAMOYLOV A.M., BARBAREE J.M., CHIN B.A., NEELY W.C. & VODYANOY V. (2003).
Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment. J. Microbiol. Methods,
53, 273–285.
31. PEPLOW M.O., CORREA–PRISANT M., STEBBINS M.E., JONES F. & DAVIES P. (1999). Sensitivity, specificity, and
predictive values of three Salmonella rapid detection kits using fresh and frozen poultry environmental
samples versus those of standard plating. App. Environ. Microbiol., 65, 1055–1060.
32. POPOFF M.Y., BOCKEMUHL J. & MCW HORTER–MURLIN A. (1994). Supplement 1993 (No. 37) to the Kauffmann–
White scheme. World Health Organization Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella,
Unite des Enterobacteries, U389 INSERM, Institute Pasteur, Paris. Res. Microbiol., 145, 711–716.
33. POPOFF M.Y. (2001). Antigenic Formulas of the Salmonella Serovars. World Health Organization
Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Pasteur Institute, Paris, France.
34. REISSBRODT R. (1995). Conventional and alternative methods for isolation and identification of Salmonella –
an overview. Biotest Bull., 5, 143–156.
35. RICKE S.C., PILLAI S.D., NORTON R.A. & MACIOROWSKI K.G. (1998). Applicability of rapid methods for detection
of Salmonella spp. in poultry feeds: a review. J. Rapid Meth. Automat. Microbiol., 6, 239–258.
36. RIJPENS N.P. & HERMAN L.M.F. (2002). Molecular methods for identification and detection of bacterial food
pathogens. J AOAC Int., 85, 984–995.
37. SNOEYENBOS G.H. (1994). Avian salmonellosis. En: Handbook of Zoonoses, Second Edition, Beran G.W.,
ed. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA.
1106
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.3.— Salmonelosis
38. SWAMINATHAN B. & FENG P. (1994). Rapid detection of food–borne pathogenic bacteria. Ann. Rev. Microbiol.,
48, 410–426.
39. THRELFALL E.J. & FROST J.A. (1990). The identification, typing and fingerprinting of salmonellae: laboratory
aspects and epidemiological applications. J. Appl. Bacteriol., 68, 5–16.
40. VAN DER ZEE, H. & HUIS IN’T VELD J.H.J. (2000). Methods for the rapid detection of Salmonella. Salmonella in
Domestic Animals, Wray C. & Wray A., eds. CAB International, Wallingford, Oxon, UK. 373–391.
41. VAN ZIJDERVELD F.G., VAN ZIJDERVELD–VAN BEMMEL A.M. & ANAKOTTA J. (1992). Comparison of four different
enzyme–linked immunosorbent assays for serological diagnosis of Salmonella enteritidis infections in
experimentally infected chickens. J. Clin. Microbiol., 30, 2560–2566.
42. VOOGT N., RAES M., W ANNET W.J.B., HENKEN N.M. & VAN DE GIESSEN A.W. (2001). Comparison of selective
enrichment media for the detetection of Salmonella in poultry faeces. Lett. Appl. Microbiol., 32, 89–92.
43. WESTPHAL O. & LUDERITZ O. (1954). Chemische Erforschung von Lipopolysacchariden gramnegativer
Bakterien. Angew. Chem., 66, 407–417.
44. WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) (1994). Guidelines on Detection and Monitoring of Salmonella Infected
Poultry Flocks with Particular Reference to Salmonella enteritidis, Wray C. & Davies R.H., eds. WHO,
Geneva, Switzerland.
45. WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) REGIONAL OFFICE FOR EUROPE (2000). WHO Surveillance Programme
for Control of Foodborne Infections and Intoxications in Europe. Seventh Report on Surveillance of
Foodborne Disease in Europe 1993–1998. Institute for Health Protection of Consumers and Veterinary
Medicine BGVV. FAO/WHO Collaborating Centre for Training and Research in Food Hygiene and
Zoonoses, P.O. Box 33 00 13, 14191 Berlin, Germany.
46. WRAY C. & W RAY A., EDS (2000). Salmonella in Domestic Animals. CAB International, Wallingford, Oxon, UK.
47. www.aoac.org/testkits/testedmethods.html (Acceso: 15/11/03)
*
* *
NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para Salmonelosis (véase el Cuadro en la Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consúltese la página Web de la OIE para conseguir la relación más actualizada:
www.oie.int).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1107
CAPÍTULO 2.10.4.
SARNA
RESUMEN
La sarna es una forma de dermatitis ectoparasitaria desencadenada y mantenida por varias
especies de ácaros, y caracterizada por la formación de costras, alopecia y prurito de la piel. Los
ácaros y las garrapatas son una subclase de los Arachnida y están divididos en dos superórdenes,
los Parasitiformes (Mesostigmata) y los Acariformes. Los Acariformes contienen tres órdenes: los
Astigmata (Acaridida, no poseen estigmas), los Prostigmata (Actinedida, poseen estigmas detrás el
gnatosoma) y los Oribatida (Cryptostigmata). Todas las principales especies de los ácaros de la
sarna se encuentran contenidas dentro de los órdenes Astigmata y Prostigmata. El diagnóstico de
la sarna en animales domésticos se basa en las manifestaciones clínicas y la demostración de
ácaros o sus estadios de desarrollo en raspados de piel.
Identificación del agente: La sarna puede ser el resultado de la infestación por ácaros
astigmátidos, por ejemplo Chorioptes, Knemidokoptes, Notoedres, Otodectes, Psoroptes, y
Sarcoptes o los ácaros prostigmátidos, por ejemplo, Cheyletiella, Demodex o Psorobia. Todos los
ácaros de la sarna se clasifican por su estructura. Deben consultarse claves ilustradas
especializadas para identificar el organismo causante.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Actualmente no existen vacunas
comerciales disponibles.
A. INTRODUCCIÓN
La sarna es una forma de dermatitis ectoparasitaria desencadenada y mantenida por varias especies de ácaros,
y caracterizada por formación de costras, alopecia y prurito de la piel. Los ácaros y las garrapatas constituyen los
Acarina, una subclase de los Arachnida. Dentro de esta subclase los ácaros están a su vez divididos en dos
superórdenes: los Parasitiformes y los Acariformes. Los Acariformes contienen tres órdenes: los Astigmata
(acaridida, no poseen estigmas), los Prostigmata (actinedida, poseen estigmas detrás del gnatosoma) y los
Oribatida (cryptostigmata) (3). Todas las especies principales de los ácaros de la sarna están contenidas dentro
de los órdenes Astigmata y Prostigmata. Astigmata es un grupo bien definido de ácaros de movimiento lento y
débilmente esclerotizados, incluyendo las familias de importancia médica o veterinaria– Sarcoptidae y
Psoroptidae. Prostigmata es el orden de ácaros más heterogéneo, con adultos con tamaño oscilando desde
100 µm hasta 16 mm (21). Incluidos en los Prostigmata se encuentran los Trombiculidae (ácaros de la cosecha),
parásitos como larvas pero predadores de vida libre en los estados de ninfa o adulto, y las familias de ácaros
propiamente dichas, Psorergatidae (Psorobia [Psorergates] sp.), Demodicidae (Demodex sp.) y Cheyletiellidae
(Cheyletiella sp.) (3).
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
El diagnóstico de la sarna en animales domésticos se basa en las manifestaciones clínicas y la demostración de
ácaros o sus estadios de desarrollo en raspados de piel (19). Deben consultarse claves ilustradas especializadas
para identificar el organismo causante.
1.
Identificación del agente
La sarna puede ser el resultado de la infestación por ácaros astigmátidos, por ejemplo Chorioptes,
Knemidokoptes, Notoedres, Otodectes, Psoroptes, y Sarcoptes, o por los ácaros prostigmatidos, por ejemplo
Cheyletiella, Demodex y Psorobia.
1108
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.4. — Sarna
A) Astigmata
Los Astigmata son ácaros pequeños de piel fina, generalmente carentes de cubiertas protectoras evidentes. Las
bases de las coxas están hundidas en el cuerpo y se denominan epímeros cuando se encuentran fuera del
cuerpo y apodemas cuando se encuentran dentro del cuerpo. El empodio es parecido a una pinza y el pedicelo
es pedunculado o sésil. No se encuentran pinzas verdaderas. Los huevos fertilizados emergen a través de una
abertura antero–ventral, la abertura ovípara o genital. La mayoría de las especies con importancia médica o
veterinaria se encuentran en la división Psoroptidia, que agrupa a los Psoroptoidea (Sarcoptidae y Psoroptidae),
los Analgoidea (Knemidokoptidae, Cytoditidae y Laminosoptidae) y los Pyroglyphoidea (Pyroglyphidae). La
división Acaridae contiene los ácaros de los productos almacenados, que pueden causar sarna transitoria y ser
una fuente importante de alérgenos.
i)
Sarcoptidae
Los ácaros sarcóptidos (sarcoptiformes) son parásitos obligados, que anidan en la piel de los mamíferos.
Son ácaros globosos con la superficie ventral aplanada y la cutícula finamente estriada. Los quelíceros
están adaptados para cortar y pelar.
a)
Sarcoptes scabiei
El ácaro (Sarcoptes scabiei) es la causa de la sarna o prurito sarcóptico en humanos y un amplio rango de
mamíferos salvajes y domésticos (tanto carnívoros como herbívoros) en todo el mundo, afectando
generalmente a las partes del cuerpo escasamente pobladas de pelo. El número de especies dentro del
género esta aún sujeto a debate. Estudios de poblaciones de ácaros Sarcoptes en un amplio rango de
hospedadores han sugerido que solamente existe una especie tipo (Sarcoptes scabiei), con un número de
variantes que infestan un amplio rango de hospedadores mamíferos (14). Investigaciones recientes
basadas en el análisis molecular del gen ITS–2 del ARNr sugieren que el género Sarcoptes es
monoespecífico (37). Los humanos se infestan fácilmente, particularmente en condiciones de pobreza o
hacinamiento (35).
Sarcoptes puede ser identificado por su tamaño, y morfología. El contorno de los ácaros adultos es circular
y de aproximadamente 250 µm de longitud, aunque cuando se desarrollan los ovarios en la hembra, puede
incrementar su tamaño hasta 300 a 500 µm de longitud. La cutícula (tegumento) es estriada, soportando en
el dorso un parche central de púas erectas y estructuras similares a ganchos que disminuye su densidad de
manera posterolateral. Las patas se encuentran desarrolladas débilmente y en ambos sexos los pretarsos
de las patas I y II soportan pinzas empodiales, pero los aparatos de succión ambulacrales se encuentran
sobre pedicelios largos no segmentados (pedúnculos). Los epímeros (apodemas) del primer par de patas
están fundidos en forma de “Y”. Las patas III y IV de la hembra (identificable por la abertura transversal de
deposición de huevos [oviporo] en el medio de la superficie ventral) son cortas y terminan en ventosas
largas y carecen de pedicelio pedunculado. Se encuentran situadas en la superficie ventral y no son visibles
en perspectiva dorsal. Los machos son más pequeños y distinguibles por la presencia de un pedicelio
pedunculado en las patas IV, entre las cuales se encuentra un patente aparato genital esclerotizado. Las
ninfas son parecidas a la hembra, aunque más pequeñas y sin oviporo. Las larvas recuerdan a las ninfas,
pero tienen solamente tres pares de patas. Un ácaro similar, Trixacarus caviae, se encuentra en cobayas,
pero es más pequeño y el ano es dorsal. Las reacciones inmunes secundarias pueden producir una
erupción en sitios alejados del área infestada.
b)
Notoedres spp.
Notoedres también anida en la epidermis del hospedador y es similar a Sarcoptes, pero puede distinguirse
por la ausencia de espinas dorsales y por el ano dorsal. Se han descrito unas 20 especies de Notoedres de
las cuales el ácaro de la sarna del gato, Notoedres cati, presenta interés veterinario, produciendo una sarna
altamente contagiosa e intensamente pruriginosa en los gatos (y a veces en perros y conejos).
Normalmente las infestaciones comienzan en la cabeza del gato, a partir de donde pueden diseminarse.
Notoedres muris se encuentra en ratas y N. musculi en el ratón doméstico. Notoedres cati es similar a
S. scabiei al presentar en todos los estadios pedicelios largos no segmentados con ventosas terminales en
las patas I y II, y en la pata IV en el macho. Notoedres cati es considerablemente más pequeño, la hembra
es de 225 µm y el macho 150 µm. El ano se encuentra localizado sobre la superficie dorsal y no existen
espinas proyectadas, aunque las estrías rompen en un patrón parecido a escamas en posición dorsal media
y las ventosas macizas sustituyen a las ventosas cónicas de S. scabei similares a ganchos.
ii)
Analgoidea
Los Analgoidea incluyen 12 especias de los ácaros de la sarna Knemidokoptes (Knemidokoptidae), el ácaro
del saco aéreo de las aves de corral (Cytodites nudus: Cytoditidae) y los Laminosoptidae, representados
por Laminosoptes cysticola, que infesta el tejido celular subcutáneo de pavos y pollos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1109
Capítulo 2.10.4. — Sarna
a)
Knemidokoptes sp.
Tres especies de Knemidokoptes son importantes en veterinaria: K. mutans, que infesta la epidermis de las
patas de las aves de corral (causando la “pata descamada”), K. gallinae (Neoknemidokoptes gallinae,
Mesoknemidokoptes laevis gallinae), el “ácaro desplumante”, que infesta la piel de las aves de corral cerca
de la base de las plumas, y K. pilae que infesta los barrotes de la jaula y los pájaros (causando la “cara
escamosa”). Los Knemidokoptes hembra tienen 400 µm de largo, y las escamas dorsales, si están
presentes, son débiles e irregulares. Knemidokoptes gallinae (Mesoknemidokoptes) no tiene ninguna
escama (3). En la superficie dorsal media anterior están presentes dos bandas esclerotizadas, casi
paralelas, y conectadas en posición posterior por una banda transversal poco desarrollada. En el macho,
los epímeros (apodemas) del primer par de patas están unidos en forma de “Y”, y en la hembra, los
epímeros (apodemos) están unidos en forma de “U”. Todas las patas de los machos y las larvas tienen
almohadillas pedunculadas, pero se encuentran ausentes en el estado de ninfa y en las hembras. El ano
está situado en posición terminal. La hembra es vivípara y existen dos estados de ninfa y uno de larva.
iii) Psoroptidae
Los miembros de la familia Psoroptidae son ácaros ovales, parásitos de la piel de los mamíferos, que no
anidan dentro de la piel. La cutícula (tegumento) es estriada, las patas III y IV son habitualmente visibles
desde arriba, los epímeros (apodemas) de la pata I no están fusionados, y no existen ventosas verticales en
el prodosoma. El macho posee aparatos succionadores adanales prominentes que se acoplan con los
tubérculos copuladores de la tritoninfa hembra (“hembra pubescente”). El oviporo invertido con forma de U
sobresale en la región ventral de la hembra, y es posterior a la pata II. Tres géneros tienen importancia
veterinaria: Psoroptes, Chorioptes y Otodectes.
a)
Psoroptes spp.
Los Psoroptes spp. tienen patas fuertemente desarrolladas que portan, en todas las fases, ventosas con
forma de embudo sobre pedicelios largos trisegmentados. La hembra es de color blanco perla y tiene
750 µm de longitud. El macho tiene un par de lóbulos opistosomales y un par de aparatos copuladores. Los
ácaros Psoroptes causan una dermatitis debilitante que acarrea pérdida de lana/pelo y formación de una
costra con prurito. Se reconocen cinco especies de Psoroptes (33): Psoroptes ovis, un ácaro del cuerpo que
causa sarna en ovejas, ganado vacuno y caballos, P. equi, un ácaro del cuerpo de los équidos,
P. natalensis, un ácaro del cuerpo de ganado vacuno y caballos, P. cuniculi, el ácaro del oído de los
conejos, cabras, caballos y ovejas, y P. cervinus, un ácaro del oído del muflón de las Rocosas, alce y wapiti.
Una sexta especie no validada es P. auchinae, un ácaro del oído de los camélidos del Nuevo Mundo.
Psoroptes natalensis y P. equi se pueden distinguir morfológicamente por la longitud de la cuarta ventosa
opistosomal (L4OOS) del macho (33). En P. natalensis la ventosa es espatulada, igual que el L4OOS más
corto del macho de P. cervinus (22). Es difícil separar P. ovis y P. cuniculi por su morfología. Igual que en el
género Sarcoptes, el número de especies en el género Psoroptes esta sujeto a debate (25). P. ovis y
P. cuniculi pueden ser variantes de la misma especie (4).
b)
Chorioptes
Las patas de los ácaros Chorioptes poseen ambulacras amplias con forma de cuenco que nacen sobre
pedicelios muy cortos no segmentados, excepto sobre las patas III de la hembra, que finalizan en dos setas
largas. Los C. bovis hembras son más pequeños que Psoroptes, y tienen 400 µm de largo. El macho de C.
bovis tiene pedicelios en los cuatro pares de patas, un par de lóbulos opistosomales cuadrados a
rectangulares, y un par de ventosas copuladoras en posición anterior. Los lóbulos opistosomales portan dos
pelos espatulados (parecidos a palas), junto con tres ventosas normales de longitud variable. Las partes de
la boca son amplias y redondeadas, adaptadas para masticar. C. bovis infesta ganado vacuno, cabras,
caballos, ovejas, camélidos y conejos, y C. texanus ha sido encontrado en cabras, renos y ganado vacuno
(28, 32). Una tercera especie, C. panda, ha sido encontrada infestando el Panda Gigante (15). Los lóbulos
opistosomales de C. texanus tienen un perfil más triangular que C. bovis y la pareja de cerdas
opistosomales espatuladas son mucho más largas. C. texanus habita generalmente las partes bajas de la
pata en cabras, caballos y camellos, de la misma forma que C. bovis en las ovejas, aunque en el último
caso también puede encontrarse infestado el escroto, lo que ha sido relacionado con infertilidad en los
carneros. En el ganado vacuno la sarna corióptica se manifiesta comúnmente en la base de la cola, el
perineo y la parte trasera de la ubre. El ácaro se alimenta en la superficie externa de la piel causando
inflamación, exudación y formación de costra. Las infestaciones fuertes pueden ocasionar enfermedad, lo
que puede conducir a la emaciación y daño en las pieles (35).
c)
Otodectes
Los machos de Otodectes son similares a Chorioptes, aunque los lóbulos opistosomales son mucho menos
visibles, los aparatos copuladores se encuentran presentes y los pelos son menos espatulados. Los
epímeros que se extienden desde las bases de las patas I y II se encuentran unidos. El macho posee
ambulacras amplias con forma de cuenco que nacen sobre pedicelios muy cortos no segmentados en todas
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Capítulo 2.10.4. — Sarna
las patas, pero solamente las patas I y II de la hembra tienen pedicelios y ambulacros. Las patas III de la
hembra terminan en dos ventosas largas y las patas IV son cortas (3). Otodectes cynotis se encuentra en
los oídos (y ocasionalmente en otras partes del cuerpo), causando otitis parasitaria en perros domésticos,
gatos, zorros y hurones junto con un otros carnívoros silvestres (34). Otodectes cynotis se alimenta en la
superficie externa de la piel causando inflamación y exudación. Una exudación excesiva puede conducir a
eczema húmedo sobre las superficies de piel adyacentes. La membrana timpánica puede perforarse y se
puede desarrollar otitis media y signos nerviosos (por ejemplo convulsiones).
iv)
Ácaros astigmados de vida libre
Los ácaros astigmatidos de vida libre (“en el forraje”) pueden encontrarse en gran número en alimentos
almacenados, cereales, alimento de aves de corral, etc. Su ingestión puede conducir a trastornos
gastrointestinales. Los ácaros también pueden ser causa de sarna accidental en mamíferos a través del
contacto con el material antigénico presente en el alimento infestado o en el ambiente. Los trabajadores que
manejan alimento almacenado infestado pueden desarrollar reacciones frente a los ácaros y sufrir de
prurito, dermatitis, rinitis o asma (35). La causa de la respuesta no ha sido establecida pero se asume que
es alérgica o debida a mordeduras. La característica más obvia de los ácaros del forraje más comunes
(Acaridae) es la posesión de muchos “pelos”, los cuales son más largos que los de las formas parasitarias,
y pueden ser simples, ramificados o espatulados. A menudo en algunos géneros (por ejemplo Glycyphagus)
los pelos posteriores llegan a enredarse en los desechos. Acarus siro, probablemente el más común de
estos ácaros, tiene pelos más cortos.
B) Prostigmata
Los ácaros prostigmatidos se encuentran débilmente esclerotizados, y cuando existe un sistema respiratorio los
estigmas se abren sobre el gnatosoma o la parte anterior del propodosoma. Los palpos se encuentran
normalmente libres y altamente desarrollados, bien como cierres con forma de pinza u órganos sensoriales.
Normalmente los quelíceros están modificados para perforar (3, 35). Se encuentran incluidos en los Prostigmata
los Trombiculidae (ácaros de la cosecha o “chigger”), parásitos como larvas, aunque predadores de vida libre en
los estados de ninfa y adulto, y las familias de ácaros de la sarna propiamente dichas Psorergatidae (Psorobia
[Psoreregates] sp.), Demodicidae (Demodex sp.) y Cheyletiellidae (Cheyletiella sp.) (3).
i)
Psorobia (Psorergates) spp.
Se han aislado dos especies de Psorobia a partir de animales domésticos y una especie en animales de
laboratorio: P. bos, el “parásito benigno” de ganado vacuno, P. ovis, la especie más importante que se
encuentra en la oveja Merina, y Psorergates simplex (Psoreregates muricola) a partir de animales de
laboratorio (3). Las larvas de Psorobia salen del huevo con las patas cortas, y se vuelven progresivamente
más grandes en cada una de las tres mudas de la ninfa, mientras que durante el estado adulto las patas se
encuentran bien desarrolladas y los ácaros son móviles. Los adultos de ambos sexos son muy pequeños
(200 µm), y se pueden reconocer por las patas colocadas radialmente alrededor de un cuerpo más o menos
circular. Cada pata tiene sobre cada fémur una espina curvada hacia dentro. La mayoría de los ácaros se
encuentran bajo el extracto córneo y en las capas superficiales de la piel de los costados, flancos y muslos
del hospedador, alimentándose del líquido exudado. El área infestada se encuentra seca y sucia, las fibras
de lana se rompen fácilmente, y la lana restante se junta en forma de mechones rotos. La irritación provoca
que las ovejas se froten, golpeen el área afectada y mastiquen su lana, lo que resulta en el “trastorno de los
mechones” y la pérdida de valor de la lana.
ii)
Cheyletiella spp.
Los Cheyletiella (ácaros de la piel) son ácaros grandes (385 µm) con pinzas palpales grandes curvadas y
un peritremo respiratorio o estoma visible en las bases de los quelíceros con forma de “M”. Cheyletiella es
un parásito obligado, que habita en la capa de queratina de la epidermis. Los ácaros se desarrollan
rápidamente, dando lugar al término “caspa andante”. Tres especies tienen importancia veterinaria,
causando dermatitis benigna no supurativa en mamíferos y dermatitis transitoria en humanos:
C. parasitovorax se encuentra en gatos, la región escapular de los conejos, y ocasionalmente en humanos,
C. yasguri origina una infestación altamente infecciosa de los cachorros (con los perros adultos como
portadores), y C. blakei causa una dermatitis leve en gatos. Cheyletiella parasitovorax tiene un órgano
sensorial oval (con forma de pala) o seta (solenidio) sobre el pliegue de la primera pata, mientras que el de
C. yasguri está dividido apicalmente (con forma de corazón) (3).
iii) Demodex spp.
Los Demodex se reconocen fácilmente por su forma anular y vermiforme (“parecida a un gusano”), pero
pueden ser pasados por alto debido a su pequeño tamaño de 100–400 µm. Demodex habita en los folículos
capilares y las glándulas sebáceas y meibomianas de la piel de un gran número de mamíferos domésticos y
silvestres, incluidos los humanos. Los machos de Demodex viven cerca o en la superficie de la piel y las
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Capítulo 2.10.4. — Sarna
hembras en los folículos. Se encuentran distintas especies en diferentes hospedadores, y se puede
encontrar más de una especie en el mismo hospedador, por ejemplo D. folliculorum y D. brevis en humanos
(12). La sarna demodécica tiene gran importancia en perros (especialmente en razas de pelo corto), cabras
y cerdos, y es menos importante en ganado vacuno, caballos, ovejas y gatos. Normalmente no existe
irritación o estados patológicos, pero en algunos individuos la cantidad y propagación de los ácaros del
hospedador aumenta hasta convertirse en una demodicosis clínica. En el ganado se manifiesta como
nódulos planos en la piel con un aumento masivo de las glándulas sebáceas que contienen una gran
cantidad de ácaros de Demodex. Las infestaciones en los perros pueden hacerse generalizadas como una
forma escamosa, asociada con pérdida de pelo y engrosamiento de la piel. La demodecosis pustular es la
forma más grave en los perros y se encuentra complicada por infecciones bacterianas secundarias. El
diagnóstico de la demodicosis depende de la recuperación de ácaros a partir de raspados profundos de la
piel. Los ácaros se pueden identificar fácilmente como Demodex, aunque se necesitan claves
especializadas para la identificación de la especie (23).
2.
Diagnóstico de la escabiosis o sarna
El diagnóstico definitivo de la escabiosis o sarna debe basarse en la recuperación e identificación del ácaro a
partir de los hospedadores afectados. El examen visual de una lesión sospechosa de sarna puede revelar los
ácaros más grandes (por ejemplo Psoroptes), pero en la mayoría de los casos es necesario tomar raspados de
piel a partir del borde de las lesiones visibles. Se deben consultar claves especializadas para identificar el
organismo causante (3).
Un indicio de la presencia de ácaros de Psoroptes es la respuesta del hospedador al arañado o frotado de la piel
afectada por parte del operario, al responder mediante un reflejo de mordisco y/o rasguño contra si mismo. El
ejercicio forzado seguido de trote incrementará el calor corporal y la absorción percutánea asociada de antígenos
/irritantes del ácaro, provocando la manifestación de signos clínicos. Los raspados de piel se recogen a partir del
área afectada. Cuando se diagnostica escabiosis sarcóptica hay que recordar que la distribución de la erupción
no tiene relación con la distribución de los ácaros. La lana o el pelo deben ser esquilados (y almacenados para el
diagnóstico diferencial de otros ectoparásitos o micosis). El área seleccionada para raspar debe ser la parte
húmeda del borde de la lesión. Si se sospecha sarna sarcóptica, el raspado se debe tomar a partir del área sin
pelo o donde se observen prurito o granos. En la sarna psoróptica de las ovejas (costra de las ovejas) el área
seleccionada es el borde de la lesión en progresión, pero se pueden recoger raspados a partir de cualquier parte
de la lesión en infestaciones por Psoroptes en conejos o ganado vacuno. En general, para los ácaros que viven
en la superficie de la piel (por ejemplo Psoroptes o Chorioptes), los raspados deben ser recogidos con la hoja del
escalpelo situada en un ángulo agudo, afeitando más que raspando la epidermis externa. Demodex, Psorobia o
Sarcoptes se encuentran anidando dentro de la piel, y la hoja del escalpelo debe mantenerse en ángulo recto y
rasparse la piel hasta que rezume sangre. Una gota de glicerina o parafina líquida colocada sobre la piel o la hoja
del escalpelo antes de que la piel sea raspada ayudará en la recogida de ácaros (29). En la sarna pustular
demodécica los ácaros son generalmente abundantes y pueden ser evidenciados mediante el examen del
contenido cremoso de una pústula abierta o cortada. En el caso de lesiones escamosas, puede ser necesario un
raspado profundo. En casos de sarna del oído (“canker”) en gatos, perros o conejos el material costroso del
interior del oído externo se puede despegar con pinzas de extremos romos. Se ha visto que una técnica para
recoger ácaros mediante limpieza por vacío es útil y más sensible que el raspado de la piel (21). Estos autores
encontraron Cheyletiella, Sarcoptes, Psoroptes, Otodectes, Demodex y ácaros del forraje a partir de perros,
ovejas o cerdos infestados, empleando un tratamiento con KOH al 10% del material recogido por vacío antes del
examen microscópico. Ocasionalmente se puede hacer un diagnóstico de sarna cuando los ácaros se
encuentran en muestras fecales, pos ejemplo a partir de perros con prurito.
En casos sospechosos de otoacariosis (Otodectes o Psoroptes) en los oídos de gatos, perros, conejos, ovejas y
cabras, los ácaros vivos se pueden observar mediante examen auroscópico del canal auditivo externo (EAC),
aunque esta técnica puede ser difícil si se aplica a animales grandes o a gran número de animales. En esta
situación puede ser necesario taponar el canal auditivo externo. Se insertan bastoncillos de algodón de tamaño
adecuado dentro del EAC hasta que se encuentra resistencia, se giran entonces lentamente y se quitan. Se debe
tener cuidado de que los bastoncillos entren en el EAC y no en las sacos ciegos del tragus. También se debe
tener cuidado con los animales jóvenes.
Los raspados de piel o bastoncillos de algodón del oído deben ser transferidos inmediatamente a tubos
pequeños que se pueden tapar firmemente, o a botellas de plástico con tapadera. El envío de sobres sellados no
es recomendable ya que pueden secarse o perderse. Los Chorioptes, Otodectes, Psoroptes y Sarcoptes vivos se
pueden observar fácilmente durante el examen directo del raspado original de la piel o bastoncillo de algodón en
un microscopio de disección (40 x), con iluminación incidente. Los ácaros estarán activos después de la
incubación de la muestra a 37°C durante 30 minutos y se pueden transferir fácilmente a portas de microscopio
utilizando una aguja de montaje.
Los ácaros se pueden montar directamente en líquido de Berlese (goma cloral), líquido de Vitzmunis, medio de
Hoyer o el medio PVA modificado de Heinze (13). Se coloca una gota de medio en el centro del porta, se
1112
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Capítulo 2.10.4. — Sarna
transfiere el espécimen en su interior mediante un cepillo fino o una aguja entomológica, y se eliminan las
burbujas de aire con una aguja. Se coloca el cubreobjetos sobre el canto en un lado del medio, se dejar caer
lentamente empleando una aguja, y se presiona entonces ligeramente con la aguja. Si hay demasiado medio la
presión forzará la salida de alguna cantidad de medio. Si hay demasiado poco medio, se añaden pequeñas
gotas, una cada vez, dejándolas fluir bajo el cubreobjetos. Después de montar, se dejan secar los portas a
temperatura ambiente durante 5–7 días antes de rodearlos con esmalte de uñas u otro sellador insoluble. El
tiempo de secado puede disminuirse colocando los portas en un horno (40–45°C) durante al menos 2 días.
Para localizar ácaros vivos y muertos de especies más pequeñas (por ejemplo Demodex) el raspado deberá
procesarse con hidróxido potásico. Se pueden colocar grandes cantidades de material (hasta 5,0 g) en un tubo
de ensayo y cubrirse con hidróxido potásico al 10%. El tubo se coloca entonces en un recipiente con agua, el
cual se lleva gradualmente a ebullición durante 5–10 minutos. Un método igual de efectivo y más seguro es
calentar a 37°C durante un periodo de tiempo más largo. La digestión se deja enfriar y se centrifuga entonces a
600 g (2.000 rpm) durante 10 minutos. Se debería evitar un hervido prolongado ya que con el tiempo los ácaros
pueden desintegrarse. Puede ser necesaria una centrifugación más rápida para las especies más pequeñas. El
sobrenadante se decanta rápidamente y el sedimento se examina al microscopio. Se ha sugerido que un
procedimiento de flotación sobre el sedimento después de decantar el sobrenadante puede aumentar
enormemente la recuperación de ácaros. Alternativamente se puede colocar un pequeño número de
especimenes en ácido láctico sobre un porta excavado (dentado). El porta se pasa constantemente sobre un
Bunsen o un mechero de alcohol. Se debe tener cuidado de que el porta no se caliente demasiado, ya que los
gases expulsados del cuerpo de los ácaros pueden hacer que estos “salten”. Si aparece humo en la superficie
del fluido el proceso está siendo demasiado caliente. Estos métodos son necesarios para aclarar el contenido del
cuerpo con vistas a preparar los ácaros para el examen microscópico. Es aconsejable llevar a cabo estos
métodos en una campana con extractor debido a los humos cáusticos que se liberan. La tinción utilizando rosa
lignina o negro clorazol puede ayudar a resaltar estructuras o a identificar ácaros embebidos en el tejido del
hospedador (3).
Pueden aparecer problemas potenciales de zoonosis cuando se manejan animales infestados o material de
diagnóstico que contiene Cheyletiella, Sarcoptes, Notoedres o Trixacarus. Los restos cuticulares o las heces de
cualquier especie de ácaro pueden ser un riesgo para aquellos predispuestos a desarrollar alergia al ácaro del
polvo (Dermatophagoides pteronyssinus).
3.
Pruebas serológicas
En Suecia se utiliza un enzimoinmunoensayo (ELISA) para el diagnóstico serológico de la sarna sarcóptica en
perros y cerdos (1, 2, 8, 9), y se utiliza actualmente en campañas de erradicación de escabiosis porcina en
Suecia (18) y Suiza (20). Actualmente hay un kit ELISA disponible comercialmente para el serodiagnóstico de la
sarna sarcóptica en cerdos y perros (sarcoptes–ELISA 2001® PIG; DOG). Se han desarrollado
técnicas ELISA para controlar infestaciones por Psoroptes en ovejas, ganado vacuno y animales no
domesticados (10, 11, 16, 17, 22, 24, 36), pero ninguna se encuentra disponible comercialmente.
Sin embargo, las técnicas ELISA son de uso rutinario por los investigadores para la detección de anticuerpos
específicos frente a S. scabiei (1, 2).
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
No existen actualmente vacunas comerciales disponibles para proteger a los animales frente a los ácaros de la
sarna. Las vacunas de ácaros, a) reducirían la necesidad de acaricidas químicos, b) reducirían la polución
ambiental, c) producirían pocos residuos en carne/leche/lana, y d) reducirían el riesgo de resistencia. En ovejas
(5–7, 26, 30, 31) y ganado vacuno (27) se ha investigado el potencial del control inmunológico de Psoroptes ovis.
Todos estos estudios demostraron que, bajo condiciones experimentales, las fracciones solubles de P. ovis
redujeron significativamente la patología de la escabiosis de la oveja e inhibieron el incremento en la población
de P. ovis.
REFERENCIAS
1.
ARLIAN L.G., MORGAN M.S., RAPP C.M. & VYSZENSKI–MOHER D.L. (1996). The development of protective
immunity in canine scabies. Vet. Parasitol., 62, 133–142.
2.
ARLIAN L.G., MORGAN M.S., VYSZENSKI–MOHER D.L. & STEMMER B.L. (1994). Sarcoptes scabiei: The circulating
antibody response and induced immunity to scabies. Exp. Parasitol., 78, 37–50.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1113
Capítulo 2.10.4. — Sarna
3.
BAKER A.S. (1999). Mites and Ticks of Domestic Animals. An Identification Guide and Information Source.
The Natural History Museum, London. Her Majesty’s Stationery Office, UK.
4.
BATES P.G. (1999). Inter– and intra–specific variation within the genus Psoroptes (Acari: Psoroptidae). Vet.
Parasitol., 83, 201–217.
5.
BATES P.G. (2000). Differences between primary and secondary infestations with sheep scab. Vet. Rec.,
146, 528–529.
6.
BATES P.G. (2000). Sheep Scab Vaccines. A Practical Approach. Proceedings of the Sheep Veterinary
Society, 24, 127–134, SVS Secretariat, Moredun Research Institute, International Research Centre,
Pentlands Science Park, Bush Loan, Penicuik, Midlothian EH26 0PZ,UK.
7.
BATES P.G., SMITH W.D., PETTIT D., VAN DEN BROEK A., HUNTLEY J., GROVES B., RANKIN M. & TAYLOR M. (2000).
Attempts to immunise sheep against Psoroptes ovis (Sheep Scab). Res. Vet. Sci., 68, (Supplement A), 28.
8.
BORNSTEIN S. & ZAKRISSON G. (1993). Humoral antibody response to experimental Sarcoptes scabiei var
vulpes infection in the dog. Vet. Dermatol., 4, 107–110.
9.
BORNSTEIN S. & ZAKRISSON G. (1993). Clinical picture and antibody response in pigs infected by Sarcoptes
scabiei var suis. Vet. Dermatol., 4, 123–131.
10. BOYCE W.M., JESSUP D.A. & CLARK R.K. (1991). Serodiagnostic antibody responses to Psoroptes spp.
Infestations in bighorn sheep. J. Wildl. Dis., 27, 10–15.
11. BOYCE W.M., MAZET J.A.K., MELLIES J., GARDNER I., CLARK R.K. & JESSUP D.A. (1991). Kinetic ELISA for the
detection of antibodies to Psoroptes sp. (Acari. Psoroptidae) in bighorn sheep (Ovis canadensis). J.
Parasitol., 27, 692–696.
12. DESCH C.E. & NUTTING W.B. (1972). Demodex folliculorum (Simon) and D. brevis Akbulatova of man.
redescription and reevaluation. J. Parasitol., 58, 169–177.
13. EVANS G.O. (1992). Principles of Acarology. CAB International, Wallingford, Oxon OX10 8DE, UK.
14. FAIN A. (1968). Etude de la variabilite de Sarcoptes scabiei avec une revision des Sarcoptidae. Acta Zool.
Pathol. Antverp., 47, 1–196.
15. FAIN A. & LECLERC M (1975). Sur un cas de gale chez le Panda Geant produit par une nouvelle espece du
genre Chorioptes (Acarina: Psoroptidae). Acarologia, 17, 177–182.
16. FISHER W.F. (1983). Development of serum antibody activity as determined by Enzyme linked
Immunosorbent assay in Psoroptes ovis (Acarina: Psoroptidae) antigens in cattle infested with P. ovis. Vet.
Parasitol., 13, 1218–1219.
17. FISHER W.R., GUILLOT F.S. & COLE N.A. (1986). Development and decline of serum antibody activity to
Psoroptes ovis antigens and infested cattle in an endemic and non–endemic scabies area of Texas. Exp.
Appl. Acarol., 2, 239–248.
18. JACOBSON M., BORNSTEIN S. & WALLGREN P. (1999). The efficacy of simplified eradication strategies against
sarcoptic mange mite infections in swine herds monitored by an ELISA. Vet. Parasitol., 81, 249–258.
19. KETTLE D.S. (1995). Medical and Veterinary Entomology, Second Edition. CAB International, Wallingford,
Oxon OX10 8DE, UK.
20. KIRCHER P. & ZIMMERMANN W. (1999). Serologische Bestandesuntersuchung und Sanierungsuberwachung
der Sarcoptes scabiei var suis Infektion: eine seroepidemiologische Studie in raudefreien und chronisch
infizierten Betrieben. Schweiz. Arch. Tierheil., 144, 567–573.
21. KLAYMAN E. & SCHILLHORN VAN VEEN T.W. (1981). Diagnosis of Ectoparasitism. Mod. Vet. Pract., 62, 767–
771.
22. LONNEUX J.F., NGUYEN T.Q., DELHEZ M. & LOSSON B.J. (1997). Antibody response after treatment in cattle
affected with Psoroptes ovis. Res. Vet. Sci., 63, 57–60.
1114
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.4. — Sarna
23. NUTTING W.B. (1967). Hair follicle mites (Demodex spp.) of medical and veterinary concern. Cornell Vet., 66,
214–231.
24. OCHS H., LONNEUX J.F., LOSSON B.J. & DEPLAZES P. (2001). Diagnosis of psoroptic sheep scab with an
improved enzyme–linked immunosorbent assy. Vet. Parasitol., 96, 233–242.
25. OCHS H., MATHIS A. & DEPLAZES P. (1999). Single nucleotide variation in rRNA ITS–2 differentiates Psoroptes
isolates from sheep and rabbits from the same geographical area. Parasitology, 119, 419–424.
26. PETTIT D., SMITH W.D., RICHARDSON J. & MUNN E.A (2000). Localisation and characterisation of ovine
immunoglobulin within the scab mite, Psoroptes ovis. Vet. Parasitol., 898, 231–239.
27. PRUETT J.H., TEMEYER K.B., FISHER W.F., BEETHAM P.K. & KUNZ S.E. (1998). Evaluation of natural Psoroptes
ovis (Acarina: Psoroptidae) soluble proteins as candidate vaccine immunogens. J. Med. Entomol., 35, 861–
871.
28. ROSEN S., YERUHAM I. & HADANI A. (1989). Chorioptes texanus (Hirst 1924), Psoroptidae on cattle in Israel.
Acarologia, 30, 373–376.
29. SMITH E.K. (1988). How to detect common skin mites through skin scrapings. Vet. Med., 165–170.
30. SMITH, W.D., BATES, P., PETTIT, D.M., BROEK, A. VAN DEN., TAYLOR, M.A (2002). Attempts to immunize sheep
against the scab mite, Psoroptes ovis. Parasite Immunol., 24, 303–310.
31. STELLA M., BRAUN M. & NUNEZ J.L. (1997). Effect of pre–immunisation with Psoroptes ovis extracts on
experimental mange. Abstracts of the 16th International Conference of the World Association for the
Advancement of Veterinary Parasitology, 10–15 August 1997, Sun City, Republic of South Africa.
32. SWEATMAN G.K. (1957). Life history, non–specificity and revision of the genus Chorioptes, a parasitic mite of
herbivores. Can. J. Zool., 35, 641–689.
33. SWEATMAN G.K. (1958). On the life history and validity of the species in Psoroptes, a genus of mange mites.
Can. J. Zool., 36, 905–929.
34. SWEATMAN G.K. (1958). The biology of Otodectes cynotis, the ear canker mite of carnivores. Can. J. Zool.,
36, 849–862.
35. WALKER A. (1994). Arthropods of Humans and Domestic Animals. A Guide to Preliminary Identification.
Chapman and Hall, London, UK.
36. WASSALL D.A., KIRKWOOD A.C., BATES P.G. & SINCLAIR I.J. (1978). Enzyme linked immunosorbent assay for
the detection of antibodies to the sheep scab mite Psoroptes ovis. Res. Vet. Sci., 43, 34–35.
37. ZAHLER M., ESSIG A., GOTHE H. & RINDER H. (1999). Molecular analyses suggests monospecificity of the
genus Sarcoptes (Acari: Sarcoptidae). Int. J. Parasitol., 29, 759–766.
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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CAPÍTULO 2.10.5.
ENFERMEDAD DE LA FRONTERA
RESUMEN
La enfermedad de la frontera (EF) es una enfermedad vírica de las ovejas descrita por primera vez
en 1959 en la región fronteriza entre Inglaterra y Gales. El virus se distribuye por todo el mundo.
Las tasas de prevalencia varían en las ovejas del 5 al 50% entre países y de región en región
dentro de cada uno de ellos. Entre los signos destacan la esterilidad de las ovejas, la aparición de
abortos y nacidos muertos y el nacimiento de corderos débiles de menor tamaño. Los corderos
afectados pueden mostrar temblores musculares, deficiente desarrollo corporal y vellones
anormalmente peludos (a los corderos se les llama “temblorosos peludos” o “de lana rizada”) y a la
enfermedad se le ha denominado “enfermedad de los corderos temblorosos peludos”. La
transmisión vertical juega un papel importante en la epidemiología de la enfermedad. La infección
de los fetos puede provocar el nacimiento de corderos con infección persistente (IP). Estos
corderos IP son virémicos, anticuerpo-negativos y excretan los virus de manera constante. El virus
se propaga de oveja a oveja, y los animales PI son la fuente más potente de infección. Las ovejas
también se pueden infectar después de un contacto próximo con vacas que excreten el virus
estrechamente relacionado de la diarrea vírica bovina (BVDV).
Es importante identificar los animales PI virémicos para que no sean utilizados con fines
comerciales o de crianza. Las pruebas serológicas resultan insuficientes. Generalmente se
considera que las ovejas no virémicas, sero-positivas son “seguras”, ya que no se conoce que se
produzcan infecciones latentes en los animales recuperados.
Identificación del agente: El virus de la EF (BDV) es un Pestivirus de la familia Flaviviridae y está
estrechamente relacionado con el virus de la fiebre porcina clásica y el BVDV. Muy pocos aislados
del BDV son citopatogénicos en cultivo celular. No existen serotipos definidos pero los aislados
víricos exhiben una considerable diversidad antigénica, y se han identificado tres grupos
antigénicos distintos.
Aparentemente las ovejas IP sanas son el resultado de una infección congénita que se puede
identificar mediante el aislamiento y la inmunotinción del virus no citopatogénico a partir de sangre
o sueros en cultivos celulares de laboratorio. Entre los métodos directos de identificación rápida de
las ovejas IP se encuentran la detección del antígeno vírico o del ARN vírico en leucocitos y la
detección inmunohistoquímica del antígeno vírico en biopsias cutáneas. La detección del virus es
menos fiable en corderos menores de dos meses que han recibido anticuerpos calostrales.
Habitualmente la infección aguda es subclínica y la viremia es transitoria y difícil de detectar. Es
difícil aislar el virus a partir de tejidos de corderos abortados o nacidos muertos, pero los tejidos de
ovejas IP contienen niveles elevados del virus, lo que se puede detectar fácilmente mediante el
aislamiento y varios métodos directos.
Pruebas serológicas: Es preferible confirmar la infección aguda por el BDV demostrando la
seroconversión con muestras pareadas o secuenciales procedentes de varios animales del grupo.
Los métodos de detección de anticuerpos que se utilizan más habitualmente son el
enzimoinmunoensayo y la prueba de neutralización vírica.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No existe una vacuna estándar
para el BDV, pero se ha preparado una vacuna comercial con el virus entero muerto. Lo ideal sería
que dicha vacuna fuese adecuada para su administración a hembras antes de la crianza para
prevenir la infección transplacentaria. Se ha recomendado el uso de las vacunas del BVDV, pero
se debe tener en cuenta la diversidad antigénica de los virus de la EF.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera
Los virus de la EF han contaminado diversas vacunas vivas modificadas de uso veterinario
producidas en células de oveja o que contienen suero de oveja. Los fabricantes de los materiales
biológicos deberían considerar este riesgo potencial.
A. INTRODUCCIÓN
El virus de la enfermedad de la frontera (BDV) es un Pestivirus de la familia Flaviviridae y está estrechamente
relacionado con el virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) y el virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) (21).
Aunque se han propuesto seis especies de Pestivirus, existen cuatro especies reconocidas, a saber: CSFV,
BVDV tipo 1 y 2 y BDV (1). Mientras que los CSFV se restringen principalmente a cerdos, se han recuperado a
partir de ovejas ejemplos de cualquiera de las otras tres especies, siendo los aislados mayoritarios virus de la EF
(27). Casi todos los aislados víricos del BDV son no citopatogénicos, aunque se han aislado virus citopáticos
ocasionales (23). El BDV se propaga de forma natural entre las ovejas a través de la vía oro-nasal y por
transmisión vertical. Principalmente en ovejas y cabras es causa de enfermedad congénita, pero también puede
provocar infecciones agudas y persistentes. Las ovejas se pueden infectar a partir de las vacas (6). Asimismo,
los cerdos pueden resultar infectados y los anticuerpos frente al BDV en cerdos pueden interferir en las pruebas
de diagnóstico de la enfermedad debida al CSFV (15). Este capitulo describe la infección por el BDV en ovejas.
a)
Infecciones agudas
Las ovejas adultas y recién nacidas sanas expuestas al BDV tan sólo experimentan una enfermedad leve o
inapreciable. Aparece una fiebre ligera y una leucopenia leve que se asocian con una viremia de vida corta
que se detecta entre los días 4 y 11 posteriores a la infección, después de la cual aparecen anticuerpos
neutralizantes del virus en el suero (19).
En las pruebas serológicas se diagnostican mejor las infecciones agudas empleando sueros pareados
procedentes de un número significativo de ovejas. Se ha demostrado que algunos aislados del BDV
ocasionales provocan fiebre elevada, leucopenia profunda y prolongada, anorexia, conjuntivitis, descarga
nasal, disnea y diarrea y el 50% de mortalidad en los corderos jóvenes. Uno de estos aislados se recuperó
a partir de una epidemia severa de la EF que afectó a ovejas lecheras en 1984 (7). Un segundo de tales
aislados fue un BDV contaminante de una vacuna viva del CSFV (29).
b)
Infección fetal
Los principales signos clínicos de la EF se observan después de la infección de ovejas gestantes. Mientras
que la infección materna inicial es leve y subclínica, las consecuencias en el feto son graves. Puede
provocar la muerte del feto en cualquier etapa de gestación, pero es más común en los fetos infectados
durante la etapa temprana. Es posible que se produzca la reabsorción de los fetos pequeños muertos o que
pueda pasar desapercibido su aborto ya que las ovejas continúan alimentándose de forma correcta y no
muestran signos de malestar. Cuando se aproxima el momento de los partos, se observará el aborto de
fetos mayores, nacidos muertos y el nacimiento prematuro de corderos pequeños y débiles.
Frecuentemente, es difícil establecer la confirmación de que un aborto o un nacido muerto se deben al
BDV, pero en algunos casos es posible aislar el virus a partir de los tejidos fetales. En los fetos abortados,
también se puede detectar el virus mediante inmunohistoquímica del cerebro, tiroides y otros tejidos (20).
Se debería comprobar la presencia de anticuerpos dirigidos contra el BDV en muestras de fluidos fetales o
de suero.
Durante el tiempo de los partos, aparecerá una cantidad excesiva de ovejas estériles, pero son los corderos
vivos enfermos los que presentan los rasgos clínicos principales y característicos de la EF. Son muy
variados los signos clínicos que exhiben los corderos con la EF y dependen de la raza de oveja, la
virulencia del virus y el momento en el que se produce la infección en el rebaño. Habitualmente, los
corderos afectados son pequeños y débiles, y muchos son incapaces de permanecer incorporados. Con
frecuencia aparecen signos nerviosos y cambios de vellón. Los signos nerviosos de la EF son los rasgos
más característicos. Los temblores pueden variar desde contracciones rítmicas violentas de los músculos
de las patas traseras y de la espalda, a un fino temblor apenas indetectable de la cabeza, orejas y rabo. Las
anormalidades del vellón son más obvias en las razas de lana suave, que desarrollan vellones peludos,
especialmente en el cuello y la espalda. En los corderos afectados por la EF también se puede observar
una pigmentación anormal negra o marrón del vellón. Se debe analizar la presencia del BDV y/o de
anticuerpos dirigidos contra él en muestras de sangre que se deberían recoger en anticoagulante
procedentes de corderos sospechosos antes de que reciban el calostro. Una vez que lo han ingerido, es
difícil detectar el virus hasta que tienen 2 meses y han descendido los niveles de anticuerpos maternos. Sin
embargo, durante este periodo de tiempo, es posible detectar el antígeno vírico en biopsias cutáneas,
mediante inmunohistoquímica y en los leucocitos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera
Es posible criar algunos corderos con la EF con tratamiento médico, aunque pueden tener lugar muertes en
cualquier momento. Los signos nerviosos se reducen de forma gradual y pueden haber desaparecido a los
3–6 meses de vida. En los momentos de estrés puede reaparecer un andar tambaleante con debilidad y
oscilación de los cuartos traseros junto con un temblor ligero de la cabeza. Frecuentemente los corderos
afectados crecen con lentitud y en condiciones normales de campo, muchos morirán antes o durante el
tiempo del destete. En los casos en los que las pérdidas han sido bajas y no han nacido corderos con
signos evidentes de la EF, éste puede ser el primer signo que presenten de la enfermedad.
Algunas infecciones fetales que se producen en la etapa media de la gestación pueden provocar signos
nerviosos graves en los corderos, problemas locomotores y esqueletos anormales. Estos corderos
presentan lesiones de hipoplasia cerebelar y displasia, hidronencefalia y porencefalia (NOTA DEL
TRADUCTOR: he buscado el significado de porencefalia en diccionarios medicos ingleses y españoles y no
aparece) como resultado de una inflamación necrotizante. Las lesiones destructivas graves parecen estar
mediadas por anticuerpos, y con frecuencia los corderos con tales lesiones presentan concentraciones
elevadas de anticuerpos en el suero dirigidos contra el BDV. La mayoría de los corderos infectados en la
etapa final de gestación son normales y están sanos y nacen libres del virus pero presentan anticuerpos
frente al BDV. Algunos de estos corderos pueden estar débiles y es posible que mueran tempranamente
(2).
c)
Viremia persistente
Cuando los fetos sufren una infección que se produce antes del inicio de la inmunocompetencia, nacen con
una viremia persistente. El feto ovino puede responder por primera vez a un estímulo antigénico
aproximadamente entre los días 60 y 85 de su periodo de gestación de 150 días. En los fetos afectados
antes del inicio de la inmunocompetencia, se produce una replicación vírica incontrolada y es común la
muerte del 50% de los fetos. En los corderos que sobreviven a la infección producida en la etapa temprana
de gestación, el virus se propaga a todos los órganos. Estos corderos parecen ser tolerantes al virus y
presentan una infección persistente, normalmente de por vida. Una muestra de sangre precalostral será
virus-positiva y anticuerpo-negativa. Típicamente, no existe reacción inflamatoria y los cambios patológicos
más característicos se aprecian en el sistema nervioso central (CNS) y en la piel. Existe una deficiencia de
mielína en todo el CNS lo que provoca los signos nerviosos. En la piel, los folículos primarios de lana
aumentan de tamaño y decrece el número de folículos secundarios de lana, lo que causa el vellón peludo o
hirsuto.
Las ovejas con viremia persistente se pueden diagnosticar mediante el aislamiento/detección del virus en
muestras de sangre. La viremia es detectable fácilmente en cualquier momento excepto durante los
primeros 2 meses de vida, cuando el virus está enmascarado por los anticuerpos calostrales (sin embargo,
durante este periodo el virus se puede identificar en leucocitos lavados), y en animales mayores de 4 años,
algunos de los cuales desarrollan niveles reducidos de anticuerpos anti-BDV (13). Aunque resulta difícil la
detección vírica en la sangre durante una infección aguda, se debería confirmar la viremia persistente
volviendo a realizar pruebas a los animales después de un intervalo de al menos 3 semanas.
Algunas ovejas virémicas sobreviven a la madurez sexual y se utilizan para la crianza. Los corderos nacidos
de estas hembras progenitoras infectadas son siempre virémicos persistentes. Las ovejas virémicas
persistentes constituyen una fuente continua de virus infecciosos para otros animales y su identificación es
un factor primordial en cualquier programa de control. Las ovejas que van a ser comercializadas deben ser
examinadas para garantizar la ausencia de viremia del BDV.
Habitualmente, los carneros infectados de manera persistente (PI) tienen un semen de baja calidad
altamente infectivo y presentan una fertilidad reducida. Todos los carneros utilizados para la crianza
deberían ser examinados para descartar una infección persistente del BDV en muestras de sangre.
También se pueden examinan las muestras de semen, pero el aislamiento vírico es mucho menos
satisfactorio que el obtenido a partir de sangre debido a la toxicidad del semen para los cultivos
celulares. Puede ser justificable la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa de trascripción
inversa (RT-PCR) para detectar el ácido nucleico del pestivirus en el semen procedente de algunos
carneros.
d)
Inicio tardío de la enfermedad en ovejas con viremia persistente
Algunas ovejas IP alojadas separadamente de otros animales desarrollan de forma espontánea descargas
nasales y oculares excesivas, debilitantes e incurables, a veces con dificultad respiratoria. En la necropsia
estas ovejas tienen un serio engrosamiento del íleo distal, ciego y colon resultado de una enteropatía
hiperplástica focal. El BDV citopático se puede recuperar a partir del intestino de estos corderos. Al no
existir una fuente externa obvia del virus citopático, lo más probable es que tales virus se originen a partir
de los virus propios del cordero. Otras ovejas IP del grupo no desarrollan la enfermedad. Este síndrome,
que también se ha reconocido en brotes de campo ocasionales de la EF, presenta varias similitudes con la
enfermedad mucosal bovina (13).
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)
No existe un laboratorio de referencia de la OIE designado para el BDV, pero los laboratorios de referencia para
el BVDV o para el CSFV podrán aconsejar de forma adecuada (véase Cuadro de la Parte 3 de este Manual
sobre animales terrestres). Uno de los métodos que se ha comprobado que es más sensible para identificar el
BDV sigue siendo el aislamiento vírico. También son métodos adecuados para identificar animales infectados por
el BDV las técnicas de inmunofluorescencia directa u otras inmunohistoquímicas que emplean secciones
congeladas de tejidos así como la RT-PCR y el enzimoinmunoensayo (ELISA) para detectar el antígeno.
a)
Aislamiento vírico
Es esencial que los laboratorios que realicen el aislamiento del virus tengan un suministro garantizado de
células susceptibles y suero bovino fetal (FBS), o equivalente, libres de pestivirus, que no contengan
actividad anti-pestivirus ni contaminación vírica. Es importante que se siga un programa que garantice la
calidad del laboratorio.
Se puede aislar el virus en distintos cultivos celulares primarios o secundarios (p.ej. riñón, testículo,
pulmón). Son raras las líneas celulares ovinas para la replicación del BDV. Pueden ser útiles las líneas
celulares semicontinuas derivadas de músculo de cordero fetal (FLM), embriones completos (19) o plexo
coroideo de oveja, pero las diferentes líneas varían de manera considerable en su susceptibilidad frente al
virus. Se han utilizado con éxito células ovinas para el aislamiento y replicación de los virus de la EF y del
BVDV de los tipos 1 y 2 a partir de ovejas. En las regiones en las que las ovejas pueden infectarse con los
BVDVs a partir de vacas, lo más adecuado sería utilizar un sistema de aislamiento vírico con células tanto
ovinas como bovinas. Se pueden sugerir diversos cultivos celulares bovinos, entre los cuales están las
células de cornete nasal, traqueales embrionarias o testiculares, o bien una línea celular continua
susceptible de riñón. Sin embargo, las células bovinas son insensibles para el aislamiento primario y la
multiplicación de algunos virus de la EF, por lo que se desaconseja la dependencia exclusiva de células
bovinas.
A partir de los animales vivos, se puede analizar el suero para detectar la presencia del virus infeccioso,
pero la forma más sensible para confirmar una viremia de pestivirus consiste en lavar leucocitos
repetidamente (al menos tres veces) con el medio de cultivo antes de co-cultivarlos con las células
susceptibles durante 5–7 días. Las células se congelan y descongelan una vez y se pasa una alícuota a
células susceptibles posteriores crecidas en un cubreobjetos. Las células se tiñen, tres días más tarde, para
detectar la presencia de pestivirus utilizando una prueba de inmunofluorescencia o de inmunoperoxidasa.
Se deberían recoger los tejidos a partir de los animales muertos en un medio de transporte vírico
(10% [w/v]). En el laboratorio, los tejidos se trituran, se centrifugan para eliminar los residuos y el
sobrenadante se pasa a través de filtros de 0,45 µm. Las lesiones de bazo, tiroides, timo, riñón, cerebro,
ganglios linfáticos e intestino son las mejores para el aislamiento vírico.
Se puede examinar el semen para determinar la presencia del BDV, pero el semen sin tratar es fuertemente
citotóxico y se debe diluir, normalmente se diluye 1/10 como mínimo en el medio de cultivo. Como la
principal fuente de semen infectado por el BDV procede de carneros IP, para identificar estos animales es
más fiable la sangre que el semen como muestra clínica. Existen muchas variaciones en los procedimientos
de aislamiento vírico. Se deberían optimizar todos ellos para alcanzar la máxima sensibilidad utilizando una
preparación vírica estándar de referencia y, cuando sea posible, aislados recientes de campo del BDV. A
continuación se describe un procedimiento práctico para el aislamiento en tubo:
i)
Los cultivos de los tubos de ensayo con monocapas subconfluentes o casi confluentes de células
ovinas susceptibles se lavan al menos dos veces con solución salina balanceada de Hanks para
eliminar el medio de cultivo antes de inocularlos con 0,2 ml de muestra y conseguir la adsorción
durante 2 horas a 37°C.
ii)
Se lavan los cultivos con 2 ml de medio. Se elimina y se añade 1 ml de medio de cultivo de
mantenimiento.
iii)
Los cultivos se incuban durante 5–7 días a 37°C. Se examinan al microscopio diariamente y se
registra la evidencia de efecto citopático (ECP).
iv)
Los tubos se congelan a –70°C, y posteriormente se descongelan, como antes y se pasan a cultivos
frescos en tubo que contengan células creciendo sobre cubreobjetos.
v)
Se sacan los cubreobjetos 3–4 días más tarde, se fijan con acetona fría durante 15 minutos y se tiñen
empleando un método de inmunofluorescencia directa o indirecta. Los controles esenciales deben
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera
incluir células negativas conocidas y células creciendo con cepas estándares citopáticas y no
citopáticas del BDV.
vi)
Los cubreobjetos se examinan con un microscopio UV para detectar fluorescencia citoplásmica difusa
que es característica de los pestivirus.
Alternativamente se pueden añadir cultivos congelados y descongelados a células que crezcan sobre
portas compartimentalizados y teñirlos mediante una prueba de inmunofluorescencia directa como se ha
indicado más arriba. Así mismo, se puede utilizar una tinción de inmunoperoxidasa sobre cubreobjetos o
portas compartimentalizados así como placas de microtitulación (véase el método de la prueba de
neutralización vírica [NV] más abajo). También se pueden ensayar cultivos congelados y descongelados
mediante un sistema ELISA para la detección antigénica.
b)
Immunohistoquímica
Es posible la detección de la presencia del antígeno vírico en la mayoría de los tejidos de los animales IP
(4, 20). Esto se debería realizar con secciones de tejido congeladas y fijadas con acetona (secciones
criostáticas) empleando los anticuerpos apropiados. Los tejidos con una cantidad elevada de antígeno vírico
son el cerebro, la glándula tiroides y la mucosa oral. Se ha demostrado que las biopsias cutáneas son útiles
para el diagnóstico in vivo de la infección persistente del BDV
c)
Enzimoinmunoensayo para la detección antigénica
El primer ELISA para la detección antigénica de pestivirus se describió con el fin de detectar ovejas
virémicas. En la actualidad se ha convertido en un ELISA de captura con sistema doble de anticuerpos
monoclonales (MAbs) para utilizarlo en ovejas y vacas. Se unen dos MAbs de captura a los pocillos de las
placas de microtitulación, y otros dos MAbs, conjugados con peroxidasa, sirven para detectar los primeros
MAbs (9). Esta prueba es la más empleada para identificar ovejas virémicas IP utilizando leucocitos
sanguíneos lisados con detergente y lavados. La sensibilidad es parecida a la obtenida mediante el
aislamiento vírico y es un método práctico para la detección del virus en un gran número de muestras de
sangre. Como en el aislamiento vírico, los niveles elevados de anticuerpos calostrales pueden enmascarar
una viremia persistente. El ELISA es más efectivo que el aislamiento vírico en presencia de anticuerpos,
pero puede dar resultados falsos negativos en corderos virémicos menores de 2 meses de edad.
Habitualmente el ELISA no es suficientemente sensible para detectar infecciones agudas del BDV en
muestras de sangre. Al igual que para la prueba con leucocitos, también se puede emplear el ELISA para
detectar el antígeno en suspensiones de tejidos, especialmente de bazo, procedentes de ovejas
sospechosas IP, como una alternativa a los métodos de inmunofluorescencia y de inmunoperoxidasa, en
cultivos celulares. Se han publicado diversos métodos ELISA para pestivirus y en la actualidad se dispone
de kits comerciales para detectar el BDV. La validación de estos kits está en proceso.
d)
Métodos de reconocimiento de los ácidos nucleicos
Se han determinado las secuencias genómicas completas de dos virus de la EF y se han comparado con
las de otros pestivirus (3, 17). El análisis filogenético demuestra que los virus de la EF están más
estrechamente relacionados con el CSFV que con el BVDV (1, 22, 27). En la actualidad se utiliza
ampliamente la RT-PCR para el diagnóstico de la infección por pestivirus. Un protocolo básico de una RTPCR mixta comprende las etapas siguientes:
i)
El ARN total se aísla mediante fenol-cloroformo, TRIZOL, isotiocianato de guanidina (GITC), o un
método de paso por columna y centrifugación.
ii)
El ADNc se sintetiza mediante cebadores antisentido o hexámeros aleatorios.
iii)
Empleando cebadores pan-pestivirus a partir de la región no codificadora 5´ la PCR mixta utiliza
aproximadamente 25 ciclos en la primera amplificación y 30–35 en la segunda.
iv)
Se utiliza el sistema TaqMan o cualquier otro sistema de sondeo para identificar el producto del
pestivirus.
La elección de cebadores es fundamental. Los cebadores pan-pestivirus son adecuados para detectar y
tipificar todas las especies de Pestivirus (18, 26). También se han descrito cebadores específicos para un
reconocimiento rápido de los virus de la EF (11, 28). Utilizando un único tubo cerrado en la RT-PCR con
sondas fluorescentes se reduce la potencial contaminación cruzada de las muestras de diagnóstico (12).
Algunas aplicaciones importantes son la detección de ARN vírico en tejidos fetales y en constituyentes de
cultivos celulares o en vacunas (25); la validación de la RT-PCR se encuentra en proceso. También se
observa que es válida para detectar el virus cuando están presentes los anticuerpos específicos del BDV.
Las precauciones que se deben tomar con la RT-PCR están contempladas en el Capítulo I.1.4. Validación y
Control de Calidad de los Métodos de la Reacción en Cadena de la Polimerasa utilizados para el
Diagnóstico de las Enfermedades Infecciosas.
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Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera
2.
Pruebas serológicas
Normalmente, los anticuerpos dirigidos contra el BDV se detectan en los sueros de oveja utilizando las pruebas
de neutralización vírica (NV) o ELISA. También se puede emplear la prueba de inmunodifusión en gel de agar
(IGDA) que es menos sensible. En cada prueba se deben incluir sueros de referencia control positivo y negativo.
Para ser considerados válidos, éstos deberían dar resultados dentro de los límites predeterminados para la
prueba. Se pueden probar sueros individuales para determinar la prevalencia del BDV en un rebaño, región o
país. Sin embargo, para el diagnóstico, los sueros de la etapa aguda y convaleciente son las muestras más
adecuadas para confirmar una infección aguda por el BDV. Siempre se deberían probar las muestras repetidas
de suero procedente de cada animal, una junto a la otra en la misma placa.
a)
Prueba de neutralización vírica
Para la prueba de NV se puede utilizar una cepa citopática estándar del BDV (p.ej. la cepa Moredun) con
células semicontinuas como las de FLM). Más abajo se indica un protocolo resumido.
i)
Los sueros control y problema se inactivan por calor durante 30 minutos a 56°C.
ii)
Partiendo de una dilución 1/4 del suero, se preparan diluciones seriadas al doble de los sueros
problema en el medio de crecimiento del cultivo celular en una placa de microtitulación de 96 pocillos
de fondo plano para cultivos celulares. Para cada muestra se utilizan dos o cuatro pocillos de cada
dilución dependiendo de la precisión requerida. El rango de diluciones también puede variar. Es
habitual ensayar los sueros inicialmente a la dilución 1/4 y titular los sueros positivos. Para titular los
sueros se necesita un mínimo de cuatro pocillos. El volumen estándar de trabajo es 25 µl: a cada
pocillo se añaden 25 µl del suero diluido; se añaden 25 µl de medio a cada uno de los dos pocillos
control inferiores y 25 µl de medio que contenga 100 DICT50 (dosis infectiva 50% en cultivo de tejido)
del virus se añaden a cada uno de los dos pocillos problema superiores. En cada prueba se incluyen
una titulación del virus y sueros control positivo y negativo.
iii)
Las placas se sellan con un sellador de placas no tóxico o una tapa, y se incuban a 37°C durante
1 hora.
iv)
A cada pocillo se añaden 100 µl de una suspensión celular con una concentración de 2 ‰ 105
células/ml. El FBS o el suero equivalente para el crecimiento de las células deben estar libres de
anticuerpos frente al BDV.
v)
Se sella la placa o se incuba en una cámara húmeda con CO2 al 5% durante 4 días a 37°C.
vi)
Los pocillos se examinan al microscopio para detectar posibles efectos citopáticos (ECPs). En los
pocillos control de los sueros problema, los ECPs serán debidos a la toxicidad. Se puede intentar la
dilución posterior de los sueros tóxicos, pero es posible que no se obtengan resultados fiables con
sueros ocasionales. El título de NV para cada suero es la dilución a la cual se consigue neutralizar al
virus en el 50% de los pocillos. Se puede calcular mediante el método de Spearman–Kärber. Un
animal seronegativo no mostrará neutralización a la dilución más baja (p.ej. 1/4).
Es difícil la elección del virus de prueba debido a la diversidad antigénica entre los pestivirus (8, 14). Se
pueden utilizar cepas estándares de los BVDV citopáticos y células bovinas. Los resultados con la cepa
Oregon C24V se correlacionan mejor con el BDV Modedun que los resultados con la cepa NADL. Ninguna
cepa individual es ideal. Debería emplearse una cepa local que proporcione el título mayor de anticuerpos
con un rango de sueros positivos de oveja. También se puede utilizar la prueba de NV con virus no
citopáticos cuando se emplee el sistema de tinción de inmunoperoxidasa después de la etapa v) indicada
más arriba. Este sistema de tinción consiste en:
i)
Se elimina el medio de cultivo y las células se lavan suavemente con solución salina tamponada con
fosfato (PBS) templada, se secan al aire y se enfrían a 4°C.
ii)
Las células se fijan rápidamente añadiendo a todos los pocillos acetona al 95% (en agua) previamente
enfriada a –20°C. Las placas se mantienen a –20°C durante 30 minutos y no se deberían apilar o
permitir que se calienten porque el plástico se puede deteriorar.
iii)
Se elimina la acetona y las placas se secan rápidamente en un ambiente fresco.
iv)
A todos los pocillos se les añaden 50 µl de antisuero frente al BDV a una dilución predeterminada en
PBS con Tween 80 al 1% (PBST). Las placas se incuban a 37°C durante 30 minutos en una atmósfera
húmeda.
v)
Las placas se vacían y lavan tres veces con PBST.
vi)
Los pocillos se vacían y se les añade un suero apropiado anti-especie conjugado a peroxidasa a una
dilución predeterminada y las placas se dejan durante 30 minutos a 37°C en una atmósfera húmeda.
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Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera
vii)
Las placas se vacían y lavan tres veces con PBST.
viii) Los pocillos de las placas se vacían y se les añaden 50 µl de sustrato activado, p.ej. 3-amino-9etilcarbazol (AEC). La solución de base AEC es: AEC (0,1 g) disuelto en dimetil formamida (15 ml).
Para utilizar se añade la solución de base (0,3 ml) a 0,05 M tampón acetato pH 5,0, filtrado a través de
membrana (4,7 ml), y posteriormente se añade H2O2 al 30% (5 µl). NB: esta solución es tóxica y se
debería manejar con las precauciones adecuadas.
ix)
Las placas se incuban a temperatura ambiente y se observan con detalle los pocillos control viruspositivos conocidos para detectar el desarrollo de la tinción citoplásmica específica roja-marrón.
Cuando la tinción es completa se elimina el sustrato cuidadosamente y se lavan a fondo los pocillos
con agua corriente. Se deja el agua corriente en los pocillos y las placas se examinan al microscopio
para observar los pocillos que contengan el virus.
x)
El título de NV se calcula como se ha indicado más arriba utilizando el método de Spearman–Kärber.
xi)
Alternativamente, la prueba se puede llevar a cabo empleando la tinción directa con el conjugado de
isotiocianato de fluoresceína.
En ocasiones puede ser necesario determinar si el anticuerpo en el rebaño está dirigido contra un virus
perteneciente a un serogrupo particular de Pestivirus. Se puede utilizar una prueba diferencial de NV en la
que los sueros se titulan contra virus representativos de cada uno de los grupos de Pestivirus, i.e. el BDV,
los tipos 1 y 2 del BVDV y el CSFV. El título máximo identificará al serotipo infectante y también se revelará
el espectro de reacción cruzada con los restantes serotipos.
b)
Enzimoinmunoensayo
Se ha descrito un ELISA de captura con MAbs para medir los anticuerpos frente al VDV. Se emplean dos
MAbs de pan-pestivirus que detectan epítopos diferentes de la proteína no estructural inmunodominante NS
2/3 que capturan el antígeno crecido en cultivo celular y lisado con detergente. Los resultados se
correlacionan cualitativamente con la prueba de NV (10).
El antígeno se prepara como se indica a continuación: Se utilizan ocho frascos de 225 cm2 de células FLM
recientemente confluentes; cuatro frascos actuarán de controles y cuatro se infectarán. Los frascos se lavan
y se infectan cuatro con 0,01–0.1 m.o.i. (multiplicidad de infección) del BDV citopático Moredun. El virus se
adsorbe durante 2 horas a 37°C. Se añade medio de mantenimiento que contiene FBS al 2% (libre de
anticuerpos frente al BDV) y los cultivos se incuban durante 4–5 días hasta que se evidencian ECPs. Se
juntan los sobrenadantes de los cuatro frascos controles y por separado los sobrenadantes de los cuatro
frascos infectados. Se centrifugan a 3.000 g durante 15 minutos para precipitar las células. Se eliminan los
sobrenadantes. Se retienen los precipitados celulares. Se lavan los frascos con 50 ml de PBS y se repite la
etapa de centrifugación como se ha indicado más arriba. Se juntan todos los precipitados controles en 8 ml
de PBS que contenga Nonidet P40 al 1% y se devuelven 2 ml a cada frasco control para lisar las células
que han permanecido fijadas. Se repite lo mismo para el caso de las células infectadas. Se mantienen los
frascos a 4°C durante al menos 2 horas agitando vigorosamente el volumen escaso de líquido en las
células durante 30 minutos para asegurar la separación completa de las células. Se centrifuga el antígeno
control y el infectado a 12.000 g durante 5 minutos para extraer los residuos celulares. Los sobrenadantes
antigénicos se conservan a –70°C en alícuotas pequeñas.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Los dos MAbs se diluyen a una dilución predeterminada (normalmente 1/4000) en 0,05 M tampón
bicarbonato, pH 9,6. Todos los pocillos de una placa de microtitulación adecuada para la prueba
ELISA (p.ej. Nunc maxisorb, Greiner 129b) se cubren toda la noche con estos anticuerpos a 4°C.
ii)
Después de lavar tres veces con PBST, a todos los pocillos se les añade una solución de bloqueo de
PBST que contenga suero de caballo al 10% (PBSTH), y se incuban a 37°C durante 1 hora.
iii)
El antígeno se diluye a una dilución predeterminada con PBSTH y se antigenan filas alternas de
pocillos con los antígenos víricos y controles durante 1 hora a 37°C. Posteriormente, las placas se
lavan tres veces con PBST antes de añadirles los sueros problema.
iv)
Los sueros problema se diluyen 1/50 en PBSTH y se añaden a los pocillos víricos duplicados y
controles duplicados durante 1 hora a 37°C. Posteriormente, las placas se lavan tres veces con PBST.
v)
Se diluye la IgG anti-ovina conjugada a peroxidasa a una dilución predeterminada en PBSTH y se
añade a todos los pocillos durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavan tres veces con PBST.
vi)
Se añade un sustrato enzimático activado adecuado, tal como orto-fenilendiamina (OPD) o tetrametil
azul (TMB) teniendo en cuenta las advertencias del fabricante acerca de su toxicidad. Después de el
desarrollo de color, la reacción se para con ácido sulfúrico y la absorbancia se lee con un lector de
placas ELISA. El valor medio de los dos pocillos controles se sustrae de los valores medios de los dos
1122
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera
pocillos víricos para obtener la absorbancia corregida para cada suero. Los resultados se expresan
como absorbancia corregida con respecto a la correspondiente de sueros conocidos positivos y
negativos. Alternativamente, se pueden extrapolar los títulos de ELISA a partir de una curva estándar
de diluciones seriadas de un suero positivo conocido de referencia
Si se pueden preparar antígenos de suficiente potencia se puede omitir la etapa de captura con MAbs.
En este caso filas alternas de los pocillos se cubren con el antígeno vírico y control diluidos a una
dilución predeterminada (normalmente 1/100) en 0,05 M tampón bicarbonato, pH 9,6, toda la noche a
+4°C. Las placas se lavan y bloquean como en la etapa ii indicada más arriba. Después de lavar, se
añaden los sueros problema diluidos y la prueba sigue adelante a partir de la etapa iv) como se indica
más arriba.
c)
Prueba de inmunodifusión en gel de agar
La prueba de IGDA se utilizó por primera vez para demostrar la relación inmunológica entre los BDV, BVDV
y CSFV.
La cepa Oregon C24V del BVDV crecida en células de testículo de ternero se ha utilizado para detectar los
anticuerpos en ovejas. Se puede preparar un antígeno adecuado empleando el medio recogido procedente
de células que muestren tempranamente ECPs. Se necesita concentrar el medio aproximadamente 100
veces mediante diálisis contra polietilenglicol (PEG). Alternativamente, se puede añadir PEG 6000 para
sonicar suspensiones virus/células en una proporción del 8% (w/v). Después de agitar constantemente
durante toda la noche a 4°C, se elimina el precipitado por centrifugación a 1.800 g durante 1 hora. Se
decanta por completo el sobrenadante y se resuspende el precipitado hasta el 1% del volumen de cultivo
original virus/células en agua destilada. El precipitado resuspendido se centrifuga a 286.000 g durante
2 horas y se recoge el sobrenadante para ser utilizado como antígeno. El precipitado se elimina.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Para considerar útil una vacuna del BDV debería ser efectiva al administrarla a las ovejas hembras antes del
periodo de crianza con el fin de prevenir la infección transplacentaria. En Europa se han preparado vacunas con
el virus BDV entero inactivado con fines experimentales y comerciales (5, 24).
Se han encontrado pestivirus contaminantes de vacunas de virus vivos modificados que provocan enfermedades
graves después de ser administradas a cerdos, vacas, ovejas y cabras. Entre las vacunas contaminadas están
las utilizadas para el control de la enfermedad de Aujeszky, del CSFV, de rotavirus, de coronavirus, de la peste
bovina, de la viruela ovina y de la dermatitis pustular contagiosa. La capacidad insidiosa de los pestivirus para
atravesar la placenta y de este modo establecer los animales IP, les proporciona la potencialidad de contaminar
vacunas a través de las células, el suero empleado como suplemento en los medios o el virus utilizado como
base de inóculo. Como casi todos los aislados de los pestivirus son no citopáticos, permanecerán sin ser
detectados a menos que se lleven a cabo pruebas específicas.
1.
Control del inóculo
a)
Caracterización del inóculo
Una vacuna ideal debería contener una cepa o cepas del virus que proporcionen protección frente a todos
los pestivirus ovinos. Recientemente, se ha demostrado que existen tres grupos de pestivirus antigénicos
distintos que infectan ovejas. Un grupo es el representado por la cepa de referencia del BDV Moredun; el
segundo grupo contiene los virus similares a la mayoría de las cepas del BVDV bovino (BVDV tipo 1); y el
tercer grupo engloba las cepas menos comunes del BVDV (tipo 2) (30). Hacen falta estudios posteriores de
protección cruzada para determinar el significado de estos descubrimientos. No obstante, parece lógico que
cualquier vacuna del BDV debería contener al menos un representante de los grupos BDV y BVDV (tipo 1).
La caracterización de los virus de las vacunas clonadas biológicamente debería comprender la tipificación
con MAbs y la genotipificación (16).
b)
Cultivo
Se puede utilizar una variedad de cultivos celulares de rumiantes. Los rendimientos óptimos dependen del
tipo celular y aislado empleados. Existe una vacuna comercial del BDV que contiene dos cepas del virus y
que se prepara en líneas celulares ovinas (5). Las células se deberían preparar de acuerdo con el sistema
de lotes del inóculo procedente de un virus del inóculo original (MCS) que se haya demostrado que está
libre de microorganismos contaminantes. Sólo se debería preparar la vacuna en células con menos de
20 pases a partir del MCS. Se debería comprobar que no existe contaminación debida a pestivirus en
células control procedentes de cada pase.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1123
Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera
c)
Validación como vacuna
Todas las vacunas deberían pasar las pruebas estándar de inocuidad y eficacia. La prueba de inocuidad de
las vacunas inactivadas del BDV debería suponer el control de todos los componentes de las vacunas para
detectar los posibles pestivirus contaminantes.
Las pruebas de eficacia de las vacunas del BDV deberían demostrar su capacidad para prevenir la
propagación transplacentaria del virus. Se ha logrado un desafío efectivo de las ovejas gestantes
vacunadas entre los días 50–60 de gestación mediante la instalación intranasal del virus o mezclándolas
con ovejas IP (5).
2.
Método de producción
Se han preparado vacunas inactivadas empleando técnicas de laboratorio convencionales con cultivos celulares
estacionarios o en botellas rotatorias. Algunos inactivantes son la formalina y la beta-propiolactona. Los
adyuvantes pueden ser hidróxido de aluminio o aceite (5, 24).
3.
Control del proceso
Los cultivos se deberían inspeccionar a diario para asegurar que están libres de contaminación bacteriana
evidente y que cualquier ECP observado sea el apropiado al virus citopático que se esté tratando de multiplicar.
No se deberían observar ECPs en cultivos que se estén utilizando para que se repliquen cepas víricas no
citopáticas.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
En el Capítulo I.1.5. se pueden encontrar las pruebas para determinar que los materiales biológicos están
estériles y libres de contaminación.
b)
Inocuidad
Se debería comprobar rigurosamente que las muestras procedentes de las vacunas inactivadas carecen de
virus viables. Se deberían realizar varios pases con muestras del producto empleando cultivos celulares
susceptibles para asegurar la ausencia del BDV vivo. Este control in vitro se puede mejorar inyectando dos
ovejas BDV-seronegativas con 20 dosis de antígeno sin valorar como parte de una prueba de inocuidad
estándar. La presencia del virus vivo tendrá como resultado el desarrollo de una respuesta serológica más
convincente que la que se observaría utilizando el virus inactivado solo. También se pueden examinar los
sueros de oveja para detectar anticuerpos dirigidos contra otros agentes conocidos.
c)
Potencia
Asimismo, es mejor ensayar la potencia de la vacuna con ovejas seronegativas en las que se mida el
desarrollo y nivel de anticuerpos. Una medida indirecta de la potencia la proporciona el nivel de infectividad
vírica previa a la inactivación. El contenido antigénico después de la inactivación se puede valorar mediante
un ELISA de captura con MAbs y relacionar con los resultados de potencia establecidos in vivo. Al igual que
se recomienda en el caso de las pruebas de potencia de la vacuna del BVDV en vacas, se aconseja
demostrar que la vacuna puede prevenir la transmisión transplacentaria del BDV en ovejas gestantes.
d)
Duración de la inmunidad
No se dispone de información acerca de la duración de la inmunidad después de la vacunación. Es
improbable que las vacunas inactivadas proporcionen niveles sostenidos de inmunidad y es probable que
después de un tratamiento inicial de 2 o 3 inyecciones sean necesarias dosis anuales de refuerzo. No se
dispone de información suficiente para determinar si existe una correlación entre los títulos de anticuerpos
vacunales en la hembra progenitora y la protección fetal.
e)
Estabilidad
Existe escasa información sobre la estabilidad de las vacunas del BDV. Es de suponer que las vacunas
inactivadas tengan al menos un año de periodo de validez si se protegen de la luz y conservan a 4°C.
f)
Conservantes
Se pueden añadir conservantes a los contenedores multidosis de vacunas que estarán sujetos a la
aprobación de la Autoridad de Control.
1124
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera
g)
Precauciones (riesgos)
El BDV se considera un riesgo para la salud humana. Se deberían utilizar prácticas microbiológicas
adecuadas y estándares para manipular el virus.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Sólo pruebas in vitro.
b)
Potencia
Pruebas in vitro del contenido antigénico
REFERENCIAS
1.
AVALOS-RAMIREZ R., ORLICH M., THIEL H.-J. & BECHER P. (2001). Evidence for the presence of two novel
pestivirus species. Virology, 286, 456–465.
2.
BARLOW R.M. & PATTERSON D.S.P. (1982). Border disease of sheep: a virus-induced teratogenic disorder.
Adv. Vet. Med. (Suppl. J. Vet. Med.), 36, 1–87.
3.
BECHER P., ORLICH M. & THIEL H.-J. (1998). Complete genomic sequence of border disease virus a pestivirus
from sheep. J. Virol., 72, 5165–5173.
4.
BRAUN U., HILBE M., EHRENSPERGER F., SALIS F., ALTHER P., STRASSER M., STALDER H.P. & PETERHANS E.
(2002). Border Disease in einem Schafbetrieb. Schweiz. Arch. Tierheilk., 144, 419–426.
5.
BRUN A., LACOSTE F., REYNAUD G., KATO F. & SAINT-MARC B. (1993). Evaluation of the potency of an
inactivated vaccine against border disease pestivirus infection in sheep. En: Proceedings of the Second
Symposium on Pestiviruses, Edwards S., ed. Fondation Marcel Merieux, Annecy, Francia, 1–3 Octubre
1992, 257–259
6.
CARLSSON U. (1991). Border disease in sheep caused by transmission of virus from cattle persistently
infected with bovine virus diarrhoea virus. Vet. Rec., 128, 145–147.
7.
CHAPPUIS G., BRUN A., KATO F., DAUVERGNE M., REYNAUD G. & DURET C. (1986). Etudes serologiques et
immunologiques realisees a la suite de I’isolement d’un pestivirus dans un foyer ovina chez des moutons de
L’Aveyron. En: Pestiviroses des Ovins et des Bovins, Espinasse J. & Savey M. eds. Ste Francaise de
Buiatrie, Paris, Francia, 55, 66.
8.
DEKKER A., W ENSVOORT G. & TERPSTRA C. (1995). Six antigenic groups within the genus pestivirus as
identified by cross-neutralisation assays. Vet. Microbiol., 47, 317–329.
9.
ENTRICAN G., DAND A. & NETTLETON P.F. (1994). A double monoclonal-antibody ELISA for detecting pestivirus
antigen in the blood of viraemic cattle and sheep. Vet. Microbiol., 43, 65–74.
10. FENTON A., SINCLAIR J.A., ENTRICAN G., HERRING J.A. & NETTLETON P.F. (1991). A monoclonal antibody
capture ELISA to detect antibody to border disease virus in sheep sera. Vet. Microbiol., 28, 327–333.
11. FULTON R.W., D’OFFAY J.M., SALIKI J.T., BURGE L.J., HELMAN R.G., CONFER A.W., BOLIN S.R. & RIDPATH J.F.
(1999). Nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) for typing ruminant pestiviruses:
bovine viral diarrhea viruses and border disease virus. Can. J. Vet. Res., 63, 276–281.
12. MCGOLDRICK A., BENSAUDE E., IBATA G., SHARP G. & PATON D.J. (1999). Closed one-tube reverse transcription
nested polymerase chain reaction for the detection of pestiviral RNA with fluorescent probes. J. Virol.
Methods, 79, 85–95.
13. NETTLETON P.F., GILMOUR J.S., HERRING J.A. & SINCLAIR J.A. (1992). The production and survival of lambs
persistently infected with border disease virus. Comp. Immunol. Microbiol. infect. Dis., 15, 179–188.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1125
Capítulo 2.10.5. — Enfermedad de la frontera
14. NETTLETON P.F., GILRAY J.A., RUSSO P. & DLISSI E. (1998). Border disease of sheep and goats Vet. Res., 29,
327–340.
15. OGUZOGLU T.C., FLOEGEL-NIESMANN G., FREY H.R. & MOENNIG V. (2001). Differential diagnosis of classical
swine fever and border disease: seroepidemiological investigation of a pestivirus infection on a mixed sheep
and swine farm. Dtsch Tierarztl. Wochenschr., 108, 210–213.
16. PATON D.J., SANDS J.J., LOWINGS J.P., SMITH J.E., IBATA G. & EDWARDS S. (1995). A proposed division of the
pestivirus genus into subgroups using monoclonal antibodies, supported by cross-neutralization assays and
genetic sequencing. Vet. Res., 26, 92–109.
17. RIDPATH J.F. & BOLIN S.R. (1997). Comparison of the complete genomic sequence of the border disease
virus, BD31, to other pestiviruses. Virus Res., 50, 237–243.
18. SANDVIK T., PATON D.J & LOWINGS P.J. (1997). Detection and identification of ruminant and porcine
pestiviruses by nested amplification of the 5' untranslated cDNA region. J. Virol. Methods, 64, 43–56.
19. THABTI F., FRONZAROLI L., DLISSI E., GUIBERT J.M., HAMMAMI S., PEPIN M. & RUSSO P. (2002). Experimental
model of border disease virus infection in lambs: comparative pathogenicity of pestiviruses isolated in
France and Tunisia. Vet. Res., 33, 35–45.
20. THUR B., HILBE M., STRASSER M. & EHRENSPERGER F. (1997). Immunohistochemical diagnosis of pestivirus
infection associated with bovine and ovine abortion and perinatal death. Am. J. Vet. Res., 58, 1371–1375.
21. VAN REGENMORTEL M.H.V., FAUQUET C.M. & BISHOP D.H.L. (2000). Virus taxonomy. En: Classification and
Nomenclature of Viruses: Seventh Report of the International committee on taxonomy of viruses : Seventh
Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses,. Academic Press, San Diego, CA, EE.UU.,
867–872.
22. VAN RIJN P.A., VAN GENNIP H.G.P., LEENCLERSE C.H., BRUSCHKE C.J.M., PATON D.J., MOORMANN R.J.M. & VAN
OIRSCHOT J.T. (1997). Subdivision of the pestivirus genus based on envelope glycoprotein E2 Virology, 237,
337–348.
23. VANTSIS J.T., BARLOW R.M., FRASER J. & MOULD D.L. (1976). Experiments in border disease VIII. Propagation
and properties of a cytopathic virus. J. Comp. Pathol., 86, 111–120.
24. VANTSIS J.T., RENNIE J.C., GARDINER A.C., W ELLS P.W., BARLOW R.M. & MARTIN W.B. (1980). Immunisation
against Border disease. J. Comp. Path., 90, 349–354.
25. VILCEK S. (2001). Identification of pestiviruses contaminating cell lines and fetal calf sera. Acta Virol., 45, 81–
86.
26. VILCEK S., HERRING A.J., HERRING J.A., NETTLETON P.F., LOWINGS J.P.L. & PATON D.J (1994) Pestiviruses
isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain
reaction and restriction endonucelase analysis. Arch. Virol., 136, 309–323.
27. VILCEK S., NETTLETON P.F., PATON D.J. & BELAK S. (1997). Molecular characterization of ovine pestiviruses.
J. Gen. Virol., 78, 725–735.
28. VILCEK S. & PATON D.J. (2000). A RT-PCR assay for the rapid recognition of border disease virus. Vet. Res.,
31, 437–445.
29. WENSVOORT G. & TERPSTRA C. (1988). Bovine viral diarrhoea virus infection in piglets born to sows
vaccinated against swine fever with contaminated virus. Res. Vet. Sci., 45, 143–148.
30. WENSVOORT G., TERPSTRA C. & DE KLUYVER E.P. (1989). Characterisation of porcine and some ruminant
pestiviruses by cross-neutralisation. Vet. Microbiol., 20, 291–306.
*
* *
1126
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO 2.10.6.
DIARREA VÍRICA BOVINA
RESUMEN
El ganado bovino es susceptible de infección con el virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) a
todas las edades (ver también el Apéndice 3.2.1 en el Código de Salud Animal de Animales
Terrestres). Este virus está extendido por todo el mundo. Los síntomas clínicos varían desde una
condición subclínica hasta una enfermedad fulminante de desenlace fatal llamada enfermedad de
las mucosas. Generalmente, las infecciones agudas pueden producir diarrea pasajera o neumonía,
en la forma de brotes que afectan a grupos de animales. Se han descrito formas agudas de la
enfermedad con una mortalidad alta, asociadas a menudo, aunque no siempre, con un síndrome
hemorrágico. Sin embargo, la mayor parte de las infecciones en los terneros jóvenes son leves y
pasan clínicamente inadvertidas. El virus se extiende principalmente por contacto entre el ganado.
La transmisión vertical juega un papel importante en su epidemiología y patogénesis.
Las infecciones del feto bovino pueden producir abortos, partos con terneros muertos, efectos
teratogénicos o una infección persistente en el ternero neonato. Los animales con viremia
persistente pueden nacer como terneros débiles o pueden tener la apariencia de terneros normales
sanos que pasan clínicamente desapercibidos. Algunos de estos animales pueden desarrollar
posteriormente la enfermedad de las mucosas con anorexia, erosiones gastrointestinales y diarrea
profusa, lo que les conduce invariablemente a la muerte. La enfermedad de las mucosas puede
producirse sólo en animales infectados persistentemente.
Es importante evitar el comercio de animales con viremia. Generalmente, se considera que el
ganado serológicamente positivo, sin viremia está “sano”, siempre que no esté grávido. El ganado
grávido que es positivo a los anticuerpos y que gesta fetos infectados persistentemente es
transmisor importante del virus dentro de las manadas. Alrededor del 15% de los animales con
viremia persistente tienen anticuerpos a la proteína NS/2 y un porcentaje más bajo a la
glicoproteína E2. Sin embargo, la seropositividad no puede igualarse a “estar sano”. Las
infecciones latentes no se producen generalmente después de la recuperación de infecciones
agudas, aunque el semen de animales con infección aguda puede ser sospechoso.
Identificación del agente: El BVDV es un pestivirus dentro de la familia Flaviviridae y está muy
relacionado con los virus de la fiebre porcina clásica y de la enfermedad bovina de la frontera. El
BVDV se presenta en dos formas: no citopatogénico y citopatogénico. Hay dos genótipos
antigénicamente distintos (tipos 1 y 2), y los aislados de virus dentro de estos grupos muestran una
considerable diversidad biológica y antigénica.
Los animales sanos con viremia persistente a causa de infecciones congénitas se pueden
identificar fácilmente aislando el virus no citopatogénico en cultivos celulares de sangre o de suero.
Es necesario usar un método de inmunomarcaje para detectar el crecimiento del virus en los
cultivos. Existen también métodos alternativos basados en la detección directa del antígeno vírico
o de ARN vírico en leucocitos. Se debería confirmar la persistencia del virus mediante nuevo
muestreo después de un intervalo de al menos 3 semanas. Generalmente, estos animales no
tienen anticuerpos contra el BVDV o niveles muy bajos.
La viremia en casos agudos es pasajera y puede ser difícil de detectar. En casos mortales de
enfermedad hemorrágica, se puede aislar el virus de tejidos post–mortem. La confirmación de
enfermedad mucosal se puede hacer mediante aislamiento del biotipo citopatogénico del BVDV,
particularmente de tejidos intestinales. También se puede detectar el virus no citopatogénico,
especialmente en sangre.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1127
Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
Pruebas serológicas: La infección aguda con el BVDV se confirma mejor demostrando la
seroconversión utilizando muestras pareadas secuenciales de varios animales en el grupo. El
muestreo en parejas (muestras de casos agudos y de convalecientes) debería hacerse con una
separación mínima de 14 días, y las muestras deberían analizarse en paralelo. El
enzimoinmunoensayo y la prueba de neutralización del virus son las pruebas utilizadas más
ampliamente.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No existe una vacuna estándar
para DVB, pero se dispone de varias preparaciones comerciales. La vacuna con virus vivo
modificado no debería administrarse a ganado gestante (o a sus terneros lactantes) debido al
riesgo de infección a través de la placenta. También existe el riesgo de inducir la enfermedad de
las mucosas en animales infectados persistentemente. Generalmente, las vacunas con virus
muertos requieren una vacunación de recuerdo. La vacuna ideal debería poder prevenir infección
trasplacentaria en vacas gestantes.
El BVDV supone un riesgo particularmente importante en la fabricación de productos biológicos
para uso veterinario debido a la alta frecuencia de contaminación de los lotes de suero fetal bovino,
utilizados como suplemento de los medios de cultivo.
A. INTRODUCCIÓN
El virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) es un pestivirus de la familia de las Flaviviridae y está muy relacionado
con los virus de la fiebre clásica porcina y de la enfermedad ovina de la frontera (20). Existen dos genotipos
antigénicamente distintos de BVDV, tipos 1 y 2, con subdivisiones suplementarias distinguibles mediante análisis
genético (66). Los dos genotipos se pueden diferenciar uno de otro, y de otros pestivirus, por anticuerpos
monoclonales (MAbs) dirigidos contra las glicoproteínas principales E2 y ERNS , o mediante análisis genético
(57, 60). La reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR) permite la tipificación de virus directamente de
las muestras de sangre (30). Generalmente, el virus tipo 1 es más común aunque se ha descrito que la
prevalencia del tipo 2 es casi tan alta como la del tipo 1 en Norteamérica. El BVDV de ambos genotipos puede
darse en formas no citopatogénicas y citopatogénicas (biotipos), clasificadas en función de si produce o no
cambios visibles en los cultivos celulares. Generalmente, el que circula en poblaciones de ganado es el biotipo
no citopatogénico. Cada biotipo tiene un papel específico en una variedad de síndromes clínicos – infecciones
crónicas, agudas y congénitas (4,10). Los virus del tipo 2 son generalmente no citopatogénicos y se han
asociado con brotes de infección aguda severa (15). Las infecciones clínicamente no aparentes son comunes
con ambos genotipos.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
a)
Infecciones agudas
Las infecciones agudas del ganado bovino se producen particularmente en animales jóvenes, y pueden ser
clínicamente no aparentes o asociadas con diarrea (1). Los animales afectados pueden estar predispuestos
a infecciones concurrentes, por ejemplo enfermedad respiratoria, debido quizás a un efecto inmunosupresor
del virus. Los toros pueden sufrir un descenso temporal de fertilidad y mostrar excreción pasajera del virus
en el semen (54). Las vacas pueden padecer también infertilidad, asociada probablemente con alteraciones
de la función ovárica (31) y de las secreciones de gonadotrofina y progesterona (27). Durante las
infecciones agudas, se puede detectar una viremia breve y producirse la excreción nasal del virus. También
puede haber una leucopenia transitoria, trombocitopenia o respuesta febril, pero estas manifestaciones
varían mucho entre distintos animales. El método más seguro para diagnosticar una infección previa es la
presencia de una respuesta serológica. El cuadro clínico es generalmente de alta morbilidad y baja
mortalidad, aunque a veces se observan características más graves (11). En particular, los brotes de la
forma grave de la enfermedad aguda con lesiones hemorrágicas, trombocitopenia y elevada mortalidad, se
han descrito esporádicamente en algunos países (1, 5) y la infección con los virus de Tipo 2 se ha
demostrado que causa, en particular, una función plaquetaria alterada (68). Otros brotes agudos pueden
mostrar fiebre, neumonía, diarrea y muerte súbita en cualquier grupo de edad, con síntomas hemorrágicos
(15).
b)
Infección congénita
Si un virus no citopatogénico infecta al feto bovino, puede producir el aborto, partos en los que el ternero
nace muerto, efectos teratogénicos o infección congénita que persiste en el ternero neonato (1, 10, 23, 50).
A menudo resulta difícil establecer la confirmación de que el aborto está causado por el BVDV (61), pero el
virus puede aislarse del tejido fetal en algunos casos, o se puede demostrar la existencia de un antígeno o
1128
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
el genoma vírico. Se debería hacer un intento para detectar anticuerpos específicos en muestras de fluidos
o de suero fetal, o en el sobrenadante de una suspensión de tejidos. Los partos en los que el ternero nace
muerto o los efectos teratogénicos se pueden asociar con una respuesta inmune fetal activa al virus durante
el periodo entre la mitad y el final de la gestación. La madre tendrá a menudo títulos altos de anticuerpos
(>1/2.000) al BVDV, lo que sugiere infección fetal y es debido probablemente a que el feto presente una
exposición vírica prolongada.
Aunque la infección congénita con BVDV conduce a menudo al aborto, esto no se detecta siempre a nivel
de campo. La infección durante el primer tercio del periodo de gestación puede dar como resultado el
aborto de un feto pequeño que pase desapercibido para el ganadero. La vaca vuelve a su rutina normal y la
incapacidad de mantener la gestación se clasifica como un ejemplo de muerte embriónica prematura. Otra
posible consecuencia de la infección es la muerte y posterior reabsorción de los fluidos del feto lo que
produce momificación. Frecuentemente, se observa que los fetos abortados tienen edema subcutáneo y
grandes efusiones pleurales y peritoneales. También pueden existir anormalidades congénitas que
producen retrasos en el crecimiento y defectos selectivos en el sistema nervioso central (SNC), tales como
hipoplasia cereblar y dismielinización (62), y defectos en el ojo, como cataratas. A veces hay defectos
esqueléticos, el más avanzado de los cuales es la artrogriposis.
Los terneros que nacen muertos son una secuela normal de las infecciones congénitas. En general, los
terneros parecen estar totalmente desarrollados en el momento del parto, pero no sobreviven. Después de
150 días de gestación, se desarrollará el sistema inmune del feto y la infección del feto resultará en una
respuesta de anticuerpos y en el nacimiento de un ternero normal.
c)
Viremia persistente
Cuando se producen infecciones en el feto antes de aproximadamente 110 días de gestación y antes de la
inmunocompetencia, el ternero puede nacer con una viremia persistente. La identificación de estos
animales se hace mediante la detección del BVDV no citopatogénico en la sangre. El virus puede
identificarse en la piel por inmunohistoquímica. Los animales con viremia persistente carecen también de
anticuerpos específicos y el diagnóstico en el ternero joven, de hasta aproximadamente 3 meses, puede ser
incorrecto por la presencia de anticuerpos maternos al BVDV. El anticuerpo materno también puede
interferir con el aislamiento del virus. En animales mayores con viremia persistente, pueden estar presentes
niveles bajos de anticuerpo debido a su habilidad para seroconvertir a cepas de BVDV (incluyendo
vacunas) "heterólogas" (antigénicamente diferente) del virus persistente (11). Para confirmar un diagnóstico
de viremia persistente, los animales deben de volver a someterse a pruebas después de un intervalo de, al
menos, 3 semanas.
Las lesiones en el ternero virémico son no patognomónicas. Los síntomas clínicos varían desde un animal
sano y aparentemente normal a un ternero débil y con dificultad para mantenerse en pie y mamar. Estos
últimos terneros pueden mostrar defectos en el SNC, como temblores musculares, incoordinación y
ceguera. A menudo mueren en días cercanos a su nacimiento, contribuyendo por tanto al "síndrome del
ternero débil".
Algunos terneros virémicos sobreviven hasta la madurez sexual y se retienen para reproducción. Los
terneros nacidos de estas madres infectadas son siempre persistentemente virémicos, y a menudo son
débiles en el momento de nacer y no se desarrollan. Los animales virémicos persistentes son una fuente
continua de virus infeccioso para el resto del ganado, y por tanto se requiere su identificación rápida y su
retirada de la manada. En los animales para comercio, se debe comprobar la ausencia de viremia DVB
persistente.
Los toros con infección persistente generalmente tienen un semen muy infeccioso de baja calidad y, en
consecuencia, una fertilidad reducida (41, 59). Todos los toros destinados a inseminación natural o artificial
deberían ser sometidos a pruebas para detectar infección persistente de DVB.
Las hembras usadas como receptoras de embriones deberían ser siempre negativas en cuanto a viremia de
DVB antes de su primer uso. Las vacas donantes infectadas persistentemente con BVDV representan
también una fuente de infección potencial, ya que los ovocitos sin zona pelúcida intacta se muestran
susceptibles a infección in vitro (65). Sin embargo, un estudio limitado de dos animales infectados
persistentemente reveló que la mayoría de los ovocitos eran negativos para BVDV (63). Los embriones
también pueden resultar contaminados después de una infección aguda del donante (2). Los productos
biológicos utilizados para técnicas de fertilización in vitro (suero bovino, cultivos celulares bovinos) tienen
un alto riesgo de contaminación y deberían examinarse para detectar BVDV (8). Incidentes recientes de
introducción aparente del virus a través de tales técnicas (21, 43) han puesto de manifiesto este riesgo. Se
considera esencial que los suplementos de suero utilizados en los medios se esterilicen como se detalla en
el Artículo 3.3.1.5 del Código de Salud para Animales Terrestres de la OIE (Código de Animales Terrestres)
y como se resume en la Sección B.1.a. de este capítulo. Los países importadores pueden pedir pruebas
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1129
Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
adicionales para confirmar la esterilización, detalladas en el Artículo 3.3.1.6 del Código de Animales
Terrestres.
d)
Enfermedad mucosal
Se ha descrito que los animales persistentemente virémicos pueden padecer la enfermedad de las
mucosas (10); sin embargo, los casos son muy raros. Se ha demostrado que este síndrome está asociado
con la presencia del biotipo citopatogénico, que puede surgir bien por superinfección (4, 13), recombinación
entre biotipos no citopatogénicos, o por mutación del biotipo persistente (45). Consecuentemente, el
diagnóstico confirmativo de la enfermedad mucosal debería incluir el aislamiento del virus citopatogénico
del ganado afectado. Este biotipo puede a veces aislarse de la sangre, pero se puede recuperar más
repetidamente de otros tejidos, en particular del tejido intestinal y de las placas de Peyer (16). El aislamiento
del virus también puede realizarse fácilmente del bazo. Éste órgano es fácil de recoger y raras veces es
tóxico para el cultivo de células después de su preparación para el aislamiento vírico. El aislamiento de las
muestras de intestino puede resultar difícil si se ha producido autolisis; en este caso deberían probarse
suspensiones de nódulos linfáticos o amígdalas. El virus no citopatogénico puede también detectarse,
particularmente en la sangre o en órganos asociados a la sangre. Para detectar antígenos víricos por
inmunofluorescencia o marcadores con inmunoperoxidasa se pueden teñir cortes de tejido congelado de
casos de enfermedad mucosal.
La enfermedad mucosal es invariablemente mortal. Su aparición puede ser tan rápida que los primeros
síntomas que se ven sean animales muertos o moribundos. Sin embargo, es más común que los animales
se vuelvan anoréxicos durante un periodo de varios días, en los que se les ve apáticos, y con signos de
dolor abdominal. Pueden desarrollar una diarrea profusa y perder rápidamente peso. Se pueden apreciar a
menudo erosiones en la boca, particularmente a lo largo del margen gingival. Se produce lacrimación y
salivación excesiva. Generalmente, los casos de enfermedad mucosal son esporádicos y raros.
El examen post–mortem revela erosiones en varias partes de la mucosa a lo largo del tracto
gastrointestinal. Las más llamativas son las que se encuentran por encima de las placas linfoides de Peyer
en el intestino delgado y en los nódulos linfoides del colon. En un examen histológico hay una clara
demostración de destrucción del tejido linfoide asociado al intestino. La mayoría de las células linfoides de
las placas de Peyer se lisan y reemplazan por células inflamatorias, restos y células del epitelio superior
colapsado.
La infección aguda grave por DVB puede ser clínicamente similar a la enfermedad de las mucosas y se
puede producir confusión, particularmente cuando están afectados varios animales. La enfermedad de las
mucosas puede producirse entre poblaciones de animales infectados persistentemente cuando se lleva a
cabo una sincronización del estro. La diferenciación requiere un examen cuidadoso de historias clínicas y
pruebas de detección de anticuerpos así como de antígenos o de virus entre los animales infectados y los
recuperados. La seroconversión entre animales recuperados es indicativa de infección aguda, mientras que
resultados positivos a dos antígenos o a virus con las muestras de un animal infectado, tomadas con una
separación de 3 semanas, constituye un diagnóstico de la enfermedad mucosal. Generalmente, los
animales con enfermedad mucosal son negativos para anticuerpos, aunque a veces se pueden detectar
niveles bajos de anticuerpos.
1.
Identificación del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)
Todos los métodos probados deben validarse sobre poblaciones de ganado infectado y no infectado, incluyendo
animales con viremias de baja y de alta titulación. Debe demostrarse que los métodos basados en ensayos por
fijación de MAb o en reconocimiento del ácido nucleico detectan el espectro completo de diversidad antigénica y
genética encontrada entre virus DVB. Hay dos Laboratorios de Referencia de la OIE para la DVB (ver Cuadro en
la Parte 3 de este Manual); los laboratorios de referencia para la fiebre porcina clásica pueden ofrecer también
asesoramiento.
a)
Aislamiento del virus
El virus puede aislarse en monocapas de algunos cultivos celulares bovinos (e.g. riñón, pulmones,
testículos o cornetes). El crecimiento de ambos biotipos es generalmente satisfactorio. El BVDV no
citopatogénico es un contaminante común de tejidos bovinos frescos, y ha de comprobarse por pruebas
regulares que los cultivos celulares están libres de virus contaminantes (7, 25). Los cultivos primarios o
secundarios deben congelarse como suspensiones de células en nitrógeno líquido. Éstos pueden probarse
en una serie de pasos, o sembrarse en otras células susceptibles y comprobarse antes del uso rutinario.
Tales problemas pueden superarse mediante el uso de líneas celulares continuas, que pueden obtenerse
sin el DVB (7).
1130
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
El suero bovino fetal que se selecciona para uso en cultivo celular debe estar también libre no solo de
virus, sino también, del anticuerpo neutralizante frente a BVDV (25). El tratamiento por calor (56°C durante
30–45 minutos) es inadecuado para la destrucción del BVDV en sueros contaminados; la irradiación a
25 kiloGrays (2,5 Mrad) es más segura. La mayoría de lotes comerciales de suero bovino fetal dan positivo
por PCR incluso después de que el virus ha sido inactivado por irradiación. Cuando se considere apropiado,
el suero de caballo se puede sustituir por suero bovino fetal, aunque a menudo se encuentra que es menos
adecuado para promocionar el crecimiento celular.
Las células leucocitarias, la sangre completa, los leucocitos lavados o el suero son adecuados para el
aislamiento del virus de animales vivos. Los anticuerpos maternos pueden interferir con el aislamiento del
suero en terneros jóvenes. Las suspensiones de tejidos de casos post–mortem deben prepararse por
métodos estándar. También se puede examinar el semen, pero es preferible una muestra de sangre del
toro donante si es posible obtenerla. Existe un informe de una excreción atípica y persistente de BVDV en
semen de un toro que no era virémico (67). El semen puro es citotóxico y debe diluirse en medio de cultivo.
En general, el semen completo puede inocularse directamente sobre las monocapas celulares, pero
ocasionalmente puede causar citotoxicidad. Por estas razones, es importante controlar el estado de las
células por examen microscópico a intervalos durante la incubación.
Hay muchas variaciones en los procedimientos utilizados para aislar el virus. Todos deben ser optimizados
para proporcionar la máxima sensibilidad de detección de una preparación de virus estándar. Esto puede
incluir uno o más paso(s) in–vitro. Para detectar el crecimiento de virus no citopatogénico, se usan los
métodos convencionales de aislamiento de virus, con la adición de un paso final de inmunomarcaje
(fluorescencia o enzimático). Por tanto los cultivos en tubo deberían incluir cubres sueltos, mientras que los
cultivos en placa pueden fijarse y marcarse directamente en la placa. A continuación se incluyen ejemplos.
•
Método de la inmunoperoxidasa en microplaca para análisis masivo de detección de virus en muestras
de suero (49)
i)
Se colocan en cada uno de los 96 pocillos de las microplacas de cultivos de tejido 10 µl de la muestra
de suero. Esto se repite para cada muestra. Se incluyen controles positivos y negativos conocidos.
ii)
Se añaden a todos los pocillos 100 µl de una suspensión de células con 150.000 células/ml en medio
sin suero fetal bovino (FCS). NB: La propia muestra actúa como suplemento del crecimiento celular. Si
se prueban otras muestras que no sean sueros, se usa medio con 10% FCS.
iii)
La placa se incuba a 37°C durante 4 días, en una atmósfera de CO2 al 5% o con la placa sellada.
iv)
Cada pocillo se examina microscópicamente para detectar evidencia de efecto citopático (ECP) o
síntomas de citotoxicidad.
v)
La placa se vacía suavemente mediante inversión y se enjuaga con solución salina tamponada con
fosfato (PBS).
vi)
La placa se fija como se indica a continuación: se sumerge en un baño con acetona al 20% en PBS,
se vacía inmediatamente, y se transfiere después a un baño fresco con acetona al 20% en PBS
durante 10 minutos. Se deja escurrir la placa totalmente y se retira tanto fluido como sea posible
mediante empapado con papel y secado. La placa se seca por completo durante al menos 3 horas a
una temperatura de 25–30°C (e.g. usando calor radiante de una lampara de la mesa de trabajo). NB:
el secado es parte del proceso de fijación.
Los métodos de fijación alternativa incluyen paraformaldehido o calor (ver Capítulo 2.1.13. Fiebre
porcina clásica, Sección B.2.b.viii).
vii)
Las células fijadas se enjuagan añadiendo PBS a todos los pocillos.
viii) Se secan los pocillos y se añade el anticuerpo contra DVB (50 µl) a todos los pocillos a una dilución
predeterminada en PBS que contiene 1% Tween 80 (PBST) y 5% de suero de caballo. (El suero de
caballo puede añadirse para reducir el marcaje inespecífico). La placa se incuba a 37°C durante
15 minutos.
ix)
La placa se vacía y se lava tres veces en PBST.
x)
La placa se seca y se añade un suero anti–especie apropiado conjugado a peroxidasa a una dilución
predeterminada en PBST (50µl por pocillo) durante 15 minutos a 37°C.
xi)
La placa se vacía y se lava tres veces in PBST.
xii)
Se añade peróxido de hidrógeno recién preparado como substrato con un cromógeno adecuado, por
ejemplo 3–amino–9–ethyl carbazol (AEC). La solución stock es: AEC (0,1 g) disuelto en dimetil
formamida (15 ml). Para empleo, se añade el stock (0,3 ml) a tampón acetato 0,05 M (5 ml, pH 5,0), y
posteriormente H2O2 al 30% (se añaden 5 µl). Se puede hacer un substrato alternativo compuesto de
9 mg de tetrahydrocloruro de diaminobenzidina y 6 mg de perborato sódico tetrahidratado disuelto en
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Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
15 ml de PBS. Aunque la tinción no es tan intensa, estos productos químicos tienen la ventaja de que
pueden ser enviados por vía aérea.
xiii) La placa se examina microscópicamente. Las células positivas para el virus muestran
tinción citoplásmica de color marrón rojizo.
•
Método en tubo para suspensiones de tejido o capa leucocítaria, o muestras de semen.
NB: Este método puede adaptarse convenientemente a placas de plástico de 24 pocillos.
i)
Se agrupan las muestras de tejido y se hace una suspensión al 10% en medio de cultivo. Se
centrifuga y se retiran los restos. El semen puro se diluye al 1/10 en medio de cultivo.
ii)
Se inoculan cultivos en tubos de ensayo (con cubres sueltos) que contienen monocapas confluentes o
subconfluentes de células bovinas susceptibles con 0,1 ml de cada muestra. El cultivo se deja
absorber durante 1 hora a 37°C.
iii)
Se lava el cultivo con 1 ml de medio; después se desecha y se añade 1 ml de medio de mantenimiento
de cultivo.
iv)
El cultivo se incuba durante 4–5 días a 37°C y se examina microscópicamente para detectar ECP o
síntomas de citotoxicidad.
v)
El cultivo puede ser congelado y descongelado para pases a cultivos frescos, o se puede retirar el
cubre, fijarlo con acetona y teñirlo con un conjugado de inmunofluorescencia directa para BVDV. En
este caso, se debe examinar en un microscopio de fluorescencia para observar la característica
fluorescencia citoplásmica difusa de los pestivirus.
Alternativamente, los cultivos pueden recogerse por congelación/descongelación y pasarse a placas
microtituladas para cultivo y para tinción por el método de la inmunoperoxidasa (ver la sección anterior
sobre el método de la inmunoperoxidasa en microplaca para examen masivo de muestras de suero) o por el
método de inmunofluorescencia descrito aquí.
b)
Enzimoinmunoensayo para detección del antígeno
Se han publicado varios métodos de enzimoinmunoensayo (ELISA) para detección del antígeno (por
ejemplo, ref. 26) y hay algunos kits comercializados. La mayoría están basados en el principio del ELISA
tipo sandwich, con un anticuerpo de captura ligado a la fase sólida, y un detector de anticuerpo conjugado a
un sistema de señal, tal como la peroxidasa. Se describen ambos sistemas basados en anticuerpos
monoclonales y policlonales. La prueba es adecuada para la detección de animales infectados
persistentemente y por lo general mide el antígeno de DVB en lisados de leucocitos periféricos de la
sangre; la nueva generación de ELISAs de captura de antígenos (ELISAs de captura ERNS) son capaces de
detectar antígeno de DVB en la sangre así como en muestras de plasma o suero. El mejor método da una
sensibilidad similar al aislamiento del virus, y puede ser el preferido en aquellos casos raros donde una
viremia persistente se combina con seropositividad. El ELISA puede tener una baja sensibilidad en
presencia de anticuerpos contra el BVDV del calostro. En presencia de anticuerpos, se debería usar la PCR
con trascripción inversa (RT–PCR), ya que es el método de detección más sensible en esta circunstancia.
El antígeno ELISA parece ser menos útil para la detección del virus en infecciones agudas de DVB.
c)
Inmunohistoquímica
Los métodos de marcaje con enzima son útiles para detectar antígeno de BVDV en cortes de tejido (69),
particularmente cuando se dispone de MAbs adecuados. Es importante que los reactivos y procedimientos
usados estén completamente validados, y que se elimine la reactividad inespecífica. Para ganado infectado
persistentemente puede usarse casi cualquier tejido, pero se obtienen mejores resultados con nódulos
linfáticos, glándula tiroidea, piel, cerebro, cuarta cavidad del rumen y placenta. Se ha demostrado que las
biopsias de la piel son útiles para el diagnóstico in–vivo de infección persistente por BDV.
d)
Detección del ácido nucleico
El método PCR–RT se puede adaptar a la detección de ARN vírico de DVB para fines de diagnóstico
(9, 32, 40, 42). Esto puede tener un valor especial cuando se sospecha contaminación vírica de bajo nivel,
por ejemplo en lotes sospechosos de FCS, o en productos biológicos tales como vacunas (34). Se necesita
precaución en la interpretación de los resultados, ya que la detección de ARN vírico no implica per se que el
virus infeccioso esté presente. Se puede utilizar PCR múltiple para amplificar y tipificar virus de cultivo
celular, o de muestras de sangre, originando productos de PCR de diferente tamaño (30). Las últimas
metodologías incorporan el uso de sondas, que confirman la identidad del producto de PCR, proporcionan
lectura automatizada y permiten también diferenciar entre pestivirus (48). Se deben evitar las pruebas para
detectar virus después de la inoculación de cultivos celulares utilizando PCR ya que pueden dar resultados
positivos si se ha usado suero fetal bovino en el medio de crecimiento. Se deben seleccionar cebadores
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Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
para regiones conservadas del genoma tales como la región 5'–no codificante, o la NS3 (gen de la p80).
Las pruebas moleculares son propensas a contaminación en personal no entrenado adecuadamente.
Consecuentemente, se deberían tomar precauciones rigurosas para evitar la contaminación por ADN en el
sistema de la prueba, y se deben aumentar los controles rigurosos (ver Capítulo I.1.3, Validación y control
de calidad de los métodos de reacción en cadena de la polimerasa utilizados para el diagnóstico de
enfermedades infecciosas).
La técnica RT–PCR también es lo suficientemente sensible como para permitir la detección de vacas
lactantes con infección persistente en una manada de hasta 100 animales o más, analizando las células
somáticas en la leche completa (22, 58). Un resultado positivo indica que al menos uno de tales animales
está presente en la manada ordeñada. Se necesita seguimiento mediante aislamiento del virus o pruebas
de detección del antígeno para identificar al individuo(s).
Se puede detectar el ácido nucleico vírico en tejidos mediante hibridación in situ con ribo–sondas ligadas a
enzima (19). Esta es una técnica sensible que se puede aplicar a tejido incluido en parafina y fijado con
formalina, permitiendo de esa forma un análisis retrospectivo.
2.
Pruebas serológicas
Se pueden detectar anticuerpos contra el BVDV en sueros de ganado mediante pruebas estándar de
neutralización de virus (NV) o mediante ELISA, utilizando uno de los varios métodos publicados (24, 36, 39, 55).
Deben incluirse en cada prueba sueros control positivos y negativos. Estos deberían dar resultados dentro de
límites predeterminado para que la prueba se considere válida. Un ELISA para detectar anticuerpos en muestras
de leche completa puede proporcionar una indicación del estado de DVB en una manada (52). Un valor de
ELISA de 1.0 o más unidades de absorbancia indica una alta probabilidad de que la manada ha estado expuesta
al BVDV en un pasado reciente, muy probablemente debido a la presencia de uno o más animales con viremia
persistente. Como contraste, un valor muy bajo o negativo (≤ 0,2) indica que es improbable que haya
animales persistentemente virémicos. Se ha sugerido una categorización adicional para valores
intermedios, pero depende del sistema de crianza en uso. En al menos un estudio, se ha demostrado que los
valores ELISA son un indicador poco fiable de la presencia en explotaciones de animales persistentemente
infectados (70). Se ha sugerido que la determinación de la presencia de anticuerpos en un número pequeño de
ganado joven (9–18 meses) es un indicador de una exposición reciente al BVDV (35), pero estos son
dependientes igualmente del grado de contacto entre diferentes grupos de animales en la manada. Se pueden
utilizar "pruebas puntuales" rápidas en un examen inicial como parte del control de DVB y de programas de
erradicación (44).
a)
Pruebas de neutralización del virus
La mayoría de los laboratorios utilizan cepas de BVDV adaptadas al laboratorio muy citopatogénicas para
pruebas de NV porque facilitan su lectura, aunque en la actualidad hay técnicas de inmunomarcaje que
permiten la detección del crecimiento o la neutralización de cepas no citopatogénicas cuando se considere
deseable. No es probable que haya ninguna única cepa ideal para todas las circunstancias, pero en la
práctica se debería seleccionar una que detecte la mayor proporción de reacciones serológicas en la
población local de ganado. Dos cepas citogénicas ampliamente utilizadas son "Oregón C24V" y NADL". La
prueba de neutralización que utiliza la cepa tipo 1 del virus no detecta niveles bajos de anticuerpo contra el
virus tipo 2 de DVB, y viceversa (29). Es importante que se usen en la prueba los tipos 1 y 2 de DVB y no
sólo aquel que se sospeche que está presente, ya que esto puede conducir a un informe incorrecto.
A continuación se incluye el esquema de un protocolo para una prueba de microtitulación de NV (24):
i)
Los sueros de la prueba se inactivan por calor durante 30 minutos a 45°C.
ii)
De una dilución inicial de 1/5 se hacen diluciones seriadas dobles en una placa para microtitulación de
96 pocillos con el fondo plano, utilizando medio de cultivo celular como diluyente. Para cada muestra,
se utilizan dos o cuatro pocillos en cada dilución, dependiendo del grado de precisión requerido.
También deberían probarse sueros control positivos y negativos.
iii)
Se añade a cada pocillo un volumen igual (por ejemplo 50 µl ) de un stock de cepa citopatogénica de
BVDV que contiene 100 DICT50 (50%), dosis infectivas medias de cultivo de tejido. También se hace
una titulación del stock del virus en algunos pocillos de repuesto para comprobar la potencia del virus
(límites de aceptación 30–300 DICT50).
iv)
La placa se incuba durante 1 hora a 37°C.
v)
Un recipiente con células adecuadas (por ejemplo de cornetes o testículos bovinos) se tripsiniza y la
concentración celular se ajusta a 3 x105/ml. Se añaden 50 µl de la suspensión celular a cada pocillo
de la placa de microtitulación.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
b)
vi)
La placa se incuba a 37°C durante 4 días, en atmósfera de CO2 al 5% o con la placa cerrada.
vii)
Los pocillos se examinan al microscopio para detectar ECP. El título de NV para cada suero es la
dilución a la cual se neutraliza el virus en 50% de los pocillos. Esto se puede calcular mediante el
método de Spearman–Kärber. Un animal seronegativo no mostrará neutralización a la dilución más
baja (1/5), equivalente a la dilución final de 1/10.
Enzimoinmunoensayo
Se pueden usar pruebas tanto indirectas como bloqueantes (36, 39, 55). Existen en el mercado algunos kits
comerciales. La mayor dificultad para configurar la prueba radica en la preparación de un antígeno vírico
con suficiente potencia. El virus ha de cultivarse bajo condiciones óptimas utilizando un tipo de célula muy
permisivo. Ningún suero utilizado en el medio debe inhibir el crecimiento del BVDV. El tiempo óptimo para la
recogida debe determinarse experimentalmente para el sistema individual de cultivo. El virus se puede
concentrar y purificar por centrifugación en gradiente de densidad. Alternativamente, puede prepararse un
antígeno potente mediante tratamiento de cultivos de células infectadas con detergentes, tales como
Nonidet P40, Mega 10, Triton X–100 o 1–octyl–beta–D–glucopiranósido (OGP). También se han utilizado
células enteras fijadas e infectadas como antígeno. En el futuro, se hará más uso de antígeno artificiales
producidos por expresión genes viíricos específicos en sistemas bacterianos o eucarióticos (64). Tales
sistemas deberían validarse probando sueros específicos contra un gran espectro de cepas diferentes de
virus. En el futuro, esta tecnología debería permitir la producción de pruebas serológicas complementarias a
vacunas marcadoras o con subunidades, permitiendo de esa forma la diferenciación entre el ganado
vacunado y el infectado naturalmente.
A continuación se incluye un esquema de un protocolo para un ELISA indirecto (24).
i)
Se inoculan cultivos rodantes de células secundarias de testículo de ternero con alta multiplicidad de
infección (alrededor de uno) con cepa Oregón C24V de BVDV, mantenidas con medio sin suero e
incubadas durante 24 horas a 37°C.
ii)
Las células se separan y se centrifugan. Se retira el sobrenadante del medio. El precipitado se trata
con dos volúmenes de 2% de OGP en PBS durante 15 minutos a 4°C, y se centrifuga para retirar los
restos de células. El antígeno de sobrenadantes se almacena en pequeñas alícuotas a –70°C, o
liofilizado. Las células no infectadas se procesan en paralelo para hacer un antígeno control.
iii)
El antígeno se diluye hasta una dilución predeterminado en 0,05 M de tampón bicarbonato, pH
9,6. Filas alternas de una placa de microtitulación de ELISA se cubren con antígenos víricos y con
antígeno control durante la noche a 4°C. Las placas se lavan en PBS con 0,05% de Tween 20 o
Tween 80 (PBST) antes de su utilización en la prueba.
iv)
Los sueros problema se diluyen 1/50 en diluyente de suero (0,5 M de NaCl; 0,01 M de tampón fosfato;
0,05 % de Tween 20; 0,001 M de ácido etilén diamino tetracético; 1% de polivinil pirrolidona, pH 7,2) y
se añaden a pocillos revestidos de antígeno vírico y de antígeno control durante 1 hora a 37°C. Las
placas se lavan después cinco veces con PBST.
v)
Se añade IgG antibovina de conejo conjugada con peroxidasa a una dilución predeterminada (en
suero diluyente) durante 1 hora a 37°C, y después se lavan las placas de nuevo cinco veces en PBST.
vi)
Se añade un sustrato adecuado de la enzima, tal como peroxido de hidrógeno/ tetrametil benzidina.
Después del desarrollo de color, se para la reacción con ácido sulfúrico y se lee la absorbancia en un
lector de placas ELISA. El valor obtenido con el antígeno control se resta de la reacción problema para
dar un valor de absorbancia neto para cada suero.
vii)
Se recomienda convertir los valores de absorbancia neta a relación muestra: positiva (o porcentaje de
positividad), dividiendo la absorbancia neta por la absorbancia neta en esa prueba de un suero
positivo estándar que tiene una absorbancia neta de alrededor de 1,0. Este procedimiento de
normalización conduce a resultados más significativos y reproducibles.
C. REQUÍSITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
La infección por el tracto orofaríngeo y respiratorio es probablemente la ruta de transmisión del BVDV más
importante en las granjas. La protección contra la dispersión por esta forma tendría un efecto beneficioso para
controlar la enfermedad debida al virus, particularmente en animales jóvenes. Se requiere también la formulación
de una vacuna que proporcione protección al feto para prevenir el amplio espectro de síndromes que resultan de
una infección in útero (12).
Aún no se ha desarrollado una vacuna estándar para protección contra la infección, pero hay algunas
preparaciones comerciales disponibles, por ejemplo, en Europa y Norteamérica. Tradicionalmente, las vacunas
1134
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Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
de DVB se han basado en una cepa citopatogénica del virus y son de dos clases: vacunas con virus vivos
modificados o vacunas inactivadas.
Aunque las vacunas con virus vivos se encuentran disponibles en algunos países, deberían utilizarse bajo
cuidadoso control veterinario porque una cepa citopatógenica puede precipitar la enfermedad mucosal por
sobreinfección de animales virémicos persistentes, mientras que en ganado gestante, un componente no
citopatogénico de la vacuna puede cruzar la placenta e infectar el feto como se describe en la Sección B.b. La
vacuna con virus vivos puede ser también imunosupresora y provocar otras infecciones. Por otra parte, las
vacunas con virus vivos modificados pueden requerir solamente una dosis única. Las vacunas constituidas
adecuadamente que contienen virus muertos son seguras pero, para obtener niveles satisfactorios de inmunidad,
requieren generalmente vacunaciones de refuerzo, lo que puede ser molesto. Un protocolo de vacunación
combinada usando virus inactivados seguido de vacunas con virus vivos puede reducir el riesgo de reacción
adversa a la cepa viva (28).
Se han descrito vacunas experimentales inactivadas basadas en la glicoproteína vírica E2 de DVB expresada por
baculovirus. Ofrecen una perspectiva futura de "vacunas marcadoras" cuando se usan en conexión con una
prueba serológica complementaria (14).
El BVDV es particularmente importante como riesgo en la producción de materiales biológicos para uso
veterinario por la alta frecuencia de contaminación de lotes de FCS utilizados como suplemento de medio de
cultivo (34). Especial atención se debe proporcionar a los sueros diseñados para administración a animales, o
utilizados como suplemento de crecimiento en transferencia de embriones o procedimientos de fertilización in–
vitro. El suero usado para tales fines debería tratarse para garantizar la esterilidad. Se recomienda que las
pruebas post–tratamiento, tal como se detallan en el Capítulo I.1.5., se utilicen para asegurar que el suero está
libre de BVDV.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se dan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción
de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 intentan ser de naturaleza general y se
pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Una vacuna ideal debería contener una cepa (o cepas) de virus que se haya demostrado que protege
contra la amplia diversidad antigénica demostrada por BVDV. Se puede obtener una buena apreciación de
las características antigénicas de cepas individuales mediante análisis con series de MAbs (56). La
identidad del virus del inóculo se debería confirmar por secuenciación (60).
La emergencia de genotipo 2 DVB ha planteado preguntas respecto al grado de protección conferido por
vacunas de tipo 1 contra genotipo 2. Un estudio in–vitro de la habilidad neutralizante de los sueros
inducidos por una vacuna reveló una amplia reactividad con diversas cepas de Europea y de EE.UU.,
incluyendo cepas tipo 2 (33). Otro trabajo ha mostrado que la vacuna derivada de un genotipo puede
proporcionar un grado de protección del otro (17, 18, 47). Sin embargo, la eficacia de la vacunación de
cualquier genotipo, particularmente con una vacuna muerta, es menos predecible en evitar la transmisión
transplacental, ya que la viremia raramente se evita por completo.
Aislados de virus citopático se mezclan a menudo con el biotipo no citopático. La separación y purificación
de los dos biotipos de un cultivo inicial mezclado depende de tres ciclos de una técnica de dilución limitante
para el virus nocitopatogénico, o de tres ciclos de selección de calvas para el virus citopatogénico. La
pureza del virus citopatogénico debe confirmarse mediante al menos un paso adicional de dilución limitante.
Cuando se han clonado los aislados, su identidad debería confirmarse mediante tinción directa o indirecta
con anticuerpo específico ligado a fluoresceína o enzima.
b)
Método de cultivo
Ambos biotipos crecerán en una variedad de cultivos celulares de origen bovino. Se pueden utilizar
procedimientos estándar, con la expectativa de recoger virus no citopatogénico a los 5–7 días y virus
citopatogénico a los 2–4 días. Los detalles para un rendimiento óptimo dependen de varios factores,
incluyendo el cultivo celular y el aislado utilizado y la proporción de inoculación inicial del virus (38).
c)
Validación como vacuna
Todas las vacunas deberían pasar pruebas estándar de inocuidad y eficacia. Es crucial asegurar que los
cultivos celulares y el suero bovino fetal incluido en el medio de cultivo estén libres de BVDV espontáneo y
de anticuerpo (descrito en la Sección B), y de otros microorganismos. Se debe demostrar que las vacunas
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1135
Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
vivas son seguras en el ganado (es decir, sin transmisión al feto), o bien se autorizan con una advertencia
para no utilizarlas en animales gestantes. Las vacunas vivas que contienen cepas citopatogénicas tienen
una advertencia apropiada sobre el riesgo de inducir enfermedad mucosal en ganado infectado
persistentemente.
Las pruebas de eficacia de vacunas de DVB en ganado no gestante están limitadas por la dificultad de
establecer un modelo satisfactorio de desafío. Las pruebas deberían incluir como mínimo la demostración
de seroconversión después de la vacunación, reducción en la eliminación del virus después de la
inoculación de desafío en ganado vacunado, y disminución de los parámetros clínicos medibles, tales como
respuesta de temperatura rectal y leucopenia (3, 12, 38). Las vacunas propuestas para uso en ganado
adulto deberían evaluarse por su eficacia en reducir la transmisión transplacentaria, consiguiendo, desde un
punto de vista ideal, la prevención completa. En este caso, se puede establecer un sistema adecuado de
desafío por inoculación intranasal de virus no citopatogénico en vacas gestantes con menos de 90 días de
gestación (12). Generalmente este sistema producirá con fiabilidad crías persistentemente virémicas en
vacas no inmunes.
2.
Método de producción
No hay un método estándar de producción de una vacuna DVB, pero se pueden usar las técnicas
convencionales de laboratorio con cultivos celulares estacionarios, rodantes o en suspensión (micro–
transportadores). Las vacunas inactivadas se pueden preparar por métodos convencionales, tales como
inactivación con etilenimina binaria o beta–propiolactona (38, 53). Se pueden usar una variedad de adyuvantes
(38, 51).
3.
Control en el proceso
Los cultivos han de inspeccionarse regularmente para asegurar que están libres de contaminación, y para
controlar la salud de las células y el desarrollo o ausencia de ECP de modo apropiado.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas de esterilidad y ausencia de contaminación de los productos biológicos se pueden encontrar
en el Capítulo I.1.5.
b)
Inocuidad
Es esencial que se elimine todo el material infeccioso durante la preparación de una vacuna inactivada, y
las muestras deben someterse a varios pases en cultivo celular para asegurar la ausencia de BVDV vivos.
También puede resultar necesario asegurarse de que varios agentes prohibidos están ausentes
(previamente a la inactivación) antes de que se autorice la utilización de la vacuna.
c)
Potencia
Idealmente, la potencia de la vacuna debe determinarse mediante inoculación en terneros seronegativos y
sin virus, y analizando después la respuesta de anticuerpos; sin embargo, esto es muy caro para el control
de lotes. El contenido antigénico se puede probar por ELISA y ajustarse según se requiera a un nivel
estándar de la vacuna en particular (3, 46). No existen protocolos de ensayo estandarizado que puedan
aplicarse a todas las vacunas. Los lotes de vacunas vivas pueden probarse por titulación de la infectividad.
d)
Duración de la inmunidad
Existen pocas publicaciones sobre la duración de los anticuerpos después de la vacunación con un
producto comercial. Los protocolos en uso recomiendan generalmente un procedimiento inicial de dos
inoculaciones y recuerdos con intervalos anuales. Solo se dispone de datos limitados sobre los niveles de
anticuerpos que se correlacionan con la protección contra las infecciones respiratorias (6, 37) o las
infecciones in útero (12).
e)
Estabilidad
No hay normativas aceptadas en cuanto a la estabilidad de las vacunas contra la DVB, pero se supone que
una vacuna viva atenuada (liofilizada) debe permanecer activa por lo menos durante 1 año si se mantiene a
4°C. Las vacunas con virus inactivados pueden tener una caducidad mayor a 4°C. En ambos casos, las
temperaturas inferiores pueden prolongar la caducidad, aunque los adyuvantes en las vacunas inactivadas
pueden evitarlo.
1136
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
f)
Precauciones
El BVDV no se considera un peligro para la salud humana. Unas buenas prácticas microbiológicas estándar
deberían ser adecuadas para manejar el virus en el laboratorio.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Pruebas de inocuidad
La inocuidad del producto final, tanto en el caso de las vacunas vivas como inactivadas, debe determinarse
en terneros susceptibles para la aparición de reacciones locales después de su administración, y en ganado
gestante para sus efectos en el ternero neonato. Las pruebas para lotes individuales se describen en la
Sección C.4.b.
b)
Pruebas de potencia para antigenicidad
Se debe demostrar que las vacunas contra la BVD producen una respuesta inmune adecuada, como se
indica en la Sección C.4.c., cuando se usan con su formación final según las instrucciones publicadas por el
fabricante. Se pueden utilizar ensayos in–vitro (Sección C.4.c.) para controlar los lotes individuales.
REFERENCIAS
1.
BAKER J.C. (1995). The clinical manifestations of bovine viral diarrhea infection. Vet. Clin. North. Am. – Food
Animal Practice, 11, 425–445.
2.
BIELANSKI A., SAPP T. & LUTZE W ALLACE C. (1998). Association of bovine embryos produced by in vitro
fertilization with a noncytopathic strain of bovine viral diarrhea virus type II. Theriogenol., 49, 1231–1238.
3.
BOLIN S.R. (1993). Immunogens of bovine viral diarrhea virus. Vet. Microbiol., 37, 263–271.
4.
BOLIN S.R. (1995). The pathogenesis of mucosal disease. Vet. Clin. North. Am., 11, 489–500.
5.
BOLIN S.R. & RIDPATH J.F. (1992). Differences in virulence between two noncytopathic bovine viral diarrhea
viruses in calves. Am. J. Vet. Res., 53, 2157–2163.
6.
BOLIN S.R. & RIDPATH J.F. (1995). Assessment of protection from systemic infection or disease afforded by
low to intermediate titers of passively acquired neutralizing antibody against bovine viral diarrhea virus in
calves. Am. J. Vet. Res., 56, 755–759.
7.
BOLIN S.R., RIDPATH J.F., BLACK J., MACY M. & ROBLIN R. (1994). Survey of cell lines in the American Type
Culture Collection for bovine viral diarrhea virus. J. Virol. Methods, 48, 211–221.
8.
BOOTH P.J., STEVENS D.A., COLLINS M.E. & BROWNLIE J. (1995). Detection of bovine viral diarrhoea virus
antigen and RNA in oviduct and granulosa cells of persistently infected cattle. J. Reprod. Fertil., 105, 17–24.
9.
BROCK K.V. (1995). Diagnosis of bovine viral diarrhea virus infections. Vet. Clin. North. Am., 11, 549–561.
10. BROWNLIE J. (1985). Clinical aspects of the bovine virus diarrhoea/mucosal disease complex in cattle. In
Practice, 7, 195–202.
11. BROWNLIE J. (1990). The pathogenesis of bovine virus diarrhoea virus infections. Rev. sci. tech. Off. int.
Epiz., 9, 43–59.
12. BROWNLIE J., CLARKE M.C., HOOPER L.B. & BELL G.D. (1995). Protection of the bovine fetus from bovine viral
diarrhoea virus by means of a new inactivated vaccine. Vet. Rec., 137, 58–62.
13. BROWNLIE J., CLARKE M.C. & HOWARD C.J. (1984). Experimental production of fatal mucosal disease in cattle.
Vet. Rec., 114, 535–536.
14. BRUSCHKE C.M., VAN OIRSCHOT J.M. & VAN RIJN P.A. (1999). An experimental multivalent bovine virus
diarrhea virus E2 subunit vaccine and two experimental conventionally inactivated vaccines induce partial
fetal protection in sheep. Vaccine, 17, 1983–1991.
15. CARMAN S., VAN DREUMEL T., RIDPATH J., HAZLETT M., ALVES D., DUBOVI E., TREMBLAY R., BOLIN S., GODKIN A. &
ANDERSON N. (1998). Severe acute bovine viral diarrhea in Ontario, 19931995. J. Vet. Diagn. Invest., 10,
27–35.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1137
Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
16. CLARKE M.C., BROWNLIE J. & HOWARD C.J. (1987). Isolation of cytopathic and non–cytopathic bovine viral
diarrhoea virus from tissues of infected animals. En: Pestivirus Infections of Ruminants, Harkness J.W., ed.
Commission of the European Communities, Brussels, Belgium, EUR10238, 3–10.
17. CORTESE V.S., W EST K.H., HASSARD L.E., CARMAN S. & ELLIS J.A. (1998). Clinical and immunologic responses
of vaccinated and unvaccinated calves to infection with a virulent type–II isolate of bovine viral diarrhea
virus. J. Am. Vet. Med. Assoc., 213, 1312.
18. DEAN H.J. & LEYH R. (1999). Cross–protective efficacy of a bovine viral diarrhea virus (BVDV) type 1 vaccine
against BVDV type 2 challenge. Vaccine, 17, 1117–1124.
19. DESPORT M., COLLINS M.E. & BROWNLIE J. (1994). Detection of bovine virus diarrhoea virus RNA by in situ
hybridisation with digoxigenin–labelled riboprobes. Intervirology, 37, 269–276.
20. DONIS R.O. (1995). Molecular biology of bovine viral diarrhea virus and its interactions with the host. Vet.
Clin. North. Am., 11, 393–423.
21. DREW T.W., SANDVIK T., W AKELEY P., JONES T. & HOWARD P. (2002). BVD virus genotype 2 detected in British
cattle. Vet. Rec., 151, 551.
22. DREW T.W., YAPP F. & PATON D.J. (1999). The detection of bovine viral diarrhoea virus in bulk milk samples
by the use of a single–tube RT–PCR. Vet. Microbiol., 64, 145–154.
23. DUFFELL S.J. & HARKNESS J.W. (1985). Bovine virus diarrhoea–mucosal disease infection in cattle. Vet. Rec.,
117, 240–245.
24. EDWARDS S. (1990). The diagnosis of bovine virus diarrhoea–mucosal disease in cattle. Rev. sci. tech. Off.
int. Epiz., 9, 115–130.
25. EDWARDS S. (1993). Bovine viral diarrhea virus. En: Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, Doyle A.,
Griffiths J.B. & Newell D.G., eds. John Wiley & Sons, Chichester, UK. Module 7B:5, 1–8.
26. ENTRICAN G., DAND A. & NETTLETON P.F. (1995). A double monoclonal antibody ELISA for detecting pestivirus
antigen in the blood of viraemic cattle and sheep. Vet. Microbiol., 43, 65–74.
27. FRAY M.D., MANN G.E., BLEACH E.C.L., KNIGHT P.G., CLARKE M.C. & CHARLESTON B. (2002). Modulation of sex
hormone secretion in cows by acute infection with bovine viral diarrhoea virus. Reproduction, 123, 281–289.
28. FREY H.R. & EICKEN K. (1995). Untersuchungen über die Wirksamkeit einer inaktivierten BVD–Vakzine sur
Erhöhung der Sicherheit einer BVD–Lebendvakzine. Tierarztl. Umsch., 50, 86–93.
29. FULTON R.W., SALIKI J.T., BURGE L.J., DOFFAY J.M., BOLIN S.R., MAES R.K., BAKER J.C. & FREY M.L. (1997).
Neutralizing antibodies to type–1 and type–2 bovine viral diarrhea viruses – detection by inhibition of viral
cytopathology and infectivity by immunoperoxidase assay. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 4, 380–383.
30. GILBERT S.A., BURTON K.M., PRINS S.E. & DEREGT D. (1999). Typing of bovine viral diarrhea viruses directly
from blood of persistently infected cattle by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol., 37, 2020–2023.
31. GROOMS D.L., BROCK K.V. & WARD L.A. (1998). Detection of bovine viral diarrhea virus in the ovaries of cattle
acutely infected with bovine viral diarrhea virus. J. Vet. Diagn. Invest., 10, 125–129.
32. HAMEL A.L., W ASYLYSHEN M.D. & NAYAR G.P.S. (1995). Rapid detection of bovine viral diarrhea virus by using
RNA extracted directly from assorted specimens and a one–tube reverse transcription PCR assay. J. Clin.
Microbiol., 33, 287–291.
33. HAMERS C., DI VALENTIN E., LECOMTE C., LAMBOT M., JORIS E., GENICOT B. & PASTORET P.–P. (2002). Virus
neutralising antibodies against 22 bovine viral diarrhoea virus isolates in vaccinated calves. Vet. J., 163, 61–
67.
34. HARASAWA R. (1995). Adventitious pestivirus RNA in live virus vaccines against bovine and swine diseases.
Vaccine, 13, 100–103.
35. HOUE H., BAKER J.C., MAES R.K., RUEGG P.L. & LLOYD J.W. (1995). Application of antibody titers against
bovine viral diarrhea virus (BVDV) as a measure to detect herds with cattle persistently infected with BVDV.
J. Vet. Diagn. Invest., 7, 327–332.
36. HOWARD C.J., CLARKE M.C. & BROWNLIE J. (1985). An enzyme–linked immunosorbent assay (ELISA) for the
detection of antibodies to bovine viral diarrhoea virus (BVDV) in cattle sera. Vet. Microbiol., 10, 359–369.
1138
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
37. HOWARD C.J., CLARKE M.C. & BROWNLIE J. (1989). Protection against respiratory infection with bovine virus
diarrhoea virus by passively acquired antibody. Vet. Microbiol., 19, 195–203.
38. HOWARD C.J., CLARKE M.C., SOPP P. & BROWNLIE J. (1994). Systemic vaccination with inactivated bovine virus
diarrhoea virus protects against respiratory challenge. Vet. Microbiol., 42, 171–179.
39. KATZ J.B. & HANSON S.K. (1987). Competitive and blocking enzyme–linked immunoassay for detection of
fetal bovine serum antibodies to bovine viral diarrhea virus. J. Virol. Methods, 15, 167–175.
40. KIM S.G. & DUBOVI E.J. (2003). A novel simple one–step single–tube RT–duplex PCR method with an internal
control for detection of bovine viral diarrhoea virus in bulk milk, blood, and follicular fluid samples.
Biologicals, 31, 103–106.
41. KIRKLAND P.D., MACKINTOSH S.G. & MOYLE A. (1994). The outcome of widespread use of semen from a bull
persistently infected with pestivirus. Vet. Rec., 135, 527–529.
42. LETELLIER C. & KERKHOFS P. (2003). Real–time PCR for simultaneous detection and genotyping of bovine
viral diarrhea virus. J. Virol. Methods, 114, 21–27.
43. LINDBERG A., ORTMAN K. & ALENIUS S. (2000). Seroconversion to bovine viral diarrhea virus (BVDV) in dairy
heifers after embryo transfer. 14th International Congress on Animal Reproduction Stockholm, Sweden,
Volume I, p. 250.
44. LINDBERG A.L.E. & ALENIUS S. (1999). Principles for eradication of bovine viral diarrhoea virus (BVDV)
infections in cattle populations. Vet. Microbiol., 64, 197–222.
45. LOEHR B.I., FREY H.R., MOENNIG V. & GREISER W ILKE I. (1998). Experimental induction of mucosal disease:
consequences of superinfection of persistently infected cattle with different strains of cytopathogenic bovine
viral diarrhea virus. Arch. Virol., 143, 667–679.
46. LUDEMANN L.R. & KATZ J.B. (1994). Enzyme–linked immunosorbent assay assessment of bovine viral
diarrhea virus antigen in inactivated vaccines using polyclonal or monoclonal antibodies. Biologicals, 22, 21–
27.
47. MAKOSCHEY B., JANSSEN M.G.J., VRIJENHOEK M.P., KORSTEN J.H.M. & VANDER MAREL P. (2001). An inactivated
bovine virus diarrhoea virus (BVDV) type 1 vaccine affords clinical protection against BVDV type 2. Vaccine
19, 3261–3268.
48. MCGOLDRICK A., BENSAUDE E., IBATA G., SHARP G. & PATON D. J. (1999). Closed one–tube reverse
transcription nested polymerase chain reaction for the detection of pestiviral RNA with fluorescent probes. J.
Virol. Methods, 79, 85–95.
49. MEYLING A. (1984). Detection of BVD virus in viraemic cattle by an indirect immunoperoxidase technique.
En: Recent Advances in Virus Diagnosis (CEC Seminar), McNulty M.S. & McFerran J.B., eds. Martinus
Nijhoff, Belfast, UK, 37–46.
50. MOENNIG V. & LIESS B. (1995). Pathogenesis of intrauterine infections with bovine viral diarrhea virus. Vet.
Clin. North. Am., 11, 477–487.
51. NEATON H.J. (1986). Which BVD vaccine should I use? Vet. Med., 81, 876–881.
52. NISKANEN R. (1993). Relationship between the levels of antibodies to bovine viral diarrhoea virus in bulk tank
milk and the prevalence of cows exposed to the virus. Vet. Rec., 133, 341–344.
53. PARK B.K. & BOLIN S.R. (1987). Molecular changes of bovine viral diarrhea virus polypeptides treated with
binary ethylenimine, beta–propiolactone and formalin. Res. Rep. Rural Dev. Admin. (L&V) Korea, 29, 99–
103.
54. PATON D.J., GOODEY R., BROCKMAN S. & W OOD L. (1989). Evaluation of the quality and virological status of
semen from bulls acutely infected with BVDV. Vet. Rec., 124, 63–64.
55. PATON D.J., IBATA G., EDWARDS S. & W ENSVOORT G. (1991). An ELISA detecting antibody to conserved
Pestivirus epitopes. J. Virol. Methods, 31, 315–324.
56. PATON D.J., SANDS J.J. LOWINGS J.P., SMITH J.E., IBATA G., EDWARDS S. (1995). A proposed division of the
pestivirus genus using monoclonal antibodies, supported by cross–neutralisation assays and genetic
sequencing. Vet. Res., 26, 92–109.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1139
Capítulo 2.10.6.— Diarrea vírica bovina
57. PELLERIN C., VANDENHURK J., LECOMTE J. & TIJSSEN P. (1994). Identification of a new group of bovine viral
diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities. Virology, 203, 260–268.
58. RADWAN G.S., BROCK K.V., HOGAN J.S. & SMITH K.L. (1995). Development of a PCR amplification assay as a
screening test using bulk milk samples for identifying dairy herds infected with bovine viral diarrhea virus.
Vet. Microbiol., 44, 77–91.
59. REVELL S.G., CHASEY D., DREW T.W. & EDWARDS S. (1988). Some observations on the semen of bulls
persistently infected with bovine virus diarrhoea virus. Vet. Rec., 123, 122–125.
60. RIDPATH J.F. BOLIN S.R. & DUBOVI E.J. (1994). Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes.
Virology, 205, 66–74.
61. RUTH G.R. (1987). Bovine viral diarrhea: a difficult infection to diagnose. Vet. Med., 81, 870–874.
62. TRAUTWEIN G., HEWICKER M., LIESS B., ORBAN S. & GRUNERT E. (1986). Studies on transplacental
transmissibility of a bovine virus diarrhoea (BVD) vaccine virus in cattle. III. Occurrence of central nervous
system malformations in calves born from vaccinated cows. J. Vet. Med., B33, 260–268.
63. TSUBOI T. & IMADA T. (1998). Detection of BVDV in bovine embryos derived from persistently infected heifers
by PCR. Vet. Rec., 142, 114–115.
64. VANDERHEIJDEN N., DEMOERLOOZE L., VANDENBERGH D., CHAPPUIS G., RENARD A. & LECOMTE C. (1993).
Expression of the bovine viral diarrhoea virus osloss–p80 protein: its use as ELISA antigen for cattle serum
antibody detection. J. Gen. Virol., 74, 1427–1431.
65. VANROOSE G., NAUWYNCK H., VAN SOOM A., VANOPDENBOSCH E. & DE KRUIF A. (1998). Replication of
cytopathic and noncytopathic bovine viral diarrhea virus in zona–free and zona–intact in vitro–produced
bovine embryos and the effect on embryo quality. Biol. Reprod., 58, 857–866.
66. VILCEK S., PATON D.J., DURKOVIC B., STROJNY L., IBATA G., MOUSSA A., LOITSCH A., ROSSMANITH W., VEGA S.,
SCICLUNA M.T. & PALFI V. (2001). Bovine viral diarrhoea virus genotype 1 can be separated into at least
eleven genetic groups. Arch. Virol., 146, 99–115.
67. VOGES H., HORNER G.W., ROWE S. & W ELLENBERG G.J. (1998). Persistent bovine pestivirus infection localized
in the testes of an immuno–competent, non–viremic bull. Vet. Microbiol., 61, 165–175.
68. WALZ P.H., BELL T.G., GROOMS D.L., KAISER L., MAES R.K. & BAKER J.C. (2001). Platelet aggregation
responses and virus isolation from platelets in calves experimentally infected with type 1 or type II bovine
viral diarrhea virus. Can. J. Vet. Res., 65, 241–247.
69. W ILHELMSEN C.L., BOLIN S.R., RIDPATH J.F., CHEVILLE F.N. & KLUGE J.P. (1991). Lesions and localization of
viral antigen in tissues of cattle with experimentally induced or naturally acquired mucosal disease, or with
naturally acquired chronic bovine viral diarrhea. Am. J. Vet. Res., 52, 269–275.
70. ZIMMER G., SCHOUSTRA W. & GRAAT E. A.M. (2002). Predictive values of serum and bulk milk sampling for the
presence of persistently infected BVDV carriers in dairy herds. Res. Vet. Sci., 72, 75–82.
*
* *
NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la Diarrea bovina vírica (ver Cuadro en la Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int).
1140
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO 2.10.7.
ENCEFALITIS DEL OESTE DEL NILO
RESUMEN
El virus del Oeste del Nilo (WNV) es un miembro del género Flavivirus de la familia Flaviviridae. El
arbovirus se mantiene en la naturaleza a través de aves y mosquitos; numerosas especies de
aves y de mosquitos permiten la replicación del virus. En muchas especies de aves, la infección
por WNV no produce síntomas evidentes mientras que en otras, como el cuervo americano
(Corvus brachirhynchos) y el arrendajo azul (Cyanocitta cristata) la enfermedad es generalizada y
mortal. Entre los mamíferos, la enfermedad clínica se muestra primariamente en caballos y
humanos.
Los síntomas clínicos de infección por WNV en caballos derivan de la encefalitis inducida por virus
o encefalomielitis. Las infecciones dependen de la transmisión del mosquito y son estacionales en
climas templados, alcanzando el máximo a comienzos de otoño en el Hemisferio Norte. Los
caballos afectados muestran frecuentemente una ataxia benigna o grave. Los síntomas pueden
variar desde ligera descoordinación hasta postración. Algunos caballos muestran debilidad,
fasciculación muscular y problemas en los nervios craneales. La fiebre no es una característica
normalmente presente en la enfermedad de los caballos.
Identificación del agente: Los tejidos de aves contienen generalmente concentraciones más altas
del virus que los de los caballos. El cerebro y la médula espinal son los tejidos preferidos para el
aislamiento del virus en los caballos. En las aves, el riñón, corazón, cerebro o intestino pueden
proporcionar aislamientos de virus. Los cultivos celulares (por ejemplo, de riñón de conejo o de
células Vero) se usan frecuentemente para el aislamiento del virus. El WNV es citopático en
sistemas de cultivo susceptibles. Se pueden detectar el ácido nucleico vírico y los antígenos víricos
en tejidos de animales infectados, por la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción
inversa (PCR–RT) o por inmunohistoquímica, respectivamente. El método más sensible para
identificar WNV en tejidos equinos es un procedimiento de PCR–RT con formato anidado.
Pruebas serológicas: El anticuerpo se puede identificar en el suero equino
por
enzimoinmunoensayo con IgM de captura (ELISA con IgM de captura), inhibición de la
hemaglutinación (IH), ELISA con IgG o neutralización por reducción de calvas (NRC). Los métodos
IH y el RNP son los que se usan con más frecuencia para identificar anticuerpos de EON en suero
de aves. En algunas pruebas serológicas, se pueden encontrar reacciones cruzadas del anticuerpo
con flavovirus relacionados, tales como el virus de la encefalitis de St. Louis o el virus de la
encefalitis japonesa.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Existen disponibles una vacuna
de WNV inactivada con formalina derivada de cultivo de tejido y una vacuna de WNV con vectores
de canarypoxvirus vivos para uso en caballos.
A. INTRODUCCIÓN
El virus del Oeste del Nilo (WNV) es un arbovirus zoonósico transmitido por mosquitos que pertenece al género
Flavivirus de la familia Flaviviridae. El género Flavivirus incluye el virus de la encefalitis japonesa (ver Capítulo
2.5.14), el virus de la encefalitis de St. Louis, y el virus Kunjin, entre otros (5). El WNV tiene un campo geográfico
amplio que incluye partes de Europa, Asia, Africa, Australia y Norteamérica. Se cree que las aves migratorias son
las responsables de la dispersión del virus, incluyendo la reintroducción del WNV de áreas endémicas a regiones
que experimentan brotes esporádicos (5). El WNV se mantiene por un ciclo de transmisión mosquito-pájaromosquito, mientras que los humanos y los caballos se consideran hospedadores finales. El análisis genético de
los aislados de EON divide las cepas en dos clases. Los aislados del linaje 1 se encuentran en África central y
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1141
Capítulo 2.10.7. — Encefalitis del Oeste del Nilo
del norte, Israel, Europa, India, Australia (virus de Kunjin) y América del Norte. Las cepas del linaje 2 son
endémicas en África central y del Sur y de Madagascar, con co–circulación de los linajes de ambos virus en
África Central (2, 6). Mientras que los brotes recientes en humanos y en equinos se deben a virus del linaje
1, cepas de ambos linajes han estado implicadas en la enfermedad de humanos y de animales.
El WNV se ha reconocido como un patógeno humano en África durante la primera mitad del siglo 20. Aunque se
han descrito varias epidemias de fiebre por EON, antes de 1996 la encefalitis como consecuencia de la infección
humana por EON era rara, pero desde entonces, los brotes de encefalitis del Oeste del Nilo se han descrito en
humanos en Rumania, Rusia, Israel y Norteamérica (3, 10, 11). Durante los años 1960, la encefalitis del Oeste
del Nilo de caballos se describió en Egipto y Francia (17, 19). Desde 1998, se han descrito brotes de encefalitis
equina por EON en Italia, Francia y Norteamérica (7, 14, 15). En Norteamérica, de 1999 a 2002, se extendió
ampliamente desde una pequeña región a toda costa Este del estado de Nueva York hasta incluir la mayor parte
de los Estados Continentales de América (EE.UU.) y Canadá, con un número creciente de caballos y aves
salvajes afectados cada año (15, 16, 22).
El periodo de incubación de la encefalitis equina por EON después de la transmisión del mosquito es de 3–
15 días. Una rápida viremia de baja titulación precede la aparición clínica (4, 19). La encefalitis por EON tiene
lugar en un porcentaje pequeño de caballos infectados; la mayor parte de los infectados no exhibe síntomas
clínicos (15). La enfermedad en caballos se caracteriza frecuentemente por ataxia suave o grave. Además, los
caballos pueden mostrar debilidad, fasciculación muscular y problemas en los nervios craneales (7, 15, 16, 20).
La fiebre no es una característica siempre presente. El tratamiento es de mantenimiento y los síntomas pueden
solucionarse o progresar hasta la postración terminal. La tasa de mortalidad es aproximadamente de uno de
cada tres caballos afectados clínicamente. El diagnóstico diferencial incluye otras encefalitis arbovíricas (por
ejemplo la encefalomielitis equina venezolana, del este o del oeste, la encefalitis japonesa) la mielitis equina por
protozoos (Sarcocystis neurona), el herpesvirus–1 equino, la enfermedad de Borna y la rabia.
Aunque muchas especies de aves, incluyendo los pollos, son resistentes a la enfermedad, el resultado de la
infección es generalmente mortal en aves susceptibles. Las aves pueden mostrar síntomas neurológicos antes
de la muerte (21). El WNV se ha detectado como enfermedad esporádica en un número pequeño de otras
especies, incluyendo ardillas, ardillas listadas, murciélagos, perros, gatos, renos, ovejas, alpacas, caimanes y
focas coincidiendo la enfermedad con periodos intensos de actividad vírica. La mayoría de las infecciones en
humanos se producen por transmisión natural de los mosquitos, pero se han descrito infecciones adquiridas en el
laboratorio. En casos clínicos sospechosos, las muestras de diagnóstico de todos los animales, particularmente
aves, deberían manejarse a nivel 3 de contención siguiendo procedimientos de laboratorio apropiados (ver
Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología) (18).
Debido a la presencia de infecciones de EON no aparentes, los criterios de diagnóstico deben incluir una
combinación de evaluación clínica y pruebas de laboratorio.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
a)
Cultivo
Las muestras para el aislamiento del virus incluyen el cerebro y la médula espinal de caballos encefalíticos
(15, 16); para tener éxito se debe utilizar una variedad de tejidos de aves incluyendo el corazón, cerebro e
intestino (21). En general, los aislados de virus se obtienen más fácilmente de las muestras aviares. Los
virus pueden propagarse en cultivos celulares susceptibles, tales como riñón de conejo (RK–13) y células
de riñón de mono verde africano (Vero), o en huevos de pollo embrionados. Es menos probable que las
inoculaciones intracerebrales de ratones recién nacidos produzcan aislamientos de virus en tejidos de
mamíferos que los métodos de cultivo celular. Puede necesitarse más de un pase de cultivo celular para
observar efecto citopático (EC). La confirmación de aislados de WNV se logra mediante tinción indirecta con
anticuerpos fluorescentes de cultivos infectados o por métodos de detección del ácido nucleico (ver más
adelante)
b)
Métodos inmunológicos
La tinción inmunohistoquímica (TH) de tejidos aviares fijados con formalina es un método fiable para la
identificación de infección por EON en aves. La especificidad de la identificación (por ejemplo flavivirus–
específico o WNV–específico) depende de la selección del anticuerpo detector. Los tejidos de cerebro y la
médula espinal de caballos con encefalitis por EON son positivos de modo irregular en pruebas de IHC;
aproximadamente el 50% de los casos de encefalitis equina por EON producen resultados falsos negativos.
La imposibilidad de identificar antígenos de WNV en el sistema nervioso central equino no excluye la
infección.
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Capítulo 2.10.7. — Encefalitis del Oeste del Nilo
c)
Métodos de reconocimiento del ácido nucleico
La detección del ácido nucleico por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (PCR–
RT) aumenta significativamente la identificación de tejidos infectados por WNV, particularmente cuando se
aplica la PCR anidada a muestras frescas, sin fijar, de cerebro y de médula espinal de caballos (12). El
método de la PRC–RT anidada para detectar ácido nucleico de WNV que codifica una porción del gen E se
describe a continuación. Este método se desarrolló utilizando un aislado de Norteamérica 1999 y ha
resultado eficaz para detectar ARN de WNV en tejidos animales durante brotes recientes en Norteamérica.
El virus de la encefalitis de St. Louis no se detecta por este método. Los virus del Oeste del Nilo del linaje
1 de China (República Popular de), Francia, Egipto, Israel, Italia, Kenia, México y Rusia muestran una
secuencia de nucleótidos altamente conservada en la región diana, independientemente de la especies de
origen. El análisis de la información de la secuencia para la cepa del linaje 2 de Uganda 1937 (Banco de
Genes M12294) en la región marcada por los cebadores de la PCR indica que no es de esperar que ocurra
la amplificación de las cepas del linaje 2 de WNV. No se han examinado otros virus del serogrupo de la
encefalitis japonesa. Los métodos no anidados, incluyendo la PCR en tiempo real, tienen menos riesgo de
contaminación cruzada en el laboratorio y pueden aplicarse con éxito a las muestras de tejido de aves (13).
Los tejidos seleccionados para PCR son los mismos que los seleccionados para los intentos de aislamiento
del virus.
•
Procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa anidada por transcripción inversa (RT—mPCR)
La RT–nPCR aquí descrita incluye varios procedimientos: extracción de ARN, transcripción inversa para
generar ADN de ARN y el primer paso de la PCR, el segundo paso de la PCR utilizando cebadores
"anidados" y, finalmente, la detección de un amplicon de tamaño apropiado por electroforesis en gel. Las
regiones del gen de la proteína E de EON de 445 bp (pares de bases) y 248 bp se amplifican en el primer
paso y en los procedimientos de anidación, respectivamente. Los kits y reactivos descritos a continuación
se proporcionan como un ejemplo. Pueden existir productos equivalentes de otras fuentes. Se requiere un
cuidado extremo en el manejo de todos los materiales y es esencial la inclusión de los controles adecuados
para asegurar los resultados precisos. Las precauciones que hay que tomar se han descrito en el Capítulo
I.1.4. Validación y Control de Calidad de los Métodos de Reacción en Cadena de la Polimerasa utilizados
para el Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas. Se debe procesar y analizar por duplicado cada muestra
de diagnóstico para aumentar la confianza en los resultados de la prueba. Se deben tener las precauciones
oportunas cuando se manejen reactivos de riesgo como el bromuro de etidio.
•
Extracción del ARN vírico
Extraer el ARN total de 50 a 100 mg de tejido utilizando reactivo Trizol® (Life Technologies, Grand Island,
NY, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Extraer también ARN total del stock control de
virus EON conteniendo 10–100 dosis infectivas de cultivo de tejido (DICT50) por 100 µl de volumen.
•
Trascripción inversa y primera fase de PCR
Cebadores de la primera fase:
1401: 5’–ACC–AAC–TAC–TGT–GGA–GTC–3’
1845: 5’–TTC–CAT–CTT–CAC–TCT–ACA–CT–3’
i)
Suspender las muestras de ARN extraído en 12 µl de ARNasa libre de agua.
ii)
Desnaturalizar a 70°C durante 10 minutos.
iii)
Añadir 2 µl de cada muestra de ARN a 48 µl de mezcla para RT–PCR que tiene una composición final
de:
10 mM Tris/HCl, pH 8,3
50 mM KCl
2,0 mM MgCl2
0,8 mM del conjunto de deoxinucleósidos trifosfato (dNTP)
25 unidades de RT de M–MLV (transcriptasa inversa del virus Moloney de la leucemia murina)
1,25 unidades de inhibidor de la ARNase
1,25 unidades de AmpliTaq GoldTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.)
37.5 pmol de los cebadores de la primera fase.
Incluir controles "sin ARN" usando 2 µl de ARNasa libre de agua en vez de ARN desnaturalizado.
iv)
Incubar los tubos de reacción a 45°C durante 45 minutos.
v)
Incubar los tubos de reacción a 95°C durante 11 minutos.
vi)
Amplificación por PCR durante 35 ciclos.
Desnaturalización a 95°C durante 30 segundos,
Anillamiento del cebador a 55°C durante 45 segundos,
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Capítulo 2.10.7. — Encefalitis del Oeste del Nilo
Extensión del cebador a 72°C durante 60 segundos (al ciclo 35, extensión del cebador a 72°C durante
5 minutos).
vii)
Mantener las muestras a 4°C hasta la segunda fase de la PCR.
•
Segunda fase (anidada) de PCR
Cebadores de la segunda fase:
1485: 5’–GCC–TTC–ATA–CAC–ACT–AAA–G–3’
5’–CCA–ATG–CTA–TCA–CAG–ACT–3’
i)
Para cada muestra y el control, añadir 1.5 µl del producto amplificado de la primera fase a 48,5 µl de
mezcla PCR con una composición final de:
10 mM Tris/HCl, pH 8,3
50 mM KCl
2,0 mM MgCl2
0,8 mM del conjunto de deoxinucleósidos trifosfato (dNTP)
1,25 unidades de AmpliTaq GoldTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.)
37,5 pmol de cada uno de los cebadores anidados.
ii)
Incubar los tubos de reacción a 95°C durante 11 minutos.
iii)
Amplificación por PCR durante 35 ciclos:
Desnaturalización a 95°C durante 30 segundos,
Anillamiento del cebador a 55°C durante 45 segundos,
Extensión del cebador a 72°C durante 60 segundos (al ciclo 35, extensión del cebador a 72°C durante
5 minutos).
iv)
Mantener las muestras a 4°C o –20°C hasta la electroforesis.
•
Análisis de los productos de PCR por electroforesis en gel
i)
Preparar una solución al 2,5% de agarosa NuSieve® 3/1 (FMC Bioproducts, Rockland, Maine, EE.UU.)
en 0,045 mM de Tris/borate, pH 8,6, 1.5 mM EDTA (ácido etilén diamino tetra–acético) (1 ‰ TBE
buffer). Hervir la agarosa en un calentador o microondas hasta completa disolución. Enfriar la agarosa
a 45–55°C. Añadir 5,0 µl de solución de bromuro de etidio (10 mg/ml) por 100 ml de agarosa caliente y
verter la agarosa con un peine. Dejar solidificar y retirar el peine.
ii)
Añadir 5,0 µl de solución de bromuro de etidio (10 mg/ml) por 600 ml de tampón 1 ‰ TBE de depósito.
Colocar el gel en el aparato y llenar los depósitos de tampón.
iii)
Mezclar 15 µl de cada muestra y control con 5 µl de solución de carga de gel (por ejemplo, Sigma G–
2526, St Louis, MO, EE.UU.) Incluir un ADN marcador de 100 bp (por ejemplo, Life Technologies,
Grand Island, NY, EE.UU., producto 15268–019, rango 100–1.500 bp) en al menos un pocillo del gel.
Cargar las muestras en los pocillos de agar e iniciar la electroforesis a 65–75 voltios hasta que el
colorante de gel de carga se desplace aproximadamente dos tercios de la longitud del gel.
iv)
Visualizar y fotografiar el gel con iluminación ultravioleta.
•
Interpretación de la prueba
Para que la prueba de PCR sea válida, los controles positivos han de mostrar la banda de tamaño
adecuado (248 bp). Los controles de "no ARN" no deberían tener bandas. Se considera que las muestras
son positivas si hay una banda del mismo tamaño que la del control positivo. Las muestras por duplicado
deberían mostrar la misma reacción. Si existe disparidad, se debería repetir la prueba, comenzando con la
extracción del tejido. Si se requiere una validación posterior, el producto de la PCR final anidada se puede
secuenciar y comparar con las secuencias publicadas de WNV en el Banco de Genes.
2.
Pruebas serológicas
Se pueden identificar anticuerpos en el suero equino por enzimoinmunoensayo de captura con IgM (ELISA de
captura con IgM), inhibición de la hemoaglutinación (IH), ELISA con IgG o neutralización por reducción de calvas
(NRC) (1, 9). El ELISA de captura con IgM descrito a continuación es particularmente útil para detectar
anticuerpos resultantes de la exposición natural a WNV. Generalmente, los anticuerpos IgM específicos de EON
equino son detectables entre el periodo de 7–10 días hasta 1–2 meses después de la infección. La mayoría de
los caballos con encefalitis EON dan positivo a la prueba de ELISA de captura con IgM a la vez que se observan
los primeros síntomas clínicos. Los anticuerpos neutralizantes de WNV son detectables en el suero equino
2 semanas después de la infección y pueden persistir durante más de 1 año. Los métodos de NRC y HI son los
más utilizados normalmente para la identificación de anticuerpos de EON en suero de aves. En algunos ensayos
serológicos, se pueden encontrar reacciones cruzadas del anticuerpo con flavivirus relacionados, como el virus
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Capítulo 2.10.7. — Encefalitis del Oeste del Nilo
de la encefalitis de St. Louis o el virus de la encefalitis japonesa. La prueba de NRC es las más específica de las
pruebas serológicas de EON; cuando sea necesario, se pueden probar en paralelo títulos de anticuerpo del
suero contra flavivirus relacionados. Finalmente, se debe considerar la historia de la vacunación de EON en la
interpretación de los resultados serológicos, particularmente en la prueba de NRC y ELISA con IgG. El ELISA de
captura con IgM se puede utilizar en especies de aves u otras especies siempre que se disponga de anticuerpo
de captura específico de la especie (por ejemplo, IgM anti–pollo). La prueba de NRC se aplica a cualquier
especie, incluyendo aves.
a)
ELISA de captura con IgM equina
Se pueden preparar antígenos de WNV y normales para ELISA de captura con IgM a partir de cerebro de
ratón
(ver Capítulo 2.5.3), cultivos de tejido, o líneas celulares recombinantes (8). En Norteamérica
hay marcas comerciales de reactivos de prueba de WNV. Se puede obtener suero control equino
caracterizado, aunque no es un estándar internacional, de los Laboratorios de los Servicios Veterinarios
Nacionales, Ames, Iowa, EE.UU. Se deberían preparar antígenos del virus y antígenos control en paralelo
para su uso en el ELISA. Las preparaciones del antígeno deben titularse con sueros control para optimizar
la sensibilidad y especificidad del ensayo. Las muestras de suero equino se prueban a una dilución de
1/400 y las muestras de líquido cerebroespinal equino se prueban a una dilución de 1/2 en el ensayo. Para
asegurar la especificidad, cada muestra de suero se prueba para controlar la reactividad tanto con el
antígeno del virus como con el antígeno control.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Revestir placas ELISA de 96 pocillos con fondo liso (por ejemplo Immulon 2HB, Dynex Technolgoies,
Chantilly, VA, EE.UU) con 100 µl por pocillo de IgM antiequina diluida en 0,5 M de tampón carbonato,
pH 9,6, de acuerdo con la dilución sugerida por el fabricante para uso como anticuerpo de captura.
ii)
Incubar las placas durante la noche a 4°C en una cámara húmeda. Las placas revestidas se pueden
almacenar durante varias semanas.
iii)
Antes de usarlas, lavar las placas dos veces con 200–300 µl/pocillo de solución salina tamponada con
fosfato 0,01 M, pH 7,2, que contenga 0,05% de Tween 20 (PBST).
iv)
Bloquear las placas añadiendo 300 µl/pocillo de leche seca desnatada al 5% recién preparada en
PBST e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, retirar la
solución bloqueante y lavar las placas tres veces con PBST.
v)
Diluir los sueros problema y control 1/400 (el líquido cerebroespinal se diluye 1/2) en PBST y añadir
50 µl/pocillo de cada muestra a pocillos duplicados (total de cuatro pocillos por muestra) sobre la
placa. Incluir control de suero positivo y negativo preparados de la misma forma que las muestras.
vi)
Cubrir las placas e incubar 75 minutos a 37°C en cámara húmeda.
vii)
Retirar el suero y lavar las placas tres veces en PBST.
viii) Diluir el virus y los antígenos normales en PBST y añadir 50 µl de antígeno vírico a un conjunto de
pocillos de sueros problema y sueros control y añadir 50 µl de antígeno normal al segundo conjunto
de pocillos de sueros prueba y control.
ix)
Cubrir las placas e incubar durante la noche a 4°C en cámara húmeda.
x)
Retirar los antígenos de los pocillos y lavar las placas tres veces en PBST.
xi)
Diluir anticuerpos monoclonales anti–Flavivirus conjugados con peroxidasa de rábano1 en PBST de
acuerdo con las indicaciones del fabricante y añadir 50 µl por pocillo.
xii)
Cubrir las placas e incubar a 37°C durante 60 minutos.
xiii) Retirar el conjugado y lavar las placas seis veces en PBST.
xiv) Añadir 50 µl/pocillo de substrato ABTS recién preparado (ácido 2,2'–azino–di–[3–etil–benzatiazolina]–
6–sulfónico) con peróxido de hidrógeno (0,1%) e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
xv)
1
Medir la absorbancia a 405 nm. Una muestra problema se considera positiva si la absorbancia de la
muestra problema en pocillos que contienen el antígeno del virus es al menos dos veces la
absorbancia del suero control negativo en pocillos que contienen el antígeno del virus y al menos dos
veces la absorbancia de la muestra probada en paralelo en pocillos que contienen antígeno control.
Disponible en centros de Prevención y Control de la Enfermedad, Reactivos de Referencia Biológica, 1600 Clifton Road
NE, Mail Stop C21, Atlanta, Georgia, 30000, EE.UU.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.7. — Encefalitis del Oeste del Nilo
b)
Neutralización por reducción de calvas (aplicable a suero de cualquier especie)
La prueba de NRC se lleva a cabo en cultivos celulares Vero en recipientes de 25 cm2 o en placas de
6 pocillos. Los sueros se pueden analizar a una dilución final de 1/10 y 1/100 o se pueden valorar para
establecer un punto final. A continuación se ofrece una descripción de la prueba llevada a cabo en
matraces de 25 cm2 utilizando 100 unidades formadoras de placas o calvas (PFU) del virus.
Previamente a la prueba, el suero se inactiva por calor a 56°C durante 30 minutos y se diluye en medios
(por ejemplo 1/5 y 1/50). Se prepara una dilución de virus (200 PFU por 0,1 ml) en medios que contengan
10% de complemento de cobaya. Se mezclan volúmenes iguales de virus y suero y se incuban a 37°C
durante 75 minutos antes de inocular 0,1 ml en monocapas de cultivos celulares confluentes. El inóculo se
absorbe durante 1 hora a 37°C, y después se añaden 4,0 ml de medio primario de cobertura. Este medio
primario está formado por dos soluciones que se preparan separadamente. La solución I contiene 2 x
Solución Salina Básica de Earle sin rojo fenol, 4% de suero bovino fetal, 100 µl/ml de gentamicina y 0,45%
de bicarbonato sódico. La solución II está formada por agar Noble al 2%, que se esteriliza y mantiene a
47°C. Se ajustan a 47°C volúmenes iguales de las soluciones I y II y se mezclan inmediatamente antes de
uso. La prueba se incuba durante 72 horas a 37°C. Se aplica a cada recipiente 4,0 ml de un segundo
medio de cobertura, preparado como se indicó anteriormente, pero conteniendo también rojo neutro al
0,003%. Después de otra incubación durante la noche a 37°C, se evalúa el número de calvas ocasionadas
por el virus en cada matraz. Los títulos de punto final se basan en la reducción al 90% en comparación con
recipientes con virus control, que deberían tener alrededor de 100 calvas.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
En Febrero de 2003, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) autorizó una vacuna de
WNV inactivada con formalina y derivada de cultivos de tejidos para uso en caballos. En Diciembre de 2003, el
USDA autorizó una vacuna viva de WNV que utiliza los canaripoxvirus como vector para uso en caballos. Estas
vacunas han mostrado ser eficaces y seguras en caballos vacunados adecuadamente. La vacunación puede ser
útil para evitar los síntomas neurológicos asociados con la infección de EON.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se indican en el Capítulo I.1.7. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las normas presentadas aquí y en el Capítulo I.1.7 son de naturaleza
general y puedan suplementarse con requisitos nacionales o regionales.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
El aislado de WNV utilizado para la producción de vacunas debe acompañarse de documentación que
describa su origen e historia. El aislado debe ser seguro en animales hospedadores a la edad de
vacunación deseada y proporcionar protección después de un inóculo de desafío.
b)
Método de cultivo
El WNV debe propagarse en líneas celulares que se sepa que mantienen el crecimiento de WNV. Las
líneas celulares deben estar libres de virus extraños, bacterias, hongos y micoplasmas. La propagación
vírica no debe exceder de cinco pases desde el inoculo del virus original, a menos que los pasos siguientes
demuestren que proporcionan protección en el animal hospedador.
c)
Validación como vacuna
El inóculo original de virus debe estar libre de bacterias, hongos y micoplasmas. Además debe probarse por
la técnica de anticuerpos fluorescentes que está libre de virus extraños, incluyendo el herpesvirus equino,
adenovirus equino, virus de la arteritis vírica equina, virus de la diarrea vírica bovina, reovirus, y virus de la
rabia. El inóculo original de virus debe estar libre de virus extraños por ECP y hemadsorción en la línea
celular Vero y en un tipo de células equinas embriónicas.
En un ensayo de inmunogenicidad, el inóculo original de virus debe proteger a los caballos susceptibles
contra una cepa de desafío virulenta en el nivel más alto de pases empleado para la producción. Debe
protegerse de la viremia a una cantidad estadísticamente significativa de caballos vacunados si se compara
con los controles. Deben realizarse estudios de ensayo de campo para determinar la seguridad de la
vacuna.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.7. — Encefalitis del Oeste del Nilo
2.
Método de producción
La línea celular susceptible se inocula en recipientes adecuados. Como medio para producción, se utiliza medio
mínimo esencial , suplementado con suero bovino fetal (SBF). Se incuba a 37°C.
Los cultivos celulares se inoculan directamente con virus activo almacenado de EON, que generalmente
presenta de 1 a 4 pasos del inóculo vírico original. Los cultivos inoculados se incuban durante 1–8 días antes de
recoger el medio de cultivo. Durante la incubación, los cultivos se observan diariamente para detectar ECP y
contaminación bacteriana.
Las vacunas de virus muertos son inactivadas químicamente con formalina o etilenimina binaria y se mezclan
con un adyuvante adecuado.
3.
Control del proceso
Los lotes de producción de EON se deben valorar en cultivos de tejido para la estandarización del producto. Los
lotes de baja titulación se pueden concentrar o combinar con lotes de alta titulación para alcanzar el título
correcto.
4.
Control de lotes
Las muestras de los recipientes finales se prueban para comprobar su pureza, seguridad y potencia.
a)
Pureza
Las muestras se examinan para detectar la contaminación bacteriana y fúngica. Para llevar a cabo los
controles de bacterias, se inoculan diez recipientes, cada uno conteniendo 120 ml de medio de soja e
hidrolizado de caseína, con 0,2 ml de muestras de diez recipientes finales. Las diez pruebas se incuban a
30–35°C durante 14 días y se observan para detectar crecimiento bacteriano. Para hacer pruebas de
hongos, se inoculan diez recipientes, cada uno con 40 ml de medio de soja e hidrolizado de caseína, con
0,2 ml de muestras de diez recipientes finales. Las pruebas se incuban a 20–25°C durante 14 días y se
observan para detectar el crecimiento de hongos.
b)
Inocuidad
Se pueden llevar a cabo pruebas de inocuidad combinando cobayas, ratones o caballos. Se deberían
realizar estudios de seguridad en el campo antes de que la vacuna reciba la aprobación final.
Generalmente, se emplean dos series, en tres localizaciones geográficas diferentes, y un mínimo de
600 animales. Alrededor de un tercio de los animales debería tener la edad mínima recomendada para la
vacunación (correlacionada con la eficacia). Si el producto final es una vacuna viva modificada, se requieren
pruebas de seguridad adicional del inóculo vírico original para demostrar la falta de virulencia.
c)
Potencia
Las vacunas con virus muertos pueden utilizar pruebas de vacunación/serológicas de animales de
laboratorio o de animales hospedadores o pruebas de vacunación/desafío para determinar la potencia del
producto final. Para determinar la potencia relativa de un producto, se consideran aceptables ensayos
paralelos utilizando técnicas ELISA de cuantificación del antígeno para comparar un estándar con el
producto final. Debe demostrarse que el estándar es protector en el animal hospedador (22). Los productos
víricos vivos se titulan en cultivos celulares para determinar la potencia del producto final. El título de
potencia final a la hora de expedir el producto debería incluir un 0,7 log10 adicional para compensar la
variabilidad de la prueba y un 0,5 log10 para la estabilidad a la fecha de caducidad, respecto a la dosis
protectora mínima establecida en la prueba de inmunogenicidad.
d)
Duración de la inmunidad
Los estudios de duración de la inmunidad se llevan a cabo antes de que la vacuna reciba la aprobación
final. La duración debería ser la misma que la de la estación del mosquito en las áreas infectadas.
e)
Estabilidad
Inicialmente, todas las vacunas tienen una validez de 24 meses antes de caducar. Se deben realizar
estudios de estabilidad en tiempo real para confirmar que las fechas de caducidad son las apropiadas.
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Capítulo 2.10.7. — Encefalitis del Oeste del Nilo
f)
Conservantes
Durante la producción se añaden antibióticos, generalmente sulfato de gentamicina o neomicina, que no
deben exceder de 30 µg/ml.
g)
Precauciones (riesgos)
Únicamente se recomienda la vacunación en caballos de zonas positivas al EON. Los caballos vacunados
pueden desarrollan un título serológico que podría interferir con la capacidad de exportación del caballo.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Ver la Sección C.4.b.
b)
Potencia
Ver la Sección C.4.c.
REFERENCIAS
1.
BEATY B.J., CALISHER C.H. & SHOPE R.E. (1989). Arboviruses. En: Diagnostic Procedures for Viral Rickettsial
and Chlamydial infections, Sixth Edition, Schmidt N.H. & Emmons R.W., eds. American Public Health
Association, Washington DC, USA, 797–856.
2.
BERTHET F.–X., ZELLER H.G., DROUET M.–T., RAUZIER J., DIGOUTTE J.–P. & DEUBEL V. (1997). Extensive
nucleotide changes and deletions within the envelope glycoprotein gene of Euro–African West Nile viruses.
J. Gen. Virol., 78, 2293–2297.
3.
BIN H., GROSSMAN Z., POKAMUNSKI S., MALKINSON M., W EISS L., DUVDEVANI P., BANET C. W EISMAN Y., ANNIS E.,
GANDAKU D., YAHALOM V., HINDYIEH M., SHULMAN L. & MENDELSON E. (2001). West Nile fever in Israel 1999–
2000: from geese to humans. Ann. NY Acad. Sci., 951, 127–142.
4.
BUNNING M.L., BOWEN R.A., CROPP B.C., SULLIVAN K.G., DAVIS B.S., KOMAR N., GODSEY M., BAKER D., HETTLER
D.L., HOLMES D.A., BIGGERSTAFF B.J. & MITCHELL C.J. (2002). Experimental infection of horses with West Nile
virus. Emerg. Infect. Dis., 8, 380–386.
5.
BURKE D.S. & MONATH T.P. (2001). Flaviviruses. En: Fields Virology, Fourth Edition, Knipe D.M. & Howley
P.M., eds. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania, USA, 1043–1125.
6.
BURT F.J., GROBBELAAR A.A., LEMAN P. A., ANTHONY F.S., GIBSON G.V.F. & SWANEPOEL R. (2002).
Phylogenetic relationships of Southern African West Nile virus isolates. Emerg. Infect. Dis., 8, 820–826.
7.
CANTILE C., DI GUARDO G., ELENI C. & ARISPICI M. (2000). Clinical and neuropathological features of West Nile
virus equine encephalomyelitis in Italy. Equine Vet. J., 32, 31–35.
8.
DAVIS B.S., CHANG G.J., CROPP B., ROEHRIG J.T., MARTIN D.A., MITCHELL C.J., BOWEN R. & BUNNING M.L.
(2001). West Nile virus recombinant DNA vaccine protects mouse and horse from virus challenge and
expresses in vitro a noninfectious recombinant antigen that can be used in enzyme–linked immunosorbent
assays. J. Virol., 75, 4040–4047.
9.
HAYES C.G. (1989). West Nile fever. En: The Arboviruses: Epidemiology and Ecology, Vol. 5, Monath T.P.,
ed. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 59–88.
10. HAYES C.G. (2001). West Nile virus: Uganda, 1937, to New York City, 1999. Ann. N.Y. Acad. Sci., 951, 25–37.
11. HUBALEK Z. & HALOUZKA J. (1999). West Nile fever – a reemerging mosquito–borne viral disease in Europe.
Emerg. Infect. Dis., 5, 643–650.
12. JOHNSON D.J., OSTLUND E.N., PEDERSEN D.D. & SCHMITT B.J. (2001). Detection of North American West Nile
virus in animal tissue by a reverse transcription–nested polymerase chain reaction assay. Emerg. Infect.
Dis., 7, 739–741.
13. LANCIOTTI R.S., KERST A.J., NASCI R.S., GODSEY M.S., MITCHELL C.J., SAVAGE H.M., KOMAR N., PANELLA N.A.,
ALLEN B.C., VOLPE K.E., DAVIS B.S. & ROEHRIG J.T. (2000). Rapid detection of West Nile virus from human
1148
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.7. — Encefalitis del Oeste del Nilo
clinical specimens, field–collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase–PCR
assay. J. Clin. Microbiol., 38, 4066–4071.
14. MURGUE B., MURRI S., ZIENTARA S., DURAND B., DURAND J.–P. & ZELLER H. (2001). West Nile outbreak in
horses in Southern France, 2000: The return after 35 years. Emerg. Infect. Dis., 7, 692–696.
15. OSTLUND E.N., ANDRESEN J.E. & ANDRESEN M. (2000). West Nile encephalitis. Vet. Clin. North Am., Equine
Pract., 16, 427–441.
16. OSTLUND E.N., CROM R.L., PEDERSEN D.D., JOHNSON D.J., W ILLIAMS W.O. & SCHMITT B.J. (2001). Equine West
Nile encephalitis, United States. Emerg. Infect. Dis., 7, 665–669.
17. PANTHIER R., HANNOUN C.L., OUDAR J., BEYTOUT D., CORNIOU B., JOUBERT L., GUILLON J.C. & MOUCHET J.
(1966). Isolement du virus Wet Nile chez un cheval de Camargue atteint d’encéphalomyélite. C.R. Acad.
Sci. (Paris), 262, 1308–1310.
18. RICHMOND J.Y. & MCKINNEY R.W., EDS (1999). Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,
Fourth Edition. United States Department of Health and Human Services. US Government Printing Office,
Washington DC, USA.
19. SCHMIDT J.R. & EL MANSOURY H.K. (1963). Natural and experimental infection of Egyptian equines with West
Nile virus. Ann. Trop. Med. Parasitol., 57, 415–427.
20. SNOOK C.S., HYMANN S.S., DEL PIERO F., PALMER J.E., OSTLUND E.N. BARR B.S., DEROSCHERS A.M. & REILLY
L.K. (2001). West Nile virus encephalomyelitis in eight horses. J. Am. Vet. Med. Assoc., 218, 1576–1579.
21. STEELE K.E., LINN M.J., SCHOEPP R.J., KOMAR N., GEISBERT T.W., MANDUCA R.M., CALLE P.P., RAPHAEL B.L.,
CLIPPINGER T.L., LARSEN T., SMITH J., LANCIOTTI R.S., PANELLA N.A. & MCNAMARA T.S. (2000). Pathology of
fatal West Nile virus infections in native and exotic birds during the 1999 outbreak in New York City, New
York. Vet. Pathol., 37, 208–224.
22. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE ANIMAL AND PLANT HEALTH INSPECTION SERVICE (2002). Summary
of West Nile virus in the United States. Available at: URL: http://www.aphis.usda.gov/oa/wnv/
23. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE ANIMAL AND PLANT HEALTH INSPECTION SERVICE, VETERINARY
SERVICES ME MORANDUM 800.90 (1998). Guidelines for Veterinary Biological Relative Potency Assays and
at:
URL:
Reference
Preparations
Based
on
ELISA
Antigen
Quantification. Available
http://www.aphis.usda.gov/vs/cvb/vsmemos.htm
*
* *
NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la fiebre del Oeste del Nilo (ver Cuadro en la Parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1149
CAPÍTULO 2.10.8.
CAMPYLOBACTER JEJUNI Y
CAMPYLOBACTER COLI
RESUMEN
Campylobacter jejuni y C. coli son las especies de Campylobacter aisladas con mayor frecuencia
en enfermos humanos infectados y se pueden transmitir directamente de los animales a los
humanos por contacto o por consumo y manipulación de alimentos de origen animal.
Tanto C. jejuni como C. coli colonizan normalmente el tracto intestinal de la mayoría de los
mamíferos y de las aves (especialmente pollos, patos y pavos). Generalmente, esta colonización
es persistente, a veces con emisiones externas del agente patógeno intermitentes, y normalmente
sin síntomas clínicos. La contaminación fecal de la carne (especialmente de la carne de aves)
durante su procesado se considera la mayor fuente de toxinfección alimentaria humana. La
colonización de Campylobacter en animales de compañía jóvenes y en animales de producción de
alimento (gatitos, cachorros, lechones, cordero y terneros), en algunos mamíferos pequeños
utilizados para estudios experimentales (hurones y ratas) y en varias especies aviares puede
asociarse con una enfermedad intestinal, pero no esta claro si Campylobacter es el agente
causante. En los humanos se pueden producir infecciones extraintestinales, incluyendo
bacteremia, y algunas secuelas de la infección, tales como polineuropatias, pueden ser graves,
aunque se presentan con poca frecuencia. Se desconoce la prevalencia de tales complicaciones
en animales. Tanto C. jejuni y C. coli, como C. fetus, se pueden aislar de fetos abortados bovinos y
ovinos, presumiblemente como consecuencia de translocación a través de la mucosa intestinal o
por infecciones ascendentes.
Aislamiento del agente: En mamíferos y aves, la detección de la colonización intestinal se basa
en el aislamiento del organismo en las heces, frotis rectales y/o contenidos del ciego. En el caso de
fetos abortados, Campylobacter se puede aislar del estómago del feto, de la placenta y de los
órganos internos. La contaminación de los productos alimenticios de origen animal se detecta por
aislamiento de Campylobacter directamente o después de enriquecimiento selectivo. Se han
descrito métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa para la detección de
Campylobacter en muestras fecales/intestinales y en muestras de carne enriquecida.
Identificación del agente: Campylobacter jejuni y Campylobacter coli son bacterias termófilas,
Gram negativas, muy móviles, que necesitan condiciones microaeróbicas a 37-42°C para su
crecimiento óptimo. Se necesitan medios de agar que contengan antibióticos selectivos para aislar
estas bacterias de muestras fecales/intestinales y de muestras de carne enriquecidas.
Alternativamente, se puede aprovechar su alta movilidad utilizando técnicas de filtración para su
aislamiento. Se pueden necesitar técnicas de enriquecimiento para organismos que hayan sido
dañados por estrés ambiental, como cambios términos, deshidratación, oxígeno atmosférico,
pérdida de nutrientes y shock osmótico, por ejemplo durante el transporte de la muestra. También
se pueden utilizar técnicas de enriquecimiento para detectar campilobacters cuando se presentan
en cantidades bajas (por ejemplo en muestras de carne).
La confirmación preliminar de aislados debe llevarse a cabo mediante microscopía óptica. Los
organismos característicos son bacterias Gram negativas, y, en la fase de crecimiento logarítmico,
son pequeñas y en forma de S. En cultivos más viejos, predominan las formas de cocos. Cuando
se examinan con el microscopio de contraste de fases, los organismos tienen un movimiento
rápido y característico como el de un sacacorchos. La identificación de los fenotipos se basa en
reacciones bajo diferentes condiciones de crecimiento. Se pueden utilizar pruebas bioquímicas y
1150
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.8. — Campylobacter jejuni y Campylobacter coli
moleculares para confirmar varias especies de Campylobacter. Generalmente, C. jejuni se puede
distinguir de todos los demás campilobacters mediante la hidrólisis de hipurato.
Existen varios métodos fenotípicos para subtipificar C. jejuni y C. coli incluyendo serotipificación y
tipificación por fagos, pero los reactivos que se necesitan para estas técnicas tienen una
disponibilidad restringida. Recientemente, se han desarrollado métodos de tipificación molecular y
se usan ampliamente con fines epidemiológicos. No existen relaciones obvias entre subtipos y
patogenicidad.
Pruebas serológicas: Las aves y los mamíferos colonizados, así como los humanos infectados,
desarrollan respuestas con anticuerpos circulantes a C.jejuni/coli. No existen pruebas serológicas
validadas para la detección de infecciones por Campylobacter, sino que se pueden utilizar en
enzimoinmunoensayo preparaciones simples de antígenos complejos incluyendo proteínas
superficiales extraíbles por ácido.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No existen vacunas efectivas
disponibles para la prevención de infecciones por Campylobacter entérico en aves o mamíferos.
A. INTRODUCCIÓN
El género Campylobacter comprende varias especies (34). Los miembros de este género son típicamente
bacterias Gram negativas, que no forman esporas, con forma de S o espiral (0,2–0,8 µm de ancho y 0,5–5 µm de
largo), con flagelos polares aislados a uno o a ambos extremos, lo que le confiere una movilidad característica,
como la de un sacacorchos. Estas bacterias son microaerófilas, pero algunas pueden crecer también
aeróbicamente o anaeróbicamente. No fermentan ni oxidan los carbohidratos. Algunas especies, particularmente
C. jejuni, C. coli y C. lari, son termófilas, y crecen óptimamente a 42°C. Pueden colonizar superficies mucosas,
generalmente del tracto intestinal, en la mayoría de las especies de mamíferos y de aves probadas. La especie
C. jejuni comprende dos subespecies ( C. jejuni subespecie jejuni y C. jejuni subespecie doylei) que pueden
diferenciarse sobre la base de la reducción del nitrato (la subespecie doylei no reduce el nitrato). La subespecie
jejuni se aísla más fácilmente que la subespecie doylei. Campylobacter jejuni y C. coli son las especies
patógenas más importantes, porque son agentes zoonósicos. Por tanto, este capítulo se centrará en estas
especies, a menos que se manifieste lo contrario. Campylobacter fetus, el agente causal de la campilobacteriosis
genital bovina, se revisa en el Capítulo 2.3.2.
En humanos susceptibles, la infección por C. jejuni/coli se asocia con enteritis aguda y dolor abdominal que dura
hasta 7 días o más. Aunque tales infecciones son autolimitadas, pueden producirse complicaciones, como
bacteremias, síndrome de Guillain-Barré, artritis reactiva y aborto (29).
Los campilobacters son la causa principal de enfermedades intestinales bacterianas en humanos identificadas en
muchos países industrializados (32). Más del 80% de los casos están producidos por C. jejuni y alrededor del
10% de los casos, por C. coli. Otras especies de Campylobacter, tales como C. consisus, C. upsaliensis, C. lari y
C. fetus, también pueden asociarse con diarrea en humanos. La detección de tales campilobacters es poco
común en el mundo industrializado pero más normal en los países en desarrollo (17). Ya que la incidencia de la
infección en humanos de los países industrializados se estima alrededor del 1% de la población por año, la carga
social y económica de esta enfermedad es significativa (12). Se cree que, básicamente, la fuente de infección por
C.jejuni/coli en humanos es la manipulación y/o el consumo de carne contaminada, especialmente carne de aves
de corral. Sin embargo, el contacto con animales domésticos y con ganado, el consumo de agua contaminada o
de leche cruda y los viajes a zonas donde la enfermedad es frecuente se consideran factores de riesgo para la
enfermedad en el hombre (12). El control de Campylobacter en la cadena alimenticia se ha convertido en el
objetivo más importante de las agencias responsables de la salud alimentaria a nivel mundial.
Generalmente, Campylobacter jejuni y C. coli se consideran comensales de ganado, animales domésticos y
aves. Sin embargo, también se han asociado con enfermedades en varios hospedadores. No está claro hasta
qué punto Campylobacter es el agente causante de la enfermedad o si puede colonizar mejor bajo determinadas
condiciones, por ejemplo, los contenidos líquidos del intestino. En perros y gatos, especialmente animales
jóvenes o animales sometidos a estrés, se asocia al C. jejuni con diarrea (11, 33), y ésta es una fuente de
infección humana bien reconocida (32). Los perros y gatos son también frecuentemente colonizados por
C. upsaliensis (perros) y C. helveticus (gatos) (3). Se han descrito brotes de enteritis asociada con
Campylobacter en algunos animales incluyendo grupos de reproducción de primates no humanos e incluso
pequeños mamíferos criados en laboratorio. Se han aislado grandes cantidades de Campylobacter de ganado
joven con enteritis, incluyendo lechones, corderos y terneros, pero también se encuentran organismos en
animales sanos. En las aves, especialmente aves de corral, la enfermedad es rara, a pesar de los altos niveles
de colonización con C. jejuni o C. coli. Se han descrito brotes de hepatitis aviar, pero el papel patogénico de
Campylobacter spp. en estos brotes no está claro. Una posible excepción son los avestruces, en las cuales se
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1151
Capítulo 2.10.8. — Campylobacter jejuni y Campylobacter coli
produce enteritis y muerte asociada con Campylobacter en los animales jóvenes. Los Campylobacter spp. se
encuentran con frecuencia en aves salvajes (7, 36).
Campylobacter jejuni, C. coli, C. hyointestinalis y C. sputorum, así como C. fetus (Capítulo 2.3.2), también
pueden asociarse con infecciones en el tracto reproductor (21). En el ganado, todas estas cepas se pueden
asociar con aborto. En ovejas hasta el 20% de los abortos asociados con Campylobacter se deben a C. jejuni o
C. coli. Tales infecciones, son presumiblemente consecuencia de traslocación del tracto gastrointestinal a través
de una ruta ascendente.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
Se está revisando actualmente (14) el procedimiento ISO (Organización Internacional de Estandarización)
existente para el método horizontal de detección de Campylobacter termotolerantes en alimentos y piensos
animales (13). Se está desarrollando un procedimiento ISO adicional para el aislamiento de Campylobacter del
agua (ISO/CD 17995:2002). Sin embargo, ninguno de estos métodos estándar pueden ser los óptimos para el
aislamiento de campilobacters en animales vivos.
Las muestras que se recolectan son las muestras fecales o intestinales (ciego) de aves de corral (pollos, pavos,
gallinas ponedoras, etc.) y de mamíferos productores de carne (ganado vacuno, ovejas y cerdos) y animales
domésticos (perros y gatos). En el matadero, se recogen muestras de piel o de carne. En casos esporádicos, por
ejemplo, en avestruces jóvenes, los campilobacters se asocian con enfermedades entéricas e, incluso, muerte.
En tales casos, y en fetos abortados, los campilobacters se recuperan de muestras de intestino, hígado y bazo
tomadas post-mortem.
Los campilobacters son organismos bastante difíciles de cultivar. Su recuperación del material fecal o de los
intestinos se puede llevar a cabo:
•
Aprovechando la rápida movilidad y el pequeño tamaño de campilobacters en relación con otra flora
intestinal, permitiendo que estos organismos pasen a través de los filtros de membrana sobre medio de
crecimiento en agar, o
•
Usando agar que contenga antibióticos selectivos, incluyendo generalmente varias combinaciones de
cefoperazona, anfoteracina-B, trimetoprim, vancomicina, etc., y
•
La recuperación de C. jejuni y C. coli termófilo utilizando los medios anteriores se puede mejorar por
crecimiento selectivo a la temperatura óptima de crecimiento de 42°C, lo que puede inhibir el crecimiento de
bacterias contaminantes.
a)
Recogida de muestras
i)
Aves de corral
Se ha descrito que las aves de corral son colonizadas sobre todo por C. jejuni (65-95%), con menos
frecuencia por C. coli y raramente por otras especies (23). Los índices de colonización en pollos están
relacionados con la edad. La mayor parte de las poblaciones son negativas hasta los 2-3 meses de
edad. Una vez que se produce la colonización por Campylobacter en poblaciones avícolas, la
transmisión por coprofagía es extremadamente rápida y pueden llegar a colonizarse en 72 horas hasta
el 100% de las aves dentro de una explotación. Las muestras de aves vivas, destinadas a la cadena
alimenticia, deberían tomarse tan próximas al momento del sacrificio como sea posible (23). La
mayoría de las aves albergan grandes cantidades de organismos (>106 unidades formadoras de
colonias por g de heces). Los campilobacter se pueden aislar a partir de vertidos fecales recientes.
Para la detección fiable de Campylobacter por cultivo, se deberían recoger heces recién evacuadas
(preferiblemente sin trazas de orina). Se debe impedir que tales muestras se sequen antes del cultivo.
Cuando se utilizan frotis, se debe utilizar un medio de transporte (como Amies, Cary Blair o Stuart).
ii)
Ganado vacuno, ovejas y cerdos
Los campilobacters son colonizadores frecuentes del intestino de ganado vacuno, ovejas y cerdos
(2, 37, 38). El ganado vacuno y las ovejas son colonizados fundamentalmente por C. jejuni, C. coli,
C. hyointestinalis y C. fetus, mientras que los cerdos son colonizados predominantemente por C. coli.
En mamíferos jóvenes, la proporción es más alta que en animales más viejos. En estos últimos, los
organismos se pueden detectar intermitentemente en las heces, probablemente debido al bajo número
o a emisiones intermitentes del agente. Han de tomarse muestras recientes (muestras rectales si es
posible) y se debe impedir que se sequen. Cuando se utilizan frotis, se debe utilizar un medio de
transporte (como Amies, Cary Blair o Stuart).
1152
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.8. — Campylobacter jejuni y Campylobacter coli
iii)
Perros y gatos
Ocasionalmente, se asocia a C. jejuni con enfermedad clínica en animales domésticos jóvenes,
particularmente enteritis. En tales casos la cantidad de organismos vertida puede ser alta. Los perros y
los gatos se encuentran colonizados frecuentemente por C. upsaliensis (perros) y C. helveticus (gatos)
(3). Las muestras fecales recogidas deben ser recientes y se debe impedir que se sequen. Cuando se
utilizan frotis, se debe utilizar un medio de transporte (como Amies, Cary Blair o Stuart).
iv)
Órganos internos (corazón, bazo, hígado o contenidos estomacales)
Los órganos se extraen post-mortem en condiciones asépticas y se envían al laboratorio el mismo día.
v)
Muestras de matadero
En las aves de corral, generalmente se utilizan los ciegos para la detección de Campylobacter. Se
pueden cortar con tijeras estériles de la parte restante del intestino y mandarlos intactos al laboratorio
en una bolsa de plástico o placa Petri. Para establecer el estado de un lote de animales al final de la
cadena de sacrificio, se deben recoger muestras de piel (piel del cuello o del pecho) o se pueden
llevar a cabo lavados generales del cuerpo del animal muerto, almacenando el líquido de lavado como
muestra a analizar posteriormente.
Las muestras de ganado vacuno, ovejas y cerdos se pueden recoger de los intestinos mediante
apertura aséptica de la pared del intestino o tomando frotis rectales. Las muestras de carne se pueden
recoger y transportar al laboratorio en una bolsa estéril.
La importancia de Campylobacter en el suministro de alimento ha sido revisada por Jacobs-Reitsma
(15).
b)
Transporte y tratamiento de muestras
i)
Transporte
Los campilobacters son muy sensibles a las condiciones ambientales, incluyendo deshidratación,
oxígeno atmosférico, luz solar y temperatura elevada. Por tanto, el transporte al laboratorio y posterior
procesado deben hacerse tan rápido como sea posible (preferiblemente el mismo día, y si no dentro
de los dos días siguientes). Las muestras no deben transportarse como frotis secos, ya que los
campilobacters se secarían y morirían rápidamente. Un medio de transporte adecuado aumenta la
probabilidad de mantener campilobacters cultivables en muestras de frotis. Las muestras se deben
proteger de la luz.
No se puede recomendar una temperatura ideal para el transporte, pero está claro que la congelación
o las temperaturas altas pueden reducir la viabilidad. Se deben evitar temperaturas altas (>20°C),
temperaturas bajas (<0°C) y fluctuaciones en la temperatura. Durante el procesado de laboratorio, las
muestras deben mantenerse a temperatura ambiente durante periodos cortos (para evitar choques
términos innecesarios). Cuando el tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y el procesado es
largo, se aconseja un almacenamiento a 4(±2) °C. Se deben seguir los procedimientos para
transporte, resumidos en el Capítulo I.1.1. Métodos de muestreo.
ii)
Medios de transporte
Frotis: Se recomienda el uso de tubos de transporte, conteniendo medios y frotis. Estos están
disponibles comercialmente. El medio para los tubos debe ser Amies, un agar simple o un medio con
base de carbón vegetal. La función del medio no es el crecimiento de Campylobacter sino proteger a
las muestras de la sequedad y de los efectos tóxicos del oxígeno.
Cuando solamente se puedan recoger cantidades pequeñas de muestras fecales/del ciego y no haya
tubos de transporte disponibles, se recomienda el envío del espécimen en medios de transporte. Se
han descrito varios medios de transporte: Cary-Blair, Cary-Blair modificado, medio Stuart modificado,
medio Campytioglicolato, agua con peptona alcalina y medio de prueba de movilidad semisólida. Se
han descrito buenos resultados de recuperación utilizando Cary-Blair (18, 28).
iii)
Tratamiento de las muestras
Las muestras han de procesarse tan pronto como lleguen al laboratorio, preferiblemente el día de
llegada o, al menos, durante los 3 días siguientes. Para evitar variaciones en la temperatura, las
muestras deberían refrigerarse únicamente cuando no se puedan procesar el mismo día; de otra
forma, se deben mantener a temperatura ambiente. Cuando las muestras se envían o se mantienen
en el laboratorio a 4°C, debe dejarse que se equilibren a temperatura ambiente antes de su
procesado, para evitar choques térmicos.
•
Para muestras fecales o intestinales, no se necesita ningún tratamiento, y se pueden poner
directamente sobre medios selectivos. Cuando se utiliza el método de filtración, se lleva a cabo
una suspensión de las heces (generalmente 1 en 10) en solución salina tamponada con fosfato
(PBS) y diluida de forma que se puedan poner gotas de la suspensión sobre el filtro.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1153
Capítulo 2.10.8. — Campylobacter jejuni y Campylobacter coli
c)
•
Los ciegos se abren asépticamente cortando el extremo con tijeras estériles y el material se saca
fuera, exprimiéndolo para su procesado.
•
Los contenidos del estomago fetal se inoculan directamente sobre un medio de cultivo adecuado.
Los órganos internos o trozos de los órganos se pasan por la llama después de meterlos en
alcohol (70%) para esterilizar la superficie, y posteriormente se homogenizan. El homogenado se
inocula en el medio de cultivo.
•
Las muestras de piel se juntan (hasta completar una cantidad total de 25 g) y se transfieren a un
medio de enriquecimiento. Las muestras de carne se pueden incubar en un medio de
enriquecimiento o se pueden lavar, y el medio de lavado se añade a un medio de
enriquecimiento. Si se utilizan grandes volúmenes, por ejemplo lavados de animales muertos, se
puede utilizar una solución salina estéril y añadirla a un volumen igual de medio de
enriquecimiento de doble concentración.
Aislamiento de Campylobacter
El aislamiento de Campylobacter de muestras fecales o intestinales se lleva cabo, generalmente, mediante
colocación directa sobre el medio selectivo o utilizando el método de filtración sobre agar no selectivo. Se
recomienda el enriquecimiento para aumentar la sensibilidad del cultivo de microorganismos potencialmente
estresado por las condiciones ambientales o en caso de bajos niveles de organismos en las heces de, por
ejemplo, ganado vacuno, ovejas y cerdos. Sin embargo, el enriquecimiento de estas últimas muestras no se
lleva a cabo rutinariamente. Generalmente, los productos de piel y carne necesitan enriquecimiento para el
cultivo de cantidades bajas de campilobacters (estresados). Después del enriquecimiento selectivo, las
muestras se subcultivan sobre medios selectivos sólidos.
i)
Medios selectivos para aislamiento
En la actualidad hay muchos medios en uso para el cultivo bacteriológico de Campylobacter spp.
Corry et al. (9, 10) proporcionan una descripción detallada de las novedades en la detección de
Campylobacter y la variedad de métodos existentes. Los medios selectivos se pueden dividir en dos
grupos fundamentales: medios que contienen sangre y medios que contienen carbón. Los
componentes de la sangre y del carbón sirven para eliminar los derivados tóxicos del oxígeno. La
mayor parte de los medios están disponibles comercialmente. La selectividad de los medios viene
determinada por los antibióticos utilizados. Se utilizan cefalosporinas (generalmente cefoperazona), a
veces en combinación con otros antibióticos (por ejemplo vancomicina, trimetroprim). Se utiliza
cicloheximida (actidiona) y más a menudo anfotericina B para inhibir a las levaduras y a los hongos
(20). La principal diferencia entre los medios es el grado de inhibición de la flora contaminante. Todos
los agentes selectivos permiten el crecimiento de C. jejuni y C. coli. No existe ningún medio disponible
que permita el crecimiento de C. jejuni e inhiba el de C. coli o viceversa. Hasta cierto punto, otras
especies de Campylobacter (por ejemplo C. lari, C. upsaliensis, C. helveticus, C. fetus y
C. hyointestinales) pueden crecer en la mayoría de los medios, especialmente a la temperatura menos
selectiva de 37°C. Si fuera necesario, se deberían determinar las especies del Campylobacter aislado.
Ejemplos de caldos de enriquecimiento selectivos:
•
•
•
•
•
Caldo Bolton
Caldo Preston
Caldo Exeter
Caldo Park y Sanders
CCDB (caldo con deoxicolato, cefoperazona y carbón)
Ejemplos de medios sólidos selectivos con sangre:
•
•
•
•
Agar Preston
Agar Skirrow
Agar Butzler
Campy-cefex
Ejemplos de medios sólidos con base de carbón
•
•
•
ii)
mCCDA (agar modificado con deoxicolate, cefoperazona y carbón), versión ligeramente
modificada de la CCDA descrita originalmente) (5, 6).
Agar Karmali o CSM (medio de carbón selectivo) (17)
Agar CAT (cefoperazona, anfotericina y teicoplanina), facilitador del crecimiento de
C. upsaliensis (1).
Inoculación de medios
Para muestras que no necesiten enriquecimiento, se extiende directamente una pequeña cantidad
(alrededor de 0.1 g utilizando un asa) sobre un medio selectivo sólido para facilitar el aislamiento de
colonias aisladas.
1154
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.8. — Campylobacter jejuni y Campylobacter coli
Para muestras que necesiten enriquecimiento (por ejemplo muestras de piel y carne), se diluyen 25 g
del material a 1/10 en medio de enriquecimiento. Las muestras de carne o las canales completas de
pollo se pueden lavar con solución salina o PBS, después de lo cual se añade un volumen de este
líquido de lavado a nueve volúmenes de medio de enriquecimiento. Se pueden añadir volúmenes más
grandes de líquido de lavado a un volumen igual de caldo de enriquecimiento de doble concentración.
Cuando se usan muestras de carne más pequeñas para el análisis, se pueden lavar con líquido de
enriquecimiento, que se incuba posteriormente.
Para fines de investigación se pueden enriquecer frotis fecales/del ciego. Se colocan en 10 ml de
caldo de enriquecimiento, bien individualmente o bien juntos, y se incuban.
iii)
Filtración pasiva
La filtración pasiva evita el uso de medios selectivos y es, por tanto, muy útil para el aislamiento de las
especies de Campylobacter más sensibles a los antimicrobianos. Este método fue desarrollado por
Steele & McDermott (30). Para filtración pasiva, las heces se mezclan con PBS (aproximadamente a
dilución de 1/10) para producir una suspensión. Aproximadamente 100 µl de esta suspensión se
depositan cuidadosamente sobre un filtro de 0,45 o 0,65 µm, que se ha colocado previamente sobre
una placa de agar sangre no selectiva. Ha de tenerse cuidado de no dejar que el inóculo se derrame
sobre el borde del filtro. Se deja que las bacterias se muevan a través del filtro durante 30-45 minutos
a 37°C o temperatura ambiente. Después se quita el filtro, el fluido que ha pasado a través del filtro se
extiende con un asa de vidrio estéril o con un extensor de plástico, y la placa se incuba
microaeróbicamente a 42°C (o a 37°C para aislar también especies que no sean C.jejuni/C.coli).
iv)
Incubación
•
Atmósfera
Se necesitan atmósferas microaeróbicas de 5-10% de oxígeno, 5-10% de dióxido de carbono (y
preferiblemente 5-9% de hidrógeno) para un crecimiento óptimo (10, 34). Se pueden producir
condiciones atmosféricas microaeróbicas adecuadas mediante diferentes métodos. En algunos
laboratorios, se utilizan evacuaciones repetidas del contenido de una jarra de gas seguidas de
sustitución de la atmósfera con gases embotellados. Hay disponibles kits generadores de gas de
fuentes comerciales. Si se trata de grandes cantidades de cultivos resultan más adecuados los
incubadores de atmósfera variable.
Para enriquecimiento, no se necesita ninguna atmósfera específica cuando se utiliza un pequeño
espacio de cabeza (<2 cm) en la botella de enriquecimiento, siempre que la tapa esté bien sellada.
•
Temperatura de incubación
Los medios se pueden incubar a 37°C o 42°C, pero es una práctica común incubar a 42°C para
minimizar el crecimiento de contaminantes y para seleccionar el crecimiento óptimo de C.jejuni/C.coli.
Se añaden los agentes fungostáticos: cicloheximida o anfotericina para impedir el crecimiento de
levaduras y hongos a 37°C (6). En algunos laboratorios, la incubación se produce a 41,5°C para
armonizar con los protocolos de aislamiento de Salmonella y Escherichia coli 0157 (13, 14). Para
enriquecimiento, se utilizan a veces protocolos específicos en los que se aumenta la temperatura
durante el tiempo de incubación para recuperar las células dañadas subletalmente.
•
Tiempo de incubación
El caldo de enriquecimiento se incuba durante 24-48 horas y se siembra por extensión sobre un medio
selectivo sólido.
Generalmente Campylobacter jejuni y C. coli manifiestan crecimiento sobre medios sólidos en 24–
48 horas a 42°C. Se recomiendan 48 horas de incubación para el diagnóstico rutinario, ya que el
número adicional de muestras positivas obtenidas mediante incubación prolongada es muy bajo (6).
v)
Identificación sobre medio sólido
En agar Skirrow u otros medios sólidos que contengan sangre, las colonias características de
Campylobacter son ligeramente rosadas, redondas, convexas, suaves y brillantes, con un borde
regular. En medios con base de carbón tales como mCCDA, las colonias típicas son grisáceas, planas
y húmedas, con tendencia a extenderse, y pueden tener brillo metálico.
d)
Confirmación
Se necesita un cultivo puro para pruebas confirmativas, pero se puede obtener una confirmación preliminar
mediante examen microscópico directo del material con colonias sospechosas.
Las pruebas confirmativas de la presencia de campilobacters termófilos y su interpretación (14) se
proporcionan en el Cuadro 1. Los resultados de las pruebas de confirmación se confirman utilizando
controles positivos y negativos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1155
Capítulo 2.10.8. — Campylobacter jejuni y Campylobacter coli
Cuadro 1. Pruebas confirmativas de Campylobacter termófilos
Prueba confirmatoria
Resultado para Campylobacter termófilo
Morfología
Bacilos curvados pequeños
Movilidad
Característica (muy móviles y con forma de sacacorchos)
Oxidasa
+
Glucosa(TSI)
–
Lactosa (TSI)
–
Sacarosa (TSI)
–
Gas (TSI)
–
Producción de H2S (TSI)
– (se pueden producir trazas de ennegrecimiento en presencia de C.coli)
Crecimiento a 25°C
–
TSI = agar hierro con azúcar triple
i)
Examen microscópico de morfología y movilidad: el material de una colonia sospechosa se suspende
en solución salina y se evalúan, preferiblemente mediante un microscopio de contraste de fases, sus
características, como bacilos delgados curvos o espirales con movilidad en forma de sacacorchos. Los
cultivos más viejos muestras formas cocoides menos móviles.
ii)
Detección de oxidasa: Obtener material de una colonia sospechosa y colocarlo en papel de filtro
mojado con reactivo de oxidasa. La aparición en 10 segundos de color violeta o azul intenso significa
que la reacción es positiva. Si se utiliza un kit de prueba de la oxidasa disponible comercialmente, hay
que seguir las instrucciones del fabricante.
iii)
Fermentación de azúcares y producción de sulfhídrico: El medio de agar con hierro y triple azúcar
(TSI) se inocula por extensión longitudinal sobre la superficie del agar inclinado y por picadura en la
base (el extremo del medio TSI en el tubo). Incubar microaeróbicamente a 42°C durante 24-48 horas.
Interpretar los resultados como en el Cuadro 2.
Cuadro 2. Interpretación de los resultados en agar TSI
Apariencia
Interpretación
Extremo:
Amarillo
Positivo a glucosa (fermentación de glucosa)
Rojo o sin cambios
Negativo a glucosa (sin fermentación de glucosa)
Negro
Formación de sulfhídrico (H2S)
Burbujas o grietas
Producción de gas a partir de glucosa
Superficie inclinada:
e)
Amarillo
Positivo a lactosa y/o sacarosa (utilizados uno o ambos
azúcares)
Rojo o sin cambios
Negativo a lactosa y sacarosa (ningún azúcar utilizado)
iv)
Crecimiento a 25°C: Inocular el cultivo puro en una placa de agar sangre no selectivo e incubar a 25°C
en atmósfera microaeróbica durante 48 horas.
v)
Pruebas de aglutinación de látex disponibles comercialmente para confirmación de cultivos puros de
C. jejuni/C. coli (incluyendo a menudo también C. lari).
Identificación de Campylobacter a nivel de especie
Entre las especies de Campylobacter spp. que crecen a 42°C, las que se encuentran más frecuentemente
en muestras de origen animal son C. jejuni y C. coli. Sin embargo, se han descrito frecuencias bajas de
otras especies. Generalmente, C. jejuni se puede diferenciar de otras especies de Campylobacter sobre la
base de la hidrólisis de hipurato, ya que es la única especie que da positiva a hipurato. Se ha descrito la
presencia de cepas de C. jejuni negativas a hipurato (31). El cuadro 3 proporciona algunas características
1156
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.8. — Campylobacter jejuni y Campylobacter coli
fenotípicas clásicas básicas de las especies más importantes de Campylobacter termófilos (14). Una de las
características probadas más frecuentemente ha sido la sensibilidad al ácido nalidíxico, pero actualmente
puede ser difícil de interpretar porque se ha producido un aumento en las cepas de C. jejuni y C. coli
resistentes al ácido nalidíxico, y en el aislamiento de genogrupos de C. lari sensibles al ácido nalidíxico. Se
han descrito programas de especificación más extensos en la literatura (25, 34). Los resultados de la
especificación deberían confirmarse utilizando controles positivos y negativos definidos.
La especificación bioquímica puede suplementarse e incluso reemplazarse por métodos moleculares. Se
han descrito algunas sondas de ADN y ensayos de identificación basado en la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para especies de Campylobacter (25, 34). On et al. (26) evaluaron la especificidad de
11 ensayos de identificación basados en PCR para C. jejuni y C. coli.
Cuadro 3. Características fenotípicas básicas de especies termófilas seleccionadas de Campylobacter.
Características
C. jejuni
C. coli
C. lari
C. upsaliensis
Hidrólisis de hipurato
+
–
–
–
Catalasa
+
+
+
– o ligero
Acetato de indoxil
+
+
–
+
Cefalotina
R
R
R
S
Clave: + = positivo; – = negativo; S = sensible; R = resistente
f)
i)
Detección de hidrólisis de hipurato: Suspender un asa de cultivo de una colonia sospechosa en 400 µl
de un solución de hipurato sódico al 1% (ha de tenerse cuidado de no incorporar agar). Incubar a 37°C
durante 2 horas, después añadir lentamente 200 µl de solución de ninhidrina al 3,5% a un extremo del
tubo para forma una capa superpuesta. Reincubar a 37°C durante 10 minutos y leer la reacción.
Reacción positiva: azul/violeta oscuro. Reacción negativa: clara o gris. Si se utilizan discos de prueba
de hidrólisis de hipurato disponibles comercialmente, seguir las instrucciones del fabricante.
ii)
Detección de actividad catalasa: Colocar una colonia sospechosa sobre un porta de vidrio. Poner una
gota de H202 al 3% sobre el material bacteriano. Examinar inmediatamente la producción de gas, lo
que indica actividad catalasa. La prueba es positiva si aparecen burbujas de gas en 30 segundos.
iii)
Detección de hidrólisis de acetato de indoxil: Poner una colonia sospechosa sobre un disco de acetato
de indoxil y añadir una gota de agua destilada estéril. Si el acetato de hidroxil se hidroliza se produce
un cambio de color a azul oscuro en 5-10 minutos. Si no hay cambio de color significa que no se ha
producido la hidrólisis.
iv)
Prueba de sensibilidad a cefalotina: La sensibilidad a cefalotina se prueba mediante la técnica de
difusión como se ha descrito anteriormente (14, 27).
Detección molecular de Campylobacter
Se han presentado previamente en la literatura métodos basados en PCR para la detección de
Campylobacter en muestras de heces animales y en muestras de carne enriquecida (24, 25). Uno de estos
ensayos está en uso en Dinamarca para análisis rutinario de frotis de cloacas de pollos en el matadero
(4, 19). Hay al menos una prueba de PCR disponible comercialmente para muestras de carne después del
enriquecimiento.
g)
Pruebas basadas en la captura del antígeno
Existen varios enzimoinmunoensayos disponibles comercialmente para la detección de Campylobacter en
muestras de deposiciones animales. Una de estas pruebas se ha usado para muestras de ciegos de pollo
(n = 42) con una sensibilidad del 91% y una especificidad del 64% (35). Para la detección de
Campylobacter en muestras de alimento enriquecidas, hay al menos dos ensayos comerciales en el
mercado.
2.
Pruebas serológicas
Aunque la colonización intestinal, sintomática o no, se asocia con respuestas de anticuerpo circulante y de las
mucosas, no se han validado pruebas serológicas desarrolladas para la identificación de mamíferos o aves
infectadas. Sin embargo, se pueden utilizar preparaciones simples de antígenos complejos en un
enzimoinmunoensayo (ELISA). Los antígenos más frecuentemente utilizados para detectar respuestas de
anticuerpos son las proteínas de superficie extraíbles con ácido (EA) (8). Primariamente estas comprenden la
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1157
Capítulo 2.10.8. — Campylobacter jejuni y Campylobacter coli
flagelina y una serie de proteínas de superficie periféricas llamada proteínas PEB. Ha de tenerse en cuenta que
los flagelos de Campylobacter contienen epitopos de reacción cruzada antigénica con otros organismos
íntimamente relacionados, como los helicobacters.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
No existen vacunas desarrolladas específicamente para C. jejuni o C. coli en animales o aves. Sin embargo,
está actualmente en desarrollo para su utilización en humanos una vacuna oral monovalente de
células enteras muertas de C. jejuni (cepa 81176), combinada con un adyuvante de toxina de E. coli
modificada lábil al calor, y este enfoque experimental podría aplicarse a aves y mamíferos
(www.armymedicine.army.mil/usammda/info196.pdf).
Se pueden producir antisueros dirigidos contra campylobacters mediante la hiperinmunización de conejos,
cabras, etc. (22). Los conejos se pueden inmunizar intramuscularmente con una suspensión bacteriana tratada
con formalina (0,3% de formalina durante 30 minutos y lavar después en PBS) en un adyuvante apropiado. Los
conejos se reinoculan a intervalos de 14 días con una serie de inyecciones subcutáneas del mismo antígeno.
Para obtener antisueros reactivos para múltiples serotipos de C.jejuni/coli, los animales deberían inmunizarse
secuencialmente con diferentes cepas, preferiblemente de serotipos diferentes. Ha de ponerse de manifiesto que
los antisueros producidos de estas forma reaccionaran con la mayor parte de las especies de Campylobacter,
incluyendo C. hyointestinalis y C. fetus así como con Helicobacter spp.
REFERENCIAS
1.
ASPINALL S.T., W AREING D.R.A., HAYWARD P.G. & HUTCHINSON D.N. (1993). Selective medium for thermophilic
campylobacters including Campylobacter upsaliensis. J. Clin. Pathol., 46, 829–831.
2.
ATABAY H.I. & CORRY J.E.L. (1998). The isolation and prevalence of campylobacters from dairy cattle using a
variety of methods. J. Appl. Microbiol., 84, 733–740.
3.
BAKER J., BARTON M.D. & LANSER J. (1999). Campylobacter species in cats and dogs in South Australia. Aust.
Vet. J., 77, 662–666.
4.
BANG D.D., PEDERSEN K. & MADSEN M. (2001). Development of a PCR assay suitable for Campylobacter spp.
mass screening programs in broiler production. J. Rapid Meth. Automat. Microbiol., 9, 97–113.
5.
BOLTON F.J., HUTCHINSON D.N. & COATES D. (1984). Blood-free selective medium for isolation of
Campylobacter jejuni from faeces. J. Clin. Microbiol., 19, 169–171.
6.
BOLTON F.J., HUTCHINSON D.N. & PARKER G. (1988). Reassessment of selective agars and filtration
techniques for isolation of Campylobacter species from faeces. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 7, 155–
160.
7.
BROMAN T., PALMGREN H., BERGSTRÖM S., SELLIN M., W ALDENSTRÖM J., DANIELSSON-THAM M.-L. & OLSEN B.
(2002). Campylobacter jejuni in black-headed gulls (Larus ridibundus): Prevalence, genotypes, and influence
on C. jejuni epidemiology. J. Clin. Microbiol., 40, 4594–4602.
8.
CAWTHRAW S., AYLING R. & NEWELL D.G. (1994). The isotype, specificity and kinetics of systemic and mucosal
antibodies to Campylobacter jejuni during experimental oral infections of chickens. Avian Dis., 38, 341–349.
9.
CORRY J.E.L., ATABAY H.I., FORSYTHE S.J. & MANSFIELD L.P. (2003). Culture media for the isolation of
campylobacters, helicobacter and arcobacters. En: Handbook of Culture Media for Food Microbiology,
Second Edition, Corry J.E.L., Curtis G.D.W. & Baird R.M. eds. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, 271–
315.
10. CORRY J.E.L., POST D.E., COLIN P. & LAISNEY M.J. (1995). Culture media for the isolation of campylobacters.
Int. J. Food Microbiol., 26, 43–76.
11. FOX J.G., MOORE R. & ACKERMAN J.I. (1983). Campylobacter jejuni-associated diarrhea in dogs. J. Am. Vet.
Med. Assoc., 183, 1430–1433.
1158
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.8. — Campylobacter jejuni y Campylobacter coli
12. FRIEDMAN C.R., NEIMANN J., WEGENER H.C. & TAUXE R.V. (2000). Epidemiology of Campylobacter jejuni
infections in the United States and other industrialized nations. En: Campylobacter, Second Edition,
Nachamkin I. & M.J. Blaser, eds. ASM Press, Washington DC, USA, 121–138.
13. ISO INTERNATIONAL STANDARD 10272 (1995) +Technical Corrigendum 1 and 2 (1997). Microbiology of food
and animal feeding stuffs – Horizontal method for detection of thermotolerant Campylobacter. International
Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varembé, Case Postale 56, CH 1211, Geneva 20, Switzerland.
14. ISO/CD 10272-1 AND 10272-2 (2002). Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for
the detection and enumeration of Campylobacter growing at 41,5 degrees Celsius. Part 1: Detection
method; Part 2: Colony count technique. International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central
Secretariat, 1 rue de Varembé, Case Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.
15. JACOBS-REITSMA W.F. (2000). Campylobacter in the food supply. En: Campylobacter, Second Edition,
Nachamkin I. & M.J. Blaser, eds. ASM Press, Washington DC, USA, 467–481.
16. KARMALI M.A., SIMOR A.E., ROSCOE M., FLEMING P.C., SMITH S.S. & LANE J. (1986). Evalutaion of a blood-free,
charcoal-based, selective medium for the isolation of Campylobacter organisms from feces. J. Clin.
Microbiol., 23, 456–459.
17. LASTOVICA A.J. & SKIRROW M.B. (2000). Clinical significance of Campylobacter and related species other than
Campylobacter jejuni and C. coli. En: Campylobacter, Second Edition, Nachamkin I. & M.J. Blaser, eds.
ASM Press, Washington DC, USA, 89–120.
18. LUECHTEFELD N.W., W ANG W.L., BLASER M.J. & RELLER L.B. (1981). Evaluation of transport and storage
techniques for isolation of Campylobacter fetus subsp. jejuni from turkey cecal specimens. J. Clin. Microbiol.,
13, 438–443.
19. LUND M., W EDDERKOPP A., WAINO M., NORDENTOFT S., BANG D.D., PEDERSEN K., & MADSEN M. (2003).
Evaluation of PCR for detection of Campylobacter in a national broiler surveillance programme in Denmark.
J. Appl. Microbiol., 94, 929–935.
20. MARTIN K.W., MATTICK K.L., HARRISON M. & HUMPHREY T.J. (2002). Evaluation of selective media for
Campylobacter isolation when cycloheximide is replaced with amphotericin B. Lett. Appl. Microbiol., 34,
124–129.
21. NEWELL D.G., DUIM B., VAN BERGEN M.A.P., GROGONO-THOMAS R. & W AGENAAR J.A. (2000). Speciation,
subspeciation and subtyping of Campylobacter fetus associated with infertility within the UK. Cattle Practice,
8, 421–425.
22. NEWELL D.G. & W AGENAAR J.A. (2000). Poultry infections and their control at the farm level. En:
Campylobacter, Second Edition, Nachamkin I. & M.J. Blaser, eds. ASM Press, Washington DC, USA, 497–
509.
23. NEWELL D.G., MCBRIDE H. & PEARSON A.D. (1983). The identification of outer membrane proteins and flagella
of Campylobacter jejuni. J. Gen. Microbiol., 130, 1201–1208.
24. OLSEN J.E., ABO S., HILL W., NOTERMANS S., W ERNARS K., GRANUM P.E., POPVIC T., RASMUSSEN H.N. & OLSVIK
O. (1995). Probes and polymerase chain reaction for the detection of food-borne bacterial pathogens. Int. J.
Food Microbiol. 28, 1–78.
25. ON S.L.W. (1996). Identification methods for Campylobacters, Helicobacters, and Related organisms. Clin.
Microbiol. Rev., 9, 405–422.
26. ON S.L.W. & JORDAN P.J. (2003). Evaluation of 11 PCR assays for species-level identification of
Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. J. Clin. Microbiol., 41, 330–336.
27. PEFANIS S.M., VENTER C.G. & HERR S. (1989). The use of cephalothin and triphenyltetrazolium chloride
impregnated filter paper strips in the identification of Campylobacter species. Onderstepoort J. Vet. Res., 56,
143–144.
28. SJOGREN E., LINDBLOM G.B. & KAIJSER B. (1987). Comparison of different procedures, transport media, and
enrichment media for isolation of Campylobacter species from healthy laying hens and humans with
diarrhea. J. Clin. Microbiol., 25, 1966–1968.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1159
Capítulo 2.10.8. — Campylobacter jejuni y Campylobacter coli
29. SKIRROW M.B. & BLASER M.J. (2000). Clinical aspects of Campylobacter infection. En: Campylobacter,
Second Edition, Nachamkin I. & M.J. Blaser, eds. ASM Press, Washington DC, USA, 69–88.
30. STEELE T.W. & MCDERMOTT S.N. (1984). The use of membrane filters applied directly to the surface of agar
plates for the isolation of Campylobacter jejuni from feces. Pathology, 16, 263–265.
31. STEINHAUSEROVA I., CESKOVA J., FOJTIKOVA K. & OBROVSKA I. (2001). Identification of thermophilic
Campylobacter spp. by phenotypic and molecular methods. J. Appl. Microbiol., 90, 470–475.
32. TAUXE R.V. (1992). Epidemiology of Campylobacter jejuni infections in the United States and other
industrialized nations. En: Campylobacter jejuni: current state and future trends, Nachamkin I., Blaser M.J. &
Tompkins L.S., eds. ASM Press, Washington DC, USA, 9–19.
33. TORRE E. (1993). Factors influencing shedding of Campylobacter jejuni in dogs without diarrhea. Am. J. Vet.
Res., 54, 260–262.
34. VANDAMME P. (2000). Taxonomy of the family Campylobacteraceae. En: Campylobacter, Second Edition,
Nachamkin I. & M.J. Blaser, eds. ASM Press, Washington DC, USA, 3–26.
35. WAGENAAR J.A., DE GOFFAU K., ACHTERBERG R., DIJKSTRA J., JACOBS-REITSMA W. & LAMBERS J. (2001). The
use of an enzyme immunoassay for the detection of Campylobacter in poultry caecal samples. Abstract L15
at 11th CHRO (Freiburg), Int. J. Med. Microbiol., 129, 107–108.
36. WALDENSTROM J., BROMAN T., CARLSSON I., HASSELQUIST D., ACHTERBERG R.P., W AGENAAR J.A. & OLSEN B.
(2002). Prevalence of Campylobacter jejuni, C. lari, and C. coli in different ecological guilds and taxa of
migrating birds. Appl. Environ. Microbiol., 68, 5911–5917.
37. WEIJTENS M. (1996). Campylobacter in pigs (dissertation). Utrecht University, The Netherlands.
38. WESLEY I.V., W ELLS S.J., HARMON K.M., GREEN A., SCHROEDER-TUCKER L., GLOVER M. & SIDDIQUE I. (2000).
Fecal shedding of Campylobacter and Arcobacter spp. in dairy cattle. Appl. Environ. Microbiol., 66, 1994–
2000.
*
* *
1160
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO 2.10.9.
CRIPTOSPORIDIOSIS
RESUMEN
La criptosporiosis está producida por protozoos parásitos del género Cryptosporidium, de los que
hay 13 especies "válidas". Se ha descrito que C. parvum, C. andersoni, C. baileyi y C. meleagridis
producen mortalidad y brotes de enfermedad en el ganado. Para confirmar el diagnóstico, se
requiere identificación en el laboratorio. La criptosporidiosis por Cryptosporium parvum produce
vómitos en mamíferos jóvenes no destetados, aunque los animales destetados y adultos también
pueden infectarse. Los síntomas varían desde una infección suave e inaparente a vómitos graves,
y los jóvenes, viejos o inmunocomprometidos son los más susceptibles. No es frecuente la muerte.
Generalmente, los animales destetados y adultos infectados no manifiestan generalmente
síntomas identificables de la enfermedad, pero excretan ooscistos que contaminan el medio. La
criptosporidiosis por Cryptosporidium andersoni afecta a las glándulas digestivas del rumen de
terneros mayores y de ganado adulto. Algunos animales muestran un incremento de peso
reducido, pero no desarrollan diarrea. Las criptosporidiosis por
Cryptosporidium baileyi,
C. meleagridis y C. galli son enfermedades de aves. Cryptosporidium baileyi afecta
fundamentalmente a la bolsa de Fabricio y a la cloaca de las gallináceas, mientras que
C. meleagridis afecta al íleon de pavipollos.
Identificación del agente: No hay una prueba prescrita para detectar la infección por
Cryptosporidium. La demostración de ooscistos de especies de Cryptosporidium o de antígeno de
Cryptosporidium en muestras tomadas adecuadamente y enviadas es suficiente para un
diagnóstico positivo. El diagnóstico se establece microscópicamente por los métodos de ácidoalcohol resistencia de Ziehl-Neelsen o de auramina con fenol utilizando frotis fecales concentrados
o sin concentrar. Los métodos microscópicos para detectar ooscistos y los enzimoinmunoensayos
para detectar antígenos de Cryptosporidium son relativamente insensibles, pero lo bastante
adecuados para detectar casos clínicos. Ni las tinciones con colorantes ni las basadas en
fluorescencia permiten determinar la especie de Cryptosporidium presente si los oocistos tienen un
tamaño entre 4-6 µm. Estos métodos pueden detectar oocistos en animales con enfermedad
clínica, pero, a veces, no son suficientemente sensibles para detectar la infección en animales
clínicamente normales. Las pruebas de detección de ácido nucleico tienen una mayor sensibilidad.
Para determinar algunas o todas las especies/genotipos o subtipos de Cryptosporidium, se puede
utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el análisis del polimorfismo de fragmentos
de restricción (RFLP) y/o la secuenciación. Las muestras para el diagnóstico preliminar se deben
recoger durante la infección aguda y deben procesarse lo antes posible, idealmente, en 24 horas.
El transporte al laboratorio debe realizarse de acuerdo con las normas de la Asociación
Internacional de Transporte Aéreo, que se resumen en el Capítulo I.1.1.
La demostración en muestras fecales de oocistos de Cryptosporidium o de antígeno específico de
Cryptosporidium es la prueba más apropiada en la mayor parte de los casos. Muchas infecciones
que causan morbilidad y/o mortalidad en mamíferos son probablemente debidas a criptosporidiosis
por C. parvum. La criptosporidiosis por C. baileyi, C. meleagridis y C. galli causa morbilidad y/o
mortalidad en aves. La especie responsable de Cryptosporidium se puede determinar por PCRRFLP y/o por secuenciación del ADN del oocisto de Cryptosporidium. No hay estándares
internacionales para la preparación de oocistos purificados, antisueros, antígenos, anticuerpos
monoclonales o hibridomas, aunque hay comercializados varios oocistos purificados y kits para la
detección de coproantígenos utilizando anticuerpos monoclonales.
Pruebas serológicas: La criptosporidiosis es a menudo una enfermedad del recién nacido y a
menos que se haya evitado la exposición a oocistos infecciosos, las pruebas serológicas no
ofrecen ningún beneficio.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1161
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No hay programa de control para
la criptosporidiosis, ni vacuna disponible rigurosamente probada y aceptada.
A. INTRODUCCIÓN
Cryptosporidium spp., descrito originalmente en 1907, se consideró como un comensal hasta su asociación con
diarreas en pavos jóvenes en los años 50 (C. meleagridis), y con brotes importantes de diarrea en terneros en los
años 70 (C. parvum). Cryptosporidium es un patógeno importante del ganado doméstico y del hombre, y, desde
los años 80, la criptosporidiosis por C. parvum se considera la causa corriente de gastroenteritis aguda
autolimitada en hospedadores inmunocompetentes. Fayer et al. (5) proporcionan una buena descripción de la
biología de Cryptosporidium.
La criptosporidiosis está causada por protozoos parásitos del género Cryptosporidium (familia Cryptosporidiidae,
orden Eucoccidiorida, subclase Coccidiasina, clase Sporozoasida, filum Apicomplexa). Aunque se han descrito
más de 20 "especies" de este parásito en función de los hospedadores animales de los que se aíslan, la
especificidad de huésped como criterio de especificación parece mal fundamentada ya que algunas "especies"
carecen de tal especificidad. La definición de especie y la identificación de este género están en constante
cambio, con la adición de "nuevas" especies basada primariamente en criterios moleculares. En la actualidad,
hay trece especies "válidas"; C. hominis encontrada fundamentalmente en humanos (previamente conocida
como C. parvum Tipo 1), C. parvum encontrada en humanos y otros mamíferos ( previamente conocida como
C. parvum Tipo 2), C. andersoni en ganado, C. canis en perros, C. muris en ratones, C. felis en gatos, C. wrairi
en cobayas, C. meleagridis en pavos y humanos, C. baileyi en pollos, C. galli en los pinzones y pollos,
C. saurophilum en lagartos, C. serpentis en serpientes y lagartos y C. molnari en peces (27). Se ha descrito que
C. parvum, C. andersoni, C. baileyi y C. meleagridis producen morbilidad y brotes de enfermedad en el ganado.
Para confirmar el diagnóstico se requiere la identificación en el laboratorio.
El descubrimiento de diferencias en la secuencia de la unidad génica repetitiva del ARN ribosomal (ARNr) entre
aislados individuales dentro de una especie "previamente válida" ha originado la revisión de la taxonomía del
género. Actualmente, C. parvum comprende casi 20 genotipos, algunos de los cuales pueden representar
especies diferentes. Incluidos en esta lista hay genotipos porcinos (2 genotipos), ovinos, equinos, bovinos, de
conejo, de marsupiales, de oposum (2 genotipos), de mono, de hurón, de zorra, de ciervo (2 genotipos), de rata
almizclera (2 genotipos), de ardilla, de oso y de ratón ciervo (27). La clasificación actual de los genotipos de
C. parvum está sujeta a cambios.
Desde el punto de vista de la salud pública y la sanidad veterinaria, es importante diferenciar entre genotipos, de
modo que se puedan evaluar los factores de riesgo y las fuentes de infección. En muchas de las especies de
Cryptosporidium del Cuadro 1, el tamaño y forma de los oocistos es similar, lo que hace difícil, si no imposible, la
identificación de especies basada en morfometría a nivel del microscopio debido a la superposición de tamaños y
formas.
Cuadro 1. Algunas diferencias entre especies del género Cryptosporidium.
Especies de
Cryptosporidium
Tamaño medio del oocisto (µm)
y (rango de tamaño)
Lugar de infección
Hospedador
C. parvum
5.5 ‰ 4.5 (3.8–6.0 ‰ 3.0–5.3)
Intestino delgado
Mamíferos
C. muris
7.5 ‰ 5.0 (6.5–8.0 ‰ 5.0–6.5)
Estómago
Ratones
C. andersoni
7.4 ‰ 5.6 (6.6–8.1 ‰ 5.0–6.5)
Estómago
Ganado vacuno
C. felis
4.5 ‰ 5.0
4.6 ‰ 4.0 (3.2–5.1 ‰ 3.0–4.0)
Intestino delgado
Gatos
C. canis
5.0 ‰ 4.7 (3.7–5.9 ‰ 3.7–5.9)
Intestino delgado
Perros
C. wrairi
5.4 ‰ 4.6 (4.8–5.6 ‰ 4.0–5.0)
Intestino delgado
Cobayas
C. baileyi
6.2 ‰ 4.6 (5.6–6.3 ‰ 4.5–4.8)
Tráquea, bolsa of Fabricio, cloaca
Aves gallináceas
C. meleagridis
5.2 ‰ 4.6 (4.5–6.0 ‰ 4.2–5.3)
Intestino
Pavos
C. serpentis
6.2 ‰ 5.3 (5.6–6.6 ‰ 4.8–5.6)
Estómago
Serpientes
C. saurophilum
5.7 ‰x 4.7 (5.3–5.7 ‰ 4.2–5.7)
Mucosa intestinal y cloacal
Lagartos
C. nasorum
3.6 ‰ 3.6
Intestino
Peces
4.3 ‰ 3.3 (3.5–4.7 ‰ 2.5–4.0)
C. molnari
4.7 ‰ 4.5 (3.2–5.5 ‰ 3.0–5.0)
Intestino
Peces
Cryptosporidium sp.
4.5–6.0 ‰ 3.6–5.6
Intestino delgado
Codorniz
Cryptosporidium sp.
5.8–5.0 ‰ 8.0–5.6
? Intestino
Serpientes, reptiles
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
1.
Síntomas clínicos
La criptoporidiosis por Cryptosporidium parvum origina vómitos en el ganado doméstico joven no destetado. Las
fases endógenas infectan a los enterocitos de la porción distal del intestino delgado, el ciego y el colon. Los
mayores cambios patológicos asociados con la enfermedad son atrofia de las vellosidades intestinales,
acortamiento de las vellosidades y disgregación de los enterocitos, y los animales afectados se recuperan a las
dos semanas de mostrar síntomas de la enfermedad. Los vómitos son más comunes en animales jóvenes; sin
embargo, animales destetados y adultos también pueden resultar infectados. Los síntomas pueden variar desde
infección suave a inaparente a vómitos graves. La muerte no es una consecuencia frecuente. Como en otros
patógenos, los jóvenes, viejos e inmunocomprometidos son los más susceptibles a la enfermedad. Los animales
infectados destetados y los adultos no muestran normalmente síntomas manifiestos, identificables con la
enfermedad, tales como vómitos, aunque los animales normales infectados clínicamente excretan oocistos que
pueden transmitirse a otros hospedadores susceptibles.
Las infecciones del ganado vacuno por Cryptosporidium parvum pueden producir diversos grados de
inactivación, anorexia, fiebre y pérdida del estado físico. Raramente producen la deshidratación aguda, el
colapso y la elevada mortalidad que se observan con Escherichia coli enterotoxigénica o con rotavirus, que
pueden ocurrir en paralelo. Las infecciones por Cryptosporidum parvum son normalmente suaves (aunque en
ocasiones pueden ser graves, pero transitorias), originando varios grados de morbilidad, pero, generalmente, con
mortalidad baja. Se pueden detectar oocistos en hospedadores clínicamente normales y en enfermos. Los
terneros y los corderos con vómitos pueden excretar entre 106 y 108 oocistos por g de heces. El ganado adulto
infectado excreta muchos menos oocistos, aunque en infecciones subclínicas pueden generar concentraciones
similares de oocistos en un periodo de 12 meses.
Cryptosporidium andersoni coloniza las glándulas digestivas del rumen de terneros mayores y de ganado adulto.
Los microvilli de las glándulas pépticas son destruidas por las fases endógenas, lo que puede explicar la elevada
concentración de pepsinógeno detectada en el plasma de los hospedadores infectados. Algunos animales
infectados muestran un incremento reducido de peso en comparación con controles no infectados. El ganado
adulto no desarrolla diarrea, pero puede excretar oocistos durante varios meses.
Cryptosporidium es un patógeno primario en pollos, pavos y codornices, causando enfermedad respiratoria y/o
intestinal, que conduce a morbilidad y mortalidad. Actualmente, dos especies infectan pollos y pavos (C. baileyi y
C. meleagridis) y una tercera no designada infecta codornices (Cryptospodrium sp.) Las especies de
Cryptosporidium son comunes en el intestino de pollos para consumo en los EE.UU. y en Japón. La
criptosporidiosis por Cryptosporidium baileyi es una enfermedad del epitelio de la bolsa de Fabricio y de la cloaca
de los pollos, aunque la tráquea y la conjuntiva son sitios minoritarios de infección. La criptosporidiosis intestinal
por Cryptosporium baileyi no ocasiona normalmente lesiones macroscópicas en pollos ni origina síntomas claros
de enfermedad. La atrofia de las vellosidades, el acortamiento de los microvilli y la separación de los enterocitos
son los principales cambios patológicos asociados con la enfermedad. La criptosporidiosis respiratoria de
Cryptosporidium baileyi en pollos puede producir morbilidad grave y, en ocasiones, mortalidad. Inicialmente, la
enfermedad se acompaña de estornudos y tos, seguida de extensión de la cabeza para facilitar la respiración. La
pérdida de los cilios de las células epiteliales y la hiperplasia, con engrosamiento de la mucosa y descargas de
exudado mucocelular en las vías aéreas, son los cambios patológicos más importantes asociados con la
enfermedad en pollos jóvenes para el consumo. Los síntomas graves de la enfermedad respiratoria pueden durar
hasta 4 semanas después de la infección (4). La criptosporidiosis por Cryptosporidium baileyi en los pavos es
similar a la de los pollos. Los aislamientos de C. baileyi en pollos causan infección en otras aves.
La criptosporidiosis por Cryptosporidium meleagridis es una enfermedad del íleon de los pavos, de otras aves de
corral y de los humanos. La criptosporidiosis por Cryptosporidium meleagridis puede producir diarrea grave en
pavipollos. Los cambios patológicos más importantes asociados con la enfermedad son la atrofia de las
vellosidades, la hiperplasia de la cripta, y el acortamiento de las microvellosidades (4). Se ha descrito la
transmisión de un aislado de C. meleagridis de pavo a pollos y a patos domésticos.
La criptosporidiosis por Cryptosporidium galli es una enfermedad de pollos y pinzones. A diferencia de los ciclos
vitales tanto de C. meleagridis como C. baileyi, los ciclos vitales de C. galli se desarrollan en las células
epiteliales del proventrículo. Los oocistos de Cryptosporidium galli (8,0-8,5 x 6,2-6,4 µm) son más grandes que
los de C. baileyi.
Se ha descrito criptosporidiosis respiratoria e intestinal en codornices criadas comercialmente, producida por
Cryptosporidium de una especie descrita inadecuadamente (Cryptosporidium sp.) cuyos oocistos son más
pequeños que los de C. baileyi y no resultan infecciosos para pollos o pavos. Los cambios patológicos son
similares a los descritos para la criptosporidiosis respiratoria e intestinal de pollos por C. baileyi (4).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
2.
Dosis infecciosa
La dosis infecciosa para C. parvum varía entre distintos aislados y entre especies hospedadoras. Para ratones
neonatos (cepa CD-1) la ID50 (dosis infecciosa media) está entre 87 y 60 oocistos (11). Diez oocistos causaron
infección en dos de cada dos primates probados, y cinco oocistos produjeron enfermedad clínica en corderos
gnotobióticos. La dosis infecciosa para ganado no es conocida, pero se cree que es pequeña. Se desconoce si
los aislados de C. parvum varían en su capacidad para colonizar diferentes especies hospedadoras. En
voluntarios adultos humanos sanos, la ID50 depende también tanto del estado del aislado como del hospedador
inmune. En estudios de infectividad en humanos voluntarios, los aislados de C. parvum difieren en su ID50, su
del aislado de C. parvum UCP
índice de ataque, y la duración de la diarrea que inducen. La ID50
(Cryptosporidium parvum Ungar, derivado humano, del Dr B. Ungar, EE.UU.) es de 1.042 oocistos; el aislado
IOWA de C. parvum (derivado bovino, de Ames, Iowa, EE.UU.) es de 132 oocistos; y el aislado de C. parvum
TAMU (derivado equino, de la Universidad de Texas A & M, EE.UU.) es de 9 oocistos (15). La infección oral con
100 oocistos de C. baileyi puede producir criptospordiosis intestinal (4).
3.
Transmisión
La transmisión puede producirse por cualquier vía a través de la cual se pueda ingerir el material contaminado
con oocistos viable excretados por individuos infectados. Entre las prácticas más probables para aumentar la
difusión de la criptosporidiosis están la cría de terneros y corderos caseros y la alimentación y la cría comunal de
neonatos, donde los animales jóvenes susceptibles están en contacto unos con otros y con las heces de
animales infectados. De forma similar, la eliminación de heces, el abono de granjas u otros deshechos
contaminados acumulados sobre el terreno, cuando van seguidos de períodos de lluvias persistentes o de nieve
que se derrite, puede conducir a contaminación del curso del agua por los oocistos de C.parvum. Estas
trayectorias se pueden utilizar como fuente de agua para otros animales, y de agua potable para consumo
humano. Los desechos contaminados incluyen tanto productos líquidos como sólidos derivados de la cría de
animales.
4.
Mantenimiento de la infección
Algunos mamíferos actúan como hospedadores de C. parvum (21, 27, 28), pero se sabe poco de la importancia
de su implicación en la transmisión de la infección, o de su mantenimiento, en animales domesticados en
ambientes de granja. Su papel en la epidemiología "de la granja" en especies domesticadas tampoco está muy
claro. Los métodos utilizados para diagnosticar la infección en pequeños mamíferos y en animales salvajes son
los mismos que los descritos para animales de granja. Los oocistos son ambientalmente resistentes y pueden
sobrevivir durante largos periodos de tiempo ( > 6 meses) en microclimas húmedos y fríos. Hay evidencia de
transmisión de criptosporidiosis de madres clínicamente normales a neonatos lactantes, pero, en general, la
duración del estado de portador sigue siendo desconocida. Algunas especies de aves actúan como
hospedadores de C. baileyi.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
No hay ninguna prueba prescrita para el diagnóstico de la infección por Crystosporidium. La detección de
oocistos de especies de Cryptosporidium o antígenos de Cryptosporidium en una muestra recogida y manipulada
adecuadamente es suficiente para el diagnóstico positivo, y los métodos preferidos para la recogida de las
muestras no son invasivos. No existen técnicas de cultivo in-vitro reproducibles y disponibles para amplificar el
número de parásitos antes de la identificación, por lo que los métodos elegidos son la detección de los oocistos
(el estadio de transmisión), del antígeno de Cryptosporidium y/o del ADN a partir de las heces o de otros líquidos
corporales. Además de estas pruebas, se puede utilizar hematoxilina y eosina para una confirmación histológica
del diagnóstico post-mortem. La histología con hematoxilina y eosina es útil para el diagnóstico confirmativo, es
común en todo el mundo y no se describirá en este capítulo.
Se pueden realizar análisis adicionales para la identificación de especies o del genotipo de C. parvum con el
ADN de Cryptosporidium utilizando técnicas moleculares, como PCR-RFLP y/o la secuenciación de los productos
amplificados de zonas genéticas definidas. Esto no sólo confirma el diagnóstico sino que permite discriminar más
de lo que es posible mediante morfología o morfometría utilizando el microscopio.
Para especies de Cryptosporidium que infectan el tracto gastrointestinal (Cuadro 1), el diagnóstico inicial se basa
en la detección de oocistos en las heces por técnicas convencionales de tinción, colorantes
fluorescentes/inmunofluorescentes o la presencia de antígenos de Cryptosporidium en las heces por
enzimoinmunoensayo (ELISA). La mayoría de los métodos de diagnóstico se han desarrollado utilizando
1164
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
C. parvum por su importancia comercial y su frecuencia. Existe evidencia circunstancial que indica que en
algunas muestras los métodos que se describen a continuación no detectan todos los aislamientos. Se espera
que tales métodos detecten la mayoría de las infecciones por C. parvum, pero su utilidad para detectar otras
especies a partir de material clínico apenas se conoce.
La comprobación de oocistos de Cryptosporidium y de antígenos específicos de Cryptosporidium en muestras
fecales es la prueba más apropiada en la mayoría de las ocasiones. Muchas infecciones que causan morbilidad
y/o mortalidad se deben probablemente a criptosporidosis por C. parvum. Las especies de Cryptosporidium
responsables se pueden determinar posteriormente por PCR-RFLP o secuenciación del ADN de los oocistos de
Cryptosporidium. No hay estándares internacionales para la preparación de oocistos purificados, antisueros,
antígenos, anticuerpos monoclonales (MAbs) o hibridomas, aunque hay comercializados varios oocistos
purificados y kits para la detección de coproantígenos utilizando anticuerpos monoclonales.
a)
Diagnóstico de laboratorio
Las propiedades diagnósticas de los oocistos de C. parvum observables en suspensión, utilizando
microscopía de contraste de interferencia diferencial de Nomarski (DIC), son las siguientes. Los oocistos
son lisos, con pared celular gruesa, sin color, con formas esféricas o ligeramente ovoides que cuando están
desarrollados (esporulados) contienen cuatro esporozoitos alargados libres (es decir, no contenidos en un
esporocisto) y un cuerpo citoplásmico residual. El tamaño medio de los oocistos de C. parvum es de 4,5 x
5,0 µm (rango de 4-6 µm).
Normalmente, el diagnóstico se establece por métodos microscópicos convencionales, y se utilizan con
frecuencia el método modificado de Ziehl- Neelsen (mZN) y el de auramina-fenol (AP) en frotis fecales sin
concentrar (2, 3, 17). Cuando en las muestras se espera un número bajo de oocistos, o cuando se
necesitan oocistos purificados para investigaciones moleculares, la concentración de los oocistos de las
muestras fecales puede aumentar la sensibilidad de la detección. Las mejores opciones para concentrar
oocistos de las heces son soluciones de azúcares (por ejemplo, solución Sheather), sales, sulfato de zinc o
formalina-éter (formalina-etil acetato) (17, 18).
b)
Demostración en las heces
Las muestras fecales de los casos clínicamente más enfermos contienen un gran número de oocistos con
paredes celulares engrosadas y suficiente antígeno de Cryptosporidium, por lo que el empleo de técnicas
estándar de tinción e inmunológicas deben dar un diagnóstico positivo. El número de animales excretores
clínicamente normales se desconoce y, dada la insensibilidad de los métodos convencionales, los que
excretan pocos oocistos pueden no ser diagnosticados por tales técnicas, debido a que el número de
oocistos está por debajo de sus límites de detección (23, 24). En animales con enfermedad clínica, los
oocistos se detectan por lo general en frotis de muestras sin concentrar. La utilización de un método de
concentración de oocistos aumenta la frecuencia de detección. Tanto los métodos de flotación, como los de
sedimentación son adecuados para concentrar oocistos de Cryptosporidium spp., y los antígenos de los
oocistos pueden buscarse en las heces después de estos procedimientos de concentración. La utilización
de pruebas de detección de ácido nucleico, como la PCR, está en aumento porque ofrece una sensibilidad
mejorada y permite la identificación de especies/genotipos/subtipos.
El personal que se está familiarizando con técnicas de tinción y concentración debe disponer de muestras
fecales positivas para Cryptosporidium spp., y se deben incluir frotis de muestras fecales positivas cada vez
que se realiza una prueba. Las muestras con oocistos de C. parvum pueden guardarse a 4°C en K2Cr2O7 o
en formalina al 10% a efectos de referencia. De modo similar, se pueden preparar frotis fecales positivos
para oocistos, secados al aire y fijados con etanol absoluto, para emplearlos como controles positivos.
Cuando se sospecha una implicación bronco-pulmonar, se pueden realizar pruebas análogas con exudados
o lavados bronquiales y pleurales.
Hay que tener en cuenta que el 2,5% de K2Cr2O7 puede ser inhibidor para la PCR. Las muestras fecales
positivas para oocistos o los oocistos parcialmente purificados almacenados en 2,5% de K2CR2O7 y
utilizados para amplificación de ácido nucleico por PCR deberían lavarse en agua desionizada para eliminar
el 2,5 % de K2CR2O7 residual antes de la extracción de ADN. Una serie de tres lavados seguidos cada uno
de ellos de centrifugación (3000 g durante 10 minutos), la eliminación del sobrenadante, y la resuspensión
del sedimento en agua desionizada debería minimizar la inhibición de la PCR por 2,5% de K2CR2O7.
c)
Seguridad del personal de laboratorio y del operario
Cryptosporidum está incluido en el grupo 2 de riesgo en el laboratorio y todos los procedimientos de
laboratorio que producen aerosoles infecciosos deben llevarse a cabo en una cámara de bioseguridad. Las
muestras para análisis de Cryptosporidium pueden contener otros organismos patógenos y deberían
procesarse en consecuencia. Para salvaguardar la salud de los trabajadores de laboratorio, se deben
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
seguir los procedimientos indicados en el Capítulo I.1.6. Seguridad humana en el laboratorio veterinario de
microbiología. El laboratorio debería tener un programa de garantía de calidad interna y externa, como se
expone en el Capítulo I.1.2. Gestión de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias.
d)
Recogida y envío de muestras
Siempre que sea posible, se deben recoger las muestras para diagnóstico primario durante la infección
aguda, y se deben procesar tan pronto como sea posible. Idealmente, se debe seleccionar un sistema de
transporte para asegurar que las muestras llegan al laboratorio en 24 horas. Si no se puede llevar a cabo el
examen rápido para la detección de Cryptosporidium, se puede reducir el deterioro de la morfología de los
protozoos y su enmascaramiento por crecimiento de otros microorganismos, particularmente levaduras,
mediante la adición de formalina acuosa al 10% (v/v), aunque puede interferir con las pruebas de la PCR.
Tanto la morfología del oocisto para identificación microscópica como el ADN del esporozoito para el
ensayo con PCR pueden mantenerse en general durante largos periodos de tiempo a 4°C sin
formalinización.
Los procedimientos utilizados para la recogida y el transporte de muestras son de una importancia crítica
para el éxito en los análisis de laboratorio. Las muestras deberían ser recogidas en un contenedor de
muestras adecuado y hermético, y deben incluirse en paquetes primarios y secundarios de seguridad. Los
procedimientos para empaquetado y envío de muestras son los detallados en las Regulaciones de
Mercancías Peligrosas de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo (8). Estas regulaciones se
resumen en el Capítulo I.1.1. Métodos de muestreo.
e)
Umbral de detección en heces
La mayoría de los métodos de tinción y fluorescencia para la detección de oocistos y las técnicas ELISA
para la detección de antígenos de Cryptosporidium son relativamente insensibles. Estos métodos pueden
detectar oocistos en animales clínicamente enfermos, pero pueden no ser lo suficientemente sensibles
como para detectar la infección en animales clínicamente normales. Anusz et al. (1) han descrito un límite
de detección de 106 oocistos por ml de heces utilizando la modificación de mZN de Kinyoun en frotis fecales
sin concentrar. La concentración de oocistos en la muestra puede aumentar la sensibilidad de detección. En
muestras humanas positivas a oocistos, se necesitan entre 1 x 104 y 5 x 104 oocistos por g de heces sin
concentrar para obtener una eficacia de detección del 100%, utilizando el método de tinción mZN de
Kinyoun (23). Las variaciones en la consistencia fecal influyen en la facilidad de la detección, siendo más
fácil detectar oocistos en concentrados de muestras de diarrea acuosa que de muestras fecales sólidas
(23). Además de técnicas microscópicas, se han descrito en la literatura varios ELISA de captura de
antígeno con límites de detección del orden de 3 x 105-106 oocistos por ml (1, 16), lo que indica que no
ofrecen una sensibilidad mayor que los métodos microscópicos.
En muestras fecales bovinas, no se detectaron oocistos en muestras sembradas con 10.000 oocistos de
C. parvum por g después de sedimentación por formol-éter y mediante análisis por tinción con AP o por
inmunofluorescencia (IF). Cuando los oocistos se concentraron utilizando flotación en sacarosa, el nivel de
detección fue de 4.000 oocistos por g por ambos métodos de tinción. Después de flotación en sal, se
pudieron detectar de forma fiable 4000 oocistos por tinción con AP, pero el límite de detección aumentó a
6.000 oocistos por g utilizando tinción por IF (23). Webster et al. (24) compararon también la microscopía
con la PCR, y encontraron que la PCR acoplada a la separación de los oocistos de muestras fecales
por partículas inmunomagnéticas (IMS) detectó cinco oocistos por ml de heces diluidas, que corresponde a
80-90 oocistos por g. Incluso considerando la dilución de las muestras fecales sólidas que se necesita para
llevar a cabo la IMS, esto representa un aumento de sensibilidad de varios órdenes de magnitud respecto a
los métodos convencionales de coprodiagnóstico. Actualmente se dispone de varias pruebas sensibles
basadas en la PCR (ver Sección B.1. Métodos de reconocimiento del ácido nucleico).
•
1
2
Preparación de frotis fecales (o de líquidos corporales adecuados) sin concentrar (incluir un porta
de control positivo cada vez que se realiza este procedimiento)
•
Procedimiento de la prueba
i)
Llevar ropa protectora y guantes desechables. Apuntar el número de referencia de la muestra sobre
un porta para microscopio con un marcador de punta de diamante1, y utilizar portas separados para
cada muestra. Colocar una gota de solución salina (unos 50 µl) en el centro del porta.
ii)
Tomar una pequeña muestra de las heces (unos 2 mg) con la punta de una barra aplicadora limpia2 (o
con una pipeta después de mezclar bien, si son muestras líquidas) y emulsionar la muestra en
solución salina mezclando cuidadosamente. Para heces líquidas (u otros fluidos corporales) poner una
Alternativamente, se puede usar un lápiz para marcar la porción opaca de un porta de vidrio para microscopio.
Para heces consistentes, la muestra debería incluir porciones de la superficie y del interior de las heces.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
gota directamente sobre el porta. En el caso de heces líquidas, hebras mucosas, exudados o pus, se
pueden mezclar con solución salina sobre el porta de microscopio. Las heces líquidas se pueden diluir
con una gota de solución salina 150 mM.
f)
iii)
Preparar un medio para hacer el frotis más grueso con áreas de grosor variable. Asegurarse de que el
frotis tiene la transparencia correcta3 .
iv)
Secar el frotis al aire a temperatura ambiente.
v)
Fijar el frotis4 con metanol durante 3 minutos.
Preparación de frotis fecales (o fluidos corporales apropiados) tras la concentración por flotación
o sedimentación
ingún método de flotación o sedimentación es específico para los oocistos de Cryptosporidium spp. Los
líquidos que se emplean para flotación son más densos que los parásitos que se van a concentrar y se
diseñan para una gravedad específica definida utilizando un hidrómetro adecuado disponible por los
suministradores de material de laboratorio más importantes. Los parásitos concentrados por métodos de
flotación o sedimentación se pueden identificar mediante los métodos descritos en este capítulo. Los
líquidos de flotación/sedimentación pueden interferir a veces con las pruebas de diagnóstico. El exceso de
sacarosa puede reducir tanto la unión de los oocistos a los portas de vidrio como la posterior unión del
anticuerpo; la exposición prolongada a NaCl puede distorsionar la morfología y la morfometría, y la
formalina puede reducir la sensibilidad de las reacciones de PCR. Cuando se concentran los oocistos, se
puede eliminar el exceso de líquido de flotación/sedimentación lavando el concentrado en agua y volviendo
a centrifugar. Después se aspira el sobrenadante y se desecha, teniendo cuidado de no alterar el
precipitado. Estos métodos de concentración son adecuados para cualquier líquido corporal que pudiera
contener oocistos.
1.
Flotación
El principio de la flotación utiliza un medio de suspensión líquido, que es más denso que los oocistos
que se van a concentrar. Por consiguiente, cuando se mezclan con el líquido de flotación, los oocistos
suben hasta la superficie y pueden ser tomados de la película superficial y detectados utilizando el
método de elección. Para que un líquido de flotación sea útil en diagnósticos, en los que la morfología
y la morfometría son factores críticos, el medio de suspensión no solamente debe ser más pesado que
el objeto que va a flotar sino que no debe producir un encogimiento o deformación capaz de convertir
al objeto en algo no diagnosticable (18). Los métodos de flotación en sacarosa, los de flotación en
sulfato de zinc y los de flotación en sal saturada son adecuados para la concentración de oocistos de
Cryptosporidium. La siguiente es una descripción de los métodos utilizados para preparar soluciones
de flotación y para concentrar oocistos.
•
Flotación en sacarosa
La solución de sacarosa (gravedad específica: 1,18) se prepara en un vaso de precipitado de vidrio
añadiendo 256 g de sacarosa a 300 ml de agua desionizada. La solución se calienta suavemente
(< 60°C) y se agita continuamente con la ayuda de un agitador magnético sobre un agitador con placa
caliente, hasta que la sacarosa se disuelva totalmente. La solución de sacarosa se coloca en hielo o
en una refrigerador hasta que su temperatura se ajuste a 4°C. La solución de sacarosa fría se
transfiere a un cilindro medidor de 500 ml y se ajusta su gravedad específica a 1,18 añadiendo
suficiente agua fría desionizada (4°C). La solución de sulfato de zinc se transfiere a una botella de
vidrio con tapa de rosca, se etiqueta, se pone la fecha, las iniciales y se almacena a 4°C hasta su
utilización.
•
Flotación en sulfato de zinc
La solución de sulfato de zinc (gravedad específica: 1,18) se prepara en un vaso de precipitado de
vidrio añadiendo 100 g de sulfato de zinc a 300 ml de agua desionizada. La solución se calienta
suavemente (< 60°C) y se agita continuamente con la ayuda de un agitador magnético sobre un
agitador con placa caliente, hasta que el sulfato de zinc se haya disuelto completamente. La solución
de sulfato de zinc se transfiere a un cilindro medidor de 500 ml y su gravedad específica se ajusta a
1,18 añadiendo suficiente agua fría desionizada (4°C). La solución de sulfato de zinc se transfiere a
una botella de vidrio con tapón de rosca, se etiqueta, se pone la fecha y las iniciales y se almacena a
4°C hasta su utilización.
3
4
Para este procedimiento se recomiendan frotis moderadamente gruesos. Si el frotis es demasiado fino o demasiado
grueso, se perderán oocistos. Se consigue un grosor aceptable cuando se pueden ver las manecillas del reloj o puede
leerse lo que está impreso en esta página si se mira a través de la preparación.
Las muestras secadas al aire y fijadas en metanol se pueden mantener a temperatura ambiente durante >6 meses antes
de la tinción.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
•
Flotación en sal
Se prepara una solución de sal saturada (gravedad específica 1,2) añadiendo aproximadamente 200 g
de cloruro de sodio a 200 ml de agua desionizada. La solución se caliente suavemente (< 60°C) y se
agita continuamente con la ayuda de un agitador magnético sobre un agitador con placa caliente. Se
añaden cantidades pequeñas de cloruro de sodio (aproximadamente 10 g) a intervalos de 10 minutos
hasta que la solución se sature. La solución salina saturada se decanta en una botella de vidrio limpia
y se coloca en hielo o en un refrigerador hasta ajustar la temperatura a 4°C. La solución de sal
saturada fría se transfiere a un cilindro medidor de 500 ml y se ajusta su gravedad específica a
1,2 añadiendo agua fría desionizada (4°C). La solución de sal saturada se transfiere a una botella de
vidrio con tapón de rosca y se etiqueta, se pone la fecha, las iniciales y se almacena a 4°C hasta su
utilización.
La salmuera es una solución acuosa concentrada de NaCl, que tiene una gravedad específica entre
1,120 y 1,200 dependiendo de las impurezas de la sal utilizada. Aunque resulta adecuada para la
concentración de oocistos de Cryptosporidium spp., algunos cistos de protozoos pueden llegar a
deformarse o abrirse en este líquido de flotación. El tiempo óptimo para examinar las muestras
obtenidas por flotación en salmuera está entre 5 y 20 minutos tras su recuperación de la flotación.
La flotación en centrifugación se ha utilizado también para recuperar oocistos de Cryptosporidium (y
otros oocistos de parásitos y óvulos) de las heces. La mayor parte de los métodos de flotación se
basan en modificaciones de la técnica de Clayton-Lane, en la que los oocistos se concentran por
flotación y se recogen como gota pendiente en la parte inferior de un cubre de vidrio colocado sobre el
menisco positivo del líquido de flotación. La centrifugación se utiliza para separar las partículas más
densas que el líquido de flotación de los oocistos y otras partículas que flotarán sobre la superficie del
líquido de flotación. La inclusión de una fase de centrifugación acelera la separación de los oocistos de
otras partículas (y por tanto, la concentración de oocistos) y minimiza el riesgo de que el líquido de
flotación afecte adversamente a la morfología y morfometría de los oocistos. El operador debería tener
en cuenta los temas relacionados con salud y seguridad, incluyendo las heridas por laceración y
pinchazo, asociadas al manejo de los cubres.
Concentración de oocistos de Cryptosporidium spp. por flotación
•
Procedimiento de la prueba
i)
Llevar ropas protectora y guantes desechables. Transferir con un palillo aplicador
aproximadamente 1-2 g de heces5 a 3 ml de líquido de flotación en un tubo de ensayo de 12 ml y
mezclar totalmente. Si las heces son líquidas, mezclar completamente, y colocar 1-2 ml del
líquido dentro del tubo de ensayo.
ii)
Añadir, agitando suavemente el líquido suficiente de flotación para formar un menisco positivo en
el borde del tubo de ensayo. Eliminar cualquier partícula grande de la superficie y, si es
necesario, añadir más líquido de flotación para mantener este menisco positivo.
iii)
Dejar reposar durante 20 minutos, y después, teniendo mucho cuidado de no estropear el
menisco convexo, retirarlo suavemente con una pipeta desechable y colocar suavemente sobre
un porta de microscopio6.
iv)
Secar el frotis al aire a temperatura ambiente.
v)
Fijar el frotis7 con metanol durante 3 minutos.
Concentración de oocistos de Cryptosporidium spp. por flotación en centrífuga
5
6
7
8
•
Procedimiento de la prueba
i)
Llevar ropas protectoras y guantes desechables. Transferir con un palillo aplicador
aproximadamente 1-2 g de heces8 a 3 ml de líquido de flotación en un tubo de centrífuga de
12 ml y mezclar completamente. Si las heces son líquidas, mezclar totalmente, y colocar 1-2 ml
de líquido en el tubo de centrífuga.
Para heces consistentes, la muestra debería incluir porciones de la superficie y del interior de las heces.
Se recomiendan frotis relativamente gruesos para este procedimiento. Si el frotis es demasiado fino o demasiado grueso,
se perderán los oocistos. Se puede conseguir un grosor adecuado cuando se pueden ver las manecillas del reloj de
pulsera o se puede leer el texto impreso en esta página a través de la preparación. Marcar el número de referencia de la
muestra sobre un porta de microscopio con un marcador de vidrio, y utilizar portas de microscopio distintos para cada
muestra. Alternativamente, se puede usar un lápiz para marcar la porción opaca de un porta de vidrio de microscopio.
Los frotis secados al aire, fijados con metanol, se pueden guardar a temperatura ambiente durante >6 meses antes de la
tinción.
Para heces consistentes la muestra debería incluir porciones de la superficie y del interior de las heces.
1168
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
ii)
Añadir agitando suavemente, el suficiente líquido de flotación para formar un menisco convexo
en el borde del tubo de centrífuga. Retirar cualquier partícula grande de la superficie y, si es
necesario, añadir más líquido de flotación para mantenerlo.
iii)
Colocar el tubo de centrífuga en una centrífuga de mesa con cubetas oscilantes, y colocar un
cubre de vidrio de 22 mm x 22 mm en el borde del tubo de centrífuga, de forma que aplane el
menisco positivo. Añadir un tubo de equilibrio si es necesario, y centrifugar a 1.100 g9 durante
5 minutos.
iv)
Una vez parada la centrífuga, recoger el cubre de vidrio entre el dedo índice y el pulgar por lados
opuestos del cubre. Habrá una gota pendiente sobre la parte inferior del cubre. Colocar
cuidadosamente el cubre, con la gota pendiente hacia abajo sobre un porta de microscopio de
vidrio.
2.
Sedimentación en centrífuga
Los parásitos se depositarán más rápidamente si la suspensión de heces se somete a
centrifugación; sin embargo, las partículas de alimentos sedimentarán también más rápidamente
y pueden enmascarar la presencia de parásitos en la película examinada. Para superar este
problema potencial, se pueden eliminar las partículas de alimento más grandes filtrando las
heces emulsionadas antes de la centrifugación a través de un tamiz con un tamaño de poro lo
bastante grande para que los parásitos pasen a su través, pero que retenga las partículas más
grandes de alimento. Como este procedimiento es más eficaz que la sedimentación por
gravedad, una muestra fecal más pequeña (500 mg-1g: el tamaño de un guisante) es suficiente
para examen. Aunque la centrifugación concentra el material más rápidamente, los restos
fecales, que pueden ocultar a los parásitos, permanecen presentes. La eficacia de la detección
aumenta añadiendo formalina para la fijación y el mantenimiento de los parásitos, y éter para
eliminar las grasas y los aceites. Tanto la formalina al 10% como el éter son bactericidas.
Después de la centrifugación, se puede ver un tapón graso en la interfase entre los dos líquidos,
que puede adherirse a las paredes interiores del tubo. La capa de éter, el tapón graso y la
formalina de debajo se desechan, y se retiene el precipitado completo para su examen.
Se han realizado muchas modificaciones de este procedimiento, y el protocolo siguiente es el
método típico utilizado en laboratorios de diagnóstico. Con este método se producen menos
deformaciones en los cistos de los protozoos que con la flotación en sulfato de zinc. Este método
logra una concentración de 15-50 veces, dependiendo del parásito escogido, y proporciona un
buen concentrado de oocistos de protozoos y de huevos de helmintos, que es satisfactorio desde
el punto de vista del diagnóstico. Todos los pasos que pueden generar aerosoles (excluyendo la
centrifugación) deben llevarse a cabo en una cabina de seguridad para la protección del
operador.
Concentración de oocistos de Cryptosporidium spp. mediante sedimentación en centrífuga (formol/éter).
9
10
11
12
13
•
Procedimiento de la prueba
i)
Llevar ropas protectoras y guantes desechables. Muestrear aproximadamente 500 mg - 1 g de
heces10 con un palillo aplicador11 y colocar en un tubo de centrífuga limpio de 12-15 ml que contenga
7 ml de formalina al 10%. Si las heces son líquidas, colocar unos 750 µl en el tubo de centrífuga.
ii)
Romper la muestra totalmente y emulsionarla utilizando un palillo aplicador.
iii)
Filtrar la suspensión resultante a través de un tamiz dentro de un vaso de precipitado, y después
verter el filtrado de nuevo dentro del mismo tubo de centrífuga12.
iv)
Añadir 3 ml de dietil éter (o acetato de etilo13) a la solución con formalina, sellar el cuello del tubo con
un tapón de goma (o con el dedo pulgar enguantado sobre la parte alta del tubo) y agitar la mezcla
vigorosamente durante 30 segundos. Invertir el tubo varias veces durante ese procedimiento y liberar
la presión desarrollada retirando el tapón de goma suavemente (o el dedo pulgar) lentamente.
No es recomendable la centrifugación a velocidades superiores a 1100 g durante periodos de tiempo más largos
(>5 minutos) ya que algunos parásitos pueden deformarse y/o quebrarse y colapsarse.
El equivalente al tamaño de un guisante.
Esta muestra debe incluir porciones de la superficie y del interior de las heces consistentes.
Un tamaño de poro de 425 µm, 38 mm de diámetro, es equivalente al Estándar Británico de malla 36 (BS 410-86) o al
Estándar Americano de malla 40 (ASTM E11-81). El borde del tamiz debe ajustar perfectamente en el borde del vaso de
precipitado. Los restos atrapados en el tamiz se eliminan invirtiendo el tamiz y pasando una corriente de agua del grifo a
través de la malla. Tanto el tamiz como el vaso de precipitado deben lavarse totalmente con agua corriente entre cada
muestra.
El acetato de etilo, aunque menos inflamable que el dietil éter es, sin embargo, inflamable, por lo que el procedimiento
debe llevarse a cabo en áreas bien ventiladas, asegurándose de que no hay llamas libres. Evitar respirarlo durante
mucho tiempo o el contacto con la piel.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1169
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
v)
Centrifugar el tubo a 1.100 g14 durante 2 minutos.
vi)
Desprender el tapón graso con un palillo de madera pasando el palo entre la pared interior del tubo y
el tapón. Desechar el tapón y el líquido superior e inferior invirtiendo el tubo, permitiendo que sólo la
última o las dos últimas gotas caigan de nuevo dentro del tubo. Eliminar este líquido, que contiene
dietil éter y formalina, en un contenedor de desechos líquidos marcado.
vii)
Suspender de nuevo el precipitado15 mediante agitación. Verter todo o la mayor parte del precipitado
resuspendido en un porta para microscopio, o transferirlo al porta con una pipeta desechable y secar
al aire.
Existe un dispositivo comercial para concentrar huevos de helmintos, larvas y cistos de protozoos y oocistos
que utiliza el método de la formalina-éter. Es un sistema cerrado que se vende como el “concentrador fecal
de parásitos” (FPC, Evergreen Scientific, Los Angeles, California 90058, EE.UU.) y consiste en dos tubos
de polipropileno, uno de fondo plano para emulsionar las heces, y otro cónico utilizado para la
centrifugación, con un filtro interconectado. El método explicativo indica que se pueden utilizar tanto
muestras fecales frescas como conservadas (10% de formalina, mertiolato-ioduro-formalina, polivinil alcohol
y acetato sódico-formalina).
g)
Métodos convencionales de tinción
Tanto el método mZN como el AP son eficaces para detectar oocistos de Cryptosporidium en heces
(2, 3, 17, 18, 23, 24). Los portas teñidos con mZN deben examinarse con una lente objetivo x40 y los
potenciales oocistos se deben confirmar y medir con la lente objetivo x100 (morfología y morfometría)
utilizando un microscopio de campo claro con un ocular x10. Los portas teñidos con AP necesitan un
microscopio de epifluorescencia equipado con un filtro para isotiocianato de fluoresceína (FITC) (excitación
a 490 nm; emisión a 510 nm). Un filtro UV (excitación a 355 nm, emisión a 450 nm) puede ayudar a
visualizar los esporozoitos teñidos con AP. Los portas teñidos con AP se pueden analizar con lentes de
objetivo x20 y los oocistos con morfología típica se pueden confirmar con lentes de objetivo x40. El objetivo
x100 debe utilizarse para todas las medidas morfométricas (tamaño). Los oocistos teñidos con AP
observados con los filtros para FITC o UV pueden medirse incrementando lentamente el voltaje (intensidad
luminosa) de la fuente luminosa de campo claro, de modo que las imágenes por fluorescencia y por campo
claro se puedan ver a la vez. El objeto se puede medir entonces con el calibrador ocular.
•
Calibración de tamaño utilizando los micrómetros ocular y objetivo
El diagnóstico de organismos intactos necesita a menudo la medida del tamaño y forma del organismo en
cuestión (morfometría), para asegurar que entra dentro del rango aceptado de parámetros estándar (por
ejemplo, tamaño y forma) de la especie determinada. A nivel microscópico, la medida de los objetos < 1mm
se consigue por medio de un micrómetro objetivo utilizado en conexión con un micrómetro ocular.
Los objetos se miden en unidades del Sistema Internacional (SI) y la unidad estándar de medida para
microscopía convencional es la micra (µ= 0,001 mm).
El micrómetro objetivo es un porta de vidrio de 76 x 26 mm que tiene una escala milimétrica, graduada en
micras y permanentemente grabada. El micrómetro ocular es un disco de vidrio o de plástico transparente
con una escala graduada, que se coloca en uno de los oculares de un microscopio binocular. Normalmente
lleva una escala de 1 cm de longitud subdividida en intervalos de milímetros. Cuando el microscopio de
enfoca sobre el objeto a medir, se enfoca simultáneamente tanto la escala del micrómetro ocular como la
imagen del objeto. La escala estándar en el micrómetro objetivo suele ser 1 o 2 mm.
Cuando se va a medir se escoge la lente objetivo adecuada, que depende del aumento requerido, y se
determina el número de divisiones correspondientes a la longitud o anchura de la imagen del objeto en la
escala del micrómetro ocular. La medida observada se traduce a longitud real (que corresponde al número
de divisiones del micrómetro ocular que representan el parámetro a medir que se ha elegido) sustituyendo
el objeto por el micrómetro objetivo y determinando el número de divisiones en el micrómetro ocular que
corresponde a un número definido de divisiones de la escala milimétrica del micrómetro objetivo, al mismo
aumento.
Recuérdese que el cálculo del valor de la división de la escala del micrómetro ocular, en longitud real, solo
es válida para el aumento de la lente objetivo escogida. Hay que calcular el valor de una división del
micrómetro ocular para cada objetivo a aumentos diferentes del microscopio.
14
15
No se aconseja la centrifugación a velocidades superiores a 1.100 g durante periodos más largos (>5 minutos), ya que
algunos parásitos pueden deformarse y/o romperse y colapsarse.
Un precipitado demasiado grande indica una o más de las siguientes causas: centrifugación superior a la velocidad y/o
tiempo recomendado, agitación insuficiente (paso iv), o muestra fecal demasiado grande.
1170
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
Como la morfometría es un componente importante del diagnóstico parasitológico, se tienen que realizar
medidas repetidas de objetos similares presentes en una muestra, o de distintos objetos de tamaño variable
en distintas muestras, que requieren utilizar varios aumentos. Determinando el valor micrométrico de la
escala ocular para cada lente objetivo usada, se puede evitar el intercambio constante entre objetos y
micrómetros oculares. Esto facilita el cálculo morfométrico rápido en milímetros o fracciones de milímetro
con cualquiera de las lentes objetivo disponibles.
El retículo graduado se coloca en el ocular desmontando el componente inferior del ocular y colocándolo en
el tubo. Debe asentarse correctamente antes de volver a ajustar el componente inferior del ocular. Hay que
asegurarse de que el diámetro de la pieza que lleva el retículo graduado es similar al diámetro interno del
tubo que lleva la lente. No debe tocarse la superficie de la pieza que lleva la graduación, y hay que
sostenerla por sus bordes, asegurándose de que esté libre de polvo y grasa. La lente ocular se enfoca
sobre la graduación ajustándola hasta que la escala se vea de forma nítida.
La determinación se lleva a cabo como se indica:
i)
Insertar el micrómetro ocular en el microscopio, con la escala ya enfocada, comprobando que la
escala graduada está en posición correcta.
ii)
Seleccionar la lente objetivo de menor aumento (por ejemplo, objetivo x10) y enfocar el microscopio en
el micrómetro objetivo, rotando el ocular y posicionando el micrómetro objetivo hasta que las escalas
del micrómetro ocular y del micrómetro objetivo se superpongan.
iii)
Contar el número de divisiones del micrómetro objetivo que corresponden exactamente a un número
entero de divisiones del micrómetro ocular.
iv)
Dividir el valor observado en el micrómetro objetivo por el número de divisiones contado en la escala
del micrómetro ocular para determinar el valor de cada división en la escala del micrómetro ocular.
v)
Repetir lo anterior para cada lente objetivo16.
vi)
Mantener cerca o acoplado al microscopio (por ejemplo, en una tabla pegada en el frontal del
microscopio) un registro permanente del cálculo del valor de cada división del micrómetro ocular para
cada lente objetivo.
•
Ejemplo
Para cada lente objetivo:
x divisiones oculares = y µm (en el micrómetro objetivo)
1 división ocular = y/x µm.
•
Examen microscópico de una muestra
La muestra debe examinarse de manera sistemática. La observación debería comenzar utilizando la lente
objetivo más baja para asegurar la visión de la muestra completa. Un esquema sugerido es el siguiente:
comenzar por el ángulo superior izquierdo de la muestra, moviéndose por el porta de izquierda a derecha,
con una anchura de campo visual cada vez, hasta alcanzar el ángulo superior derecho. Bajar una altura de
campo y continuar moviéndose por el porta de derecha a izquierda, campo a campo, hasta el borde
izquierdo de la muestra. Continuar de esta manera hasta llegar al fin de la muestra (esquina inferior
derecha). Durante este período de observación debe ajustarse continuamente el enfoque fino de modo que
se observe también la muestra en profundidad. Cuando se localiza un objeto sospechoso, se examina a
mayor aumento y se considera o se ignora. Si el aumento de la imagen del objeto es insuficiente para
visualizar características morfológicas con la lente objetivo superior (seca), debe utilizarse entonces la lente
objetivo de inmersión (x 100). Se pueden sellar montajes en húmedo con esmalte para uñas o con un
sellador permanente.
Si los oocistos son de un rango de tamaño entre 4-6 µm (ver Cuadro 1), ni las tinciones con colorantes ni
las basadas en fluorescencia permiten determinar la especie presente de Cryptosporidium. Para mamíferos
domésticos, se admite que la mayoría de las infecciones se deben a C. parvum, de modo que puede
hacerse un diagnóstico inicial de criptosporidiosis por C. parvum. Sin embargo, la presencia de oocistos de
ese tamaño no indica necesariamente que la especie infecciosa sea C. parvum. De modo similar, en el caso
de las aves, se puede hacer un diagnóstico preliminar de criptosporidiosis por C. baileyi o C. meleagridis
dependiendo del sitio de la infección y del tamaño de los oocistos. La identificación molecular de la
especie/genotipo/subtipo se puede realizar con posterioridad.
16
Hay que tener en cuenta que el valor calculado en milímetros para cada división del micrómetro ocular es diferente para
lentes objetivos de diferente aumento, con valores calculados de longitud real menor para cada división del micrómetro
ocular a medida que incrementa el aumento.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
•
Descripción de los resultados del examen microscópico
Las muestras negativas deben describirse como “No se observan oocistos de Cryptosporidium“.
Las muestras positivas deben describirse como “Se observan oocistos de Cryptosporidium”.
Para muestras positivas se puede utilizar un sistema indicativo basado en el número de oocistos
observados con la lente objetivo x40. No obstante, el examen microscópico no puede considerarse como
una determinación cuantitativa, ya que el número de oocistos varía considerablemente a lo largo de la
infección.
+
++
+++
•
=
=
=
menos de 5 oocistos por porta
de 1 a 10 oocistos por campo visual
11 o más oocistos por campo visual
Método de Ziehl-Neelsen modificado (mZN)
Fucsina fenicada fuerte: Disolver 20 g de fucsina fenicada en 200 ml de metanol absoluto y mezclar con
una agitador magnético hasta su disolución. Añadir con cuidado 125 ml de fenol líquido (GPR [80% p/p en
agua destilada]) hasta que se mezcle bien y llevar el volumen final a 1.675 ml con agua desionizada.
Mezclar exhaustivamente. Filtrar antes de usar a través de papel de filtro Whatman No. 1 para eliminar
restos, y conservar en una botella de reactivo stock. Marcar con fecha e iniciales. Guardar el reactivo stock
en la oscuridad a temperatura ambiente.
También se dispone de preparaciones comerciales. A menudo la concentración de fucsina básica puede
variar entre límites aceptables de 1-3%.
1% de metanol ácido: Añadir cuidadosamente 20 ml de ácido clorhídrico (GPR/SLR) a 1.980 ml de metanol
absoluto y mezclar. Pasar a una botella de reactivo stock, y marcar con la fecha e iniciales.
0,4% de verde malaquita: Añadir 2 g de verde malaquita a 480 ml de agua desionizada y mezclar con un
agitador magnético. Filtrar a través de papel de filtro Whatman No.1, pasar a una botella de reactivo stock, y
marcar con la fecha e iniciales.
•
Procedimiento de la prueba
Cada vez que se realiza el proceso, incluir un porta de control positivo.
i)
Llevar ropa protectora y guantes desechables. Fijar los frotis secados al aire o los concentrados17 con
metanol durante 3 minutos.
ii)
Sumergir el porta en fucsina fenicada fuerte en frío y teñir durante 15 minutos.
iii)
Lavar el porta con agua del grifo.
iv)
Decolorar con 1% de metanol ácido durante 10-15 segundos18.
v)
Lavar el porta con agua del grifo.
vi)
Dar coloración de contraste con 0,4% de verde malaquita durante 30 segundos.
vii)
Lavar el porta con agua del grifo.
viii) Secar el porta al aire (El frotis puede examinarse con o sin cubre. Se extiende sobre el frotis un poco
de aceite de inmersión y se observa con lentes secas o con aceite de inmersión, sin la adición de
cubre. Un método alternativo es añadir cubre y medio de montaje y examinar después el frotis).
17
18
19
ix)
Detectar la presencia de oocistos examinando el porta con la lente objetivo x40 en un microscopio de
campo claro. Confirmar la presencia de oocistos con la lente objetivo de aceite de inmersión.
x)
Medir la forma y tamaño de los cuerpos coloreados de rojo19.
Para este procedimiento se recomiendan frotis moderadamente gruesos.
Debe evitarse la decoloración excesiva.
Los oocistos de Isospora spp. se tiñen de rojo y aparecen como cuerpos ovoides alargados, estrechados al final y
conteniendo un zigoto granular o dos esporoblastos. Los oocistos de Cyclospora spp. se tiñen de rosa y aparecen como
discos circulares (de 8-10 µm de diámetro) con una mórula central. El grado y proporción de la tinción varía en oocistos
individuales. En muestras fecales, el oocisto suele verse generalmente no esporulado.
1172
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
•
Características diagnósticas de oocistos de Cryptosporidium spp. teñidos con mZN
Los oocistos de Cryptosporidium spp. se tiñen de rojo en un fondo verde pálido. El grado y proporción de la
tinción varía con oocistos individuales. Además, las estructuras internas toman el colorante con distinta
afinidad. Algunos pueden aparecer amorfos mientras otros contienen las formas características de los
esporozoitos. Los oocistos de Cryptosporidium parvum se presentan como discos con 4-6 µm de diámetro.
Las levaduras y los restos fecales se tiñen de rojo mate. Algunas esporas bacterianas pueden retener
también el color rojo, pero son muy pequeñas y no originan confusión.
•
Auramina-fenol
Auramina-fenol (AP): Disolver 3 g de fenol en 100 ml de agua desionizada y añadir lentamente 0,3 g de
Auramina O. Filtrar por papel de filtro Whatman No.1 y pasar a una botella de reactivo stock. Marcar la
fecha y las iniciales del reactivo. Guardar a temperatura ambiente en una botella de vidrio protegida de la
luz con un tapón hermético. También son adecuados colorantes comerciales, como el reactivo de Lempert.
3% de metanol ácido: Añadir cuidadosamente 60 ml de ácido clorhídrico (GPR/SLR) a 1940 ml de metanol
absoluto y mezclar. Pasar a un frasco de reactivo stock, y marcar con la fecha e iniciales.
0,1% de permanganato potásico: Añadir 0,5 g de permanganato potásico a 499,5 ml de agua desionizada y
mezclar con un agitador magnético. Filtrar por papel de filtro Whatman No.1, pasar a un frasco de reactivo
stock y marcar la fecha y las iniciales del reactivo.
•
Procedimiento de la prueba
Cada vez que se realiza el proceso, incluir un porta de control positivo.
i)
Llevar ropa protectora y guantes desechables. Fijar los frotis secados al aire o los concentrados20 con
metanol durante 3 minutos.
ii)
Sumergir los portas en colorante AP durante 10 minutos.
iii)
Lavar con agua del grifo para eliminar el exceso de colorante.
iv)
Decolorar con 3% de alcohol ácido durante 5 minutos.
v)
Dar la tinción de contraste con 0,1% de permanganato potásico durante 30 segundos.
vi)
Secar el porta al aire a temperatura ambiente21 (ver el paso viii del Ziehl-Neelsen modificado (mZN),
arriba).
vii)
Examinar la presencia de oocistos en un microscopio de epifluorescencia equipado con filtros para
FITC, observando el porta con la lente objetivo x20. Confirmar la presencia de oocistos con la lente
objetivo x40.
viii) Medir la forma y tamaño de los cuerpos fluorescentes22.
•
Características diagnósticas de los oocistos de Cryptosporidium spp. teñidos con AP.
Los oocistos de Cryptosporidium spp. parecen circulares u ovoides y muestran una fluorescencia típica
verde-manzana sobre un fondo oscuro. Los oocistos de Cryptosporidium parvum son circulares o con forma
anular, con diámetro de 4-6 µm. Si es posible, examinar la preparación con un filtro para UV (excitación a
355 nm, emisión a 450 nm), ya que los esporozoitos son visibles más fácilmente bajo UV que con el filtro
para FITC. Con el filtro para UV, los oocistos son de color verde pálido y los esporozoitos, amarillo
verdosos.
•
Cultivo
No hay un método reproducible para el cultivo de Cryptosporidium spp. de líquidos corporales. Se han descrito
técnicas de cultivo celular in vitro para oocistos infecciosos semipurificados pero no se han probado lo suficiente
con aislamientos y materiales inhibidores como para ser recomendadas con fines rutinarios.
20
21
22
Para este procedimiento se recomiendan frotis moderadamente gruesos.
No secar los portas con papel secante, ya que algunos papeles secantes contienen fibras fluorescentes.
Los oocistos potenciales se determinan aumentando lentamente el voltaje (intensidad de luz) de la fuente luminosa, de
modo que se puedan ver al mismo tiempo las imágenes en fluorescencia y en campo claro. Los objetos pueden medirse
entonces con el micrómetro ocular.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
•
Métodos inmunológicos
Han resultado útiles dos sistemas de detección inmunológica de oocistos de Cryptosporidium y se han
comercializado varios kits. Cada uno tiene un nivel similar de sensibilidad y puede emplear tanto muestras
fecales concentradas como no concentradas, dependiendo del número probable de oocistos en la muestra.
Comparados con las tinciones convencionales, los kits de detección basados en anticuerpos (inmunoflorescencia
y ELISA) son caros, considerando que parecen tener un umbral similar de detección.
a)
Inmunofluorescencia directa
En la inmunofluorescencia directa, un anticuerpo marcado con FITC contra epítopos superficiales
específicos del género se une a los oocistos de Cryptosporidium presentes en la muestra. Utilizando un
sistema de filtro para FITC, la excitación con luz UV (longitud de onda de máxima excitación 490 nm,
longitud de onda media de emisión 530 nm) causa que los oocistos marcados muestren una fluorescencia
verde-manzana brillante. Los materiales incluidos en los kits comerciales varían, pero normalmente incluyen
controles positivos y negativos de oocistos de C. parvum, MAb anti-Cryptosporidium marcado con FITC
(suministrado a la dilución de trabajo) y un medio de montaje con glicerol que incorpora un inhibidor de la
foto-decoloración. En cada prueba deben incluirse siempre muestras conocidas positivas y negativas.
Los frotis fecales secados al aire o los concentrados fecales se fijan con metanol absoluto (o con acetona,
dependiendo de las instrucciones del fabricante) y se secan. A menudo los portas del kit son portas con
pocillos en los que se ponen tanto las muestras como los reactivos. Deben seguirse las instrucciones del
fabricante. No conviene diluir los reactivos del kit para incrementar el volumen de la prueba. El MAb antiCryptosporidium específico de género y marcado con FITC (mAb Cryptosporidium) se aplica a la dilución de
trabajo predeterminada sobre la muestra seca fijada y el porta se incuba horizontalmente en la oscuridad en
una cámara húmeda. El exceso de anticuerpos se elimina por un ligero lavado y se seca. Se coloca sobre la
muestra medio de montaje y se aplica un cubre, asegurándose de no retener burbujas de aire. Si no se
suministra medio de montaje, resulta adecuada una mezcla de 50% de glicerol no fluorescente y 50% de
solución salina tamponada con fosfato (PBS) (v/v). Las muestras se observan con el objetivo x20, los
oocistos se confirman empleando la lente objetivo x40, y se determina el número de oocistos presentes. Los
números se expresan como se ha indicado anteriormente. En ausencia de un método comercializado, el
método siguiente produce resultados satisfactorios.
Se puede utilizar el fluorógeno nuclear, 4´6-diamidino-2-fenil indol (DAPI; [C16 H15N5.2HCl, peso 350,2]),
para resaltar los núcleos de los esporozoitos dentro de los oocistos fluorescentes, lo que suministra una
confirmación morfológica adicional (6, 19). El DAPI es un intercalante inespecífico del ADN, de modo que el
ADN de otras células que interfieren, como bacterias y levaduras, también será marcado. A una
concentración de trabajo de 0,4 µg/ml el DAPI resulta particularmente útil cuando se buscan oocistos en
muestras no fecales (por ejemplo, en agua y alimentos). El DAPI se intercala en el núcleo de los
esporozoitos en oocistos viables y no viables y origina una fluorescencia azul.
Se utiliza un filtro azul (excitación a 490 nm; emisión a 510 nm) para visualizar la localización del FITC-CmAb y una excitación ultravioleta (UV) (excitación a 355; emisión a 450 nm) para determinar la presencia de
los núcleos de los esporozoitos teñidos con DAPI.
•
Procedimiento de la prueba
Cada vez que se realiza el proceso, incluir un porta de control positivo.
23
24
i)
Llevar ropa protectora y guantes desechables. Fijar los frotis secados al aire o los concentrados con
metanol durante 5 minutos23.
ii)
Colocar 50 µl de MAb anti-Cryptosporidium a la dilución de trabajo en el pocillo de cada porta.
Asegurar un recubrimiento completo del pocillo24.
iii)
Colocar el porta preparado en una cámara húmeda por encima del material absorbente utilizado para
generar humedad. Comprobar que el material absorbente está húmedo.
iv)
Colocar la cámara húmeda en un incubador a aproximadamente 37°C durante el tiempo indicado por
el fabricante (normalmente 30-60 minutos).
Alternativamente, dejar evaporar el metanol hasta sequedad a temperatura ambiente.
Los volúmenes, los tiempos, etc. pueden variar según las instrucciones de los fabricantes. Seguir siempre dichas
instrucciones.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
v)
Con un aspirador tipo Büchner, aspirar suavemente el exceso de MAb de cada pocillo. Mover la placa
hacia el operador con un ángulo de 45° de la horizontal y aspirar el líquido que queda en el fondo del
pocillo colocando la punta del aspirador cerca del líquido, pero sin tocarlo. La succión del aspirador
eliminará el líquido. Repetir esta operación en cada pocillo de portas que contengan una muestra.
vi)
Colocar 50µl de PBS en cada pocillo y dejar estar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
vii)
Aspirar suavemente el PBS de cada pocillo como se ha indicado en el paso v. Añadir otros 50µl de
PBS a cada pocillo y dejar estar otros 2 minutos antes de aspirar suavemente el PBS como se ha
descrito.
viii) Añadir a cada pocillo 50 µl de DAPI 1/5000 en solución de PBS y dejar estar durante 2 minutos a
temperatura ambiente. La solución de trabajo de DAPI se prepara diluyendo una solución stock de
2 mg/ml de DAPI a 1/5000 en PBS (150 mM, pH 7,2). La solución de trabajo debe prepararse cada día
que se necesite. La solución stock de DAPI (2 mg/ml en metanol) puede guardarse en la oscuridad a
4°C indefinidamente.
ix)
Aspirar suavemente la solución de DAPI de cada pocillo como se describe en el paso v.
x)
Añadir 50 µl de agua desionizada a cada pocillo y dejar estar durante 1-3 segundos a temperatura
ambiente; después aspirar suavemente el agua desionizada de cada pocillo como se describe en el
paso v.
xi)
Depositar 50 µl de medio de montaje en el centro de cada pocillo de cada porta, luego aplicar
suavemente un cubre en el porta para microscopía.
xii)
Dejar asentar el cubre antes de analizar el porta25.
xiii) Observar la preparación para oocistos con el objetivo x20 y confirmar con el objetivo x40 de un
microscopio de epifluorescencia equipado con un filtro para FITC. Medir los oocistos con el objetivo
x10026. Si es necesario, los portas se pueden guardar en la oscuridad a temperatura ambiente hasta
su lectura.
•
Características diagnósticas de oocistos
Cryptosporidium marcado con FITC
de
Cryptosporidium
spp.
teñidos
con
MAb
anti-
Los oocistos de Cryptosporidium spp. son redondos o ligeramente ovales y exhiben una fluorescencia
verde-manzana brillante con filtro para FITC. Sus medidas (largo x ancho) se presentan en el Cuadro 1. A
menudo la fluorescencia tiene más intensidad en la circunferencia del oocisto, sin roturas visibles de la
pared celular teñida. Si en el kit se incluye el colorante azul de Evans, que reduce la fluorescencia
inespecífica, la fluorescencia de fondo será roja. La fluorescencia inespecífica es amarilla. Observar
siempre el control positivo para asegurarse de que el tamaño, forma y color del oocisto potencial coincide
con los del control positivo. El DAPI se intercala en los núcleos de los esporozoitos de oocistos viables y no
viables originando una fluorescencia azul cielo. Con lentes de objetivo de inmersión x100, el núcleo del
esporozoito es esférico o subesférico, con aproximadamente 1 micra de diámetro. En el caso de un oocisto
distorsionado, la demostración de cuatro núcleos fluorescentes en un objeto de tamaño comparable al
oocisto ayuda a su identificación (6, 19).
b)
Detección de antígenos de Cryptosporidium por enzimoinmunoensayo
En el ELISA se busca la presencia de antígenos de Cryptosporidium en las heces (coproantígeno).
Dependiendo del kit comercial, los coproantígenos de Cryptosporidium se capturan y desarrollan con una
25
26
Estos montajes temporales pueden convertirse en semi-permanentes sellando los bordes del cubre con esmalte claro de
uñas. Dejar asentarse el cubre durante aproximadamente 30 minutos o 1 hora antes de sellar. Utilizando la brocha que
acompaña al esmalte de uñas, aplicar cuidadosamente el esmalte a lo largo del perímetro del cubre asentado, utilizando
la anchura de la brocha como guía para la anchura del esmalte aplicado. Asegurar un recubrimiento uniforme por todo el
perímetro del cubre sin dejar huecos. Dejar secar el esmalte a temperatura ambiente antes de marcar el porta de modo
adecuado con un número propio de identificación. Si es necesario, utilizar un escalpelo para quitar con cuidado el exceso
de esmalte secado y endurecido.
Los oocistos potenciales se determinan aumentando lentamente el voltaje (intensidad de luz) de la fuente luminosa ,de
modo que se puedan ver al mismo tiempo las imágenes en fluorescencia y en campo claro. Los objetos pueden medirse
entonces con el micrómetro ocular.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
mezcla de anticuerpos mono y policlonales. Excepto un incremento en el número de muestras y la
automatización, los kits de detección de antígenos no ofrecen más sensibilidad ni ventajas que los métodos
descritos.
Los kits de detección de antígeno por ELISA en “sandwich” que están comercializados contienen filas de
pocillos con anticuerpo fijado anti-Cryptosporidium para capturar los coproantígenos de Cryptosporidium,
anticuerpos anti-Cryptosporidium para desarrollar la reacción que están conjugados a un enzima
(frecuentemente la peroxidasa de rábano), substrato, un sistema para desarrollar el cromógeno/substrato y
solución de parada (que cuando se añade a la mezcla de reacción inhibe la catálisis enzimática posterior).
Se han desarrollado para detectar antígenos de C. parvum en heces, pero también son capaces de detectar
epítopos comunes en infecciones no debidas a C. parvum. En las preparaciones comerciales se incluyen
muestras positivas y negativas, y normalmente contienen todos los reactivos necesarios para realizar el
análisis y las instrucciones del fabricante, que deben seguirse. No resulta conveniente diluir los reactivos del
kit para aumentar la capacidad de la prueba. Normalmente, se incluye un método explicativo y una fórmula
para calcular el valor de corte y asignar resultados positivos o negativos a las muestras. Los reactivos se
guardan por lo general a 4°C cuando no se usan. Todos los reactivos deben alcanzar la temperatura
ambiente antes de utilización. Debido a la variación en los métodos descritos para diferentes kits
comercializados, en este capítulo no se incluye ningún método de detección de coproantígeno.
•
Métodos de reconocimiento del ácido nucleico
La PCR es más sensible que los métodos convencionales y las pruebas inmunológicas para detectar
oocistos en las heces, aunque la sensibilidad de los métodos publicados varía entre 1 y 106 oocistos. A
menudo estas técnicas están restringidas a laboratorios especializados. Se requiere atención al elegir los
cebadores, pues algunos amplifican productos específicos de género (amplicones) mientras otros
amplifican amplicones específicos de especie. Antes de su adopción rutinaria en el laboratorio clínico, debe
superarse la variabilidad en los métodos y las dificultades inherentes a amplificar ácidos nucleicos en
muestras fecales por PCR.
Las muestras fecales pueden contener inhibidores de la PCR. Además de bilirrubina y de sales biliares, los
polisacáridos complejos son potentes inhibidores. Para Cryptosporidium, la ebullición de muestras fecales
en 10% de polivinilpolipirrilidona (PVPP) antes de la extracción puede reducir la inhibición.
La mejor información sobre especie/genotipo/subtipo deriva del estudio de tres regiones genéticas (dos
correspondientes a ARNr 18S [9, 13, 25, 26] y una a la proteína de la pared del oocisto de Cryptosporidium
[COWP] [8, 20]), de fragmentos génicos por PCR-RFLP y/o por secuenciación de amplicones. La
amplificación por PCR del ADN de Cryptosporidium utilizando los cebadores de ARNr 18S (CPB-DIAGF/R)
de Johnson et al. (9) origina productos cuya longitud varía de 428 a 455 bp. Se comentan los cebadores de
Johnson et al. (9) porque se han evaluado en reacciones cruzadas en un total de 23 organismos y los
cebadores funcionan en una variedad de matrices. La modificación por Ward et al. (22) del cebador inverso
de Johson et al. (9) (substitución de CPB-DIAGR por PW99R [TAA-GGA-ACA-ACC-TCC-AAT-CTC], que
produce un amplicón de aproximadamente 420 bp) es más sensible que CPB-DIAGR/R (9) tanto en
pruebas de PCR directas como anidadas. Se requieren más estudios en diferentes matrices antes de que
PW99R (22) se pueda recomendar por completo para reemplazar a CPB-DIAGR. La prueba anidada con
ARNr 18S (Nichols-Johnson; 13) también parece ser muy sensible.
Actualmente no hay ninguna zona genética “estándar” recomendada para identificar especies, pero la
RFLP o la secuenciación de las zonas génicas 18S suministra información de más especies que la zona de
COWP. Para detectar de modo fiable un pequeño número de oocistos (< 100), se necesita una PCR
anidada. En el laboratorio del autor se han probado extensamente dos técnicas PCR para ARNr 18S
(13, 25, 26) y los cebadores de Nichols-Johnson (13) parecen más sensibles, sobre todo con números bajos
(< 10) de oocistos de C. parvum, C. hominis, C. felis, y C. muris. Aunque es menos sensible, la prueba de
Xiao et al. (25, 26) tiene la ventaja de ser capaz de detectar más especies que la de Nichols-Johnson (13)
por RFLP.
El Cuadro 2 contiene las especies de Cryptosporidium y los genotipos determinados por RFPL del amplicón
definido por los cebadores CPB-DIAGR/F tras la digestión con los enzimas de restricción VspI, DraI y DdeI.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
Cuadro 2. Cryptosporidium spp. y genotipos determinados por RFLP de los amplicones definidos por los cebadores
CPB-DIAGR/F tras digestión con los enzimas VspI, DraI and DdeI
Especies y genotipos de Cryptosporidium
(Longitud del amplicón en bp)
DdeI
VspI
DraI
C. parvum 1 (438)
222,104,112
Ninguno
204,68,166
C. parvum 2 (435)
219,104,112
Ninguno
201,68,166
C. muris (432)
320,112
Ninguno
42,224,166
C. andersoni (431)
319,112
Ninguno
265,166
C. felis (455)
239,104,112
50,405
221,68,166
C. baileyi (428)
212,104,112
84,344
262,166
47,171,104,112
Ninguno
200,68,166
318,112
Ninguno
264,166
C. wrairi
219,104,112
Ninguno
201,68,166
Cryptosporidium cerdo (435)
219,104,112
Ninguno
201,68,166
Cryptosporidium monitor del desierto (432)
216,108,112
Ninguno
198,68,166
C. meleagridis (434)
C. serpentis (430)
Cryptosporidium ratón (439)
48,175,104,112
Ninguno
205,68,166
Cryptosporidium hurón (438)
48,174,103,113
Ninguno
204,68,166
Cryptosporidium perro (429)
213,104,112
Ninguno
195,68,166
Cryptosporidium koala (436)
220,104,112
Ninguno
202,68,166
Cryptosporidium canguro (436)
220,104,112
Ninguno
202,68,166
Cryptosporidium mono (436)
220, 104, 112
Ninguno
202, 68,166
Cryptosporidium oso (432)
216,104,112
Ninguno
87,111,68,166
No todas las especies/genotipos de Cryptosporidium se pueden identificar mediante PCR-RFPL de las
zonas de ARNr 18S, aunque todas las especies conocidas con impacto comercial en los animales
domésticos se identifican por PCR-RFPL. La secuenciación del amplicón puede ofrecer una mejor
información que la PCR-RFPL, pero es más costosa y lleva más tiempo. Actualmente, la disponibilidad de la
secuenciación es muy variable en distintas partes del mundo y, para las especies más importantes que
afectan a los animales domésticos, la prueba PCR-RFPL aún tiene que jugar un papel importante.
Una prueba de PCR-RFPL anidada en tubo único (8), que amplifica un fragmento del gen que codifica la
COWP, distingue entre C. hominis y C. parvum. Esta prueba se recomienda frente a la de la referencia
20 porque es más sensible y ofrece una solución a la frecuente contaminación en las técnicas PCR
anidadas debido a la re-amplificación de los productos de PCR. En esta prueba de PCR anidada en tubo
único, los cebadores internos y externos se añaden a la mezcla inicial de reacción. La optimización de
concentraciones de cebadores y las temperaturas de anillamiento originan la amplificación preferencial de
sólo un tamaño en el producto, definido por los cebadores internos.
No existe un método recomendado para extraer el ADN de oocistos de Cryptosporidium, y la sensibilidad de
la mayoría de los métodos no se ha establecido por completo. El ADN de Cryptosporidium puede extraerse
después de la purificación parcial de los oocistos utilizando una de las técnicas de flotación/sedimentación
descritas arriba o de los oocistos de las heces tras extracción mediante bolas de zirconio (12). Si el método
de concentración usual en el laboratorio es por sedimentación con formol-éter, los concentrados de oocistos
adecuados para la lisis y amplificación por PCR se pueden preparar sustituyendo agua desionizada por la
formalina al 10% empleada en el método descrito. Utilizando columnas comerciales de purificación, la
pérdida de ADN puede ser una consecuencia de la purificación, pero normalmente debe haber un número
de oocitos presentes en la muestra para extraer suficiente ADN de Cryptosporidium para un análisis por
PCR-RFPL/secuenciación.
El método siguiente es eficaz para extraer ADN de un número bajo de oocistos parcialmente purificados
(aproximadamente 10), y se emplea en el laboratorio del autor (14). Los oocistos parcialmente purificados
se suspenden en 100 µl de tampón de lisis (50 mM de Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM de ácido etilén diamino tetraacético, pH 8,0, 0,5% de dodecil sulfato sódico [SDS], todos son productos de Sigma-Aldrich) y se someten
a 15 ciclos de congelación y descongelación (1 minuto en nitrógeno líquido; 1 minuto a 65°C). A
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
continuación las muestras se transfieren a un baño a 55°C, se añade proteinasa K (a una concentración
final de 200 µg/ml) y se incuba durante 3 horas. La proteinasa K se desnaturaliza por calor (90°C, 20
minutos), las muestras se enfrían en hielo durante 1 minuto, se centrifugan (16.000 g, 5 minutos) y se
extraen 70 µl del sobrenadante para amplificación por PCR. El SDS es un inhibidor de la polimerasa Taq a
concentraciones tan bajas como 0,01%; por tanto, es necesario neutralizar el SDS del ADN extraído. La
adición de Tween 20 al 2% neutraliza hasta el 0,05% de SDS.
Los reactivos para la reacción de PCR se depositan en tubos de pared fina de 0,5 ml. Cada tubo contiene
90 µl de reactivos ya mezclados (200 µM de cada uno de los cuatro dNTPs, 200 nM de cada uno de los
cebadores CPB-DIAGR y CPB-DIAGF, seroalbúmina bovina a una concentración final de 400 µg/ml,
3,5 mM de MgCl2, 2,5 U de polimerasa Taq en tampón para PCR y Tween 20 a una concentración final de
2% para inactivar el SDS al 0,05%). Finalmente, se introducen 10 µl de ADN molde y después 40 µl de
aceite mineral. Las muestras se someten a 39 ciclos de amplificación y los productos se visualizan después
de teñir geles de agarosa al 1,4% con bromuro de etidio (9).
En el Cuadro 3 se presentan los cebadores y los protocolos de los pasos de ciclos para amplificar el
fragmento génico correspondiente al ARNr 18S (9, 25, 26) o al de COWP (8).
Cuadro 3.Protocolos de los ciclos de PCR para rARN 18S (referencias 9, 25 & 26) y de PCR anidada en tubo único
para COWP (referencia 8)
Cebadores
Protocolo de pasos de ciclos
Ref.
CPB-DIAGF
AAG-CTC-GTA-GTT-GGA-TTT-CTG
CPB-DIAGR
TAA-GGT-GCT-GAA-GGA-GTA-AGG
80°C, 5 minutos; 98°C, 30 segundos
1 ciclo
55°C, 30 segundos; 72°C, 1 minuto; 94°C, 30 segundos 39 ciclos
72°C, 10 minutos
1 ciclo
4°C
absorber
9
XF1 (externo)
TTC-TAG-AGC-TAA-TAC-ATG-CG
XR1 (externo)
CCC-ATT-TCC-TTC-GAA-ACA-GGA
XF2 (interno)
GGA-AGG-GTT-GTA-TTT-ATT-AGA-TAA-AG
XR2 (interno)
AAG-GAG-TAA-GGA-ACA-ACC-TCC-A
94°C, 3 minutos
1 ciclo
94°C, 35 segundos; 55°C, 45 segundos; 72°C, 1 minuto 35ciclos
72°C, 7 minutos
1 ciclo
4°C
absorber
25,
26
oocry3 (externo)
AGA-TTA-ACA-GAA-TGC-CCA-CCA-GGT-A
oocry4 (externo)
CCA-TGA-TGA-TGT-CCT-GGA-TTT-TGT-A
oocry1 (interno)
CCT-GGA-TAT-CTC-GAC-AAT
Oocry2 (interno)
GCG-AAC-TAA-TCG-ATC-TCT-CT
94°C, 5 minutos
94°C, 1 minuto; 67°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto
94°C, 1 minuto; 54°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto
72°C, 10 minutos
4°C
•
1 ciclo
20ciclos
35 ciclos
1 ciclo
absorber
8
Descripción de los resultados del análisis por PRC-RFLP/secuenciación
Las muestras negativas deben describirse como “NO se ha detectado ADN de Cryptosporidium”.
Las muestras positivas deben describirse como “Se ha detectado ADN de Cryptosporidium“, y, después de
la identificación de la especie respectiva a partir de los perfiles de RFLP presentados en el Cuadro2, se
inserta la especie/genotipo/subtipo identificada (ver Cuadro 2 y referencias 6 y 20).
2.
Pruebas serológicas (y/o pruebas de inmunidad celular si son relevantes)
A menudo la criptosporidiosis es una enfermedad del recién nacido y a falta de evidencias que excluyan la
exposición a oocistos infecciosos, las pruebas serológicas no ofrecen ninguna ventaja. Las pruebas serológicas
se pueden utilizar para análisis seroepidemiológicos: la mayoría se basan en técnicas ELISA con extractos
acuosos de extractos de C. parvum (por ejemplo, referencia 7). Las pruebas de inmunidad celular no parecen
ofrecer ventajas específicas, y no existen.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
No hay programa de control para la criptosporidiosis, ni existen vacunas disponibles rigurosamente probadas.
REFERENCIAS
1.
ANUSZ K.Z., MASON P.H., RIGGS M.W. & PERRYMAN L.E. (1990). Detection of Cryptosporidium parvum oocysts
in bovine feces by monoclonal antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol., 28,
2770–2774.
2.
CASEMORE D.P. (1991). Laboratory methods for diagnosing cryptosporidiosis. Broadsheet 128. J. Clin.
Pathol., 44, 445–451.
3.
CASEMORE D.P., ARMSTRONG M. & SANDS R.L. (1985). Laboratory diagnosis of cryptosporidiosis. J. Clin.
Pathol., 38, 1337–1341.
4.
CURRENT W.L. (1997). Cryptosporidiosis. En: Diseases of Poultry, Tenth Edition, Calnek B.W., Barnes H.J.,
Beard C.W., McDougald L.R. & Saif Y.M. eds. Mosby-Woolfe, Mosby International, Lynton House, 7–12
Tavistock Square, London WC1H 9LB, UK, 883–890.
5.
FAYER R., SPEER C.A. & DUBEY J.P. (1990). General biology of Cryptosporidium. En: Cryptosporidiosis of Man
and Animals, Dubey J.P., Speer C.A. & Fayer R. eds. CRC Press. Boca Raton, Florida, USA, 1–30.
6.
GRIMASON A.M., SMITH H.V., PARKER J.F.W., BUKHARI Z., CAMPBELL A.T. & ROBERTSON L.J. (1994). Application
of DAPI and immunofluorescence for enhanced identification of Cryptosporidium spp. oocysts in water
samples. Water Res., 28, 733–736.
7.
HILL B.D., BLEWETT D.A., DAWSON A.M. & W RIGHT S.E. (1990). Analysis of the kinetics, isotype and specificity
of serum and coproantibody in lambs infected with Cryptosporidium parvum. Res. Vet. Sci., 48, 76–81.
8.
HOMAN W., VAN GORKOM T., KAN Y.Y. & HEPENER J. (1999). Characterization of Cryptosporidium parvum in
human and animal feces by single-tube nested polymerase chain reaction and restriction analysis. Parasitol.
Res., 85, 707–712.
9.
JOHNSON D.W., PIENIAZEK N.J., GRIFFIN D.W., MISENER L. & ROSE J.B. (1995). Development of a PCR protocol
for sensitive detection of Cryptosporidium in water samples. Appl. Environ. Microbiol., 61, 3849–3855.
10. INTERNATIONAL AIR TRANSPORT ASSOCIATION (2003). Dangerous Goods Regulations, 44th Edition. International
Air Transport Association, 800 Place Victoria, P.O. Box 113, Montreal, Quebec H4Z 1M1, Canada, 815 pp.
11. KORICH D.G., MARSHALL M.M., SMITH H.V., O’GRADY J., BUKHARI Z., FRICKER C.R., ROSEN J.P. & CLANCY J.L.
(2000). Inter-laboratory comparison of the CD-1 neonatal mouse logistic dose-response model for
Cryptosporidium parvum oocysts. J. Eukaryot. Microbiol., 47, 294–298.
12. MCLAUCHLIN J., PEDRAZA-DIAZ S., AMAR-HOETZENEDER C. & NICHOLS G.L. (1999). Genetic characterization of
Cryptosporidium strains from 218 patients with diarrhea diagnosed as having sporadic cryptosporidiosis. J.
Clin. Microbiol., 37, 3153–3158.
13. NICHOLS R.A.B., CAMPBELL B.M. & SMITH H.V. (2003). Identification of Cryptosporidium spp. oocysts in UK still
natural mineral waters and drinking waters using a modified nested PCR-RFLP assay. Appl. Environ.
Microbiol., 69, 4183–4189.
14. NICHOLS R.A.B. & SMITH H.V. (2004). Optimisation of DNA extraction and molecular detection of
Cryptosporidium parvum oocysts in natural mineral water sources. J. Food Protect., 67, (In press).
15. OKHUYSEN P.C, CHAPPELL C.L., CRABB J.H., STERLING C.R. & DUPONT H.L. (1999). Virulence of three distinct
Cryptosporidium parvum isolates for healthy adults. J. Infect. Dis., 180, 1275–1281.
16. ROBERT B., GINTER A., COLLARD A. & COPPE P. (1990). Diagnosis of bovine cryptosporidiosis by enzymelinked immunosorbent assay. Vet. Parasitol., 37, 1–8.
17. SMITH H.V. (1992). Intestinal protozoa. En: Medical Parasitology: a Practical Approach, Hawkey P.M. &
Gillespie S.H., eds. IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK, 79–118.
18. SMITH H.V. (1998). Detection of parasites in the environment. Parasitology, 117, S113–S141.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1179
Capítulo 2.10.9. — Cryptosporidiosis
19. SMITH H.V., CAMPBELL B.M., PATON C.A. & NICHOLS R.A.B. (2002). Significance of enhanced morphological
detection of Cryptosporidium sp. oocysts in water concentrates using DAPI and immunofluorescence
microscopy. Appl. Environ. Microbiol., 68, 5198–5201.
20. SPANO F., PUTIGNANI L., MCLAUCHLIN J., CASEMORE D.P. & CRISANTI A. (1997). PCR-RFLP analysis of the
Cryptosporidium oocyst wall protein (COWP) gene discriminates between C. wrairi and C. parvum, and
between C. parvum isolates of human and animal origin. FEMS Microbiol. Lett., 150, 209–217.
21. STURDEE A.P., CHALMERS R.M. & BULL S.A. (1999). Detection of Cryptosporidium oocysts in wild mammals of
mainland Britain Vet. Parasitol. 80, 273–280.
22. WARD P.I., DEPLAZES P., REGLI W., RINDER H. & MATHIS A. (2002). Detection of eight Cryptosporidium
genotypes in surface and waste waters in Europe. Parasitology, 124, 359–368.
23. WEBER R., BRYAN R.T., BISHOP H.S., W ALQUIST S.P., SULLIVAN J.J. & JURANEK D.D. (1991). Threshold of
detection of Cryptosporidium oocysts in human stool specimens: evidence for low sensitivity of current
methods. J. Clin. Microbiol., 29, 1323–1327.
24. WEBSTER K.A., SMITH H.V., GILES M., DAWSON L. & ROBERTSON L.J. (1996). Detection of Cryptosporidium
parvum oocysts in faeces: comparison of conventional coproscopical methods and the polymerase chain
reaction. Vet. Parasitol,. 61, 5–13.
25. XIAO L., MORGAN U., LIMOR J., ESCALANTE A., ARROWOOD M., SHULAW W., THOMPSON R.C.A., FAYER R. & LAL
A.A. (1999). Genetic diversity within Cryptosporidium parvum and related Cryptosporidium species. Appl.
Environ. Microbiol, 65, 3386–3391.
26. XIAO L., SING A., LIMOR J., GRACZYK, T.K., GRADUS S & LAL A.A. (2001). Molecular charactrisation of
Cryptosporidium oocysts in samples of raw surface water and wastewater. Appl. Environ. Microbiol., 67,
1091–1101.
27. XIAO L., FAYER R, RYAN U. & UPTON S.J. (2004). Cryptosporidium taxonomy: recent advances and
implications for public health. Clin. Microbiol. Rev., 17, 72–97.
28.
WWW .KSU.EDU/PARASITOLOGY/ Hacer
click en ‘Host checklist for C. parvum’
*
* *
1180
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO 2.10.10.
ENFERMEDADES VÍRICAS DE HENDRA
Y DE NIPAH
RESUMEN
El virus de Hendra (HeV) y el virus de Nipah (NiV) surgieron en la última década del siglo veinte
como causa de brotes de una enfermedad neurólogica y respiratoria que afecta a varias especies
animales. El NiV ha quitado la vida a más de cien personas y el HeV ha provocado la muerte de
dos personas. En 1994, el HeV causó una enfermedad respiratoria grave y la muerte de
13 caballos y de un entrenador de caballos en un establo de Brisbane, Australia. Entre Septiembre
de 1998 y Abril de 1999, después de su propagación no reconocida como una infección
respiratoria porcina en Malasia, apareció el NiV entre la población humana como responsable de
una encefalitis mortal. Se sacrificaron más de un millón de cerdos para detener la extensión de la
enfermedad. Los murciélagos frugívoros (zorros voladores) del género Pteropus son los
hospedadores naturales de ambos virus.
La infección de caballos por el HeV se caracteriza por la aparición de manera progresiva de
fiebres altas, hinchazón facial, dificultad respiratoria grave y, finalmente, una abundante descarga
nasal espumosa. Algunos caballos muestran síntomas neurológicos. Las observaciones post
mortem más comunes son ganglios linfáticos pulmonares dilatados, edema pulmonar severo y
congestión. La lesión subyacente consiste en una degeneración generalizada de los capilares
sanguíneos en varios órganos. En capilares y arteriolas se observan frecuentemente células
endoteliales sincitiales que contienen el antígeno vírico .La infección equina por el HeV no
provoca siempre la muerte y algunos caballos que manifiestan síntomas clínicos sobreviven. Los
experimentos de transmisión realizados en el laboratorio han demostrado que el HeV no se
propaga con facilidad entre los caballos, un descubrimiento que concuerda con la observación de
que en el brote original, la infección no se transmitió de forma generalizada a los caballos de
propiedades adyacentes.
La infección porcina por el NiV es muy contagiosa pero no se identificó inicialmente como una
enfermedad nueva porque ni la morbilidad ni la mortalidad eran destacadas y los síntomas clínicos
no eran significativamente diferentes de los de otras enfermedades porcinas conocidas. Las
observaciones que se realizaron cuando se investigó el brote y durante las infecciones
experimentales confirmaron que la infección de cerdos por el NiV se caracteriza por fiebre y
afectación respiratoria, y síntomas nerviosos ocasionales. Algunos animales infectados muestran
una inusual tos seca productiva (sonido semejante a ladridos). Se han notificado casos de aborto
en cerdas. Las lesiones inmunohistoquímicas se encuentran en el sistema respiratorio (traqueitis y
neumonía bronquial e intersticial) o en el cerebro (meningitis) de los animales infectados. Las
células sincitiales que contienen el antígeno vírico se observan en capilares sanguíneos, vasos
linfáticos y epitelio respiratorio.
Ambos virus afectan a animales de compañía. El HeV provoca en gatos una enfermedad
respiratoria similar a la observada en caballos. La infección natural de perros con el NiV causa un
síndrome parecido al moquillo con una alta tasa de mortalidad. De manera experimental el NiV
origina una enfermedad semejante a la producida por el HeV en gatos. Se ha demostrado la
presencia de células endoteliales sincitiales que contienen el antígeno vírico en las infecciones de
gatos debidas a ambos virus y en la infección de perros por el NiV.
Parece que no existe transmisión directa persona a persona. Aparentemente el contagio humano
se produce por el contacto con animales: el NiV a partir de cerdos y el HeV a partir de caballos.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1181
Capítulo 2.10.10. — Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
El HeV y el NiV son miembros estrechamente relacionados de la familia Paramyxoviridae. Las
diferencias encontradas entre ellos y con respecto a otros miembros de esta familia han
conducido a su clasificación en un género nuevo, Henipavirus, dentro de la subfamilia
Paramyxovirinae. Tanto el HeV como el NiV son agentes de bioseguridad de nivel 4 y es vital que
las muestras procedentes de animales sospechosos se transporten a laboratorios autorizados sólo
bajo condiciones biológicamente seguras y de acuerdo con los reglamentos internacionales.
Identificación del agente: tanto el HeV como el NiV pueden propagarse en una variedad de
cultivos celulares. Debería intentarse el aislamiento del virus a partir de muestras de campo no
fijadas, pero sólo en situaciones en las que pueda garantizarse la seguridad del operador. Los
procedimientos de identificación después del el aislamiento del virus comprenden la inmunotinción
de células infectadas y la neutralización con antisueros específicos.
El antígeno vírico está presente en el endotelio vascular y, en el caso del NiV en cerdos, en el
epitelio respiratorio. Puede examinarse un amplio rango de tejidos fijados en formalina para
detectar los antígenos del HeV y del NiV. Los protocolos para el análisis inmunohistoquímico
deberían incluir muestras de cerebro a varios niveles, pulmón, bazo y riñón. En hembras
gestantes o en casos de aborto, deberían analizarse, por ser apropiadas, muestras de útero,
placenta y tejidos fetales.
Pruebas serológicas: se dispone de pruebas de neutralización vírica (NV) y de
enzimoinmunoensayo (ELISA). Actualmente se acepta la NV como procedimiento de referencia.
La capacidad de los antisueros para la neutralización cruzada del HeV y del NiV hasta un grado
limitado significa que una única NV empleada con cualquiera de los virus no permite la
identificación definitiva de anticuerpos específicos. Pueden diferenciarse los anticuerpos
neutralizantes del HeV y del NiV comparando la mayor capacidad de neutralizar el virus homólogo
respecto a la del heterólogo. Esto puede que no sea un impedimento esencial en situaciones de
brotes en los que se conozca el agente causal, pero se deberían someter a análisis NV, tanto con
el HeV como con el NiV, las muestras de suero que procedan de casos sospechosos o de áreas
del mundo distintas de Australia y Malasia. La relación serológica entre el HeV y el NiV permite
asegurar que los ELISAs que utilizan el antígeno del HeV o del NiV pueden emplearse para
detectar los anticuerpos producidos frente a ambos virus. Las reacciones inespecíficas que tengan
lugar en las pruebas ELISA y los animales que reaccionen positivamente a dichas pruebas deben
confirmarse mediante una NV antes de considerarse indicativos de infección por el NiV o el HeV.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: actualmente no se dispone de
vacunas para el HeV ni para el NiV.
A. INTRODUCCIÓN
El virus Hendra (HeV) y el virus Nipah (NiV) son virus de murciélagos frugívoros que comúnmente se conocen
como “zorros voladores”, y que son miembros del género Pteropus. Se han encontrado anticuerpos frente al
HeV aproximadamente en el 50% de las cuatro especies de Pteropus australianos (25), y en una reducida
encuesta serológica se han detectado fácilmente anticuerpos frente al NiV en un grupo de murciélagos de
Malasia, entre los que se incluyen dos especies de pterópidos (14). El HeV ha estado presente en la población
de zorros voladores australianos durante al menos 20 años (15). El HeV y el NiV se han aislado a partir de
zorros voladores de Australia y Malasia, respectivamente (1, 7).
El HeV surgió en Brisbane, Australia, en Septiembre de 1994 como causa de un brote de una enfermedad
respiratoria aguda que causó la muerte de 13 caballos y de un entrenador de caballos (16). Inicialmente el virus
se denominó morbillivirus equino, pero posteriores análisis genéticos indicaron que no parecía lo
suficientemente relacionado con los morbillivirus para merecer su inclusión en este género. Ha habido otros dos
casos de infección equina mortal por HeV en el Norte de Queensland. Dos caballos desarrollaron una
enfermedad aguda y murieron casi 1 mes antes del brote de Brisbane, pero se determinó que el HeV era la
causa de la muerte sólo después de que el dueño del caballo, quien probablemente adquirió el HeV durante la
necropsia de los caballos, muriera 13 meses más tarde por una encefalitis mediada por el HeV (20). En Enero
de 1999 murió un tercer caballo sin que se asociara con ninguna enfermedad humana (6).
Los estudios retrospectivos de muestras histológicas de archivo indican que el NiV ha causado una baja
mortalidad entre los cerdos de Malasia desde 1996, pero permaneció desconocido hasta 1998, año en el que
surgió como agente causal de un brote de encefalitis en humanos (2). En contraste con la enfermedad
respiratoria equina causada por el HeV, que fue frecuentemente mortal pero caracterizada por una
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.10. — Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
transmisibilidad baja (24), la enfermedad respiratoria provocada por el NiV en cerdos fue a menudo subclínica y
altamente contagiosa, propiedades que conducen a la dispersión rápida del virus entre la población porcina de
Malasia y obligó a las autoridades a elegir los sacrificios como el único medio para controlar la propagación (17).
Se eliminaron más de un millón de cerdos; 106 de 267 hombres infectados, la mayoría criadores de cerdos en
Malasia y personal de mataderos en Singapur que tuvieron contacto directo con los animales vivos, murieron de
encefalitis (1, 19).
El diagnóstico de la enfermedad causada por los Henipavirus se realiza mediante el aislamiento del virus o la
demostración del antígeno vírico en muestras de tejidos. La detección de anticuerpos específicos también
puede ser útil particularmente en cerdos en los que la infección por el NiV puede pasar desapercibida. La
identificación de anticuerpos anti-HeV en caballos es menos útil debido a la alta tasa de muerte por la infección
en esta especie. La demostración de anticuerpos específicos frente al HeV o al NiV es de importancia
diagnóstica por la rareza de la infección y por la seria implicación zoonósica de la transmisión de la infección.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
a)
Aislamiento y caracterización del virus
Los virus HeV y NiV se clasifican como agentes de bioseguridad de nivel 4 (BSL4), ya que existe un alto
riesgo de infección del personal de laboratorio y deben tomarse las debidas precauciones (21). Las
directrices de bioseguridad de la OIE del Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios
de microbiología, proporciona información adicional. Sin embargo, debido al alto riesgo de infección
humana en el laboratorio, los requisitos de BSL4 superan los requisitos de nivel 4 de contención de la OIE.
El aislamiento del virus facilita enormemente los procedimientos de identificación y el diagnóstico definitivo
debería establecerse en lugares en los que se pueda garantizar la seguridad del operador. El aislamiento
es especialmente relevante en cualquier nuevo caso o brote, particularmente en países o áreas
geográficas en las que no se haya documentado previamente la infección por el HeV o el NiV. La
demostración de que las especies silvestres actúan como hospedadores naturales de los virus requiere el
aislamiento del virus después de la captura de estos animales.
i)
Muestreo y presentación de las muestras
Las muestras a diagnosticar deben entregarse a laboratorios designados en envases de diseño
especial. Para el transporte de muestras de una supuesta enfermedad zoonósica, se deben seguir las
instrucciones de la Asociación de Transporte Aéreo Internacional (IATA) y los Reglamentos de
Mercancías Peligrosas (DGR) (13). Los requisitos están recogidos en el Capítulo I.1.1. Métodos de
muestreo.
Se ha resumido la variedad de tejidos que producen virus, tanto en casos naturales como
experimentales (5). Deben ser siempre sometidos a prueba el cerebro, el pulmón, el riñón y el bazo.
Las muestras se deben transportar en hielo a 4°C, y, si esto no es posible, en hielo seco. No se
deberían mantener a –20°C durante mucho tiempo.
ii)
Aislamiento en cultivos celulares
La propagación del virus debería llevarse a cabo bajo condiciones BSL4. La estricta observancia de
esta norma permitirá limitar la manipulación de muestras de diagnóstico donde la presencia del HeV o
del NiV se pueda sospechar, pero no confirmar, hasta su traslado a laboratorios con equipamiento
BSL4. El aislamiento primario del virus a partir de muestras sospechosas, de ser necesario, puede
realizarse bajo condiciones BSL3. Sin embargo, si esto último se intenta, se debe desarrollar una
normativa local que garantice la seguridad del operador y aplicarla si en los cultivos infectados se
aprecia un efecto citopático (ECP) “tipo paramyxovirus”. Tales directrices harán hincapié en la
práctica adecuada de laboratorio, la utilización de cabinas de clase II y puede ser necesaria la fijación
con metanol de las células infectadas, para destruir el virus infeccioso, lo que continuará con la
detección por inmunofluorescencia de antígenos de los Henipavirus. El medio de cultivo procedente
de células Henipavirus positivas debe transferirse a un laboratorio BSL4.
Los tejidos en el laboratorio receptor se manejan bajo condiciones de esterilidad y se preparan
suspensiones al 10% (w/v), moliendo los tejidos en un sistema de homogenización cerrado, p. ej., una
batidora/stomacher que emplee una bolsa de plástico o un molinillo mezclador que utilice bolas de
acero autoclavables dentro de cilindros metálicos cerrados. Después de la clarificación del
homogenizado mediante centrifugación a 300 g, el sobrenadante se añade a las monocapas de
cultivo celular. El aislamiento del virus se ve facilitado por el hecho de que el HeV y el NiV crecen
rápidamente hasta un título alto en muchos cultivos celulares. Las células de riñón de mono verde
africano (Vero) y las de riñón de conejo (RK-13) han demostrado ser particularmente susceptibles. El
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Capítulo 2.10.10. — Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
HeV también se replica en cerebro de ratón lactante y en huevos embrionados de gallina y, aunque el
primero pueda representar un método viable de aislamiento primario, no hay datos sobre la
susceptibilidad relativa de los sistemas in vivo, de tal modo que puedan compararse con los sistemas
de cultivo celular, más convenientes. Habitualmente se desarrolla un ECP en 3 días, pero se
recomiendan dos pases de 5 días antes de estimar que el intento ha resultado infructuoso. Después
de una baja multiplicidad de infección, el ECP se caracteriza por la formación de sincitios que
después de 24–48 horas, pueden contener sobre unos 60 o más núcleos. Los sincitios formados por
el NiV en las monocapas celulares Vero son significativamente mayores que los creados por el HeV
en el mismo periodo de tiempo. Aunque la distribución de núcleos en los sincitios inducidos por el NiV
en la etapa temprana de la infección se parece a la inducida por el HeV, con agregación nuclear en el
centro de los sincitios, los núcleos en los sincitios maduros inducidos por el NiV se distribuyen
alrededor de la periferia de la célula gigante (12).
iii)
Métodos de identificación
•
Inmunotinción de células fijadas
La velocidad con la que el HeV y el NiV se replican y los altos niveles de antígeno vírico generados en
las células infectadas hacen de la inmunofluorescencia un método útil para identificar de manera
rápida la presencia de Henipavirus, empleando para ello antisuero anti-NiV o anti-HeV. Hasta la
fecha, el género Henipavirus comprende el HeV y el NiV y no se conocen virus relacionados
antigénicamente.
La reactividad serológica cruzada entre el HeV y el NiV implica que un antisuero policlonal frente a
uno de los dos virus o antisueros monoespecíficos inducidos por proteínas individuales de cualquiera
de ellos, no podrán diferenciar entre ambos. Actualmente se están desarrollando anticuerpos
monoclonales (MAbs) y se están probando para desempeñar esta función tanto en la identificación
primaria del virus después del aislamiento como para su empleo en el examen inmunohistoquímico
de tejidos procedentes de casos sospechosos.
•
Procedimiento de la prueba
Bajo condiciones BSL4, las monocapas de células Vero o RK-13 crecidas en cubreobjetos o en
portas compartimentalizados, se infectan con el virus aislado y las monocapas se examinan para
detectar la presencia de sincitios después de un periodo de incubación de 24–48 horas a 37°C. Se
recomienda que se ensaye un rango de diluciones del virus (no diluido, 1/10, 1/100) porque los
sincitios se observan más fácilmente después de una infección a baja multiplicidad. Una vez que se
detectan los sincitios, las células infectadas se fijan mediante inmersión en un recipiente lleno de
metanol. El recipiente se sella y su superficie se esteriliza antes de trasladarlo a un lugar del
laboratorio menos seguro, por ejemplo BSL2, donde los portas se secarán al aire. El antígeno vírico
se detecta utilizando suero anti-HeV o anti-NiV y procedimientos inmunofluorescentes estándar. Un
rasgo característico de los sincitios inducidos por los Henipavirus es la presencia de unas grandes
estructuras poligonales que contienen el antígeno vírico. Estas se observan más fácilmente con Mabs
y anticuerpos monoespecíficos frente a la proteína N de la nucleocápsida y a la fosfoproteína P.
•
Inmunomicroscopía electrónica
Los títulos elevados que se generan in vitro en las células por la presencia del HeV y del NiV permiten
su visualización en el medio de cultivo mediante microscopía electrónica de contraste negativo sin
necesidad de concentrar por centrifugación. La detección de interacciones virus-anticuerpo mediante
inmunomicroscopía electrónica proporciona una información valiosa a cerca de la estructura vírica y
la reactividad antigénica, incluso durante el aislamiento primario del virus. Otras técnicas
ultraestructurales permiten completar el examen diagnóstico, como el cultivo celular en rejilla (11), en
el que las células se cultivan, se infectan y se visualizan sobre unas rejillas de microscopio
electrónico, y la identificación de los virus replicándose y los cuerpos de inclusión en secciones finas
de tejidos infectados y cultivos celulares fijados e incluidos. Se han descrito los detalles de estas
técnicas y su aplicación en la detección y el análisis del HeV y del NiV (12).
b)
Neutralización vírica: diferenciación entre el HeV y el NiV
Las pruebas de neutralización se basan en métodos de cuantificación y se dispone de tres procedimientos
para titular el HeV y el NiV. En el ensayo tradicional de placas y en el de microtitulación el título se calcula
como las unidades formadoras de placas (PFU) o la dosis infectiva del cultivo tisular, respectivamente,
capaces de causar un ECP en el 50% de los pocillos de réplica (DICT50). En un procedimiento alternativo,
los virus se titulan sobre monocapas de células Vero en placas de 96 pocillos y tras 18–24 horas, los focos
de infección se detectan inmunológicamente en células fijadas con metanol empleando antisuero
antiantivírico (3). El título vírico se expresa como unidades formadoras de focos (FFU)/ml.
Los ensayos de neutralización que emplean estos tres métodos se describen más adelante. El aislado
vírico que reacciona con antisueros anti-HeV y/o anti-NiV en un ensayo inmunofluorescente se considera
idéntico, desde un punto de vista serológico, al HeV o al NiV si muestra la misma sensibilidad a la
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Capítulo 2.10.10. — Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
neutralización mediante los antisueros anti-HeV y anti-NiV que el HeV o el NiV. El antisuero anti-HeV
neutraliza al HeV a una dilución cuatro veces superior aproximadamente a la que neutraliza al NiV. Por el
contrario, el antisuero anti-NiV neutraliza al NiV unas cuatro veces más eficientemente que al HeV (2). Los
procedimientos de cuantificación vírica deberían llevarse a cabo en condiciones BSL4.
i)
Reducción de placas
Los HeV y NiV stock y el Henipavirus no identificado se diluyen en los medios y las réplicas de cada
virus, que contienen aproximadamente 100 PFU en 50–100 µl, se mezclan con un volumen igual de
medio mínimo esencial de Eagle (EMEM) o de una serie de diluciones del antisuero anti-HeV o antiNiV en EMEM. Las mezclas virus-antisuero se incuban a 37°C durante 45 minutos, se adhieren a las
monocapas de células Vero a 37°C durante 45 minutos y el número de placas se determina mediante
procedimientos de ensayo tradicional de placas después de una incubación a 37°C durante 3 días.
ii)
Neutralización en placas de microtitulación
Los HeV y NiV stock y el Henipavirus no identificado se diluyen y las réplicas de cada virus, que
contienen aproximadamente 100 DICT50 en 50 µl, se adicionan a los pocillos de prueba de una placa
de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano. Los virus se mezclan con un volumen igual de EMEM
o de una serie de diluciones del antisuero anti-HeV o anti-NiV en EMEM. Las mezclas se incuban a
37°C durante 45 minutos y se añaden aproximadamente 2,4 ‰ 104 células a cada pocillo hasta un
volumen final aproximado de 200 µl. Después de 3 días a 37°C, la lectura de la prueba se realiza
mediante un microscopio invertido y los pocillos se valoran por el grado de ECP observado. Los que
contengan sólo células o células y antisuero no mostrarán ECP. Por el contrario, los pocillos que
contengan células y virus mostrarán sincitios y destrucción celular. Un pocillo positivo es aquél donde
todas o una proporción de células de la monocapa forman grandes sincitios típicos de la infección por
henipavirus.
iii)
Inmunoensayo de placas
Se adicionan células Vero (2 ‰ 104 en 200 µl medio/pocillo) a placas de microtitulación de fondo plano
y se cultivan durante toda la noche a 37°C. Los HeV y NiV stock y el Henipavirus no identificado se
diluyen y las réplicas conteniendo cerca de 60 FFU/50 µl se mezclan con un volumen igual de EMEM
o de una serie de diluciones de antisueros anti-HeV y anti-NiV en EMEM. Las mezclas virus-antisuero
se incuban durante 45 minutos a 37°C y se adhieren a monocapas de células Vero durante
45 minutos a 37°C. Las mezclas virus–antisuero se extraen, se añaden 200 µl de EMEM a cada
pocillo y se continúa la incubación a 37°C. Después de 18–24 horas el medio de cultivo se elimina y
las placas se sumergen en metanol absoluto frío durante 10 minutos y a continuación se introducen
en bolsas de plástico, se rellenan con metanol, se sellan al calor y su superficie se esteriliza con lysol
al 4% (v/v) para trasladarlas desde el laboratorio BSL4. También se puede utilizar para la
esterilización glutaraldehído a concentraciones tan bajas como el 0,1% durante 24 horas. Se
recomienda que cada laboratorio determine la concentración de glutaraldehído requerida para la
esterilización en el periodo de tiempo necesario. Las placas una vez fijadas con metanol se secan al
aire, los pocillos se bloquean con tampón fosfato salino (PBS) que contenga Tween 20 al 0,05% y
leche desnatada en polvo al 2% y se incuban durante 30 minutos a 37°C con antisuero frente al HeV
o al NiV o con un antisuero monoespecífico frente a la proteína vírica. El anticuerpo antivírico unido a
los sincitios puede detectarse con un anticuerpo antiespecie específico conjugado a fosfatasa alcalina
y el sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato y p-nitro azul de tetrazolio (NBT/BCIP; Promega, número
de catálogo S3771). Cuando aparecen placas púrpuras frente a un fondo claro (10–30 minutos), se
elimina el sustrato y las placas de microtitulación se enjuagan con agua destilada y se secan al aire.
Las placas se cuentan empleando una lupa.
c)
Métodos de reconocimiento basados en el ácido nucleico
Los genomas del HeV y del NiV se han secuenciado por completo (22) y para detectar estos virus se
utilizan métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa que están siendo aplicados en varios
laboratorios (10).
d)
Detección de antígenos de los Henipavirus en tejido fijado - inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica ha demostrado ser una de las pruebas más útiles para la detección del HeV y del
NiV. Llevada a cabo sobre tejidos fijados con formalina o células fijadas con formalina, es una prueba
segura y ha permitido investigaciones retrospectivas de materiales de archivo (9). Como la replicación
vírica y la patología primaria tienen lugar en el endotelio vascular (8), hay un amplio rango de tejidos en los
que pueden detectarse los antígenos del HeV y del NiV (5). Se cree que los antígenos del HeV pueden
desaparecer tempranamente del tejido pulmonar en el curso de la infección, de modo que la muestra
sometida a prueba debería incluir una serie de tejidos, salvo el de pulmón. El antígeno del HeV se ha
detectado en el riñón de un caballo 21 días después de iniciada la infección (24), de modo que este órgano
siempre debería ser analizado. Un protocolo ideal para el análisis inmunohistoquímico debería emplear
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Capítulo 2.10.10. — Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
muestras de cerebro a varios niveles, pulmón, ganglios linfáticos mediastínicos, bazo y riñón. En hembras
gestantes deberían ser incluidos tejidos fetales, de útero y de placenta.
Se pueden utilizar una serie de antisueros frente al HeV y al NiV en investigaciones inmunohistoquímicas
de tejidos infectados, pero se ha descubierto que son especialmente adecuados los antisueros de conejo
frente al HeV y al NiV purificados a partir de placas. También se dispone de algunos Mabs. Aunque en el
pasado se ha empleado con éxito un sistema de detección de biotina-estreptavidina ligado a peroxidasa
(8), el sistema de detección preferido es el reactivo anti-conejo/anti-ratón unido a polímero de dextrano
conjugado a fosfatasa alcalina.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Los portas que contienen las secciones de los tejidos control positivo y negativo y la muestra
problema fijados con formalina e incluidos en parafina, se desparafinan mediante tres inmersiones en
xileno durante 1 minuto. Las secciones se hidratan realizando dos cambios de etanol al 98–100%, un
cambio de etanol al 70% y agua corriente para eliminar el alcohol residual.
ii)
Se enjuagan los portas con agua destilada, se sumergen en 0,01 M CaCl2 (se ajusta a pH 7,8 con
0,1 M hidróxido sódico) que contenga tripsina (Difco Trypsin 250) al 0,1% (w/v) durante 20 minutos a
37°C y se lavan con agua destilada.
iii)
Los portas se dejan horizontales en una cámara húmeda y se enjuagan con PBS durante 5 minutos.
A cada porta se añaden 200 µl de H2O2 diluido en agua al 3% y se dejan transcurrir 20 minutos a
temperatura ambiente para bloquear la peroxidasa endógena. Los portas se lavan con PBS durante
5 minutos.
iv)
Se adicionan 200 µl de una dilución apropiada de anticuerpo de conejo anti-Nipah o anti-Hendra en
PBS conteniendo leche desnatada en polvo al 0,1% (w/v) a los portas del tejido problema y a los
portas controles positivo y negativo. A un conjunto duplicado de portas de prueba y controles positivo
y negativo se les añade un anticuerpo de conejo frente a un patógeno no relacionado. Se cubren los
portas y se incuban a 37°C durante 1 hora.
v)
Se lavan los portas con PBS durante 5 minutos y se aplican 2–3 gotas de solución de EnvisionTM (Ig
anti-conejo conjugada a polímero de dextrano marcado con peroxidasa [DAKO Corporation, 6392 Via
Real, Carpinteria, CA 03013]). Se incuban a 37°C durante 20 minutos.
vi)
Se prepara el sustrato disolviendo 2 mg de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) en 200 µl de dimetil
formamida (Merck) y se añaden 10 ml de 0,02 M tampón acetato, pH 5,0. Se añaden 5 µl H2O2
(30% w/v) y se mezclan. Se comprueba que el porta control positivo presenta un color suficiente,
normalmente en 2–5 minutos y se para la reacción mediante un enjuague con agua destilada. La
solución del sustrato debe prepararse inmediatamente antes de su utilización.
vii)
Los portas se contratiñen con hematoxilina durante 1–3 minutos, se enjuagan con agua corriente, se
les añade solución de Scott (0,04 M bicarbonato sódico, 0,3 M sulfato magnésico), y se lavan bien
bajo agua corriente. A continuación se enjuagan con agua destilada y se montan con cubreobjetos
empleando medio de montaje acuoso.
viii) Se realiza la lectura de los portas observándose el depósito del cromógeno en el citoplasma, lo que
indica la presencia del antígeno vírico. En el citoplasma de las células positivas se verá una
coloración granular marrón/rojiza. Los núcleos celulares son azules y esto facilita la identificación de
la morfología tisular y ayuda a la localización del antígeno vírico en el tejido.
2.
Pruebas serológicas
En los laboratorios donde se realizan las pruebas serológicas, particularmente en situaciones de brote, se han
adoptado diversas estrategias para reducir el riesgo de exposición del personal de laboratorio al HeV y al NiV.
Los sueros pueden ser gamma-irradiados (6 kiloGreys) o diluidos 1/5 en PBS conteniendo Tween 20 al 0,5% y
Triton-X100 al 0,5% e inactivados por calor a 56°C durante 30 minutos.
a)
Pruebas de neutralización vírica
Los Henipavirus pueden cuantificarse mediante ensayos de placas, microtitulación o inmunoensayos de
placas y estas pruebas pueden modificarse para detectar anticuerpos antivíricos (véase más arriba). La
prueba de neutralización vírica (NV) se acepta como patrón de referencia. En el ensayo en placas de
microtitulación, el más usualmente utilizado, que se realiza bajo condiciones BSL4, los sueros se incuban
con el virus en los pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos antes de añadir las células Vero. Los
sueros se analizan comenzando con una dilución al 1/2 aunque esto puede acarrear problemas de
citotoxicidad inducida por el suero. En el caso de muestras de baja calidad o volúmenes pequeños de
muestra, como puede ser el caso de sueros de zorro volador o de murciélago carnívoro, puede utilizarse
una dilución inicial al 1/5. Los cultivos se leen a los 3 días y aquellos sueros que bloqueen completamente
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Capítulo 2.10.10. — Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
el desarrollo de ECP se designarán como positivos. En el caso de problemas de citotoxicidad el
inmunoensayo de placas descrito anteriormente tiene una ventaja, porque las mezclas virus/suero se
extraen de las monocapas de células Vero después del periodo de adherencia, de modo que se limita su
ECP.
b)
Técnica de enzimoinmunoensayo
Los antígenos de los Henipavirus para las pruebas de enzimoinmunoensayo (ELISA) se irradian con
6 kiloGreys antes de su uso, un tratamiento que tiene un efecto insignificante sobre el título antigénico. En
el ELISA indirecto desarrollado en respuesta al brote inicial en Hendra de 1994, el antígeno se obtuvo a
partir de células infectadas por el HeV sometidas a varios ciclos de congelación y descongelación y
tratamiento con dodecil sulfato sódico al 0,1% (w/v) (P. Selleck, datos no publicados). En el programa
nacional de vigilancia porcina de Malasia de 1999 (4) se empleó un formato de ELISA indirecto similar en el
que el antígeno procedía de células infectadas por el NiV tratadas con un detergente no iónico.
Posteriormente, para controlar los niveles altos de actividad de unión inespecífica en algunos antisueros
porcinos, se desarrolló un ELISA modificado basado en la reactividad relativa de sueros con el antígeno
del NiV y un antígeno control derivado de células Vero no infectadas. En el Centro de Control de
Enfermedades de Atlanta, EE.UU., el enfoque no sólo ha sido disponer de un ELISA indirecto para detectar
la IgG sino también utilizar un ELISA de captura para detectar la IgM.
La especificidad del ELISA indirecto para el NiV (98,4%) (18) significa que en programas de vigilancia, la
prueba producirá falsos positivos. Esto puede que no sea un problema importante de cara a afrontar un
brote de NiV en el que se infecta un alto porcentaje de cerdos y el propósito de la vigilancia es detectar
granjas infectadas. Sin embargo, este nivel de especificidad de la prueba crea un problema en ausencia de
un brote o si es limitado el número de muestras a analizar. Si un resultado positivo por ELISA es indicativo
de infección auténtica, la falta de respuesta puede conducir a una extensión del virus y provocar víctimas
humanas mortales. En contraste, el iniciar medidas de control en respuesta a un ELISA falso positivo
podría suponer un derroche de recursos (5). El enfoque actual es probar todos los sueros reactivos al
ELISA mediante la NV, siendo considerados positivos los sueros que den positivo en esta última prueba.
La confirmación mediante la NV debería hacerse bajo condiciones BSL4, lo que puede implicar el envío de
las muestras a un laboratorio reconocido a nivel internacional.
El procedimiento ELISA para el NiV que se indica a continuación se ha desarrollado en el Laboratorio de
Salud Animal de Australia (AAHL) para sueros porcinos y se ha estandarizado después de los estudios
realizados en colaboración con el Instituto de Investigación Veterinaria de Ipoh, Malasia.
•
Procedimiento de la prueba
Preparación de antígenos del NiV
i)
Se cultivan células Vero hasta su confluencia en botellas de cultivo rotatorio en medio EMEM
conteniendo suero fetal de ternero (FCS) al 10% (v/v). Para infectar con el virus, se vierte todo menos
5 ml del medio procedente de cada botella de cultivo rotatorio y, en un laboratorio BSL4, se añade el
NiV purificado a partir de placas con pocos pases, hasta una multiplicidad de infección de
0,1 DICT50/células.
ii)
Se hace rotar las botellas durante 30 minutos a 33°C para que se adhiera el virus, se añaden 60 ml
de EMEM conteniendo FCS al 10% a cada botella y se les hace rotar durante unas 48 horas más a
33°C. La multiplicidad de infección, el tiempo de incubación y la temperatura se eligen de modo que,
aunque la mayoría de las células sean infectadas e incorporadas en sincitios en 48 horas, unas pocas
células se separen en el medio de cultivo. El medio de cultivo de las células infectadas bajo estas
condiciones es una fuente de virus excelente para su posterior purificación (23).
iii)
Se lavan las monocapas de células infectadas por el virus una vez con 0,01 M PBS frío y, empleando
un rascador, se desprenden las células de cada botella de cultivo rotatorio y se les añade 5–10 ml de
PBS enfriado en hielo.
iv)
Se agrupan las células desprendidas en tubos de 50 ml mantenidos en hielo y las células se
precipitan a 300 g durante 5 minutos a 4°C. Se vierte PBS y las células se resuspenden en TNM
(10 mM Tris, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, pH 7,2) enfriado en hielo; se emplean aproximadamente
0,5 ml de TNM por cada botella de cultivo.
v)
Se añade NP40 (detergente no iónico, Nonidet P40) hasta el 1% (mediante la adición de 1/10 del
volumen de NP-40 al 10% [v/v] en agua) y las células se lisan mediante 5–10 golpes realizados con
un homogenizador Dounce. Esto también desprende antígeno vírico del citoesqueleto que por otra
parte se extraerá por centrifugación (etapa vi).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1187
Capítulo 2.10.10. — Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
vi)
Se precipitan los núcleos a 600 g durante 10 minutos a 4°C. Los núcleos no se lisarán bajo estas
condiciones y deberían formar un fuerte precipitado blanco.
vii)
Se saca con cuidado el sobrenadante del extracto citoplasmático y se vierte en un tubo limpio al que
se le añade ácido etilen-diamino-tetra-acético hasta 1.5 mM. Se lleva hasta 10 ml con TNE, se
preparan alícuotas pequeñas, se congelan a –80°C y se gamma-irradian con 6 kiloGreys. Las
alícuotas se conservan a –80°C.
Preparación del antígeno control, células Vero no infectadas
viii) Se cultivan las células Vero en botellas de cultivo rotatorio en EMEM conteniendo FCS al 10%.
Cuando confluyen, las monocapas se lavan una vez con PBS frío y las células se desprenden de las
botellas y se les añade 5–10 ml de PBS enfriado en hielo. Se procede como se ha descrito en el caso
de células infectadas por el virus desde las etapas iv–vii antes indicadas.
Preparación de los sueros problema
ix)
En una cabina de seguridad biológica de clase II, se diluye un 1/5 el suero a probar en PBS
conteniendo Triton X-100 al 0,5% (v/v) y Tween 20 al 0,5% (v/v) en los pocillos de una placa de
microtitulación de 96 pocillos. Se sella la placa de microtitulación. El personal de laboratorio debería
usar batas y guantes y rociarse ambas manos, al igual que la placa de microtitulación sellada, con
Virkon al 1% antes de extraer la placa de microtitulación de la cabina de bioseguridad para calentarla
a 56°C durante 30 minutos.
x)
Se mezclan 22.5 µl del suero inactivado por calor con un volumen igual de antígeno de células Vero
no infectadas diluido 1/100 en PBS. Se mezcla a fondo y se incuba a 18–22°C durante 30 minutos.
xi)
Se añaden 405 µl de solución de bloqueo (PBS conteniendo suero de pollo al 5% y leche desnatada
en polvo al 5%) hasta alcanzar una dilución final del suero de 1/100 y se incuba a 18–22°C durante
30 minutos. Se añaden alícuotas de 100 µl a dos pocillos que contengan el antígeno del NiV y a dos
pocillos que contengan el antígeno control, células Vero no infectadas, como se describe en la etapa
xiv.
Procedimiento ELISA
xii)
Se diluyen las células Vero control y los antígenos del NiV en PBS para asegurar que los pocillos
controles de células y antígeno vírico se cubren con una concentración similar de proteínas.
Normalmente el antígeno se diluye desde 1/1.000 a 1/4.000 pero debe determinarse un factor de
dilución específico para cada lote de antígeno. Se añaden 50 µl de antígeno vírico y control celular a
los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos Nunc Maxisorp, como se indica
seguidamente: antígeno vírico en las columnas 1, 3, 5, 7, 9 y 11 y antígeno control celular en las
columnas 2, 4, 6, 8 10 y 12 (Fig. 1). Se incuba a 37°C durante 1 hora con agitación. También se
pueden incubar las placas durante toda la noche a 4°C.
xiii) Se lavan las placas ELISA tres veces con PBS que contenga Tween 20 al 0,5% (PBST)
(250 µl/pocillo) y se bloquea con PBS que contenga suero de pollo al 5% y leche desnatada en polvo
al 5% (100 µl/pocillo) durante 30 minutos a 37°C en un agitador.
xiv) Se lavan las placas tres veces con PBST y se añaden 100 µl de los sueros absorbidos inactivados
procedentes de la etapa xi) a cada pocillo, como se indica en el formato más adelante. Se añaden
100 µl de PBS que contenga suero de pollo al 5% y leche desnatada en polvo al 5% a los pocillos del
conjugado y del control de sustrato. Se incuban las placas sin agitación durante 1 hora a 37°C y se
lavan tres veces con PBST.
xv)
Se diluye el conjugado de proteína A-peroxidasa de rábano picante (ICN Pharmaceuticals; número de
catálogo 622811) en PBST que contenga leche desnatada en polvo al 1% (w/v). El factor de dilución
es aproximadamente de 1/3000. Después de mezclar, se añaden 100 µl de proteína A-conjugado a
todos los pocillos a excepción de los del control de sustrato. Se añaden 100 µl de PBST que contenga
leche desnatada en polvo al 1% a los pocillos del control de sustrato. Se incuban las placas durante
1 hora a 37°C sin agitación y se lavan tres veces con PBST.
xvi) Se prepara el sustrato (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina; TMB; Sigma, número de catálogo T 3405)
disolviendo un comprimido (1 mg) en 10 ml de 0,05 M tampón citrato fosfato, pH 5,0 y se añaden 2 µl
de H2O2 al 30% (v/v) fresco. Se añaden 100 µl del sustrato TMB a cada pocillo. Se incuban durante
1188
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.10. — Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
10 minutos a 18–22°C y se para la prueba mediante la adición a cada pocillo de 100 µl de 1 M ácido
sulfúrico.
xvii) Se leen las placas utilizando de blanco un pocillo del control de sustrato. Las densidades ópticas (OD)
a 450 nm del pocillo con el antígeno del NiV y del pocillo con el antígeno control de las células Vero,
se emplean para calcular una ratio OD para cada suero (OD del antígeno del NiV/OD del antígeno
control Vero).
Interpretación de los resultados
xviii) Una ratio OD >2,0 con una OD del antígeno del NiV >0,20 se considerará positivo.
xix) Una ratio OD >2,0 con una OD del antígeno del NiV <0,20 se considerará negativo.
xx)
Los sueros con una ratio OD entre 2,0 y 2,2 deberían considerarse dudosos.
xxi) Los sueros dudosos y positivos deberían ensayarse mediante una prueba NV.
Fig. 1. Formato de placa ELISA.
A
B
NiV
Con
NiV
Con
NiV
Con
NiV
Con
NiV
Con
NiV
Con
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
H
H
Suero problema
Suero problema
#1
#1
Suero problema#1
Suero problema
H
H
#1
C
D
E
F
G
H
N
N
L
L
Conj
Sus
N
N
L
L
Conj
Sus
Suero problema
Suero problema
#2
#2
Suero problema
Suero problema
#2
#2
Suero problema
Suero problema
#3
#3
Suero problema
Suero problema
#3
#3
Suero problema
Suero problema
#4
#4
Suero problema
Suero problema
#4
#4
NiV: antígeno procedente de células infectadas por el NiV; Con: antígeno procedente de células Vero no infectadas; H: suero
porcino altamente positivo; N: suero porcino negativo; L: suero porcino con reacción positiva baja; Conj: control del conjugado;
Subs: control del sustrato.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Actualmente no se dispone de vacunas para el HeV ni para el NiV.
AGRADECIMIENTOS
Muchas personas del Laboratorio de Salud Animal de Australia han contribuido al desarrollo de las pruebas
descritas aquí, especialmente Peter Hooper, Gail Russell y Megan Braun (inmunohistoquímica), Paul Selleck,
Chris Morrissy, Brenda van der Heide, Greer Meehan y John White (ELISA) y Gary Crameri (imunoensayo de
placas).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1189
Capítulo 2.10.10. — Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
REFERENCIAS
1.
CHUA K., KOH C., CHENG S., HOOI P., KHONG J., W EE.K., CHUA B., CHAN Y., LIM M. & LAM S. (2001).
Surveillance of wildlife for source of Nipah virus: methodologies and outcomes. En: Report on the Regional
Seminar on Nipah virus infection, jointly organised by the Office International des Epizooties and the
Department of Veterinary Services, Malaysia. Kuala Lumpur, Malaysia, 81–83.
2.
CHUA K.B., BELLINI W.J., ROTA P.A., HARCOURT B.H., TAMIN A., LAM S.K., KSIAZEK T.G., ROLLIN P.E., ZAKI S.R.,
SHIEH W.J., GOLDSMITH C.S., GUBLER D.J., ROEHRIG J.T., EATON B., GOULD A.R., OLSON J., FIELD H., DANIELS P.,
LING A.E., PETERS C.J., ANDERSON L.J. & MAHY B.W.J. (2000). Nipah virus: A recently emergent deadly
paramyxovirus. Science, 288, 1432–1435.
3.
CRAMERI G., W ANG L.-F., MORRISSY C.W.J.R. & EATON B.T. (2002). A rapid immune plaque assay for the
detection of Hendra and Nipah viruses and anti-virus antibodies. J. Virol. Methods, 99, 41–51.
4.
DANIELS P., AZIZ J., KSIAZEK T.G., ONG B.L., BUNNING M.J.B., FIELD H., OLSON J., HOFFMAN D., BOLOU J. &
OZAWA Y. (2000). Nipah virus – developing a regional approach. En: Comprehensive Reports on Technical
Items presented to the International Committee or Regional Commissions. OIE, Paris, France, 2207–2217.
5.
DANIELS P., KSIAZEK T. & EATON B.T. (2001). Laboratory diagnosis of Nipah and Hendra virus infections.
Microbes Infect., 3, 289–295.
6.
FIELD H.E., BARRATT P.C., HUGHES R.J., SHIELD J. & SULLIVAN N.D. (2000). A fatal case of Hendra virus
infection in a horse in north Queensland: clinical and epidemiological features. Aust. Vet. J., 78, 279–280.
7.
HALPIN K., YOUNG P.L., FIELD H.E. & MACKENZIE J.S. (2000). Isolation of Hendra virus from pteropid bats: a
natural reservoir of Hendra virus. J. Gen. Virol., 81, 1927–1932.
8.
HOOPER P., ZAKI S., DANIELS P. & MIDDLETON D. (2001). Comparative pathology of the diseases caused hy
Hendra and Nipah viruses. Microbes Infect., 3, 315–322.
9.
HOOPER P.T., GOULD A.R., RUSSELL G.M., KATTENBELT J.A. & MITCHELL G. (1996). The retrospective diagnosis
of a second outbreak of equine morbillivirus infection. Aust. Vet. J., 74, 244–245.
10. HOOPER P.T., GOULD A.R., HYATT A.D., BRAUN M.A., KATTENBELT J.A., HENGSTBERGER S.G. & W ESTBURY H.A.
(2000). Identification and molecular characterization of Hendra virus in a horse in Queensland. Aus. Vet. J.,
78, 281–282.
11. HYATT A.D., EATON B.T. & LUNT R. (1987). The grid-cell culture technique: the direct examination of virusinfected cells and progeny viruses. J. Microsc., 145, 97–106.
12. HYATT A.D., ZAKI S.R., GOLDSMITH C.S., W ISE T.G. & HENGSTBERGER S.G. (2001). Ultrastructure of Hendra
virus and Nipah virus within cultured cells and host animals. Microbes Infect. , 3, 297–306.
rd
13. INTERNATIONAL AIR TRANSPORT ASSOCIATION (2002). Dangerous Goods Regulations, 43 edition. International
Air Transport Association (IATA), 800 Place Victoria, P.O. Box 113, Montreal, Quebec H4Z 1M1, Canada.
14. JOHARA M.Y., FIELD H., RASHDI A.M., MORRISSY C., VANDERHEIDE B., ROTA P., BINADZHAR A., W HITE J., DANIELS
P., JAMALUDDIN A. & KSIAZEK T. (2001). Nipah virus infection in bats (order Chiroptera) in peninsular
Malaysia. Emerg. Infect. Dis., 7, 439–441.
15. MACKENZIE J.S., CHUA K.B., DANIELS P.W., EATON B.T., FIELD H.E., HALL R.A., HALPIN K., JOHANSEN C.A.,
KIRKLAND P.D., LAM S.K., MCMINN P., NISBET D.J., PARU R., PYKE A.T., RITCHIE S.A., SIBA P., SMITH D.W., VAN
DEN HURK A.F., W ANG L.F. & W ILLIAMS D.T. (2001). Emerging viral diseases of South-east Asia and the
western pacific. Emerg. Infect. Dis., 7, 497–504.
16. MURRAY K., SELLECK P., HOOPER P., HYATT A., GOULD A., GLEESON L., W ESTBURY H., HILEY L., SELVEY L. &
RODWELL B. (1995). A morbillivirus that caused fatal disease in horses and humans. Science, 268, 94–97.
17. NOR M.N.M., GAN C.H. & ONG B.L. (2000). Nipah virus infection of pigs in peninsular Malaysia. Rev. sci.
tech. Off. int. Epiz., 19, 160–165.
18. ONG B.L., DANIELS P.W., BUNNING M., AZIZ J., W HITE J., MUNIANDY M., OLSON J., CHANG K.W., MORRISSY C., LIM
Y.S., KSIAZEK T. & NORDIN M.N. (2000). A surveillance program for the detection of pig herds exposed to
1190
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.10. — Enfermedades víricas de Hendra y de Nipah
Nipah virus infections in peninsular Malaysia. En: Proceedings of the 9th International Symposium on
Veterinary Epidemiology and Economics (ISVEE). Abstract ID 63. Colorado, USA.
19. PATON N.I., LEO Y.S., ZAKI S.R., AUCHUS A.P., LEE K.E., LING A.E., CHEW S.K., ANG B., ROLLIN P.E., UMAPATHI
T., SNG I., LEE C.C., LIM E. & KSIAZEK T.G. (1999). Outbreak of Nipah-virus infection among abattoir workers
in Singapore. Lancet, 354, 1253–1256.
20. ROGERS R.J., DOUGLAS I.C., BALDOCK F.C., GLANVILLE R.J., SEPPANEN K.T., GLEESON L.J., SELLECK P.N. & DUNN
K.J. (1996). Investigation of a second focus of equine morbillivirus infection in coastal Queensland. Aust.
Vet. J., 74, 243–244.
21. US DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTRES FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION AND
NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (1999). Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Fourth
Edition. Catalogue number 017-040-00547-4. United States Government Printing Office, Washington DC,
USA.
22. W ANG L.F., HARCOURT B.H., YU M., TAMIN A., ROTA P.A., BELLINI W.J. & EATON B.T. (2001). Molecular biology
of Hendra and Nipah viruses. Microbes Infect., 3, 279–287.
23. W ANG L.F., MICHALSKI W.P., YU M., PRITCHARD L.I., CRAMERI G., SHIELL B. & EATON B.T. (1998). A novel P/V/C
gene in a new member of the Paramyxoviridae family, which causes lethal infection in humans, horses, and
other animals. J Virol., 72, 1482–1490.
24. W ILLIAMSON M.M., HOOPER P.T., SELLECK P.W., GLEESON L.J., DANIELS P.W., W ESTBURY H.A. & MURRAY P.K.
(1998). Transmission studies of Hendra virus (equine morbillivirus) in fruit bats, horses and cats. Aust. Vet.
J., 76, 813–818.
25. YOUNG P.L., HALPIN K., SELLECK P.W., FIELD H., GRAVEL J.L., KELLY M.A. & MACKENZIE J.S. (1996). Serologic
evidence for the presence in Pteropus bats of a paramyxovirus related to equine morbillivirus. Emerg.
Infect. Dis., 2, 239–240.
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1191
CAPÍTULO 2.10.11.
GRIPE PORCINA
RESUMEN
La gripe porcina es una enfermedad vírica muy contagiosa de los cerdos. Las infecciones por el
virus de la gripe porcina (SIV) causan una enfermedad respiratoria caracterizada por tos,
estornudos, descargas nasales, temperatura rectal elevada, letargia, dificultades respiratorias y
apetito reducido. En algunos casos, las infecciones por SIV se asocian a trastornos en la
reproducción, como abortos. Los síntomas clínicos y la excreción nasal del virus pueden aparecer
a las 24 horas de la infección. En infecciones por SIV las tasas de morbilidad pueden alcanzar el
100%, aunque las de mortalidad son relativamente bajas. Las infecciones bacterianas secundarias
pueden agravar los síntomas clínicos de una infección por SIV. La transmisión se realiza por
contacto a través de secreciones que contengan SIV, como aerosoles originados por la tos o el
estornudo y por las descargas nasales.
Identificación del agente: La identificación del virus es más fácil cuando se recogen muestran a
las 24–48 horas de la aparición de los síntomas clínicos. El cerdo de elección es un animal sin
tratar con manifestación aguda y temperatura rectal elevada. El virus puede detectarse fácilmente
en el tejido pulmonar y en frotis nasales. El aislamiento se puede realizar en huevos embrionados
de pollo y en líneas celulares continuas. El subtipado de los virus aislados se hace por pruebas de
inhibición de la hemaglutinación (HI) y de inhibición de la neuraminidasa. En tejidos fijados con
formalina, se puede realizar inmunohistoquímica, y en tejidos frescos, una prueba con anticuerpos
fluorescentes. También existen pruebas de reacción en cadena de la polimerasa. Se han
comercializado enzimoinmunoensayos (ELISA) para la detección del virus de la gripe tipo A.
Pruebas serológicas: La prueba serológica más importante para la detección de anticuerpos
contra el SIV es la prueba HI realizada con pares de sueros. La prueba HI es específica de
subtipos. En general los sueros se recogen distanciados 10–21 días. Un aumento de cuatro veces
o más entre el título de la primera muestra y la segunda sugiere una infección reciente por SIV.
Otras pruebas serológicas adicionales son la prueba de inmunodifusión en gel de agar, la
inmunofluorescencia indirecta, la neutralización vírica y ELISA.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se han comercializado vacunas
con SIV inactivado y con adyuvante. Las vacunas pueden contener un único subtipo de SIV o
varios subtipos. Las vacunas deben reflejar el perfil antigénico actual de los virus de campo y
contener los subtipos y cepas tan variados como sean necesarios para asegurar la protección. La
vacuna final tiene que ser pura, segura, potente y eficaz.
A. INTRODUCCIÓN
La gripe porcina es una enfermedad vírica muy contagiosa que en una piara afectada puede tener un impacto
importante (5, 16). El virus de la gripe porcina (SIV) es un ortomixovirus tipo A con un genoma de ARN
segmentado. Los virus de la gripe porcina tipo A se pueden subdividir según sus proteínas de la hemaglutinina y
de la neuraminidasa. Los subtipos de SIV que se identifican con más frecuencia en cerdos son H1N1, H1N2 y
H3N2. Otros subtipos identificados en cerdos son H1N7, H3N1, H4N6 y H9N2. Los virus H1N1, H1N2 y H3N2 de
Europa son antigénica y genéticamente distintos de los encontrados en EE.UU. (1, 2, 4, 8, 12, 15, 20). Los
cerdos tienen receptores en su tracto respiratorio que reconocen virus de la gripe porcina, humana y aviar. En
consecuencia, los cerdos se han considerado como “recipientes de mezcla” para el desarrollo de nuevos virus
de la gripe cuando los virus de la gripe porcina, aviar y/o humana se recombinan en los cerdos (13). Las
infecciones por SIV causan una enfermedad respiratoria caracterizada por tos, estornudos, descargas nasales,
temperaturas rectales elevadas, letargia, dificultad respiratoria y apetito disminuido. Entre los agentes que
pueden originar una enfermedad respiratoria en cerdos están el virus del síndrome reproductivo y respiratorio
1192
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.11. — Gripe porcina
porcino, el virus de la enfermedad de Aujeszky (seudorabia), el coronavirus respiratorio porcino, Actinobacillus
pleuropneumoniae y Mycoplasma hypopneumoniae, aunque la mayoría de éstos tienen otros síntomas que no
son similares a los de la gripe porcina (11). Sólo Actinobacillus pleuropneumoniae, en infección aguda, presenta
síntomas clínicos similares a la gripe porcina, como disnea, taquipnea, respiración abdominal, tos, fiebre,
depresión y anorexia. Los síntomas clínicos y la excreción nasal pueden aparecer a las 24 horas de la infección.
En el cerdo se dan dos formas de la enfermedad, la epidémica o la endémica. En la forma epidémica el virus
pasa por todas las fases con una recuperación rápida del cerdo si no existen factores de complicación del tipo
de infecciones bacterianas secundarias. En la forma endémica los síntomas pueden ser menos aparentes, y no
todos los cerdos muestran los síntomas clínicos tradicionales de la infección. En las infecciones por SIV las
tasas de morbilidad pueden alcanzar el 100%, aunque las tasas de mortalidad son en general bajas. El impacto
económico más importante está relacionado con la pérdida de peso, que se traduce en la necesidad de un
mayor número de días para alcanzar el peso adecuado para el mercado. La transmisión se realiza por contacto
con secreciones que contienen SIV, como los aerosoles que se originan por la tos y el estornudo, y por
descargas nasales. Pueden darse infecciones por SIV en humanos y se han descrito algunas muertes. Deben
tomarse precauciones para impedir las infecciones humanas como se describe en el Capítulo I.1.6. Seguridad
humana en los laboratorios veterinarios de microbiología.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
Como el SIV es un agente patógeno potencial para humanos, todo trabajo con tejidos infecciosos, frotis, huevos
embrionados y cultivos celulares debe hacerse en cámaras de seguridad biológica de tipo II.
a)
Cultivo
•
Procesamiento de muestras
El tejido pulmonar puede prepararse para el aislamiento de virus de varias formas, por ejemplo en un
mortero, en un digestor, en un homogenizador, o cortándolo con la hoja de un escalpelo o con tijeras. El
procesamiento del tejido se hace en un medio de cultivo celular suplementado con antibióticos (por
ejemplo, a 10 x la concentración de trabajo), a una concentración final del 10% (p/v). La suspensión se
incuba 30 minutos en la oscuridad a 20–22°C. Los frotis nasales deben ponerse en medio de cultivo celular
o en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Al llegar al laboratorio los frotis nasales se agitan
vigorosamente a mano o en un vórtex. Tanto los frotis nasales como el tejido pulmonar se centrifugan a
1500–1.900 g durante 15–30 minutos a 4°C. Se recoge el sobrenadante y se guarda a 4°C hasta la
inoculación. Si el sobrenadante se tiene que mantener más de 24 horas antes de la inoculación, debe
guardarse a –70°C. El sobrenadante de la muestra pulmonar se inocula sin más dilución. El sobrenadante
de los frotis nasales se puede inocular también sin diluir o diluido a 1/3 con medio de cultivo. Para reducir
la contaminación bacteriana, se añaden antibióticos al medio de cultivo celular utilizado en el
procesamiento y/o el sobrenadante se filtra, aunque esto puede disminuir el título vírico.
•
Aislamiento del virus en cultivo celular
i)
El aislamiento del virus se realiza en líneas celulares susceptibles de infección por SIV. La línea
celular preferida es la Madin–Darby de riñón canino (MDCK), pero pueden emplearse líneas celulares
primarias de riñón o de testículo porcino, o del epitelio pulmonar.
ii)
Lavar tres veces las monocapas celulares confluentes (48–72 horas después de la puesta en cultivo
de las células) con medio de cultivo celular que contenga una concentración final de 2 µg/ml de
tripsina; la concentración depende del tipo de tripsina y puede utilizarse hasta 10 µg/ml. El medio se
puede suplementar con antibióticos, pero no con suero fetal bovino.
iii)
Inocular el cultivo celular con una cantidad adecuada de sobrenadante de suspensión de tejido o de
frotis. Nota: el volumen de inóculo varía con el tamaño del recipiente del cultivo celular. En general se
inoculan de 100–200 µl en cada pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos, 1 ml en cada tubo
Leighton, y 1–2 ml en una botella de 25 cm2.
iv)
Incubar los cultivos celulares inoculados durante 1–2 horas a 37°C. Cuando se usan cultivos
celulares abiertos al medio, como placas de cultivo, la incubación se debe realizar en una cámara
húmeda con 5% de CO2.
v)
Eliminar el inóculo y lavar la monocapa tres veces con el medio de cultivo que contiene tripsina.
vi)
Añadir un volumen apropiado de medio de cultivo de mantenimiento a todos los recipientes e incubar
a 37°C durante 7 días con examen periódico del efecto citopático (ECP). Si al final del período de
incubación no se observa ECP, el cultivo celular se congela a –70°C, se descongela, y se siembra de
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1193
Capítulo 2.10.11. — Gripe porcina
nuevo como se describió antes (paso iii). Si se observa ECP, se puede probar una alícuota del medio
de cultivo para detectar virus hemaglutinantes y se puede recoger y utilizar como inóculo para
confirmación por la técnica de inmunofluorescencia (ver Sección B.1.e. más adelante). Para este fin
se pueden inocular monocapas de MDCK (o de otra línea celular adecuada) en cubres (tubo Leighton,
placa de cultivo celular de 24 pocillos) o en portas con cámaras. El procedimiento de aislamiento es
como se describió arriba (paso iii). En algunos casos puede ser necesario hacer diluciones decimales
del virus del cultivo celular para tener un ECP apropiado en los cubres. Los subtipos de la gripe se
pueden determinar por las pruebas de inhibición de la hemaglutinación (HI) y de inhibición de la
neuraminidasa (NI).
•
Inoculación en huevo (14)
i)
Emplear huevos embrionados de pollo de 10–11 días.
ii)
Inocular 0,1–0,3 ml de inóculo en la cavidad alantoidea y en el saco amniótico; muchos laboratorios
inoculan sólo por la vía alantoidea con una sensibilidad similar. Generalmente se inoculan 4 huevos
por muestra.
iii)
Incubar los huevos a 35–37°C durante 3–4 días y mirarlos al trasluz diariamente. Los huevos con
embriones muertos antes de las 24 horas de inoculación se desechan.
iv)
Refrigerar los huevos con embriones muertos después de 24 horas de la inoculación. Recoger el
líquido amniótico y alantoideo de los huevos con embriones muertos y de los huevos con embriones
viables al fin del período de incubación. Este material debe considerarse potencialmente infeccioso y
tratarse adecuadamente para evitar la exposición al SIV del laborante.
v)
Centrifugar los líquidos a 1.500–1.900 g durante 10–20 minutos a 4°C. Pasar el sobrenadante a otro
tubo para prueba.
vi)
Se evalúan los líquidos para presencia de SIV con la prueba de hemaglutinación (HA) (ver más
adelante).
vii)
Repasar los líquidos negativos para actividad hemaglutinante (negativos para SIV) en huevos o en
líneas celulares como se describió antes. El aislamiento puede mejorarse haciendo diluciones
decimales del líquido en medio de cultivo. Se pueden añadir antibióticos al medio de cultivo.
•
Prueba de hemaglutinación
i)
Preparar una suspensión al 0,5% de eritrocitos de sangre de pavo macho o de pollo; la sangre de
pavo macho se utiliza en algunos laboratorios de EE.UU. pero no se recomienda para identificar
aislamientos europeos. Los eritrocitos lavados y las suspensiones al 0,5% se pueden guardar a 4°C
hasta una semana. Eliminarlos si se observa hemólisis.
ii)
Para cada virus desconocido, distribuir 50 µl de PBS en una fila de 12 pocillos de una placa de
microtitulación de 96 pocillos con fondo en V o en U. Debe incluirse como control otra línea de
pocillos.
iii)
Añadir 50 µl de aislamiento sin diluir al primer pocillo de cada fila correspondiente.
iv)
Con una micropipeta, diluir en serie el aislamiento en volúmenes de 50 µl. Las diluciones resultantes
variarán de ½ (pocillo 1) a 1/2048 (pocillo 11). El pocillo 12 contiene sólo PBS y sirve como control de
células.
v)
Añadir a cada pocillo 50 µl de suspensión de eritrocitos al 0,5% y agitar la placa para mezclar bien.
Nota: mantener los eritrocitos suspendidos cuidadosamente durante el proceso de distribución.
vi)
Cerrar la placa con cinta aislante e incubar a temperatura ambiente hasta que en el pocillo control se
forme un botón definido (30–60 minutos).
vii)
Los pocillos con hemaglutinación completa (HA positiva, SIV presente) muestran los eritrocitos
distribuidos por todo el pocillo formando una “alfombra”. Los pocillos con un botón definido de
eritrocitos en el fondo del pocillo son negativos para actividad hemaglutinante (negativos para SIV).
Una actividad HA incompleta se manifiesta por botones parciales caracterizados por márgenes
difusos o con apariencia de “donut”. Cuando la interpretación entre completa e incompleta es dudosa,
se voltea la placa con un ángulo de aproximadamente 45°C durante 20–30 segundos y se observa el
arrastre de los eritrocitos, que en el caso de pocillos con inhibición completa produce una apariencia
de lágrimas translúcidas alrededor de las células. Los pocillos con inhibición parcial no producirán
arrastre en lágrima.
1194
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.11. — Gripe porcina
b)
Tipificación de aislamientos de SIV
•
Prueba de inhibición de la hemaglutinación
i)
Diluir los antígenos HA de referencia (H1, H3, etc.) a una concentración de 8 unidades HA (HAU) por
50 µl (4 HAU/ 25µl) en PBS 0,01 M, pH 7.
ii)
Estandarizar los virus desconocidos de gripe A para que contengan 8 HAU en 50 µl.
iii)
Realizar una titulación (prueba HA) con todos los aislamientos desconocidos y los antígenos de
subtipo H para confirmar que están presentes las HAUs correctas. Esta titulación se realiza como se
describe en el procedimiento para HA excepto que se emplean seis pocillos en vez de once.
iv)
Tratar el suero con RDE; añadir 50 µl de suero a 200 µl de RDE (enzima destructora de los
receptores; dilución 1/10 en solución salina con calcio equivalente a 100 unidades por ml). Incubar
durante la noche (12–18 horas) en un baño de agua a 37°C. Añadir 150 µl de solución de citrato
sódico al 2,5% e inactivar por calor durante 30 minutos a 56°C. Nota: se recomienda el tratamiento
con RDE ya que elimina la hemaglutinación inespecífica y favorece la identificación de aislamientos
H1N2 y H3N2.
v)
Eliminar las aglutininas naturales del suero, tratando el suero diluido con 0,1 ml de eritrocitos lavados
y empaquetados por cada 1 ml de suero diluido. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente
con mezcla ocasional para mantener los eritrocitos suspendidos. Centrifugar el suero tratado a 800 g
durante 10 minutos y conservar el suero.
vi)
Añadir 25 µl de antígeno estandarizado (aislamiento desconocido o control positivo de antígeno) a
tres pocillos de una placa de microtitulación con 96 pocillos de fondo en V o en U. Añadir 50 µl de
PBS a varios pocillos para servir como control de eritrocitos. Nota: se pueden utilizar 25 µl de PBS en
lugar de los 25 µl de antígeno estandarizado.
vii)
Añadir 25 µl del antisuero adecuado estandarizado al primer pocillo del subtipo H evaluado. Hacer
diluciones seriadas del antisuero en volúmenes de 25 µl en los pocillos del antígeno con una pipeta
de 25 µl. Repetir este procedimiento para cada subtipo H evaluado. Nota: si se utilizaron 25 µl de PBS
en lugar de los 25 µl del antígeno estandarizado en el paso vi, se añaden 25 µl del antígeno
estandarizado a cada pocillo que contenga el antisuero estandarizado.
viii) Cubrir la(s) placa(s) e incubar a temperatura ambiente durante 20–60 minutos.
ix)
Añadir 50 µl de suspensión de eritrocitos al 0,5% a cada pocillo y agitar la(s) placa(s) para mezclar
bien. Mantener los eritrocitos en suspensión durante el proceso de distribución.
x)
Cubrir la(s) placa(s) con cinta aislante e incubar a temperatura ambiente hasta que se forme un botón
definido en los pocillos de control positivo (normalmente 30–60 minutos). Observar las placas
después de 20 minutos de incubación para hemaglutinación ya que algunos aislamientos pueden
comenzar a eluirse (separarse de los eritrocitos) a los 30 minutos.
xi)
Leer los resultados de la prueba como se describió antes para la prueba HA. Una muestra
considera positiva para un determinado subtipo H si se inhibe la hemaglutinación. La prueba
considera válida si el antígeno positivo de referencia y su antígeno homólogo muestran el título
esperado y si la titulación de cada antígeno (desconocido y control positivo) es 8 HAUs. Si no
presentan estas condiciones, la prueba debe repetirse.
xii)
Si los eritrocitos en los pocillos de células control no sedimentan en un botón bien definido,
comprobar como posibles causas: una composición incorrecta del PBS, evaporación excesiva de las
placas, eritrocitos demasiado viejos, o concentración incorrecta de eritrocitos.
•
Prueba de inhibición de la neuraminidasa
se
se
HI
se
La identificación de subtipos basada en la prueba NI supera las disponibilidades de muchos laboratorios.
Para la tipificación de los aislamientos en cuanto a N, se debe consultar a los laboratorios de referencia.
c)
Prueba de inmunofluorescencia
i)
Esta técnica se puede utilizar en cortes de tejidos o en cubres/portas con monocapas celulares
infectadas. Se deben incluir controles positivos y negativos con todos los procedimientos de tinción.
ii)
Las células inoculadas se incuban lo suficiente para permitir que el 10–25% de las células se infecten
por el virus. Lavar los cubres o portas con PBS una vez, colocarlos durante 5–10 minutos en acetona
al 100% y secar al aire. La acetona debe utilizarse en una cámara aireada.
iii)
Preparar cortes congelados de tejido en portas de vidrio. Fijar los portas con acetona durante 5–10
minutos y secar al aire.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.11. — Gripe porcina
d)
iv)
Aplicar el conjugado (anticuerpo contra la gripe porcina marcado con fluoresceína) e incubar en una
cámara húmeda a 37°C durante 37 minutos.
v)
Lavar con PBS, pH 7,2, inundar durante 5–10 minutos con PBS, lavar con agua destilada y secar al
aire.
vi)
Colocar los cubres sobre portas de vidrio con las células hacia abajo, con líquido de montaje. Extraer
la goma de ajuste de las cámaras de los portas y añadir líquido de montaje y después un cubre.
Hacer lo mismo para montar los cortes de tejido en portas.
vii)
En una habitación oscura, observar los portas teñidos con un microscopio de luz ultravioleta. Las
células infectadas con SIV se identifican por una fluorescencia brillante verde manzana. Se
recomienda que la persona que examine las muestras tenga experiencia en la observación de
muestras marcadas con fluoresceína ya que pueden ser difíciles de interpretar.
Inmnuhistoquímica (19)
i)
Cortar pulmón fijado con formalina e incluido en parafina en secciones de 4 µm de grosor y colocarlas
en portas recubiertos de poli–L–lisina. Con todas las pruebas deben incluirse controles de tejido
positivo y negativo.
ii)
Calentar los portas a 60°C durante 15 minutos, eliminar la parafina, y rehidratar por inmersiones en
concentraciones decrecientes de etanol y luego en agua destilada.
iii)
Tratar las muestras con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos y lavar dos veces con agua
destilada.
iv)
Digerir las muestras con proteasa al 0,05% durante 2 minutos y lavar dos veces durante 2 minutos
con tampón Tris/PBS 0,1 M, pH 7,2, a temperatura ambiente.
v)
Aplicar a cada porta el anticuerpo monoclonal primario anti–SIV de ratón (dirigido contra la
nucleoproteína vírica) e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C.
Lavar los portas con tampón Tris/PBS.
vi)
Aplicar el anticuerpo secundario (anticuerpo biotinilado anti–ratón de cabra) durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Lavar con tampón Tris/PBS.
vii)
Aplicar el anticuerpo terciario (estreptavidina conjugada con peroxidasa) durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Lavar con tampón Tris/PBS.
viii) Añadir la solución de tetrahidrocloruro de diaminobenzidina durante 5 minutos a temperatura
ambiente. Lavar dos veces con agua destilada.
e)
ix)
Teñir los portas para contraste con la hematoxilina de Gill durante 10–30 segundos, lavar con agua
durante 2 minutos, deshidratar, limpiar y añadir cubres.
x)
Los tejidos infectados con SIV se identifican por la presencia de una coloración marrón en el epitelio
bronquiolar y en los neumocitos.
Enzimoinmunoensayo con antígeno de captura
Se han comercializado enzimoinmunoensayos con antígeno de tipo A de captura (ELISAs) para la
detección de virus de la gripe humana. Este tipo de pruebas se han utilizado también para detectar SIV en
tejido pulmonar y en frotis nasales (10, 17). Las pruebas están generalmente disponibles en compañías del
sector de la salud humana.
f)
Reacción en cadena de la polimerasa
Se han desarrollado pruebas de reacción en cadena de la polimerasa para el diagnóstico de la gripe
porcina (6). No se dispone en la actualidad de una información amplia sobre la validación de estas
pruebas.
2.
Pruebas serológicas
La prueba serológica fundamental para la detección de anticuerpos frente al SIV es la prueba HI que es
específica de subtipos. Debe realizarse sobre sueros pareados recogidos con una separación de 10–21 días.
Un aumento de cuatro veces o más en el título entre la primera y la segunda muestra indica una infección
reciente por SIV. Otras pruebas serológicas que se han descrito, pero que generalmente no se utilizan, son la
neutralización vírica, la inmunodifusión en medio sólido y la inmunofluorescencia indirecta. Se ha descrito en la
literatura la tecnología ELISA para la detección de anticuerpos frente a SIV y al menos existe en el mercado un
kit comercial. La validación de las pruebas ELISA está en marcha.
1196
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.11. — Gripe porcina
•
Prueba de inhibición de la hemaglutinación
i)
Diluir los antígenos HA de referencia (H1, H3, etc.) hasta una concentración de 4–8 HAU/25 µl con
PBS 0,01 M, pH 7,2.
ii)
Prueba con H1N1: Inactivar los sueros por calor durante 30 minutos a 56°C. Diluir a 1/10 con PBS.
Añadir 0,1 ml de eritrocitos lavados y empaquetados de pollo macho a 1 ml de suero inactivado por
calor y diluido, mezclando a continuación. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos con
agitación periódica cada 10–15 minutos. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos a 4°C. Nota: como
alternativa a la inactivación por calor y el tratamiento con eritrocitos empaquetados de pollo, los
sueros se pueden tratar con RDR y con eritrocitos de pollo como se describe más adelante en el paso
iii.
iii)
Prueba con H1N2 y H3N2: Añadir 50 µl de suero a 200 µl de RDE (enzima destructora de los
receptores; dilución 1/10 en solución salina con calcio presentando 100 unidades por ml). Incubar
durante la noche (12–18 horas) en un baño de agua a 37°C. Añadir 150 µl de solución de citrato
sódico al 2,5% e inactivar por calor durante 30 minutos a 56°C. Combinar 200 µl de muestra tratada
con 25 µl de PBS. Añadir 50 µl de eritrocitos de pollo o pavo macho al 50% para una dilución final del
suero de 1/10. Agitar e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C.
Nota: son preferibles los eritrocitos de pollo para todos los aislamientos europeos.
iv)
Depositar 50 µl de suero tratado en dos pocillos con fondo en V o en U de una placa con 96 pocillos.
Depositar 25 µl de suero tratado en dos pocillos para utilizarlos como control de suero. Los sueros
control positivos y negativos se tratan del mismo modo que los sueros desconocidos.
v)
Depositar 25 µl de PBS en los pocillos de control de suero y en todos los pocillos vacíos excepto en
los dos pocillos identificados como control de células. Añadir 50 µl de PBS a los pocillos de control de
células.
vi)
Hacer diluciones seriadas dobles del suero en volúmenes de 25 µl en la placa, y después añadir 25 µl
del antígeno apropiado a todos los pocillos de la prueba excepto a los que corresponden a control de
suero y control de células.
vii)
Incubar las placas cerradas a temperatura ambiente durante 30–60 minutos.
viii) Añadir 50 µl de suspensión de eritrocitos al 0,5% (de pollo para H1N1 y de pavo para H3N2) a cada
pocillo, agitar, e incubar a temperatura ambiente durante 20–30 minutos hasta que se forme un botón
definido en el fondo de los pocillos de control de células. Mantener los eritrocitos en suspensión
durante el proceso de distribución.
b)
ix)
Realizar una prueba HA utilizando los antígenos de la prueba HI antes de –y simultáneamente a– la
prueba HI, para verificar que las concentraciones de antígeno son las apropiadas.
x)
Para que la prueba sea válida no debe haber hemaglutinación en el pocillo de control de suero, ni
debe haber inhibición de la hemaglutinación con el suero negativo, además el suero positivo debe
tener su título HI anticipado y la titulación HA debe indicar 4–8 HAU por 25 µl.
Enzimoinmunoensayo (9)
Se ha descrito en la literatura la tecnología ELISA para detección de anticuerpos frente a SIV. Al menos
una prueba ELISA está disponible en forma de kit comercial.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las normas indicadas aquí y en el Capítulo I.1.7 son de tipo general y
pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
1.
Control de inóculos
a)
Características del inóculo
La identidad del inóculo debe estar bien documentada, incluyendo el origen y la historia de pases del
agente. Deben establecerse todas las propiedades definitorias tales como subtipos de hemaglutinina y
neuraminidasa. Para establecer los subtipos de H y de N se puede utilizar la inhibición de la
hemaglutinación y la inhibición de la neuraminidasa por antisueros específicos de subgrupo. También, se
pueden neutralizar alícuotas del virus de siembra original con antisueros específicos, como antisuero
producido contra SIV H1N1 o SIV H3N2, y después inocular en el saco alantoideo de huevos embrionados
de pollo de 10 días o en líneas celulares susceptibles, como la MDCK. El líquido alantoideo o el
sobrenadante del cultivo celular se recoge después de 72–96 horas de incubación y se prueba para
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.11. — Gripe porcina
actividad HA. La identidad se demuestra por la falta de actividad HA en el inóculo neutralizado, y la
presencia de actividad HA en el no neutralizado. Las diferencias antigénicas presentes en una cepa dada,
que la diferencie de otros miembros del subtipo y que puedan tener un impacto beneficioso en su empleo
como vacuna, deben confirmarse por secuenciación y análisis genético.
b)
Método de cultivo
El inóculo de SIV se puede cultivar en huevos o en cultivo celular. La selección de un método de cultivo
depende del grado de adaptación del virus, crecimiento en el medio, velocidad de mutación, y rendimiento
vírico en el sistema específico de cultivo. Los productos de la vacuna contra el SIV deben limitarse a cinco
pases del inóculo original para evitar variación antigénica.
c)
Validación del cultivo
Debe demostrarse la pureza del inóculo y de las células utilizadas para la producción de vacuna. El inóculo
original debe estar libre de agentes exógenos, bacterias o micoplasmas, usando pruebas que se sepa que
son sensibles para detectar estos organismos. La alícuota de prueba debe ser representativa de un título
adecuado para producción de vacuna, pero no tan alto como para que un suero hiperinmune sea incapaz
de neutralizar el virus del inóculo en una prueba para pureza. El virus de siembra se neutraliza con suero
monoespecífico o con anticuerpo monoclonal contra el SIV y la mezcla virus/anticuerpo se cultiva en varios
tipos de líneas celulares en monocapa. Los cultivos se subcultivan en pases cada 7 días, por lo menos
durante 14 días, cuando se prueban para agentes citopatogénicos y hemadsorbentes. Las células también
se examinan para otros virus que puedan haber infectado las células o el inóculo en pases previos. Los
contaminantes potenciales son el virus de la diarrea bovina vírica, reovirus, virus de la rabia, virus de la
enfermedad de Aujeszky (seudorabia), virus de la gastroenteritis transmisible, coronavirus respiratorio
porcino, parvovirus porcinos, adenovirus porcinos, virus de la encefalomielitis hemaglutinante, rotavirus
porcinos, circovirus porcinos, y virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino. Las líneas celulares
en las que se prueba el inóculo incluyen: una línea celular de riñón de mono verde africano (Vero) (para
rabia y reovirus), una línea celular porcina, una línea celular de la especie de células utilizada para
propagar el inóculo, si no es de origen porcino, y líneas celulares de cualquier otra especie por las que se
haya pasado el inóculo. Además, se recomienda una línea celular muy permisiva para el virus de la diarrea
bovina vírica, tipos 1 y 2. El virus de la diarrea bovina vírica es un contaminante potencial introducido por el
empleo del suero bovino fetal en los sistemas de cultivo celular.
Deben investigarse los factores que pueden contribuir a la inestabilidad durante la producción, como la
replicación en una línea celular no común. Si se aprueba la producción para cinco pases desde el inóculo
original, debe garantizarse la secuenciación de los genes H y N al número máximo de pases para
confirmar la estabilidad del inóculo vírico.
d)
Validación como vacuna
Las vacunas candidatas deben ser puras, seguras, potentes y eficaces.
Las cepas utilizadas en la producción de vacunas deben estar relacionadas antigénicamente con las cepas
de SIV que circulan en el campo (3, 7, 18). Para la selección pueden utilizarse las pruebas de inhibición de
la hemaglutinación y de neutralización que demuestren reacción cruzada entre antisueros de animales
vacunados con la cepa vacunal candidata y aislamientos actuales de campo. Un estudio de
vacunación/desafío en el cerdo, utilizando cepas de desafío homólogas y heterólogas, indicará el grado de
protección aportado por la vacuna. Los cerdos utilizados en estos estudios deben estar libres de
anticuerpos contra el SIV. Los estudios sobre vacunación/desafío deben realizarse con virus producido
según el método previsto de fabricación, al máximo número de pases del virus permitido, y con cerdos de
la edad mínima recomendada en la etiqueta de la vacuna. Inicialmente, los lotes se componen de varias
cantidades de antígenos. El lote problema que contenga la menor cantidad de antígeno que confiera
protección es el estándar frente al que se miden los lotes de la futura producción. El mejor criterio para
ensayos de evaluaciones de grupos de tratamiento es una notable reducción de virus (títulos y duración de
la excreción) en el tracto respiratorio de cerdos vacunados. También son criterios las diferencias en la
observación clínica de lesiones pulmonares. Si se emplean métodos in vivo o in vitro para determinar la
potencia de cada lote de producción de vacuna, los ensayos deben hacerse en paralelo con estudios del
antígeno mínimo para establecer criterios de puesta de la vacuna en el mercado. En algunos países se
dispone de vacunas combinadas que contienen más de una cepa de SIV. La eficacia de los diferentes
componentes de estas vacunas debe establecerse independientemente y en combinación, en caso de que
exista interferencia entre los distintos antígenos.
2.
Método de producción
Una vez que la vacuna se muestra eficaz, y que las condiciones de fabricación propuestas resultan aceptables a
las autoridades competentes, se puede obtener la aprobación para la producción de la vacuna. En general, los
sistemas de monocapa o de suspensión celular a gran escala operan bajo estrictas condiciones asépticas
controladas por temperatura y con métodos definidos de producción que aseguran una repetición de lote a lote.
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Capítulo 2.10.11. — Gripe porcina
Cuando el virus alcanza su título máximo, determinado por HA, ECP, inmunofluorescencia u otra técnica
aprobada, el virus se clarifica, se filtra y se inactiva. Se han utilizado con éxito varios agentes inactivantes, como
formalina y etilenimina binaria. Debe realizarse un estudio de la cinética de inactivación con el agente
inactivador aprobado, en un lote de virus con un título mayor que el título máximo de producción y crecido en las
condiciones del método de producción aprobado. Este estudio debe demostrar que el método de inactivación es
adecuado y asegura la inactivación completa del virus. Las muestras tomadas a intervalos durante la
inactivación, cuando se inoculan en una línea celular susceptible o en el saco alantoideo de huevos
embrionados, deben indicar una pérdida lineal y completa del título al final del proceso de inactivación. Esto
supone menos de una partícula infecciosa por cada 104 litros de líquidos después de la inactivación.
Generalmente se añade un adyuvante para aumentar la respuesta inmune. A menudo, el adyuvante es un
aceite mineral, aunque otros adyuvantes pueden ser igualmente eficaces.
3.
Control del proceso
Los cultivos celulares deben comprobarse macroscópicamente para descartar anormalidades o signos de
contaminación y se deben desechar si no resultan satisfactorios. Un lote está listo para la recogida cuando el
ECP vírico alcanza el 80–100%. La concentración de virus se puede determinar utilizando la masa de antígeno
o ensayos de infectividad.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Durante la producción se deben realizar pruebas para contaminación por bacterias, micoplasmas y
hongos, tanto en los lotes de recogida de vacunas inactivadas como en los de vivas, y se deben confirmar
en el producto final (ver Capítulo I.1.5.).
b)
Inocuidad
Para evaluar la inocuidad de un producto inactivado se pueden emplear ratones o cobayas. En un modelo,
se inoculan ocho ratones intraperitonealmente o subcutáneamente con 0,5 ml y se observan durante
7 días. La prueba de inocuidad en ratón puede no ser aplicable cuando se usan ciertos adyuvantes,
especialmente productos derivados de saponina. En otro modelo, dos cobayas se inyectan con una dosis
de 2 ml cada uno intramuscularmente o subcutáneamente y se observan durante 7 días. La aparición de
síntomas clínicos adversos o de mortalidad atribuibles a la vacuna indican que el lote no es aceptable para
uso. La inactivación completa del virus en un producto inactivado puede determinarse por múltiples pases
de los líquidos producidos, después de la inactivación y antes de la adición de adyuvante, en cultivos
celulares o en huevos, seguidos de pruebas HA para detectar la presencia de virus.
El producto final puede examinarse en el animal hospedador utilizando dos animales de la edad mínima
para la que se recomendada su empleo, de acuerdo con las instrucciones dadas en el prospecto del
producto; los animales se observan durante 21 días. También se recomiendan estudios de inocuidad en el
campo sobre animales vacunados, en un mínimo de tres áreas geográficas distintas y al menos con
300 animales por área. Si la vacuna se utiliza en cerdos destinados al mercado para consumo humano,
debe establecerse un tiempo de aislamiento en consonancia con el adyuvante empleado (generalmente
21 días) por medio de examen histopatológico enviado a las autoridades competentes en seguridad
alimentaria.
c)
Potencia
Para establecer que durante la producción se alcanzan los títulos mínimos, se mide el contenido
antigénico. Generalmente, el contenido antigénico se mide antes de la inactivación y previamente a
cualquier proceso posterior. Entre las pruebas que pueden utilizarse para determinar el contenido
antigénico en el producto final están ELISA para potencia relativa, HA y HI. Es necesario confirmar la
sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y severidad de tales pruebas.
d)
Duración de la inmunidad
Antes de que se apruebe un producto, debe determinarse la duración de la inmunidad y la frecuencia de
vacunación recomendada. En principio, esta información se adquiere directamente de estudios de
vacunación y desafío utilizando el animal hospedador. El período de protección demostrada, medido por la
capacidad de los animales vacunados para resistir inoculaciones de desafío en una prueba validada, se
puede especificar en las indicaciones del prospecto de la vacuna comercial. Una vez que se ha identificado
una prueba de potencia adecuada, si la deriva antigénica requiriera reemplazar las cepas de la vacuna, se
pueden examinar cepas del mismo subtipo en el animal hospedador o en un modelo apropiado de animal
de laboratorio. Sin embargo, las cepas circulantes pueden mostrar diferencias antigénicas notables con la
cepa vacunal, pero la cepa vacunal puede suministrar aún protección. También, puede que la vacuna no
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.11. — Gripe porcina
proteja contra una nueva cepa que parece antigénicamente similar a la de la vacuna. En consecuencia,
parece que la eficacia de las cepas vacunales siempre tiene que ser evaluada en el cerdo.
e)
Estabilidad
Las vacunas deben guardarse a 4°C + 2°C con una exposición mínima a la luz. La caducidad debe
determinarse utilizando, a lo largo del período de validez propuesto, la prueba aprobada de potencia
(Sección C.5.b.).
f)
Conservantes
El conservante más común es el timerosal a una concentración que no supere el 0,01% (1/10.000). La
adición de timerosal o de otros compuestos mercuriales debe evitarse en lo posible. Además, en el
producto final pueden estar presentes antibióticos residuales del medio de cultivo celular en cantidades
restringidas. Por ejemplo, la gentamicina residual no debe exceder de 30 mcg por ml de vacuna.
g)
Precauciones
Las vacunas inactivadas contra el SIV no presentan un peligro especial para el usuario, aunque la
inoculación accidental puede originar una reacción adversa debido al adyuvante y a componentes
secundarios de la vacuna. En general, con vacunas inactivadas contra el SIV pueden vacunarse con
seguridad los cerdos sanos destetados y las cerdas grávidas en cualquier fase de gestación.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Las muestras de los recipientes finales con el producto completo de las vacunas inactivadas deben
probarse en ratones jóvenes como se describe en la Sección C.4.b.
b)
Potencia
Para evaluar los nuevos lotes que se comercializan, debe utilizarse la prueba de potencia que se establece
al estudiar la protección con el mínimo de antígeno. Se necesita que la prueba sea específica y
reproducible. Debe detectar con fiabilidad las vacunas que no son suficientemente potentes. Si se utiliza
serología de animales de laboratorio en vez de serología del cerdo, debe demostrarse primero que la
vacunación de los animales de laboratorio induce una respuesta específica, sensible y dependiente de la
dosis según se mide en la prueba de potencia, y que se correlaciona con la protección en el cerdo
(Sección C.1.d.).
REFERENCIAS
1.
BROWN I.H., HARRIS P.A., MCCAULERY J.M. & ALEXANDER D.J. (1998). Multiple genetic reassortment of avian
and human influenza A viruses in European pigs, resulting in the emergence of the H1N2 virus of novel
genotype. J. Gen. Virol., 79, 2947–2955.
2.
CASTRUCCI M.R., DONATELLI I., SIDOLI L., BARIGAZZI G., KAWAOKA Y. & W EBSTER R.G. (1993). Genetic
reassortment between avian and human influenza A viruses in Italian pigs. Virology, 193, 503–506.
3.
DE JONG J.C., VAN NIEUWSTADT A.P., KIMMAN T.G., LOEFFEN W.L., BESTEBROER T.M., BIJLSMA K., VERWEIJ C.,
OSTERHAUS A.D. & CLASS E.C. (1999). Antigenic drift in swine influenza H3 haemagglutinins with implications
for vaccination policy. Vaccine, 17, 1321–1328.
4.
DONE S.H. & BROWN I.H. (1997). Swine influenza in the United Kingdom, past and present. Large Anim.
Pract., 2, 20–28.
5.
EASTERDAY B.C. & VAN REETH K. (1999). Swine influenza. In: Diseases of Swine, Straw B.E., D’Allaire S.,
Mengeling W.L. & Taylor D.J., eds. Iowa State University Press, Iowa, USA, 277–290.
6.
FOUCHIER R.A., BESTEBROER T.M., HERFST S., VAN DER KEMP L., RIMMELZWAAN G.F. & OSTERHAUS A.D. (2000).
Detection of influenza A viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the
matrix gene. J. Clin. Microbiol., 38, 4096–4101.
7.
HEINEN P.P., VAN NIEUWSTADT A.P., DE BOER–LUIJTZE E.A. & BIANCHI A.T.J. (2001). Analysis of the quality of
protection induced by a porcine influenza A vaccine to challenge with an H3N2 virus. Vet. Immunol.
Immunopathol., 82, 39–56.
1200
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.11. — Gripe porcina
8.
KARASIN A.I., LANDGRAF J., SWENSON S., ERICKSON G., GOYAL S., W OODRUFF M., SCHERBA G., ANDERSON G. &
OLSEN C.W. (2002). Genetic characterization of H1N2 influenza A viruses isolated from pigs throughout the
United States. J. Clin. Microbiol., 40, 1073–1079.
9.
LEE B.W., BEY R.F., BAARSCH M.J. & EMERY D.A. (1993). Subtype specific ELISA for the detection of
antibodies against influenza A H1N1 and H3N2 in swine. J. Virol. Methods, 45, 121–136.
10. LEE B.W., BEY R.F., BAARSCH M.J. & SIMONSON R.R. (1993). ELISA method for detection of influenza A
infection in swine. J. Vet. Diagn. Invest., 5, 510–515.
11. LOEFFEN W.L., KAMP E.M., STOCKHOFE–ZURWIEDEN N., VAN NIEUWSTADT A.P., BONGERS J.H., HUNNEMAN W.A.,
ELBERS A.R., BAARS J., NELL T. & VAN ZIJDERVELD F.G. (1999). Survey of infectious agents involved in acute
respiratory disease in finishing pigs. Vet. Rec., 145, 123–129.
12. NOBLE S., MCGREGGOR M.S., W ENTWORTH D.E. & HINSHAW V.S. (1993). Antigenic and genetic conservation of
the haemagglutinin in H1N1 swine influenza viruses. J. Gen. Virol., 74, 8243–8251.
13. SCHOLTISSEK C., BURGER H., BACHMANN P.A. & HANNOUN C. (1983). Genetic relatedness of hemagglutinins of
the H1 subtype of influenza A viruses isolated from swine and birds. Virology, 129, 521–523.
14. SENNE D.A. (1998). Virus propagation in embryonating eggs. In: A Laboratory Manual for the Isolation and
Identification of Avian Pathogens, Fourth Edition, Swayne D.E., Glisson J.R., Jackwood M.W., Pearson J.E.
& Reed W.M., eds. American Association of Avian Pathologists, Kennett Square, Pennsylvania, USA, 235–
240.
15. SHEERAR M.G., EASTERDAY B.C. & HINSHAW V.S. (1989). Antigenic conservation of H1N1 swine influenza
viruses. J. Gen. Virol., 70, 3297–3303.
16. SHOPE R.E. (1931). Swine influenza. III. Filtration experiments and etiology. J. Exp. Med., 54, 373–380.
17. SWENSON S.L., VINCENT L.L, LUTE B.M., JANKE B.H., LECHTENBERG K.E., LANDGRAF J.G., SCHMITT B.J., KINKER
D.R. & MCMILLEN J.K. (2001). A comparison of diagnostic assays for the detection of type A swine influenza
virus from nasal swabs and lungs. J. Vet. Diagn. Invest., 13, 36–42.
18. VAN REETH K., LABARQUE G., DE CLERCQ S. & PENSAERT M. (2001). Efficacy of vaccination of pigs with
different H1N1 swine influenza viruses using a recent challenge strain and different parameters of
protection. Vaccine, 19, 4479–4486.
19. VINCENT L.L., JANKE B.H., PAUL P.S. & HALBUR P.G. (1997). A monoclonal–antibody–based
immunohistochemical method for the detection of swine influenza virus in formalin–fixed, paraffin–
embedded tissues. J. Vet. Diagn. Invest., 9, 191–195.
20. W EBBY R.J., SWENSON S.L., KRAUSS S.L., GERRISH P.J., GOYAL S.M. & W EBSTER R.G. (2000). Evolution of
swine H3N2 influenza viruses in the United States. J. Virol., 74, 8243–8251.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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CAPÍTULO 2.10.12.
TOXOPLASMOSIS
RESUMEN
Definición y descripción de la enfermedad: La toxoplasmosis es una infección zoonósica de
animales causada por el protozoo parásito Toxoplasma gondii. En ovejas y cabras la
toxoplasmosis causa abortos o el nacimiento de corderos/crías débiles, lo que puede ir
acompañado de fetos momificados. Las características de las membranas intercotiledonarias
placentales son normales, pero en los cotiledones pueden verse focos blancos de necrosis, de
aproximadamente 2-3 mm de diámetro. Microscópicamente, estos focos aparecen como áreas de
necrosis por coagulación que están relativamente libres de inflamación. La inflamación, cuando
existe, no es supurativa. Los taquizoítos de Toxoplasma se observan sólo raramente asociados
con estos focos, habitualmente en la periferia de la lesión. El examen del cerebro puede revelar
microgliosis focal. Las lesiones a menudo tienen un pequeño foco central de necrosis que se
podría mineralizar. Con frecuencia se presenta leucomalacia focal en la sustancia blanca cerebral,
debida a la anoxia producida a consecuencia de la patología placentaria. La microgliosis focal es
más específica cuando la leucomalacia refleja una patología placentaria, pero puede ocurrir en
otras condiciones tales como la enfermedad de la frontera (border disease) o raramente en la
clamidiosis ovina. La infección en cerdos puede causar pérdidas fetales severas en cerdas
gestantes pero con más frecuencia es leve e inapreciable.
Identificación del agente: Toxoplasma gondii es a menudo difícil de encontrar en secciones de
tejidos, y es más probable su presencia en secciones de cerebro y placenta. Se puede confirmar
su identidad mediante inmunohistoquímica, mientras que se puede emplear la reacción en cadena
de la polimerasa para identificar el ADN del parásito en los tejidos. El aislamiento de T. gondii a
partir de muestras es caro y lento, pero, si es preciso, es mejor llevarlo a cabo inoculando ratones
con homogeneizado derivado de cerebro fetal o placenta.
Pruebas serológicas: La prueba de tinción es el método serológico establecido desde hace más
tiempo, y en muchos sentidos representa el “patrón de oro”, al menos en humanos. La prueba de
tinción emplea taquizoítos de Toxoplasma virulentos vivos, un “factor accesorio” tipo complemento
y suero problema. Cuando el anticuerpo específico actúa sobre los taquizoítos, estos últimos no
se tiñen uniformemente con azul de metileno alcalino. La prueba no se puede realizar en algunas
especies. Además, como se emplea Toxoplasma vivo, la prueba conlleva un riesgo potencial de
infección en humanos y, por otra parte, resulta cara su realización. La prueba de
inmunofluorescencia indirecta (IFI) proporciona títulos comparables a los de la prueba de tinción,
pero es más segura porque utiliza taquizoítos muertos. La prueba IFI puede utilizarse para
diferenciar anticuerpos IgM e IgG. La prueba de aglutinación directa y la de aglutinación con latex
son relativamente rápidas y ninguna de las dos requiere instrumental de laboratorio complicado.
La técnica del enzimoinmunoensayo requiere un equipamiento de laboratorio algo más sofisticado
pero permite manejar gran número de muestras y no está sujeta a la interpretación humana de los
resultados.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se dispone comercialmente de
una vacuna compuesta por taquizoítos vivos de T. gondii para ser empleada en ovejas en algunos
países europeos y en Nueva Zelanda. La vacuna se administra como una suspensión
concentrada de taquizoítos con un adecuado diluyente y sistema de presentación. La vacuna se
debe mantener y manipular estrictamente de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes,
puesto que tiene un periodo de validez muy corto.
1202
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.12. — Toxoplasmosis
A. INTRODUCCIÓN
Toxoplasma gondii es un protozoo parásito intracelular obligado que puede causar abortos en ovejas, cabras y
cerdos. El parásito también tiene un potencial zoonósico. En un caso típico de aborto, una oveja o una gama
infectada en la etapa intermedia de gestación produce un cordero/cría nacida muerta unos pocos días antes de
la fecha prevista para el nacimiento. El feto abortado se acompaña a menudo de un hermano débil o de un feto
“momificado” (3). La oveja/gama permanece asintomática. En tales casos, los cotiledones placentarios están
típicamente moteados con focos blancos de alrededor de 2–3 mm de diámetro mientras que las membranas
intercotiledonarias se encuentran normales. La infección en la etapa temprana de gestación, cuando el feto tiene
sólo un sistema inmune rudimentario, provoca la muerte fetal y la reabsorción. En este caso la madre puede
presentarse como estéril, lo que a la larga puede parecer un problema de infertilidad del rebaño. Las madres
que resultan infectadas en la última etapa de gestación previsiblemente produzcan descendencia infectada pero
clínicamente normal. Después de la infección, ya sea durante o fuera de la gestación, no es de esperar que el
parásito cause abortos en las siguientes gestaciones. La infección en los cerdos puede provocar severas
pérdidas fetales en cerdas gestantes, pero en las condiciones en las que se encuentran las explotaciones
ganaderas intensivas modernas, la infección es con más frecuencia leve e inapreciable (7).
El ciclo de vida de T. gondii tiene componentes sexuales y asexuales. La fase asexual tiene lugar en el
hospedador intermediario, el cual es en la mayoría de los casos, si no en todos, un animal de sangre caliente.
La fase sexual ocurre en las células enteroepiteliales del hospedador definitivo felino y tiene como resultado la
producción de ooquistes. Después de la infección primaria de un gato, los ooquistes pueden eliminarse en las
heces durante varios días, Los ooquistes esporulan en el medio exterior a lo largo de 1–5 días (dependiendo de
la aireación y de la temperatura) y a partir de ese momento los ooquistes se vuelven infectivos. Son muy
resistentes y pueden permanecer infectivos en el medio ambiente durante un año o más. Los ooquistes
esporulados tienen un diámetro de 11
13 µm y cada uno de ellos contiene dos esporocistos con cuatro
esporozoítos cada uno (5). Cuando un animal susceptible ingiere ooquistes esporulados, los esporozoítos
penetran en la pared intestinal, transformándose en taquizoítos y estableciendo una infección.
En el ciclo asexual hay dos estadios de desarrollo: el taquizoíto de multiplicación rápida y el bradizoíto de
multiplicación lenta. Los taquizoítos penetran activamente en las células del hospedador donde se multiplican
causando la rotura celular y la liberación de los organismos localmente y en el torrente sanguíneo. Cuando el
hospedador desarrolla inmunidad, el parásito mantiene su tamaño y forma originales pero se transforma en el
estadio de bradizoíto y se multiplica más lentamente en los quistes tisulares hasta establecer una infección
persistente. Estos quistes tisulares microscópicos están presentes con mayor frecuencia en el cerebro y en el
músculo esquelético y representan la etapa quiescente del parásito dentro del hospedador. En ovejas, cabras,
cerdos, caballos y hombre, los quistes pueden permanecer durante el resto de la vida del individuo (5).
Habitualmente las especies de Toxoplasma no producen enfermedad clínica en ganado vacuno, camélidos o
ciervos, pero pueden causar la muerte de monos del Nuevo Mundo, marsupiales australianos, liebres (marrones
y de montaña) y algunos pájaros.
El aborto de ovejas y cabras causado por T. gondii debe diferenciarse del provocado por otros agentes
infecciosos, incluyendo las infecciones por Chlamydophila abortus (ver Capítulo 2.4.7. Aborto enzoótico de
ovejas), Coxiella burnetii (ver Capítulo 2.2.10. Fiebre Q), Brucella melitensis (ver Capítulo 2.4.2. Brucelosis
caprina y ovina [excluyendo la infección por Brucella ovis]), Campylobacter fetus fetus (ver Capítulo
2.3.2. Campilobacteriosis genital bovina), Salmonella spp. (ver Capítulo 2.10.3), Enfermedad de la Frontera (ver
Capítulo 2.10.5.), y los virus que causan la Lengua Azul, la enfermedad de Wesselsbron y la enfermedad de
Akabane. En cerdos, Brucella suis (ver Capítulo 2.6.2.) puede causar también muerte fetal, momificación y
aborto.
Riesgos para la salud humana
Toxoplasma gondii infecta fácilmente a los seres humanos y mientras la infección es relativamente común
(aproximadamente el 30% de la población dependiendo de la edad y del ambiente), la enfermedad clínica es
relativamente inusual. Quienes de forma especial corren el riesgo de desarrollar la enfermedad clínica son las
mujeres embarazadas, ya que el parásito puede plantear una seria amenaza para el feto si la madre resulta
infectada por primera vez durante la gestación, y los individuos en estado de inmunosupresión, tales como
pacientes con transplantes de tejidos, pacientes de SIDA, pacientes con ciertos tipos de cáncer y los que
reciben ciertas formas de terapia contra el cáncer; estos individuos corren el riesgo de desarrollar una infección
letal aguda de no ser tratados. También pueden ser más susceptibles los niños y ancianos. En ocasiones, las
personas sin inmunodeficiencia aparente pueden desarrollar una enfermedad caracterizada por malestar
general, fiebre y linfoadenopatía. Las dos principales fuentes de infección humana son la ingestión de carne
poco cocinada o cruda que contiene quistes tisulares de T. gondii vivos, o la exposición a ooquistes procedentes
de heces de gato, que pueden encontrarse en jardines y en hoyos de arena de parques infantiles.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1203
Capítulo 2.10.12. — Toxoplasmosis
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
a)
Aislamiento
La mejor forma de aislar T. gondii procedente de fetos abortados ovinos y caprinos y de membranas fetales
se realiza inoculando ratones de laboratorio. Los mejores tejidos para la inoculación son cerebro fetal y
cotiledones placentarios, y los resultados óptimos se obtienen con muestras frescas libres de
contaminación. Las muestras no deben congelarse en ningún momento puesto que el parásito moriría.
i)
Con precauciones asépticas, se recogen 2–5 g de cotiledón placentario o tejido cerebral del feto
abortado.
ii)
Se homogeniza el tejido en un volumen igual de tampón fosfato salino 0,3 M estéril (PBS), pH
7,4, con adición de antibióticos (100 Unidades Internacionales [UI])/ml de penicilina y 745 UI/ml
estreptomicina) en un homogeneizador “stomacher” (Seward Laboratory, London) u otro equipo de
maceración adecuado. El tejido cerebral puede ser homogeneizado correctamente pasándolo diez
veces a través de una aguja de calibre 16 mediante una jeringa.
iii)
Se inoculan por vía intraperitoneal tres ratones libres de Toxoplasma con 0,5 ml del tejido
homogeneizado.
iv)
Se sacrifican los ratones 6–8 semanas después de la inoculación y se extraen sus cerebros. También
debe conservarse la sangre en esta etapa y el suero se separa y congela a –20°C. Asimismo, deben
recogerse los cerebros de los ratones que mueran antes de las 6–8 semanas.
v)
Se homogeniza cada cerebro de ratón con un volumen igual de PBS estéril pasándolo diez veces a
través de una aguja de calibre-16 mediante una jeringa.
vi)
Se extiende una gota (5 µl) de una suspensión dada en cinco portas.
vii)
Se seca y se tiñe con Giemsa, se deshidrata y se monta bajo un cubreobjetos.
viii) Los portas se examinan al microscopio. Los quistes tisulares aparecen como estructuras circulares
que miden 5–50 µm rellenos de bradizoítos en forma de cuarto creciente y teñidos de azul.
Un método alternativo para examinar el cerebro de ratón consiste en tomar una pequeña porción de la
parte delantera del cerebro (aproximadamente del tamaño de la cabeza de una cerilla) y aplastarla con un
cubreobjetos. Los quistes tisulares se detectarán fácilmente.
Si los tejidos inoculados están fuertemente infectados con T. gondii, los ratones pueden morir al cabo de
1–2 semanas.
La ausencia de quistes tisulares no implica que se descarte un posible diagnóstico positivo. Se debe
analizar el suero de los ratones para detectar la presencia de anticuerpos contra Toxoplasma (p. ej.
utilizando una prueba de inmunofluorescencia indirecta [IFI]); si este análisis es también negativo, es
improbable la infección por Toxoplasma.
b)
Secciones de tejidos
En cotiledones placentarios afectados de ovejas y cabras se aprecian típicamente grandes focos de
necrosis por coagulación, que pueden mineralizarse con el tiempo. La inflamación asociada es
característicamente suave y no supurativa. Las muestras bien preservadas de cotiledones placentarios
pueden mostrar un edema moderado del mesénquima de las vellosidades fetales con una hipercelularidad
difusa debida a la presencia de grandes células mononucleares. A veces son visibles pequeñas cantidades
de toxoplasmas intra- y extracelulares, normalmente en la periferia del área necrótica o en una vellosidad
que está en las etapas tempranas de la infección. Los taquizoítos de Toxoplasma son ovoides, de 2–6 µm
de largo, con núcleos moderadamente basófilos y localizados en el centro o hacia el extremo posterior.
En el cerebro fetal se pueden desarrollar lesiones primarias y secundarias. Los focos microgliales,
típicamente con un centro necrótico y a veces mineralizado y frecuentemente asociado con una meningitis
linfoidea focal suave, representan una respuesta inmune fetal después de un daño directo por la
multiplicación local del parásito. Los toxoplasmas se encuentran sólo raramente, casi siempre en la
periferia de estas lesiones. La leucomalacia focal es también común y se considera que es debida a la
anoxia fetal en la etapa última de la gestación causada por las lesiones avanzadas en el placentoma que
impiden la transferencia de suficiente oxígeno entre la madre y el feto. Estos focos se producen más
comúnmente en los centros de sustancia blanca cerebral, pero a veces también en la sustancia blanca
cerebelal. Estos cambios neuropatológicos, cuando se ven juntos, son típicos de la infección por
1204
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.12. — Toxoplasmosis
Toxoplasma. Sin embargo, la confirmación de la identidad de estructuras tipo T. gondii en secciones de
tejido de, por ejemplo, cerebro o placenta puede llevarse a cabo por inmunohistoquímica que marca T.
gondii intactos o restos antigénicos. El método es fácil y sensible y se emplea con tejidos fijados
(incluyendo tejidos de archivo) que pueden también exhibir cierto grado de descomposición, de modo que
en este caso el aislamiento no sería apropiado o posible. Son igualmente adecuados el método ABC
indirecto de la inmunoperoxidasa y la técnica peroxidasa–antiperoxidasa (PAP) (10).
c)
Métodos de reconocimiento del ácido nucleico
Se han desarrollado varias técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa para detectar el
ADN de T. gondii. Las regiones diana principales son la secuencia repetitiva B1, el gen P30 (SAG1) o el
ARN ribosómico (ARNr). La PCR B1 y P30 son técnicas ampliamente usadas y representan buenas
ayudas diagnósticas, pero son mejores si se utilizan en conjunción con otra prueba, porque son
insuficientemente fiables cuando se emplean solas. Se ha ensayado una técnica de PCR basada en la
detección del ARNr 18S y parece ser más sensible, sin embargo se necesitan más estudios (6). La
sensibilidad de la PCR depende del número de copias de la secuencia diana (B1: 35 copias; P30: 1 copia;
ARNr: 110 unidades repetidas). Se dispone comercialmente de oligonucleótidos sintéticos de ADN
personalizados (ej. www.sigma-genosys.co.uk).
El método descrito es una forma combinada de PCR, que amplifica la secuencia de ADN repetitiva B1 (12).
El ADN del parásito puede extraerse y purificarse a partir de varios tejidos, incluyendo placenta, el sistema
nervioso central, el corazón y el músculo esquelético.
Se retiran los glóbulos rojos contaminantes de los tejidos lavando en tampón de lisis Tris/NH4 Cl 10 mM,
pH 7,6, y a continuación se centrifugan a 2.000 g durante 15 minutos. Entonces se extrae el ADN a partir
del sedimento resultante y se resuspende en Tris 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM conteniendo
100 µg/ml de proteinasa K y Tween 20 al 0,5%.
Las muestras se incuban a 55°C durante al menos 1 hora; entonces se inactiva la proteinasa K mediante
ebullición. El procedimiento de la PCR se realiza en volúmenes de 50 µl. La amplificación del gen B1 se
lleva a cabo según una modificación del procedimiento descrito en la ref. 1. La mezcla de reacción
contiene Tris 10 mM, pH 8,3, MgCl2 2,5 mM, KCl 40 mM, gelatina al 0.01%, dNTPs 0.1 mM, 0.2 µM de cada
cebador (los oligonucleótidos cebadores se describen en la ref. 1), dos cebadores sentido P1 y P2 y dos
antisentido P3 y P4) y 2,5 unidades de polimerasa Taq.
La amplificación primaria se realiza con los cebadores 1 y 4 dando un producto de 193 bp después de
25 ciclos a 93°C durante 1 minuto, 50°C durante 1,5 minutos y 72°C durante 3 minutos. El producto
amplificado se diluye entonces al 1/20 en agua destilada para reducir la amplificación de los productos no
específicos.
La amplificación secundaria utilizando los cebadores internos 2 y 3 y las mismas condiciones de reacción,
se lleva a cabo en 15 ciclos dando un producto de 94 bp. Entonces se visualiza el producto final en geles
de agarosa a 1%. Se puede emplear un ensayo tipo Southern utilizando una sonda marcada para
confirmar la identidad de los productos B1 de la PCR y distinguirlos de los productos no específicos.
2.
Pruebas serológicas
Se dispone de diversas pruebas serológicas para la detección de anticuerpos frente a T. gondii. En un tipo de
prueba el observador juzga el color de los taquizoítos al microscopio, tal como sucede con la prueba de tinción
(DT) y la prueba IFI. Otra prueba depende del principio de aglutinación de taquizoítos de Toxoplasma, glóbulos
rojos o partículas de latex, como sucede con la prueba de aglutinación directa (DAT), la prueba de aglutinación
indirecta (IHA) y la prueba de aglutinación con latex (LA), respectivamente. Con la técnica de
enzimoinmunoensayo (ELISA), el cambio en la intensidad de color define la cantidad de anticuerpo específico
en una solución dada. Las pruebas DT, IFI, DAT y ELISA se especifican más adelante, indicándose la prueba IFI
con más detalle.
La prueba serológica DT (9) se considera el “patrón de oro” para anticuerpos anti-Toxoplasma en humanos. Los
taquizoítos vivos de Toxoplasma se incuban con un factor accesorio tipo complemento y el suero problema a
37°C durante 1 hora antes de añadir azul de metileno. Los anticuerpos específicos inducen la permeabilización
de la membrana del parásito de modo que el citoplasma se derrama y los taquizoítos no incorporan el colorante
de modo que aparecen incoloros. Los taquizoítos no expuestos al anticuerpo específico (p. ej. una muestra de
suero negativo) incorporan el colorante y aparecerán azules. La prueba DT es al mismo tiempo sensible y
específica en humanos, pero podría ser impracticable en otras especies. Además es potencialmente peligrosa
puesto que se emplea el parásito vivo. Es costosa y requiere un alto grado de experiencia técnica.
La prueba IFI (8) es un método simple y se utiliza ampliamente. Los taquizoítos intactos y muertos de
Toxoplasma se incuban con el suero problema diluido, se añade el antisuero específico anti especie
fluorescente apropiado, y el resultado se visualiza entonces con un microscopio de fluorescencia. Se dispone
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1205
Capítulo 2.10.12. — Toxoplasmosis
comercialmente de anticuerpos marcados con fluorescencia para una variedad de especies animales; el método
es relativamente económico y se encuentran disponibles comercialmente los kits adecuados. Sin embargo, el
método requiere un microscopio de fluorescencia y como los datos son interpretados visualmente, se pueden
producir variaciones subjetivas. Puede resultar difícil encontrar algunos conjugados específicos de las especies
y existe riesgo de una posible reacción cruzada con anticuerpos frente al factor reumatoide y con anticuerpos
antinucleares.
La prueba DAT (4) es sensible y específica. Se añaden taquizoítos formalinizados de Toxoplasma a pocillos con
forma de U de placas de microtitulación y se aplican las diluciones de los sueros problema. Las muestras
positivas producirán aglutinación que puede ser variable, mientras que las muestras negativas producirán un
botón de taquizoítos sedimentados en el fondo del pocillo. La prueba es simple y fácil de realizar aunque se
requieren cantidades relativamente grandes de antígenos. Se dispone de kits comerciales. Más adelante se
indica el método de crecimiento y recogida de parásitos.
La técnica original ELISA (11) utiliza una preparación de antígeno soluble realizada con taquizoítos de la cepa
de Toxoplasma RH (como se describe más adelante) y se coloca en pocillos de una placa de microtitulación. Se
añaden los sueros problema (p. ej. ovino en origen), seguido de un conjugado anti-especie marcado con un
enzima como puede ser IgG anti-ovina marcada con peroxidasa de rábano. Cualquier conjugado adherido causa
un cambio de color en el sustrato que es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo unido y puede
ser leído con un espectrofotómetro a la absorbancia específica del sustrato empleado. La técnica es simple,
permite ensayar un gran número de muestras y es fácil de realizar con el conjugado anti-especie elegido. Se
dispone comercialmente de conjugados anti-especies, sustratos y kits completos. Sin embargo la técnica
requiere un espectrofotómetro. La técnica ELISA es idónea para laboratorios que analizan gran número de
muestras.
Preparación de antisueros y antígenos
Se pueden obtener comercialmente antisueros contra T. gondii y antisueros conjugados para las pruebas IFI y
ELISA, lo que permite muestrear una variedad de especies animales. No se dispone de patrones internacionales
para sueros animales.
Más adelante se indican los protocolos a seguir en la preparación del antígeno del taquizoíto para su utilización
en las pruebas IFI y ELISA. Los taquizoítos se pueden cultivar en ratones o en cultivo de tejidos y se mantienen
intactos para la prueba IFI, o se preparan como antígeno soluble para la técnica ELISA.
Producción de taquizoítos de Toxoplasma en ratones
i)
Se inyectan seis ratones libres de Toxoplasma por vía intraperitoneal utilizando una jeringa de 1ml y
una aguja de calibre 23, con 0,2 ml de 1 107/ml de taquizoítos de T. gondii de la cepa RH, se
recogen frescos a partir de un pase previo por ratón o a partir de cultivo de tejidos. (Para la
recuperación óptima de los taquizoítos tomando las mínimas células mononucleares del hospedador,
los ratones deben tener más de 6-8 semanas de vida y pesar aproximadamente 22-25 g.)
ii)
Se sacrifican los ratones 3 días más tarde mediante inhalación de CO2 (evitar la dislocación cervical
porque puede causar contaminación del fluido peritoneal con glóbulos rojos).
iii)
Se pincha el ratón de espaldas sobre una superficie de corcho limpia. Se separa la piel abdominal
con precauciones asépticas, se extrae cualquier fluido peritoneal con una aguja de calibre 21 unida a
una jeringa de 1 ml y se expulsa suavemente el exudado recogido en un volumen igual de PBS.
El momento óptimo de recoger los taquizoítos es de 72 horas después de la inoculación inicial,
momento en el que habrá organismos suficientes pero antes de que exista contaminación significativa
de las células hospedadoras. También es importante no posponer la recogida del fluido peritoneal
más allá de 3 días desde la muerte de los ratones. (Si los taquizoítos para la inoculación del ratón se
toman a partir de muestras estabilizadas congeladas, podría ser necesario recoger los ratones 4 o
5 días después de la inoculación inicial y realizar un pase del parásito una vez más a través de
ratones antes de ser utilizados como antígeno en las pruebas indicadas anteriormente.)
iv)
Se centrifuga el fluido a 500 g durante 5 minutos, se aspira el sobrenadante y se resuspende en una
solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Se alternan lavados en PBS y HBSS por centrifugación.
v)
Se calcula la concentración de taquizoítos y células hospedadoras contaminantes con una cámara de
recuento Neubauer mejorada (El recuento de taquizoítos se realiza a dilución 1/1.000 y la
contaminación celular a dilución 1/10).
vi)
Se llevan a cabo posteriores lavados (etapa iv anterior) cuando sea necesario para reducir la
contaminación celular a <0,5% de células mononucleares y <0,25% de glóbulos rojos.
1206
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.12. — Toxoplasmosis
vii)
Se resuspenden los taquizoítos en PBS hasta alcanzar una concentración final de 1
107/ml.
viii) Los taquizoítos se pueden mantener de esta manera por pases continuos sin necesidad de adicionar
penicilina/estreptomicina, siguiendo procedimientos asépticos estrictos.
Preparación de alícuotas de de taquizoítos de T. gondii estabilizadas y congeladas
i)
Se consiguen los taquizoítos a partir de ratones o cultivos de tejidos como ya se ha descrito.
ii)
Se centrifugan a 500 g durante 5 minutos y se resuspenden en medio de Dulbecco modificado por
Iscove (IMDM) (Gibco BRL, Paisley, Gran Bretaña) aproximadamente tres veces.
iii)
Se añaden las siguientes soluciones hasta conseguir estas concentraciones: dimetil sulfóxido al 10%;
suero de caballo normal al 20% (libre de anticuerpos frente a T. gondii); taquizoítos resuspendidos al
70% hasta una concentración final de 1 108 taquizoítos/ml.
iv)
La preparación debe permanecer estática durante 1 hora.
v)
Se distribuyen alícuotas de 1ml en tubos de tapón de rosca apropiados para el almacenamiento en
nitrógeno líquido.
vi)
Se introducen los tubos en un pequeño contenedor. Se envuelven en un material aislante grueso y se
colocan en un congelador a –70°C hasta conseguir que los taquizoítos se congelen gradualmente.
vii)
Al día siguiente se transfieren a nitrógeno líquido, manteniéndolos bien aislados mientras se
transfieren.
viii) Este material estabilizado puede ser empleado para inocular ratones o cultivar el parásito en cultivo
de tejidos. Cuando se saca del congelador, la muestra se descongela rápidamente en agua templada.
Producción de taquizoítos de Toxoplasma en cultivos de tejidos
i)
Se puede cultivar Toxoplasma gondii y mantener en cultivo de tejidos mediante pases dos veces por
semana en células de riñón de mono verde africano (Vero).
ii)
Las células y el parásito se cultivan en medio IMDM suplementado con 50 UI/ml de penicilina,
50 µg/ml estreptomicina y suero fetal bovino al 2%.
iii)
Los taquizoítos se recogen a partir de frascos de cultivo de tejidos raspando la monocapa celular
mediante un raspador celular estéril.
iv)
Se emplean frascos de cultivo de tejidos de 25cm2 que han sido sembrados con 1 105 células Vero,
se añaden taquizoítos en una relación de dos taquizoítos por célula de la monocapa y se incuban a
37°C en un incubador con atmósfera humidificada y un 5% de CO2. Se recogen después de 3–4 días.
Preparación de taquizoítos intactos para ser utilizados en la prueba IFI
107/ml taquizoítos de la cepa de T. gondii RH en PBS.
i)
Se prepara una suspensión de 4
ii)
Se añade formaldehído (40%) hasta conseguir una concentración final de 0,2% (v/v).
iii)
Se incuba a 4°C durante toda la noche y se divide en alícuotas empleando tubos cerrados
adecuadamente que se mantienen congelados hasta su uso.
Producción de antígeno soluble para la técnica ELISA
i)
Se prepara una suspensión de taquizoítos de la cepa de T. gondii RH en PBS.
ii)
Se centrifuga a 2.000 g durante 15 minutos, se conserva el precipitado y se resuspende en nueve
veces su volumen en agua destilada.
iii)
Se rompen los taquizoítos mediante tres ciclos de congelación y descongelación.
iv)
Entonces se sonica la preparación de antígeno durante 20 segundos a 4°C y una amplitud de
20 micras.
v)
Se extrae cualquier residuo celular mediante centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos a 4°C.
vi)
Se retiene el sobrenadante y se conserva a –20°C hasta su uso. (La estimación de proteínas
esperada tiene un valor de entre 2 y 4 µg/ml.)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1207
Capítulo 2.10.12. — Toxoplasmosis
Protocolo para la prueba IFI
El siguiente es un protocolo para realizar una prueba IFI de detección de anticuerpos IgG antiToxoplasma
en suero ovino. Sólo requiere pequeñas modificaciones para las pruebas en diferentes especies o para la
medida de anticuerpos IgM.
i)
Se limpia el número necesario de portas multiprueba de 15 pocillos para cultivo de tejidos (Flow
laboratorios) y se deja secar.
ii)
Se colocan 5 µl de una preparación de taquizoítos intactos en cada pocillo y se dejan sacar.
iii)
Se fijan en metanol durante 10 minutos.
iv)
Se realizan dos lavados de 10 minutos en PBS 0,3 M, pH 7,4.
v)
Se añaden 5 µl del suero ovino problema (diluido en PBS) a cada pocillo. (Se preparan diluciones
seriadas de los sueros problema, p. ej. 1/16, 1/32, etc. hasta 1/1.024.) Se debe incluir un suero
control positivo y negativo en cada prueba así como una muestra con “sólo PBS”. Se incuban
30 minutos a temperatura ambiente.
vi)
Se realizan dos lavados de 10 minutos en PBS.
vii)
A cada pocillo se añaden 5 µl de una dilución apropiada de IgG de conejo anti-oveja conjugada a
isotiocianato de fluoresceína, diluidos en colorante azul de Evan filtrado al 2% en PBS, y se incuban
durante 30 minutos a temperatura ambiente.
viii) Se realizan tres lavados de 10 minutos en PBS.
ix)
Se colocan los portas bajo cubreobjetos con glicerol tamponado (nueve partes de PBS y una de
glicerol) o Citifluor (Citifluor Ltd, Londres).
x)
Se examina mediante un microscopio de fluorescencia, provisto de objetivos 20 x y 40 x.
Con un resultado negativo del suero problema los parásitos intactos aparecerán rojos debido a la
autofluorescencia del colorante azul de Evan. También pueden presentar un casquete fluorescente verde
en un extremo del parásito (fluorescencia polar no específica). Con un suero problema positivo los
parásitos presentarán fluorescencia roja y al menos el 80% de ellos en un pocillo dado estarán rodeados
por una banda continua de fluorescencia verde. En una oveja/cabra adulta un título se considerará positivo
cuando los pocillos muestren resultado positivo a diluciones 1/64 y será negativo a diluciones 1/32. Para
corderos/crías y suero fetal, los títulos serán 1/32 y 1/16, respectivamente.
Un ejemplo de sistema en porta se indica a continuación:
Muestra 1
1/16

1/32

1/64

1/512

1/1024

PBS only

1/1256

1/128

1/64

|
|
|
1/128

1/256

1/1024

1/512

1/32

1/16

Muestra 2
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
La única vacuna disponible es una preparación viva producida comercialmente para ovejas (Toxovax, Intervet
BV, Países Bajos; Toxovax, AgVax, Ag Research, Nueva Zelanda), y actualmente con licencia de uso en Gran
Bretaña, Irlanda, Francia, España y Nueva Zelanda. Consiste en cultivo de tejidos en los que se desarrollan
taquizoítos de T. gondii S48 atenuados por mas de 3000 pases en ratones. La vacuna estimula la inmunidad
protectora efectiva durante al menos 18 meses después de una única inyección subcutánea, pero como es
incapaz de producir quistes tisulares, las ovejas no permanecen con una infección vacunal persistente. La
vacuna tiene un corto periodo de validez y supone un riesgo potencial para individuos inmunodeprimidos y
hembras en estado de gestación (2).
1208
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.12. — Toxoplasmosis
REFERENCIAS
1.
BURG J.L., GROVER C.M., POULETTY P. & BOOTHROYD J.C. (1989). Direct and sensitive detection of a
pathogenic protozoan, Toxoplasma gondii, by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 27, 1787–
1792.
2.
BUXTON D. (1993). Toxoplasmosis: the first commercial vaccine. Parasitol. Today, 9, 335–337.
3.
BUXTON D. (2000). Toxoplasmosis and neosporosis. En: Diseases of Sheep, Martin W.B. & Aitken I.D., eds.
Blackwell Science, Oxford, UK, 86–94.
4.
DESMONTS G. & REMINGTON J.S. (1980). Direct agglutination test for diagnosis of Toxoplasma infection:
method for increasing sensitivity and specificity. J. Clin. Microbiol., 11, 562–568.
5.
DUBEY J.P. & BEATTIE C.P. (1988). Toxoplasmosis of Animals and Man. CRC Press, Boca Raton, Florida,
USA.
6.
ELLIS J.T. (1998). Polymerase chain reaction approaches for the detection of Neospora caninum and
Toxoplasma gondii. Int. J. Parasitol., 28, 1053–1060.
7.
LIND P. & BUXTON D. (2000). Veterinary aspects of Toxoplasma infection. En: Congenital Toxoplasmosis;
Scientific Background, Clinical Management and Control, Ambroise-Thomas P. & Petersen E., eds.
Springer, Paris, France, 261–269.
8.
MUNDAY B.L. & CORBOULD A. (1971). The application of the Toxoplasma indirect fluorescent-antibody test to
sheep sera. Aust. J. Med. Technol., 2, 3–6.
9.
SABIN A.B. & FELDMAN H.A. (1948). Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon
affecting a protozoon parasite (Toxoplasma). Science, 108, 660–663.
10. UGGLA A., SJOLAND L. & DUBEY J.P. (1987). Immunohistochemical demonstration of toxoplasmosis in fetuses
and fetal membranes of sheep. Am. J. Vet. Res., 48, 348–351.
11. VOLLER A., BIDWELL D.E., BARTLETT A., FLECK D.G., PERKINS M. & OLADEHIN B. (1976). A microplate enzymeimmunoassay for toxoplasma antibody. J. Clin. Pathol., 29, 150–153.
12. W ASTLING J.M., NICOLL S. & BUXTON D. (1993). Comparison of two gene amplification methods for the
detection of Toxoplasma gondii in experimentally infected sheep. J. Med. Microbiol., 38, 360–365.
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1209
CAPÍTULO 2.10.13.
ESCHERICHIA COLI VEROCITOTOXIGÉNICA
RESUMEN
Escherichia coli es una bacteria habitual en el tracto grastrointestinal de los animales y de los
humanos. Algunas cepas se han adaptado muy bien para producir diarreas y diversas
enfermedades intestinales. Desde 1977, se sabe que algunas cepas que ocasionan diarreas de E.
coli producen toxinas que tienen un efecto citopático irreversible sobre células Vero cultivadas. Las
cepas verocitotoxigénicas de E. coli (VTEC) pertenecen a más de 100 serotipos diferentes.
Escherichia coli 0157:H7 es el serotipo predominante y más virulento en un subtipo patógeno de
VTEC, llamado E. coli enterohemorrágico (EHEC). Esta designación se basa en su capacidad para
producir colitis hemorrágica y el síndrome de la uremia hemolítica en humanos, su habilidad para
producir verocitotoxinas, para unirse y producir lesiones de eliminación de células epiteliales y en
que poseen un plásmido grande característico. En las dos décadas pasadas, la VTEC 0157:H7 ha
adquirido importancia mundial como problema de salud pública. Otros serogrupos no–0157,
incluyendo 026, 091, 0103, 0104, 0111, 0113, 0117, 0118, 0121, 0128 y 0145, se han asociado
con brotes ocasionales de enfermedad humana y otros aún con casos esporádicos. Las VTEC se
han aislado en heces de algunos animales, fundamentalmente portadores sanos, incluyendo el
ganado vacuno, ovejas, cabras, cerdos, gatos, perros, pollos y aves salvajes. Se considera que el
ganado vacuno es el reservorio principal de E. coli 0157:H7 para la infección en el hombre. A pesar
de su patogenicidad para los humanos, la infección de animales con E. coli 0157:H7 es
invariablemente asintomática. Como contraste, los serogrupos EHEC 026, 0111 y 0103 pueden ser
patógenos tanto para humanos como para animales. La presencia de VTEC en heces de animales
proporciona el potencial para que estos organismos entren en la cadena alimentaria por
contaminación fecal de productos lácteos, contaminación de la carne con contenidos intestinales
durante el proceso del sacrificio o contaminación de la fruta y los vegetales por contacto con abono
infectado. Las VTEC se transmiten también a través del agua y por contacto directo con personas
o con animales infectados.
Identificación del agente: Se han desarrollado procedimientos de diagnóstico para el VTEC,
fundamentalmente para E. coli 0157:H7, que intentan superar los problemas de aislar cantidades
bajas de los organismos de productos complejos, tales como heces animales, muestras clínicas y
alimentos. La identificación de E. coli 0157:H7 en portadores animales subclínicos depende del
enriquecimiento de muestras de heces en medios líquidos, generalmente agua tamponada con
peptona con o sin adición de vancomicina, cefsulodina y cefixima, durante 6 horas a 37 °C seguida
de separación inmunomagnética usando partículas paramagnéticas disponibles comercialmente o
bolas recubiertas con anticuerpo anti–lipopolisacárido 0157. Las bolas con bacterias ligadas se
colocan en agar selectivo, normalmente agar MacConkey con 1% de sorbitol que contienen
cefixima y telurito potásico, y se incuban durante 18 horas a 37 °C. Las colonias que no fermentan
sorbitol se confirman bioquímicamente como E. coli y mediante pruebas de aglutinación de suero o
látex como poseedoras del antígeno somático 0157 y/o el antígeno flagelar H7. La virulencia
potencial para los humanos se confirma mediante la demostración de la producción de
verocitotoxina mediante ensayo en células Vero, enzimoinmunoensayo (ELISA) o pruebas de
aglutinación o por demostración de los genes que codifican la verocitotoxina mediante la reacción
en cadena de la polimerasa. La detección de VTEC no–0157 descansa en el análisis directo de
colonias sobre placas no selectivas mediante, por ejemplo, inmunomarcaje o sondas de ADN para
la producción de verocitotoxinas. Se han descrito numerosas pruebas inmunológicas y de
reconocimiento del ácido nucleico para proporcionar un diagnóstico preliminar más rápido de
1210
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.13. — Escherichia coli verocitotoxigénica
VTEC y hay muchas disponibles comercialmente. La tipificación del fago y la electroforesis en gel
de campo pulsante se utilizan ampliamente en laboratorios de referencia para subtipificar VTEC
0157 con fines epidemiológicos.
Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas no se usan rutinariamente en animales para
diagnosticar la infección por VTEC, pero se ha demostrado que el ganado vacuno infectado con
VTEC produce anticuerpos séricos al lipopolisacárido 0157 que pueden detectarse mediante
ELISA.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No existen en la actualidad
vacunas disponibles para controlar las infecciones por VTEC en animales o humanos, pero se
están desarrollando algunas vacunas experimentales.
A. INTRODUCCIÓN
Escherichia coli se encuentra habitualmente en el tracto gastrointestinal de los animales y de los humanos, en los
que algunas cepas se han llegado a adaptar para producir diarrea y una variedad de enfermedades adicionales
intestinales. Escherichia coli se caracteriza rutinariamente por la identificación serológica de los antígenos O
somáticos, H flagelares y K capsulares. Sin embargo, mientras que algunos serotipos se correlacionan
completamente con algunos síndromes clínicos, la diferenciación de cepas patógenas de la flora normal depende
de la identificación de las características de virulencia. Desde 1977, se ha reconocido que algunas cepas
diarreicas de E. coli producen toxinas que tienen un efecto citopático irreversible sobre células Vero cultivadas
(16). Se ha demostrado que E. coli verocitotoxigénica pertenece a más de 100 serotipos diferentes (13, 26).
También se han descrito como E. coli productoras de la toxina Shiga (STEC) debido a la similitud demostrada
entre las verocitotoxinas (VT) y las toxinas Shiga (stx) de Shigella dysenteriae (22). En las dos últimas décadas
VTEC 0157:H7 ha crecido en importancia mundial como problema de salud pública. Escherichia coli 0157:H7 es
el serotipo predominante y más virulento en un subtipo patógeno de VTEC, designado E. coli enterohemorrágico
(EHEC). Esta designación se basa en su capacidad para producir colitis hemorrágica y el síndrome de uremia
hemolítica en humanos, su habilidad para producir VT, para causar uniones y lesiones de eliminación de
células epiteliales, y en que tiene un plásmico característico grande (21). Otros serotipos no–0157, incluyendo
026:H11, 0104:H21, 0111: H– y 0145: H–, se han asociado con brotes de la enfermedad en humanos, y otros
más con casos esporádicos (13).
VTEC se ha aislado de las heces de algunos animales, fundamentalmente sanos, incluyendo ganado vacuno,
ovejas, cabras, cerdos, gatos, perros, pollos y aves salvajes (3, 13). Se ha descrito que las cepas
0157 representan una minoría de las VTECs que colonizan el tracto intestinal de los animales. La presencia de
VTEC en heces de animales proporciona el potencial para que estos organismos entren en la cadena alimentaria
por contaminación fecal de la leche, contaminación de carne con contenidos intestinales durante el sacrificio o
contaminación de fruta y vegetales por contacto con abono contaminado. VTEC se transmite también a través
del agua y por contacto directo con personas infectadas, animales o deshecho animales. Se considera que el
ganado vacuno es el mayor reservorio de E. coli 0157:H7 de infección para humanos, aunque el organismo se ha
aislado de algunos animales domésticos, caballos, perros, conejos, pájaros y moscas. A pesar de su habilidad
para causar enfermedad grave en humanos (23), la infección de animales con E. coli 0157:H7 es invariablemente
subclínica. Sin embargo, algunos serotipos no–0157, son patógenos para animales y humanos e incluyen
026:H11; 0103:H2; 0111: H– (2,13).
VTEC se asocia también con la enfermedad de los edemas en los lechones, con cuatro serotipos responsables
de la mayoría de los brotes mundiales, a saber, 045: K+, 0138:K81, 0139:K82 y 0141: K–Los factores de
virulencia principales son las adhesinas de las fimbrias, F18, implicadas en la colonización, y la toxina VT2e que
es responsable de los síntomas clínicos. Se ha demostrado un alto grado de relación genética entre las cepas
0101 que albergan genes stx2e de origen humano y porcino, y se requiere más investigación del papel de los
cerdos como portadores subclínicos de STEC en la epidemiología de la enfermedad humana.
Debido a que E. coli 0157:H7 se ha convertido en la VTEC zoonósica predominante, se han desarrollado
métodos de diagnóstico para detectar este serotipo selectivamente en casos clínicos humanos (26) y en fuentes
alimentarias (27). Sin embargo, en este capítulo se pondrá de relieve el aislamiento y la identificación de 0157 y
otras VTEC de animales portadores (8).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1211
Capítulo 2.10.13. — Escherichia coli verocitotoxigénica
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
•
Muestras
En la mayoría de los casos, las muestras tomadas de animales para el aislamiento de VTEC son heces
recogidas con fines de inspección o como parte de una encuesta epidemiológica después de un brote de
enfermedad en humanos. Las muestras se pueden tomar del recto o de heces recién evacuadas en la granja o
de contenidos intestinales después del sacrificio. Existe una variedad de VTEC presente en animales sanos y no
se cree que todos sean patógenas para humanos. Algunos aislados de E. coli 0157, particularmente de cerdos,
no son cepas verocitotoxigénivas ni patógenas para humanos. Sin embargo, el diagnóstico debe incluir la
demostración de factores de virulencia conocida en los aislados. Estos incluyen las verocitotoxinas VT1 (Stx1) y
VT2 (Stx2) y sus genes y una proteína de adhesión a la membrana exterior asociada con lesiones de unión y
eliminación, intimina, codificada por el gen eae (18). Escherichia coli 0157:H7, que es la VTEC más significativa
en la enfermedad humana, se presenta subclínicamente en animales. Se cree que el ganado vacuno es el
reservorio más importante de este serotipo. En un rebaño infectado, sólo se puede detectar una proporción de
animales infectados, y el organismo está presente en portadores en pequeñas cantidades y es arrojado en las
heces intermitentemente. En el vertido influye la edad de los animales, la dieta, el estrés, la densidad de
población, la localización geográfica y la estación (20). Los índices de aislamiento se deben mejorar tomando
muestras de heces mejor que frotis rectales, aumentando el tamaño de la muestra, el número de individuos
muestreados y repitiendo el muestreo. Se deben tomar precauciones para evitar contaminación cruzada de
muestras en tránsito y en el laboratorio. Las muestras deben mantenerse frías y cultivarse tan pronto como sea
posible después de la recogida.
•
Seguridad
Ha de tenerse cuidado cuando se manejan muestras positivas de VTEC ya que las dosis infectivas capaces de
producir infección grave en humanos pueden ser bajas (posiblemente 100 organismos para VTEC 0157:H7) y se
han descrito infecciones adquiridas en el laboratorio (ver Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios de
microbiología veterinaria).
•
Aislamiento
a)
Enriquecimiento de medios líquidos
Las muestras clínicas se colocan rutinariamente sobre medios líquidos para el aislamiento de E.coli, pero el
número de organismos objetivo en las heces de portadores sanos es generalmente bajo y el
enriquecimiento de medios líquidos mejora la recuperación. Normalmente los medios enriquecidos usados
son agua tamponada con peptona suplementada con 8 mg/litro de vancomicina, 10 mg/litro de cefsulodina y
0,05 mg/litro de cefixima (BPW–VCC) para suprimir el crecimiento de organismos Gram positivos,
Aeromonas spp. y Proteus spp.; caldo de soja tripticasa modificado (mTSB) suplementado con 20 mg/litro
de novobiocina o 10 mg/litro de acriflavina para reducir el crecimiento de organismos Gram positivos; o
caldo de E. coli modificado con 20 mg/litro de novobiocina (mEC+n). E. coli EHEC crece mal a 44 °C. La
incubación óptima para minimizar el crecimiento excesivo de otros organismos es 6 horas a 37 °C para
heces bovinas. Para muestras de carne, se usa el enriquecimiento durante 6 horas a 41–42 °C y para agua
y productos lácteos, 24 horas a 41–42 °C. Se necesita preenriquecimiento no selectivo para la recuperación
efectiva de niveles bajos de E.coli 0157. Los caldos enriquecidos se deben precalentar para impedir que los
organismos sufran un choque por frío y ralenticen su crecimiento inicial; la incubación durante 24 horas
puede aumentar la recuperación si los organismos están bajo la influencia de algún factor que las altere.
b)
Separación inmunomagnética
Se ha utilizado la separación inmunomagnética (MS) como técnica de concentración selectiva para mejorar
el aislamiento de E. coli 0157:H7 donde la cantidad de organismos es baja (7). Partículas paramagnéticas
disponibles comercialmente o bolas recubiertas con anticuerpo anti–lipopolisacárido (LPS) se mezclan con
la muestra de prueba. Las bolas con bacteria ligada se separan del sobrenadante por un campo magnético
y después del lavado se ponen sobre agar selectivo y se incuban durante 18 horas a 37 °C para aislar las
colonias sospechosas. La técnica es específica de serogrupo. Hay sistemas comerciales disponibles para
separación automática o manual (6). La recuperación puede estar afectada por la relación bola–organismo
(la óptima es 3:1), el caldo enriquecido usado y el problema de adsorción no específica de E. coli a las
bolas magnéticas (que se puede reducir mediante el uso de una solución de fuerza magnética baja en el
procedimiento de IMS y lavado cuidadoso). Estos factores deberían tenerse en cuenta cuando se trata de
maximizar la sensibilidad de la técnica para detectar el E. coli .
1212
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.13. — Escherichia coli verocitotoxigénica
c)
Cultivo selectivo de Escherichia coli 0157
No hay características bioquímicas que distingan la mayoría de las VTEC de otras E. coli. Sin embargo, la
incapacidad de la mayor parte de las cepas de E. coli 0157:H7 para fermentar D–sorbitol rápidamente y su
falta de actividad beta–glucuronidasa se puede explotar en el aislamiento e identificación de estos
organismos. Sin embargo, los aislados menos comunes de E. coli 0157: H– (no móviles), que fermentan
sorbitol y son positivos a beta–glucoronidasa, no se identificarán por aislamiento en los medios selectivos
escogidos por estas características bioquímicas (15). El agar MacConkey que contiene 1% de D–sorbitol en
lugar de lactosa (SMAC) es un medio útil y barato sobre el que crece el E. coli que no fermenta el sorbitol
en pequeñas colonias redondas blanco–grisáceas. La selectividad se mejora mediante la adición de
0,5% de rhamnosa, y la adición de 0,05 mg/litro de cefixima (CR–SMAC) inhibe el crecimiento en exceso
por Proteus spp. Aunque pocas colonias sospechosas requieren la prueba sobre este medio, la rhamnosa
es un suplemento caro. Una modificación alternativa es la adición de 2,5 mg/litro de telurito potásico
además de la cefixima (CT–SMAC), que tiene un mayor efecto inhibidor frente a E. coli no–0157 y otros no
fermentadores de sorbitol, como Aeromonas, Plesiomonas, Morganella y Providencia, que frente a E. coli
0157 (28). Este es el medio más usado para aislar E. coli 0157.
Para distinguir E. coli 157:H7 no productor de beta–glucuronidasa se utilizan medios que contengan
glucurónidos cromogénicos o fluorogénicos. La hidrólisis de 4–metilumbeliferil–beta–D–glucurónido (MUG)
por actividad beta–glucuronidasa produce un compuesto fluorescente visible bajo luz ultravioleta. La adición
de 0,1 g/litro de 5–bromo–4–cloro–3–indoxyl–beta–D–glucurónido (BCIG) a SMAC diferencia las colonias
blancas de E. coli 0157:H7 de las colonias azul verdosas de los organismos positivos a la beta–
glucuronidas y negativos al sorbitol. Se pueden encontrar medios cromogénicos y fluorogénicos disponibles
comercialmente mediante referencia a catálogos de medios. Mientras que se han hecho algunos avances
para mejorar la selectividad de los medios para E. coli 0157:H7, las tasas de aislamiento, particularmente
de los organismos estresados, pueden resultar afectadas negativamente por los aditivos usados. Para
mitigar estos efectos, la adición de agentes de recuperación tales como 1% de piruvato sódico a agar de
soja triptona o el retraso de la exposición de las células con estrés a agentes selectivos puede ayudar a la
recuperación del organismo (5).
d)
Aislamiento de otras VTEC
VTEC no–0157 crece bien sobre medios que permiten el crecimiento de E. coli, tales como agar sangre o
agar MacConkey, y la mayoría sólo se pueden diferenciar de otras E. coli por su capacidad para producir
VT. El gran número de diferentes serotipos de VTEC impide el uso de antisueros O en el examen rutinario y
la identificación preliminar de colonias sobre estos medios. Se puede usar IMS para una concentración
selectiva de serogrupos 026, 0103, 0111 y 0145 de una muestra preenriquecida, como para las cepas
0157. Estos serogrupos son los VTECs no–0157 más comúnmente asociados con la enfermedad humana,
pero las bolas producidas comercialmente están disponibles actualmente sólo con fines de investigación.
La incapacidad de las cepas 026 para fermentar rhamnosa ha conducido al desarrollo reciente de medios
que pueden ser útiles para diferenciar E.coli 026 de otros organismos entéricos. El primero es el agar
rhamnosa–MacConkey (RMAC) en el cual la lactosa en el medio MacConkey es reemplazada por 10g/litro
de rhamnosa. Se considera que la adición de 2,5 mg/litro de telurito de potasio y 0,05 mg/litro de cefixima
(CT–RMAC) incrementa la especificidad. El segundo es un agar de rhamnosa cromogénico incorporando 10
g/litro de rhamnosa y 0,02 g/litro de rojo fenol en agar coliforme de ES (un medio indicador para la actividad
beta–galactosidasa) al cual se añaden 0,5 mg/litro de telurito potásico y 0,05 mg/litro de cefixima. Sobre
este medio, se han descrito colonias 026 de color azul marino a negro, mientras otros serotipos de E. coli
son verdes y otras enterobacterias que no son E. coli son verdes, amarillas o incoloras.
Un marcador de virulencia para VTEC potencialmente útil es la producción de enterohemolisina, que
produce hemólisis de eritrocitos de oveja lavados tras incubación durante la noche sobre agar sangre
suplementado con calcio. Esta característica la comparte el 90% de las E. coli productoras de VT aisladas
en infecciones humanas. Sin embargo, el descubrimiento de que una proporción de VTEC causantes de
enfermedad puede ser negativos para la producción de enterohemolisina, reduce el valor del agar de
enterohemolisina para el análisis.
En la mayoría de los casos, sin embargo, el aislamiento de VTEC descansa en el análisis directo de
colonias en la placa por inmunotransferencia o sondas de ADN para producción de VT para identificar
colonias de cara a su caracterización posterior. Las colonias se replican primero de forma que las colonias
positivas puedan aislarse después de que los replicados se hayan probado. Las colonias se pueden
transferir a membranas adecuadas (nitrocelulosa o nylon) de las que se hacen réplicas o se pasan a placas
de microtitulación de 96 pocillos que contengan caldo para la replicación antes de transferir alícuotas a los
filtros apropiados. Las colonias se analizan utilizando sondas de ácido nucleico o anticuerpos para
identificar cualquier VTEC (26). Hull et al. (11) desarrollaron un ensayo de inmunomarcaje con mitomicina
para detectar VTEC en heces que es lo bastante sencillo para usarse en laboratorios de diagnóstico
rutinario. Se inoculan sobre placas de agar MacConkey diluciones seriadas de heces en caldo y se incuban
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.13. — Escherichia coli verocitotoxigénica
durante la noche a 37 °C. Utilizando técnicas estándar de réplica en placa, el cultivo de la placa con
alrededor de 200 colonias se transfiere a dos filtros de nitrocelulosa de 0,45–µm de tamaño de poro puestos
en agar Syncase con 25 ng de mitomicina/ml. Este medio induce el crecimiento vegetativo de los
bacteriófagos que portan los genes para VT y aumenta la expresión de la toxina. (Alternativamente se
pueden colocar suspensiones bacterianas o fecales directamente sobre los filtros). Las placas se incuban
durante la noche a 37 °C. Después, se retiran los filtros de las placas, se meten en un baño de cloroformo
durante 15 minutos, se bloquean durante 1 hora con leche descremada al 5% en Tris 10 mM, 150 mM de
NaCl, y 0,5% de Tween (pH 8) (TNT). Los filtros se incuban durante 1 hora con antisueros contra VT1 o
VT2, se lavan 3 veces durante 5 minutos en TNT, se incuban durante 1 hora con antiinmunoglobulina G
conjugada con fosfatasa alcalina, seguido de 3 lavados posteriores de 5 minutos en TNT. Cualquier
reacción se visualiza por desarrollo de color con nitroazul y 5–bromo–4–cloro–3–indolil–fosfato. En paralelo
se prueban E. coli control VT1, VT2 y VT–negativo. El uso de anticuerpos policlonales da algunos resultado
positivos falsos que se eliminan utilizando anticuerpos monoclonales. Cuando se compara la utilización de
sondas de ADN con la utilización del ensayo de inmunotransferencia de colonias con mitomicina, se
demostró que los resultados eran comparables. El ensayo de inmunotransferencia tiene la ventaja de ser
más simple de llevar a cabo que el de las sondas de ADN. Las placas con mitomicina duran más cuando se
almacenan en la oscuridad a 4 °C.
La inmunotransferencia de colonias o el uso de sondas son técnicas de trabajo intenso y se pueden aplican
mejor a muestras analizadas que hayan resultado positivas a la presencia de VT o genes de VT mediante,
por ejemplo, enzimoinmunoensayo (ELISA) o reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
•
Identificación y caracterización de colonias sospechosas
Se debe confirmar bioquímicamente que las colonias que crecen sobre medios sólidos, sospechosas de VTEC,
son de E.coli. Los antígenos “O” somáticos y los “H” flagelares se identifican serológicamente, y para confirmar la
virulencia, tiene que demostrarse que los organismos son productores de VT. Para las cepas de VTEC 0157, se
dispone de métodos de subtipificación en laboratorios de referencia para investigaciones epidemiológicas.
a)
Pruebas bioquímicas
Las VTEC son bioquímicamente similares a otras E. coli. Las cepas de VTEC 0157:H2 difieren en que no
fermentan el sorbitol, no producen beta–glucoronidasa y fermentan la rafinosa y el dulcitol. Se puede
distinguir Escherichia coli de E. hermanii por la falta de crecimiento en presencia de cianuro potásico e
incapacidad para fermentar la celobiosa. Escherichia hermanii es positiva en ambas pruebas. El noventa y
ocho por ciento de las cepas de E. hermanii tiene un pigmento amarillo característico sobre agar nutritivo
que no se ve en VTEC. Escherichia coli se puede confirmar mediante la utilización de triptófano y actividad
con la beta–galactosidasa (ver debajo) o mediante tiras de pruebas bioquímicas disponibles
comercialmente.
b)
Pruebas serológicas
Hay disponibles kits comerciales de látex para 0157, 026, 091, 0103, 0111, 0128, 0145 y H7. Los ensayos
han de llevarse a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se deben incorporar organismos
control positivos y negativos y control del látex. Se debe llevar a cabo un análisis preliminar utilizando
pruebas de aglutinación en porta o tubo con antisuero anti–O LPS (existen disponibles antisueros para
181 antígenos–O). Se ha demostrado que el antisuero 0157 produce reacciones cruzadas con otros
organismos incluyendo E. hermanii (encontrado frecuentemente en alimentos), Salmonella O del grupo N,
Yersinia enterocolitica serotipo 09 y Citrobacter freundii, lo que indica la necesidad de confirmar colonias
sospechosas de VTEC como E. coli. Los aislamientos deben probarse para detectar la presencia de
antígeno flagelar (los antisueros se preparan contra antígenos–H 56), pero esto puede requerir un pase a
través de un medio para detectar la movilidad. Algunos patógenos no son móviles.
c)
Producción de verocitotoxina en ensayos de células Vero (16)
El ensayo de células Vero permanece como método normalizado para la confirmación de la producción de
VT (ver abajo). Las células Vero poseen una alta concentración de globotriaosilceramida (Gb3) y
globotetraosilceramida (Gb4) como receptores de unión de la toxina en su membrana plasmática y detectan
todas las variantes de VT. La prueba se puede utilizar con suspensiones fecales, filtrados de cultivo o
cultivos vivos. En cultivos fecales mezclados, la sensibilidad del ensayo aumenta tratando la suspensión
con polimixina B o mitomicina para liberar toxina asociada a la célula. Aunque esta prueba es sensible, no
está sin embargo disponible en todos los laboratorios de diagnóstico rutinario. Requiere un trabajo intenso y
los resultados pueden llevar 3–4 días después de inocular el cultivo celular. Donde no haya instalaciones
para cultivo de tejidos, para detectar la producción de VT, se pueden utilizar otros métodos, incluyendo
ELISA o aglutinación, y por PCR se pueden detectar los genes vt. Todos estos métodos están disponibles
como kits comerciales.
1214
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Capítulo 2.10.13. — Escherichia coli verocitotoxigénica
d)
Subtipificación de Escherichia coli 0157 para estudios epidemiológicos
Se dispone de una variedad de métodos en laboratorios de referencia que permiten discriminar entre cepas
de E. coli 0157:H7 para ayudar en las investigaciones epidemiológicas de brotes de enfermedad humana
(10,26). Estos métodos varían en su complejidad técnica y se requiere más de una técnica para
proporcionar una diferenciación útil. Las técnicas incluyen tipicación por fagos, pruebas de biotipificación y
sensibilidad antimicrobiana, perfil de plásmidos, análisis del polimorfismo de la longitud de fragmentos de
restricción, ribotipificación, electroforesis en gel de campo pulsante (EGCP) y varios análisis basados en la
PCR (amplificación aleatoria del ADN polimórfico; PCR del elemento de ADN repetitivo; análisis del
polimorfismo de la longitud del plásmido amplificado). De éstos, solamente la tipificación del fago y la EGCP
se usan ampliamente. A pesar de las dificultades en la interpretación de los perfiles, la EGCP se ha
impuesto como el método estándar utilizado por laboratorios de referencia de salud pública para subtipificar
VTEC 0157 debido a su alto nivel de discriminación, precisión y reproducibilidad. Se utiliza en "Pulsenet",
una red de laboratorios de salud pública que utilizan un método de EGCP estandarizado que permite la
comparación de huellas dactilares por una base de datos electrónicos en los Centros de Control de
Enfermedad y Prevención en los EE.UU. (www.cdc.gov/ncidod/dbmd/pulsenet/pulsenet.htm). El sistema
"Enter–net" de la Unión Europea para el seguimiento de Salmonella y VTEC descansa fundamentalmente
en la tipificación fágica para subtipificar las cepas de E. coli 0157:H7. Los métodos de subtipificación para
serotipos no 157 han sido menos explorados, aunque se pueden adoptar procedimientos similares a los
utilizados para VTEC 0157.
•
Técnicas sin cultivo para la detección de VTEC
Aunque el diagnóstico definitivo de VTEC depende del aislamiento y caracterización de cultivos puros, los
métodos de cultivo para VTEC son laboriosos y llevan mucho tiempo. Esto ha llevado al desarrollo de una serie
de pruebas inmunológicas y de hibridación de ácido nucleico para la identificación rápida de antígenos de O y H,
y de VT o genes asociados con la producción de VT en la muestra. Ya que las pruebas tienen un nivel de
detección por encima de las cantidades a las que el organismo está presente normalmente en las heces o en los
alimentos, se necesita una fasede enriquecimiento (preferiblemente no selectivo para el aislamiento de bacterias
dañadas o con alteras) para aumentar las cantidades antes de la prueba.
a)
Métodos inmunológicos
Se pueden utilizar inmunoensayos para identificar antígenos O y H, y se puede utilizar VT para confirmar la
identidad de los organismos una vez que se han aislado de muestras clínicas, alimenticias o ambientales,
mientras que otros como las tecnologías de membranas y varillas, ensayos de microplaca,
inmunotransferencia de colonias, inmunofluorescencia y ELISA, se utilizan como métodos rápidos para
detectar la presencia de patógenos potenciales en muestras antes de su aislamiento, acortando, por tanto,
el tiempo para un supuesto diagnóstico. La mayor parte de los ensayos para antígenos somáticos y
flagelares se diseñan para detectar LPS 0157 y el antígeno flagelar H7. Los ensayos con toxinas tienen la
ventaja de detectar todas las VTEC. Existen kits comerciales para enzimoinmunoensayos con 0157 y VT,
inmunoensayo visual para 0157 y pruebas de aglutinación para 0157, H7 y VT (4, 8, 21, 26). No todas se
han validado para utilización en heces. También hay reactivos especializados disponibles en los que
anticuerpos anti–0157 se conjugan con fluoresceína, peroxidasa o fosfatasa. De los enzimoinmunoensayos
el formato que se usa con más frecuencia es el ensayo en "sandwich". El anticuerpo está ligado a la
superficie de un portador para capturar un antígeno específico de VTEC; después de la adición del sustrato
apropiado, un segundo anticuerpo con un marcador enzimático se liga a este antígeno y produce una
reacción de color. Los kits se han validado con protocolos de pre–enriquecimiento específicos y reactivos
para asegurar resultados reproducibles. Algunos utilizan muestras tratadas con calor mejorando de esa
forma la seguridad de la prueba, y otros incorporan un sistema de procesamiento automático para analizar
grandes cantidades de muestras. Otros son ELISAs desarrollados para analizar colonias con el antígeno
0157. Los kits comerciales tienen la ventaja de que son fáciles de llevar a cabo en laboratorios rutinarios, y
las pruebas deben hacerse de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los kits validados para
muestras de alimentos y de canales o para muestras clínicas humanas pueden carecer de sensibilidad para
muestras de heces de animales. Los ensayos inmunológicos solo proporcionan resultados preliminares, que
pueden confirmarse por aislamiento y caracterización de los organismos que producen el antígeno 0157 o
la toxina.
b)
Métodos de reconocimiento con ácido nucleico
i)
Ensayos de hibridación en colonia
La hibridación en colonia es un medio útil para detectar VTEC en cultivo mixto para una
caracterización posterior. Están disponibles sondas de ADN y de oligonucleótido sintético marcadas
con digoxigenina o biotina y por tanto adecuadas para utilización en laboratorios de diagnóstico. Se
han descrito ensayos para detectar genes de VT, el plásmido de 60 MDa en E. coli 0157 y el gen eae,
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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individualmente y en combinación (21, 23, 26). Los ensayos de hibridación son menos sensibles para
detectar VTEC en cultivos líquidos o extractos fecales.
ii)
PCR para genes de VT y otros marcadores de virulencia
Se han descrito muchos PCR para la detección de VT1, VT2 y genes variantes de VT2 (21, 23, 26), y
se han comparado algunos de estos métodos de PCR tipificadores de la toxina (29). La presencia de
los genes asociados con la producción de VT no confirma la expresión del gen y por tanto la
producción de toxina. La PCR puede utilizarse sobre placas con cultivo puro o mixto, o en cultivos
líquidos, y extractos de alimentos o heces. También puede utilizarse para detectar genes en
organismos inviables. La PCR, además del papel que desarrolla en el diagnóstico, tiene el potencial
de ser utilizada para analizar muestras para VTEC en estudios epidemiológicos. La amplificación de
genes diana en extractos de ADN bacteriano de heces es menos efectiva que en cultivos puros, y se
requiere una preparación cuidadosa de la muestra para mejorar su sensibilidad. Las heces contienen
inhibidores inespecíficos de la PCR y no existe ningún método único ideal para eliminarlos. La
sensibilidad mejora mediante enriquecimiento no selectivo previo a la prueba, pero permanece menor
que mediante la utilización de IMS o el ensayo de citotoxicidad de células Vero. Hay ensayos
comerciales disponibles.
También se han desarrollado sondas de ADN y ensayos de PCR para detectar otros genes en VTEC
que se ha demostrado que están asociados con virulencia en humanos, incluyendo eae (que codifica
intimina), ehx (que codifica la producción de enterohemolisina), fliC (que codifica el antígeno H7), rfb
0157 (que codifica LPS 0157), uidA (el gen de la glucuronidasa mutante en E. coli 0157:H7 negativo a
la beta–glucuronidasa) y katP (un gen situado sobre un gran plásmido de E. coli 0157:H7 que codifica
una nueva catalasa peroxidasa) (21, 23, 26). Se ha desarrollado una variedad de ensayos múltiples
para detectar simultáneamente varios genes de diagnóstico. Estos ensayos son importantes en la
caracterización de cultivos puros. En poblaciones bacterianas mixtas de muestras de alimentos o
heces pueden ser útiles en la identificación de muestras para las que se deben diseñar procedimientos
de aislamiento.
•
Análisis de heces para la detección de Escherichia coli 0157:H7
Escherichia coli 0157:H7 es la VTEC más preocupante para la Salud pública. El hecho de que se aloje en el
tracto intestinal de animales sanos, particularmente ganado vacuno, representa una fuente de infección directa e
indirecta para humanos. El análisis se basa en técnicas de cultivo diseñadas para superar los problemas de
aislar pocos organismos, posiblemente en estado estresado, de una flora de fondo competente mediante la
identificación de colonias sospechosas y demostración de características de virulencia conocidas. Estos métodos
aún están en desarrollo y el siguiente es una descripción de los métodos empleados rutinariamente en un
laboratorio veterinario nacional. Se deben tomar las precauciones adecuadas para evitar la contaminación en
humanos (ver Capítulo I.1.6.).
a)
b)
Pre—enriquecimiento
i)
Transportar las heces en contenedores estériles, herméticos y cerrados a 4 °C y
ii)
ponerlas en cultivo tan pronto como sea posible, preferiblemente dentro de las 2 horas siguientes a la
recogida. Las heces que se van a almacenar durante más de 24 horas deben congelarse a –70 °C.
iii)
Mezclar las heces a una dilución de 1/10 en agua caliente tamponada con peptona (BPW) en
contenedor etiquetado.
iv)
Incubar a 37 °C ±2 °C durante 6 horas.
v)
Incluir cultivos control positivos y negativos.
Separación inmunomagnética
i)
El uso de Dynabeads®anti–E.coli 0157, producto 710.04 (Dynal Biotech, ASA, Oslo, Noruega), cumple
los requisitos de AFNOR (DYN 16/02–0696 y DIN 10167); se cita en el Manual Analítico Bacteriológico
de la Administración de Alimentos y Drogas de EE.UU. (www.cfsan.fda.gov/-ebam/bam-4a.html) y el
Compendio de Métodos Analíticos de la Salud de Canadá (www.hc-sc.gc.ca/food-aliment/mh-dm/mgedme/compendium/volume_3/e_mflp9001.html) y es el método oficial del Ministerio de Salud de Japón.
ii)
Siguiendo las instrucciones de los fabricantes, se lleva a cabo la separación inmunomagnética (IMS)
sobre las muestras preenriquecidas utilizando el método manual (MIMS) o automático (AIMS). Ha de
tenerse cuidado en mezclar bien las bolas antes de utilizarlas y evitar la contaminación cruzada entre
los tubos preparados. Si se utiliza el método manual, es esencial ceñirse a las instrucciones para lavar
con cuidado el complejo bola–bacteria.
iii)
Después del lavado final, usar una micropipeta para pasar 50 µl de cada suspensión de bolas–
bacterias a una placa de agar MacConkey etiquetada con sorbitol conteniendo cefixima y telurito
potásico (CT–SMAC) (28) teniendo cuidado de evitar la contaminación cruzada.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.13. — Escherichia coli verocitotoxigénica
iv)
c)
d)
e)
f)
Utilizando una torunda estéril, extender la gota sobre un tercio o la mitad de la placa para romper los
complejos. Utilizando un asa estéril de 1 µl, diluir más el complejo bola–bacteria sobre un cuadrante
extendiendo en ángulo recto desde el área previamente sin extender. Utilizando un segundo asa
estéril, extender en ángulo recto desde este cuadrante hasta el área final de la placa sin extender para
obtener colonias aisladas. Incubar a 37 °C ± 2 °C durante 16–18 horas (las colonias que fermentan
sorbitol pierden color tras este tiempo y pueden confundirse con E. coli 0157 que no fermenta sorbitol).
Un método alternativo para aislar colonias negativas a sorbitol es extender el inóculo completo sobre
la superficie de una placa de CT–SMAC seca con una varilla doblada estéril.
Identificación de colonias
i)
Picar hasta 10 colonias blancas negativas a sorbitol por placa y probar mediante aglutinación de látex
0157 siguiendo las instrucciones del fabricante (incluir los apropiados organismos control positivos y
negativos y control de látex)
ii)
Subcultivar colonias positivas para aglutinación sobre medio sólido sin antibióticos (por ejemplo
5% agar sangre de oveja). Extender para obtener colonias aisladas. Incubar a 37 °C ± 2 °C durante la
noche.
Confirmación de Escherichia coli
i)
Inocular caldo de o–nitrophenyl beta–D–galactopyranosido (ONPG). Establecer controles positivos y
negativos. Incubar durante la noche, aeróbicamente a 37 °C. Escherichia coli produce resultado
positivo indicado por un cambio a coloración amarilla, lo que confirma actividad beta–galactosidasa.
ii)
Colocar un círculo de papel de filtro de membrana de nitrato de celulosa de 0,45 µm sobre una placa
de agar con bilis y triptona, (TBA) utilizando forceps estériles. Utilizar un asa de 1 µl para retirar un asa
completa de crecimiento para prueba e inocular un área del tamaño de un guisante sobre la superficie
del filtro Milipore. Establecer controles positivos y negativos. Incubar a 44 °C durante al menos
17 horas. Transferir la membrana a papel de filtro empapado con reactivo para indol para la detectar la
utilización de triptófano. Escherichia coli muestra una reacción positiva indicada por una coloración
violeta/rosa.
iii)
Existe en el mercado un colorante para la detección de indol. El reactivo se coloca sobre papel de filtro
y una porción de la colonia se extiende sobre la mancha del reactivo. Esto requiere menos de
5 minutos y puede ser confirmada mediante la prueba descrita si las colonias sospechosas aparecen
negativas.
iv)
Alternativamente, utilizar tiras comerciales de pruebas bioquímicas disponibles para confirmar la
presencia de E. coli.
Determinación somática (24)
i)
Utilizando un asa estéril, se toma una sola colonia obtenida mediante el método de
identificación de colonias descrito en el punto (c) anterior y subcultivarla en 4 ml de caldo Schlecht.
Incubar a 37 °C ± 2 °C durante la noche.
ii)
Hervir el caldo Schlech durante un mínimo de 1 hora a 100 °C.
iii)
Poner 25 µl de solución salina al 0,85% en los pocillos 2 al 12 de una placa de microtitulación con
pocillos en U. Poner 50 µl de antisuero 0157 en el pocillo 1. Hacer una serie de diluciones dobles del
antisuero hasta 1/1024, descartando 25 µl después de mezclar bien. Añadir 50 µl de suspensión de
caldo hervida a los pocillos 1 al 12. Cubrir la placa para impedir la evaporación e incubar a 37 °C
durante 6 horas. Utilizar un fondo negro para identificar aglutinación en los pocillos.
Ensayo en células Vero
i)
Utilizando un asa estéril, se toma una colonia aislada obtenida mediante el método de identificación de
colonias descrito en el punto (c) anterior y subcultivar en 4 ml de caldo Mundell. Incubar a 37 °C ± 2 °C
durante la noche.
ii)
Hacer caldos con cepas control de organismos que no produzcan ninguna toxina, que produzcan
enterotoxina termolabil (LT), factor necrotizante citotóxico (CNF) y verocitotoxina (VT). Incubar a
37°C± 2 °C durante la noche.
iii)
Colocar células Vero (células de riñón de mono verde Africano, referencia ATCC CCL81, proporción
de siembra 2 x 105/ml) en placas de microprueba con pocillos de fondo liso, 200 µl para cada pocillo,
24 horas antes de la inoculación. Incubar a 37 °C ± 2 °C en 5% de CO2 durante 24 horas.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.13. — Escherichia coli verocitotoxigénica
iv)
Añadir 100 µl de una disolución de 400.000 unidades/ml de sulfato de polimixina B en agua destilada
estéril a cada cultivo líquido durante la noche. Incubar a 37 °C ± 2 °C durante 5 horas.
v)
Centrifugar los caldos a 3.000 rpm durante 30 minutos.
vi)
Retirar los sobrenadantes
aproximadamente).
vii)
Colocar la placa de células Vero sobre una hoja de trabajo numerada para identificar cada pocillo.
Inocular 10 µl de sobrenadante preparado en el pocillo relevante de las células Vero. Volver a poner
las células Vero en el incubador de CO2 e incubar durante 3 días.
a
contenedores
estériles
etiquetados
(se
necesitan
1,5
ml
viii) Examinar las células después de 24, 48 y 72 horas para observar cualquier efecto citopático.
Comparar con las pruebas control positivas y negativas. Con muestras positivas a VT, la capa celular
se desintegra y entre las 24 y 72 horas de observan ennegrecidas y arrugadas.
g)
PCR multiplex para VT1, VT2 y eae (1, 12, 25)
Se utiliza PCR multiplex para confirmar la presencia de determinantes de virulencia utilizando cebadores,
como se muestra a continuación:
Gen
objetivo
No.
de
Secuencia del cebador
Posición del
Tamaño del
nucleótido
amplicon (bp)
F (5’–CGC–TCT–GCA–ATA–GGT–ACT–CC–3’)
287–306
256
R
(5’–CGC–TGT–TGT–ACC–TGG–AAA–GG–
522–541
F (5’–TCC–ATG–ACA–ACG–GAC–AGC–AG–3’)
623–642
R (5’–GC–TTC–TGC–TGT–GAC–AGT–GAC–3’)
788–807
F
271–293
acceso
VT1
M19437
3’)
VT2
X07865
EaeA
X60439
(5’–GC–TTA–GTG–CTG–GTT–TAG–GAT–
185
618
TG–3’)
871–890
R (5’–CCA–GTG–AAC–TAC–CGT–CAA–AG–3’)
i)
Utilizando un asa estéril, coger una colonia aislada obtenida mediante el método de identificación de
colonias descrito en el punto (c) anterior y subcultivar en 1 ml de caldo Luria–Bertani. Establecer tres
caldos control adecuadas. Incubar a 37 °C ± 2 °C durante la noche.
ii)
Hervir los caldos durante 15 minutos a 100 °C. Retirarlos del baño de agua y dejar que se enfríen.
iii)
Preparar una mezcla maestra de 48 µl por muestra conteniendo:
1 x tampón Saiki (50 mM KCl; 10 mM Tris, pH 8,5; 100 µg/ml de gelatina); 3 mM de MgCl2; 0,5 U de
polimerasa Taq; 25 pmoles de cada cebador (cebadores directos e inversos para VT1, VT2 y eaeA);
0,2 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP.
iv)
Mezclar mediante inversión de los tubos y poner 48 µl en cada tubo de reacción de PCR.
v)
Añadir 2 µl de cultivo hervido (extracto crudo de ADN) al fondo de cada tubo de reacción (incluir tres
extractos control y un medio blanco).
vi)
Hacer un PCR utilizando parámetros cíclicos de desnaturalización inicial a 94 °C durante 2 minutos;
25 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 62 °C durante 1,5 minutos y 72 °C durante 2 minutos; con una
extensión final de 72 °C durante 5 minutos. La reacción se mantiene a 4 °C hasta que se necesite para
la electroforesis.
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vii)
Hacer electroforesis con 15 µl de cada muestra de PCR sobre un gel de agarosa al 1,5% en tampón E
(10x solución concentrada obtenida añadiendo a agua destilada en el siguiente orden: 109 g/litro de
Tris, 55,6 g/litro de ácido ortobórico, 9,3 g de EDTA, completada hasta 1 litro con agua destilada y
ajustada a pH 8,0 con 10 ml de ácido clorhídrico concentrado, diluida en agua destilada antes de
usarla). Correr como referencia un marcador de peso molecular de 10 bp para comparación.
viii) Teñir con bromuro de etidio y observar mediante transiluminación
ix)
2.
Inspeccionar los recorridos del control para identificar las posiciones de los amplicones VT1, VT2 y
eae. Comparar con las bandas presentes en los recorridos de las muestras problemas. Registrar los
resultados
Pruebas serológicas
En los humanos, el serodiagnóstico de VTEC puede ser útil, particularmente en fase tardía del curso de la
enfermedad cuando se hace cada vez más difícil aislar de las heces el organismo causante. El LPS ha resultado
ser el antígeno preferido, y se ha demostrado la producción de anticuerpos de suero al LPS de un amplio
espectro de serotipos prevalentes de VTEC. Las pruebas serológicas no se utilizan para el diagnóstico de
infección animal con VTEC. Sin embargo, se ha demostrado que la exposición del ganado a la infección por E.
coli 0157:H7 da como resultado la producción de anticuerpos contra el LPS 0157, que persiste durante meses,
demostrables por ELISA indirecto (14). Se han demostrado reacciones cruzadas entre LPS 0157 y los antígenos
de LPS de otras bacterias incluyendo E. coli 055, Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Brucella abortus y
cepas no–01 de V. cholerae. Para reducir la reactividad cruzada, se ha desarrollado un ELISA bloqueante
utilizando un anticuerpo monoclonal específico para E. coli 0157 con anticuerpo competidor para la detección de
anticuerpos de suero al antígeno 0157 en ganado vacuno (17). Se han demostrado anticuerpos de suero a VT1,
pero no a VT2, en ganado mediante pruebas de neutralización de toxina en ensayos con células Vero (14). Otros
estudios han mostrado una mayor prevalencia de anticuerpos neutralizantes de VT1 que de VT2 , en sueros de
ganado, lo que se puede explicar por la mayor prevalencia de VTEC productor de VT1 en ganado y/o la menor
inmunogenicidad de VT2.
C. REQUISTOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
No hay en la actualidad vacunas disponibles para control zoonósico de VTEC. Se están explorando varios
procedimientos para el control inmunológico de infecciones de EHEC en humanos (19). Éstos están dirigidos a
impedir la colonización, la enfermedad intestinal o las secuelas graves del síndrome de uremia hemolítica y
púrpura trombocitopénica trombótica. Incluyen el uso de vacunas conjugadas (por ejemplo el polisacárido
0157 ligado a la subunidad B de VT1 y VT2 como proteínas portadoras), vacunas de vector vivo, vacuna por
toxoide o inmunización pasiva con globulina hiperinmune o anticuerpos monoclonales contra VT. Sin embargo, si
existiera una vacuna efectiva disponible, serían polémicas las consecuencias políticas, sociales y económicas de
una vacunación extensiva de las personas contra patógenos existentes en sus alimentos. Como se cree que los
animales, fundamentalmente el ganado vacuno, son reservorios de infección de la población humana, una
estrategia nueva que se está investigando es vacunar ganado vacuno para reducir la colonización con VTEC
patogénica y reducir, por tanto, la contaminación de los alimentos y del ambiente (por ejemplo, hacer que los
alimentos sean más seguros como medida opuesta a proteger al consumidor). Una posibilidad es usar una cepa
viva colonizante negativa a la toxina como vacuna oral para inducir anticuerpos contra los componentes de
superficie, y otra es proporcionar factores de colonización, como la intimina, como vacuna vía digestiva a través
de plantas transgénicas (9).
REFERENCIAS
1.
BEEBAKHEE G., LOUIE M., DE AZAVEDO J. & BRUNTON J. (1992). Cloning and nucleotide sequence of the eae
gene homologue from enterohemorrhagic Escherichia coli serotype O157:H7. FEMS Microbiol. Lett., 91,
63–68.
2.
BETTELHEIM K.A. (2000). Role of non–O157 VTEC. J. Appl. Microbiol., 88, 38S–50S.
3.
BEUTIN L., GEIER D., STEINRUCK H., ZIMMERMANN S. & SCHEUTZ F. (1993). Prevalence and some properties of
verotoxin (Shiga–like toxin)–producing Escherichia coli in seven species of healthy domestic animals. J.
Clin. Microbiol., 31, 2483–2488.
4.
BOER E. DE & HEUVELINK A.E. (2001). Evaluation of methods for the detection and isolation of Escherichia
coli O157 from foods and faeces. Proceedings of European Union Concerted Action CT98–3935.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1219
Capítulo 2.10.13. — Escherichia coli verocitotoxigénica
Verocytotoxigenic E. coli in Europe. 1. Methods for Verocytotoxigenic E. coli. Duffy G., Garvey P., Coia J.,
Wasteson Y. & McDowell D.A., eds. Int. J. Food Microbiol., 66, 25–35.
5.
BLACKBURN C. DE W. & MCCARTHY J.D. (2000). Modifications to methods for the enumeration and detection of
injured Escherichia coli O157:H7 in foods. Int. J. Food Microbiol., 55, 285–290.
6.
CHAPMAN P.A. & CUDJOE K.S. (2001). Evaluation of BeadretrieverTM, an automated system for concentration
of Escherichia coli O157 from enrichment cultures by immunomagnetic separation. J. Rapid Methods
Automation Microbiol., 9, 203–214.
7.
CHAPMAN P.A., W RIGHT D.J. & SIDDONS C.A. (1994). A comparison of immunomagnetic separation and direct
culture for the isolation of verocytotoxin–producing Escherichia coli o157 from bovine faeces. J. Med.
Microbiol., 40, 424–427.
8.
CLIFTON–HADLEY F.A. (2000). Detection and diagnosis of Escherichia coli O157 and other verocytotoxigenic
E. coli in animal faeces. Rev. Med. Microbiol., 11, 47–58.
9.
GYLES C.L. (1998). Vaccines and Shiga toxin–producing Escherichia coli in animals. En: Escherichia coli
O157:H7 and Other Shiga Toxin–Producing E. coli Strains, Kaper J.B. & O’Brien A.D. eds. ASM Press,
Washington, D.C., USA, 434–444.
10. HOPKINS K.L. & HILTON A.C. (2000). Methods available for the sub–typing of Escherichia coli O157. World J.
Microbiol. Biotechnol., 16, 741–748.
11. HULL A.E., ACHESON D.W.K., ECHEVERRIA P., DONOHUE–ROLFE A. & KEUSCH G.T. (1993). Mitomycin
immunoblot colony assay for detection of shiga–like toxin–producing Escherichia coli in fecal samples:
comparison with DNA probes. J. Clin. Microbiol., 31, 1167–1172.
12. JACKSON M.P., NEILL R.J., O’BRIEN A.D., HOLMES R.K. & NEWLAND J.W. (1987). Nucleotide sequence analysis
and comparison of the structural genes for Shiga–like toxin I and Shiga–like toxin II encoded by
bacteriophages from Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett., 44, 109–114.
13. JOHNSON R.P., CLARKE R.C., WILSON J.B., READ S.C., RAHN K., RENWICK S.A., SANDHU K.A., ALVES D., KARMALI
M.A., LIOR H., MCEWEN S.A., SPIKA J.S. & GYLES C.L. (1996). Growing concerns and recent outbreaks
involving non–O157:H7 serotypes of verotoxigenic Escherichia coli. J. Food Protect., 59, 1112–1122.
14. JOHNSON R.P., CRAY W.C. & JOHNSON S.T. (1996). Serum antibody responses of cattle following experimental
infection with Escherichia coli O157:H7. Infect. Immun., 64, 1879–1883.
15. KARCH H. & BIELASZEWSKA M. (2001). Sorbitol–fermenting Shiga toxin–producing Escherichia coli O157:H–
strains: Epidemiology, phenotypic and molecular characteristics and microbiological diagnosis. J. Clin.
Microbiol., 39, 2043–2049.
16. KONOWALCHUK J., SPEIRS J.I. & STAVRIC S. (1977). Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli. Infect.
Immun., 18, 775–779.
17. LAEGREID W., HOFFMAN M., KEEN J., ELDER R. & KWANG J. (1998). Development of a blocking enzyme–linked
immunosorbent assay for detection of serum antibodies to O157 antigen of Escherichia coli. Clin. Diagn.
Lab. Immunol., 5, 242–246.
18. LAW D. (2000). Virulence factors of Escherichia coli O157 and other Shiga toxin–producing E. coli. J. Appl.
Microbiol., 88, 729–745.
19. LEVINE M.M. (1998). Immunoprophylaxis of Shiga toxin–producing Escherichia coli infection and disease:
strengths and weaknesses of various strategies. En: Escherichia coli O157:H7 and Other Shiga Toxin–
Producing E. coli Strains, Kaper J.B. & O’Brien A.D., eds. ASM Press, Washington, D.C. USA, 405–408.
20. MEYER–BROSETA S., BASTIAN S.N., ARNE P.D., CERF O. & SANAA M. (2001). Review of epidemiological surveys
on the prevalence of contamination of healthy cattle with Escherichia coli serogroup O157:H7. Int. J. Hyg.
Environ. Health, 203, 347–361.
21. NATARO J.P. & KAPER J.B. (1998). Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev., 11, 142–201.
1220
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.13. — Escherichia coli verocitotoxigénica
22. O’BRIEN A.D. & LAVECK G.D. (1983) Purification and characterization of a Shigella dysenteriae type 1–like
toxin produced by Escherichia coli. Infect. Immun., 40, 675–683.
23. PATON J.C. & PATON A.W. (1998). Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin–producing Escherichia coli
infections. Clin. Microbiol. Rev., 11, 450–479.
24. SOJKA W.J. (1965) Escherichia coli in domestic animals and poultry. Review Series No. 7 of the
Commonwealth Bureau of Animal Health. Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK.
25. STROCKBINE N.A., JACKSON M.P., SUNG L.M., HOLMES R.K. & O’BRIEN A.D. (1988). Cloning and sequencing of
the genes for Shiga toxin from Shigella dysenteriae type 1. J. Bacteriol., 170, 1116–1122.
26. STROCKBINE N.A., W ELLS J.G., BOPP C.A. & BARRETT T.J. (1998). Overview of detection and subtyping
methods. En: Escherichia coli O157:H7 and Other Shiga Toxin–Producing E. coli Strains, Kaper J.B. &
O’Brien A.D., eds. ASM Press, Washington, D.C., USA, 331–356.
27. VERNOZY–ROZAND C. (1997). Detection of Escherichia coli O157:H7 and other verocytotoxin–producing E.
coli (VTEC) in food. J. Appl. Microbiol., 82, 537–551.
28. ZADIK P.M., CHAPMAN P.A. & SIDDONS C.A. (1993). Use of tellurite for the selection of verocytotoxigenic
Escherichia coli O157. J. Med. Microbiol., 39, 155–158.
29. ZIEBELL K.A., READ S.C., JOHNSON R.P. & GYLES C.L. (2002). Evaluation of PCR and PCR–RFLP protocols for
identifying Shiga toxins. Res. Microbiol., 153, 289–300.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1221
CAPÍTULO 2.10.14.
LISTERIA MONOCYTOGENES
RESUMEN
La listeriosis es una de las enfermedades más importantes de transmisión por alimentos. Las
manifestaciones de la enfermedad en el hombre comprenden septicemia, meningitis (o
meningoencefalitis) y encefalitis, habitualmente precedidas de síntomas parecidos a los de la
gripe, incluida la fiebre. En mujeres gestantes, las infecciones intrauterinas o cervicales pueden
provocar abortos espontáneos o nacidos muertos. También se ha asociado Listeria
monocytogenes con manifestaciones gastrointestinales acompañadas de fiebre. Aunque la
morbilidad de la listeriosis es relativamente baja, la mortalidad de la enfermedad
sistémica/encefalítica puede ser muy alta, con valores cercanos al 30%. Los ancianos, las mujeres
gestantes, los recién nacidos y los individuos inmunodeprimidos se consideran de alto riesgo de
contraer la enfermedad.
Una amplia variedad de especies animales puede infectarse con L. monocytogenes, pero la
listeriosis clínica es esencialmente una enfermedad de rumiantes, con casos esporádicos y
ocasionales en otras especies. Las manifestaciones clínicas principales de la listeriosis animal son
encefalitis, septicemia y aborto, y la enfermedad es fundamentalmente de transmisión alimentaria.
Los hallazgos post-mortem y la histopatología dependen de la presentación clínica.
Se han identificado varios determinantes moleculares y celulares de la virulencia de este patógeno
intracelular y, aunque existen evidencias de polimorfismo entre las distintas especies de
L. monocytogenes respecto a algunos de estos determinantes de virulencia, dicha heterogeneidad
no se puede correlacionar con la capacidad o la incapacidad de este organismo para producir
enfermedad. Por tanto, todas las cepas de L. monocytogenes se consideran patógenas
potenciales.
Identificación del agente: se dispone de una variedad de métodos convencionales y rápidos
para la detección e identificación de L. monocytogenes en muestras de alimentos y en muestras
clínicas procedentes de animales con listeriosis. Los métodos convencionales siguen siendo el
“patrón de oro” con el que se comparan los restantes métodos. Habitualmente son muy sensibles.
Estos métodos utilizan agentes selectivos y procedimientos de enriquecimiento para reducir el
número de microorganismos contaminantes y permitir la multiplicación de L. monocytogenes.
Aunque no se necesite con fines reglamentarios, se dispone de diferentes niveles de tipificación
de las cepas de L. monocytogenes, entre los que se incluyen el serotipado, el fagotipado, la
electroforesis de enzimas multilocus, los patrones de digestión del ADN mediante enzimas de
restricción (mediante electroforesis convencional o electroforesis en gel de campo pulsado
[PFGE]), la tipificación basada en la secuencia de los ácidos nucleicos y la amplificación aleatoria
del ADN polimórfico (RAPD).
Pruebas serológicas: las pruebas serológicas no se han utilizado tradicionalmente para el
diagnóstico de la listeriosis. Se han probado varios formatos y todos han demostrado ser poco
fiables, carentes de sensibilidad y de especificidad. Los ensayos serológicos experimentales
basados en la detección de anti-listeriolisina O se han empleado en algunas investigaciones
epidemiológicas y como apoyo al diagnóstico de infecciones del sistema nervioso central con
resultado de cultivo negativo.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: se ha comprobado que es muy
difícil desarrollar vacunas efectivas contra L. monocytogenes que, al ser un organismo intracelular,
necesita la participación de los linfocitos T efectores para desencadenar una respuesta inmune
efectiva. Se han estudiado vacunas experimentales utilizando animales de laboratorio con el fin de
1222
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
conferir protección frente a la infección por L. monocytogenes mediante una serie de diferentes
aproximaciones, incluyendo la inmunización con ADN plasmídico, la señalización de los
CD40 junto con L.monocytogenes inactivada por calor, el empleo de mutantes deficientes en
listeriolisina O inoculados junto con listeriolisina O encapsulada en liposomas, y la inmunización
con antígenos de Listeria y IL-12.
A. INTRODUCCIÓN
Aunque Listeria monocytogenes se ha considerado durante muchos años un patógeno de animales, su papel
significativo como patógeno humano transmitido por alimentos sólo se hace evidente a partir de 1980, cuando
comienzan a aparecer en la literatura informes documentados de brotes de listeriosis, detectados por consumo
de alimentos contaminados (45). Hoy en día, L. monocytogenes se considera uno de los agentes más
importantes de enfermedades de transmisión alimentaria. Las explicaciones posibles de la emergencia de la
listeriosis humana transmitida por alimentos como un asunto del máximo interés de Salud Pública comprenden
los cambios importantes en la producción, procesamiento y distribución de los alimentos, la utilización cada vez
mayor de la refrigeración como medio de conservación primaria de los alimentos, los cambios en los hábitos de
comida de la población, particularmente respecto a la comodidad de los alimentos ya preparados y un
incremento del número de personas consideradas de alto riesgo de sufrir la enfermedad (ancianos, gestantes,
recién nacidos, inmunodeprimidos) (42, 49).
Una amplia variedad de especies animales puede infectarse por L. monocytogenes, entre las que se encuentran
mamíferos, aves, peces y crustáceos, aunque la mayoría de casos de listeriosis clínica tienen lugar en
rumiantes; los cerdos raras veces desarrollan la enfermedad y, generalmente, las aves son portadoras
subclínicas del microorganismo. La mayor parte de las infecciones en animales son subclínicas, pero la
listeriosis puede producirse esporádicamente o de forma epidémica. Además del impacto económico de la
listeriosis en animales, existe una conexión entre los animales y su papel como fuente de infección para el
hombre, bien sea como resultado del contacto directo con animales infectados, especialmente durante el parto
de vacas u ovejas, o bien después del consumo de productos de origen animal contaminados (54). Sin
embargo, la importancia relativa de la transmisión zoonótica de la enfermedad al hombre no está clara y
aparentemente es más relevante para la Salud Pública la contaminación a partir del ambiente en el que se
procesan los alimentos (41).
La manifestación primaria de la listeriosis en el hombre puede incluir la presencia de septicemia, meningitis (o
meningoencefalitis) y encefalitis, habitualmente precedida de síntomas parecidos a los de la gripe, incluida la
fiebre. También se presentan manifestaciones gastrointestinales acompañadas de fiebre. A pesar de que la
morbilidad de la listeriosis es relativamente baja, la mortalidad puede alcanzar valores de alrededor del 30%. En
embarazadas, la infección puede dar lugar a abortos, nacidos muertos o nacimientos prematuros (42, 47).
En los animales, las manifestaciones clínicas de la listeriosis incluyen encefalitis, septicemia y aborto,
especialmente en ovejas, cabras y vacas. La forma septicémica es relativamente poco común y por lo general,
pero no de manera invariable, se produce en el recién nacido. Se caracteriza por depresión, inapetencia, fiebre y
muerte. La forma encefalítica se denomina a veces “enfermedad en círculo” debido a la tendencia a dar vueltas
en una dirección, y es la manifestación más común de la enfermedad en los rumiantes. Los síntomas
comprenden depresión, anorexia, caída de la cabeza o torcimiento de la cabeza hacia un lado, parálisis facial
unilateral y queratoconjuntivitis bilateral. El aborto se produce, por lo general, en la última etapa (después de
7 meses en vacas y 12 semanas en ovejas) (26, 53). Normalmente sólo tiene lugar una forma clínica de
listeriosis en un grupo particular de animales. También se ha descrito la oftalmitis ovina (52). Asimismo, se
asocia la mastitis de rumiantes con la infección por L. monocytogenes. Cuando se produce listeriosis en cerdos,
la manifestación primaria es septicemia, son menos frecuentes los casos de encefalitis y raros los abortos.
Aunque las aves son portadoras subclínicas habituales, se han descrito casos esporádicos de listeriosis, siendo
más frecuente la septicemia y mucho menos común la aparición de meningoencefalitis. La listeriosis aviar puede
ser el resultado de una infección secundaria en condiciones de enfermedad vírica y salmonelosis (54).
Los hallazgos post mortem y la histopatología, en la listeriosis animal, dependen de la presentación clínica. En
la forma encefalítica, el fluido cerebroespinal puede estar turbio y los vasos meníngeos congestionados. Son
raras las lesiones patológicas globales del cerebro. En ocasiones, la médula muestra áreas de
reblandecimiento. Sin embargo, la enfermedad muestra una histopatología característica que consiste en focos
de células inflamatorias con manguito perivascular adyacente, predominando linfocitos e histiocitos, células
plasmáticas y ocasionalmente neutrófilos. Los microabscesos en el tronco cerebral son frecuentemente
unilaterales y pueden mostrar licuefacción del neurópilo. La mayoría de las veces están implicadas la médula y
la protuberancia. En la forma septicémica, pueden detectarse focos múltiples de necrosis en el hígado y, con
menor frecuencia, en el bazo. Los fetos abortados de los rumiantes muestran muy pocas lesiones globales, pero
puede producirse autolisis si el feto estuvo retenido antes de su expulsión (38, 53).
Las evidencias indican que la listeriosis animal es sobre todo una enfermedad de transmisión alimentaria,
siendo el medio ambiente la fuente principal de contaminación de los alimentos. El ensilado es la fuente más
frecuente de listeriosis transmitida por alimentos (22, 55). La mucosa intestinal es la vía de entrada principal,
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1223
Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
después de la ingestión oral, en el caso de una listeriosis septicémica/abortiva. El periodo de incubación puede
ser tan corto como de 1 día. Aunque la patogénesis de la listeriosis encefalítica está en controversia, parece que
los microorganismos pueden entrar en las terminaciones nerviosas a través de abrasiones de la mucosa bucal,
los labios, los orificios de la nariz, la conjuntiva o los dientes y, a continuación, migran centrípetamente hasta
causar una infección del sistema nervioso central. Una ruta alternativa de infección para esta forma de listeriosis
puede ser hematógena. El periodo de incubación de la forma encefalítica es normalmente de 2–3 semanas y el
curso de la enfermedad es corto; 1–4 días (41).
Listeria monocytogenes es un bacilo Gram-positivo responsable de la mayor parte de las infecciones por Listeria
que afectan al hombre, aunque se han publicado algunos casos raros de infección debidos a L. ivanovii y
L. seeligeri. En animales, L. monocytogenes es responsable de la mayoría de las infecciones, pero en ovejas el
10–15% de los casos de septicemia listérica se deben a L. ivanovii.
Aunque L. monocytogenes posee un potencial zoonótico evidente, también es un importante contaminante
medioambiental, de relevancia a nivel de salud pública.
Se dispone de una tipificación de cepas de L. monocytogenes establecida mediante una variedad de métodos y
con fines de investigación epidemiológica, pero aún no ha sido resuelta la cuestión de si todas las cepas de
L. monocytogenes son o no capaces de causar enfermedad (23, 33, 35, 36).
Se han identificado diversos determinantes moleculares de virulencia que juegan un papel en la infección celular
por L.. monocytogenes y el hecho de que todavía no sea conocido su mecanismo de acción, hace de
L. monocytogenes uno de los modelos más interesantes de interacción patógeno-hospedador, tanto a nivel
celular como molecular. Estos determinantes de virulencia comprenden, entre otros, las internalinas, la
listeriolisina O (LLO), la proteína Act A, dos fosfolipasas, una metaloproteasa y una hidrolasa de sales biliares
(16, 19). A pesar de que existe polimorfismo entre diferentes cepas de L. monocytogenes respecto a algunos de
estos determinantes de virulencia, este hecho no puede correlacionarse con la capacidad o la incapacidad del
organismo para producir enfermedad (33).
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
En la actualidad existen varios métodos convencionales y rápidos disponibles para la detección e identificación
de L. monocytogenes en muestras de alimentos y en muestras procedentes de listeriosis animal. Los métodos
bacteriológicos convencionales son importantes por varias razones: su empleo permite obtener el
microorganismo en cultivo puro, lo que será útil con propósitos reglamentarios. Siguen siendo el “patrón de oro”
frente a los cuales se comparan y validan otros métodos. Normalmente estos métodos son muy sensibles y no
requieren equipamiento sofisticado o caro. Algunas desventajas de este grupo de métodos incluyen el periodo
de tiempo relativamente largo que se necesita para finalizar los protocolos, la experiencia práctica que se
precisa en varias manipulaciones, la necesidad de productos químicos, reactivos y medios muy diferentes, la
posibilidad de que algunos microorganismos contaminantes enmascaren la presencia de las bacterias diana,
incluyendo una posible falta de detección de variantes atípicas del organismo diana y la subjetividad relativa que
supone la interpretación del crecimiento bacteriano en placas de agar con un medio selectivo y diferencial (1).
El aislamiento e identificación de L. monocytogenes a partir de alimentos, muestras medioambientales y
muestras clínicas procedentes de animales, requiere el uso de agentes selectivos y procedimientos de
enriquecimiento que mantengan los niveles de microorganismos contaminantes en valores razonables y
permitan la multiplicación de L. monocytogenes hasta niveles que sean suficientes para poder detectar este
microorganismo. Con este fin, en los primeros tiempos de la bacteriología clínica listeriana, se utilizaba
regularmente el enriquecimiento en frío (24), explotando la capacidad del microorganismo de multiplicarse a
temperaturas de refrigeración, mientras que las bacterias contaminantes no se desarrollarían bajo estas
condiciones. Sin embargo, dicho procedimiento necesita tiempos de incubación muy largos, a menudo meses,
por lo que resulta inadecuado para las investigaciones actuales de brotes de transmisión alimentaria y de casos
esporádicos, tanto como para la puesta en práctica de programas efectivos de análisis de riesgos y control de
puntos críticos (HACCP) en las plantas de procesamiento y producción de alimentos. Se han incorporado
compuestos selectivos en los medios de cultivo que permiten el crecimiento de L. monocytogenes a
temperaturas de incubación normales; de este modo se acorta el tiempo requerido para el desarrollo selectivo
del microorganismo. Ejemplos de estos compuestos selectivos son la cicloheximida, colistina,
cefotetan, fosfomicina, cloruro de litio, ácido nalidíxico, acriflavina, feniletanol, ceftazidima, polimixina B y
moxalactam (2, 3, 7, 27, 31, 51).
El diagnóstico bacteriológico de la listeriosis animal ha consistido tradicionalmente en la siembra directa de las
muestras en placa con medio de agar sangre o en otros medios de enriquecimiento y, en paralelo, el empleo de
la técnica de “enriquecimiento en frío”, con subcultivos semanales durante 12 semanas (24, 40, 53). La
introducción de procedimientos alternativos de enriquecimiento y agentes selectivos para el aislamiento de
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
L. monocytogenes a partir de alimentos y de muestras medioambientales ha abierto la posibilidad de utilizar
algunas de estas técnicas para el análisis bacteriológico de muestras procedentes de animales con listeriosis.
A pesar de los avances conseguidos en el aislamiento de L. monocytogenes a partir de alimentos, todavía existe
la posibilidad de mejorar en diversas áreas. Ningún procedimiento se puede considerar lo suficientemente
sensible para detectar L. monocytogenes a partir de todos los tipos de alimentos (17). Además, pueden
encontrarse células de L. monocytogenes en estado subletal en alimentos procesados debido a la refrigeración,
calentamiento, acidificación y otros tipos de tratamientos físicos o químicos. Estas bacterias en estado subletal
necesitan condiciones especiales de cultivo para reparar el daño, antes de poderse detectar en el cultivo.
a)
Métodos de cultivo
Los métodos convencionales para el aislamiento de L. monocytogenes a partir de alimentos que han
ganado aceptación con propósitos reglamentarios internacionales son el método de la Administración de
Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) (27), el método oficial de la Asociación Oficial de
Químicos Analistas (AOAC) (7), los Estándares ISO 11290 (31, 32), el método del Servicio de Inspección y
Seguridad Alimentaria (FSIS) del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y los
Estándares franceses (2, 3).
Dependiendo de la naturaleza de la muestra, un método particular puede ser más adecuado que otro. El
Comité Técnico de la Organización Internacional para la Estandarización ISO/TC 34, Subcomité SC
9, Microbiología, de Productos Agroalimentarios, afirma que el Estándar ISO 11290, partes 1 y 2 (31, 32)
puede utilizarse para la detección de L. monocytogenes en una gran variedad de alimentos y productos
alimenticios. Aunque reconocen que este estándar puede no ser el más apropiado en ciertos casos,
recomiendan que se lleve a cabo el máximo esfuerzo para aplicar este método, en lo posible.
Los métodos de la FDA y de la AOAC pueden utilizarse para el análisis de la leche y los productos lácteos.
El método del USDA-FSIS se recomienda para la carne roja y carne de ave (cruda o lista para comer),
huevos y derivados y muestras medioambientales.
El procedimiento tradicional de aislamiento de L. monocytogenes a partir de tejidos animales consiste en la
siembra directa de las muestras en placas con medio agar sangre de oveja u otro medio de cultivo rico y la
utilización en paralelo de la técnica de “enriquecimiento en frío”, con subcultivos semanales durante
12 semanas (24, 40, 53). El aislamiento mediante siembra directa en placa es relativamente fácil si el
microorganismo está presente en gran número en un lugar normalmente estéril, como sucede en el caso
de la forma septicémica de la enfermedad, pero el aislamiento es difícil, sin embargo, cuando el
microorganismo está presente en número reducido, como sucede en el caso de la forma encefálica o si las
muestras están fuertemente contaminadas con otros microorganismos. La comparación de la eficacia de la
siembra directa en placa, el enriquecimiento en frío y el método de la AOAC, ha establecido claramente la
superioridad de este último sobre los otros dos, para el aislamiento de L. monocytogenes a partir de una
amplia variedad de material procedente de la necropsia animal, tanto en términos de tiempo requerido para
el aislamiento e identificación del microorganismo como en tasas de aislamiento (20).
Para la enumeración de L. monocytogenes se aplica el Estándar ISO 11290, parte 2 (32) tanto como los
protocolos opcionales mencionados en los métodos de la FDA y del USDA-FSIS (27, 51).
i)
Aislamiento
Las muestras utilizadas en el análisis deben ser representativas del alimento, incluyendo la superficie
externa e interna. En el caso de la listeriosis animal, las muestras deberían escogerse de acuerdo a la
presentación clínica de la enfermedad: material procedente de lesiones del hígado, riñones y/o bazo, en el
caso de la forma septicémica; fluido espinal, protuberancia y médula, en el caso de la forma encefálica; y
placenta (cotiledones), contenido abomasal fetal y/o secreciones uterinas, en el caso de aborto. Se deben
emplear temperaturas de refrigeración (4°C) para la manipulación, conservación y transporte de muestras.
Si la muestra ya está congelada, se debería mantener congelada hasta su análisis.
Todos los medios de cultivo preparados tienen que someterse a un control de calidad y ser capaces de
mantener el crecimiento del microorganismo objeto de la prueba a partir de un inóculo pequeño. La cepa
de referencia debería cultivarse en paralelo a las muestras sospechosas para asegurar que las pruebas se
están realizando correctamente.
Estos métodos de cultivo convencional conllevan un procedimiento de enriquecimiento basado en la
utilización de medios de cultivo líquidos que contengan agentes selectivos. La naturaleza de los medios y
los agentes selectivos varían con el método. Los métodos de la FDA (27) e ISO incluyen una etapa de preenriquecimiento para tratar de recuperar las células de L. monocytogenes en estado subletal, mientras que
en los métodos del USDA-FSIS (51) y de la AOAC (7) las muestras se procesan directamente en caldo de
enriquecimiento. En el caso del método de la FDA, el pre-enriquecimiento se lleva a cabo a 30°C durante
4 horas en caldo tripticasa-soja con extracto de levadura (TSB YE) sin agentes selectivos. El protocolo ISO
emplea un “enriquecimiento primario” durante 24 horas a 30°C en presencia de agentes selectivos, pero a
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Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
la mitad de concentración (“caldo Fraser a la mitad”). Cuando se trabaja con muestras clínicas,
procedentes de listeriosis animal, la cantidad de tejido animal disponible para el análisis podría no ser
suficiente para utilizar la misma cantidad de inóculo que se recomienda para el enriquecimiento de las
muestras de alimento (25 g o ml). Si este es el caso, se emplea tanto material de muestra como sea
posible (inténtese 10–25 g ó ml) (20).
Las muestras se enriquecen durante 24–72 horas a 30°C, 35°C ó 37°C, dependiendo del método. El
método de la FDA emplea TSB YE con acriflavina, ácido nalidíxico y cicloheximida. El método del USDAFSIS utiliza dos etapas de enriquecimiento: el enriquecimiento “primario” se realiza en medio de la
Universidad de Vermont (UVM) y contiene ácido nalidíxico y acriflavina; el enriquecimiento “secundario” se
lleva a cabo en caldo Fraser con ácido nalidíxico, cloruro de litio y acriflavina. El estándar ISO indica el
caldo Fraser para el enriquecimiento “secundario” con agentes selectivos a la concentración normal,
mientras que el enriquecimiento “primario” se lleva a cabo en “caldo Fraser a la mitad”, como se indica
anteriormente. El método EOAC considera el enriquecimiento selectivo en caldo triptona de soja que
contenga acriflavina, ácido nalidíxico y cicloheximida (“medio de enriquecimiento selectivo”).
Después de el enriquecimiento selectivo, los cultivos se siembran en placas de agar con un medio
selectivo/diferencial para el aislamiento de las colonias presuntivas de L. monocytogenes. Todos los
métodos utilizan el agar de Oxford, a excepción del método del USDA-FSIS, que emplea una fórmula
modificada del agar de Oxford (MOX). El agar de Oxford contiene cloruro de litio, cicloheximida, colistina,
acriflavina, cefotetan y fosfomicina como agentes selectivos, y las colonias de Listeria spp. son pequeñas,
negras y rodeadas de un halo negro. Además del agar de Oxford, el método de la FDA incluye cloruro de
litio/feniletanol/moxalactam (LPM) o agar PALCAM y el estándar ISO incluye este último, que contiene
cloruro de litio, polimixina B, acriflavina y ceftazidima. El agar MOX, empleado en el método del USDAFSIS, contiene cloruro de litio, colistina y moxalactam.
ii)
Identificación
Las colonias típicas de Listeria spp., una vez crecidas en el medio selectivo/diferencial, se seleccionan
para su identificación a nivel de especie, utilizando una batería de pruebas. Estas pruebas comprenden la
reacción a la tinción de Gram, la catalasa, los ensayos de movilidad (en una muestra en fresco observada
por microscopía de contraste de fases y después de su inoculación en un medio de prueba de movilidad),
de hemólisis y de utilización de carbohidratos. Algunos protocolos emplean pruebas convencionales y no
convencionales disponibles comercialmente, p. ej., el Vitek, el API, el MICRO-ID, los kits de
enzimoinmunoensayo (ELISA) y los kits de ensayo de ácidos nucleicos que ayudan en la identificación de
L. monocytogenes.
La prueba Christie–Atkins–Munch–Peterson (CAMP) es una herramienta muy útil que facilita la
identificación de las especies de Listeria spp a partir de los aislamientos. Se emplea en los protocolos ISO
y de la AOAC y se considera opcional en los métodos de la FDA y del USDA-FSIS. La prueba es fácil de
realizar e interpretar. Consiste en sembrar en estría una cepa ß-hemolítica de Staphylococcus aureus
(ATCC cepa 49444 o 25923, NCTC cepa 7428 o 1803) y de Rhodococcus equi (ATCC cepa 6939, NCTC
cepa 1621) formando unas únicas líneas rectas y paralelas, en una placa de agar sangre de oveja o en
una placa por la técnica de la doble capa de agar, con la capa de agar sangre superior muy delgada. Las
estrías deben tener la suficiente separación para permitir que las cepas de Listeria de prueba y de control
se puedan sembrar perpendicularmente, entre los dos organismos indicadores, sin que los toquen
(separados 1–2 mm). Después de una incubación de 24–48 horas a 35–37°C (12–18 horas si se emplea la
doble capa de agar), se considera una reacción positiva la aparición de una zona destacada de ß-hemólisis
en la intersección de las cepas de prueba/control con las cepas indicadoras.
Cuadro 1. Diferenciación de especies de Listeria
Especie
Hemólisis
Producción de ácido
Prueba CAMP
Ramnosa
Xilosa
S. aureus
R. equi
+
+
–
+
–
L. innocua
–
V
–
–
–
L. ivanovii
+
–
+
–
+
L seeligeri
L. monocytogenes
(+)
–
+
(+)
–
L. welshimeri
–
V
+
–
–
L. grayi subsp. Grayi
–
–
–
–
–
L. grayi subsp. Murrayi
–
V
–
–
–
V: variable; (+): reacción débil; +: >90% reacciones positivas; –: sin reacción.
La serología, la tipificación lisogénica y el ensayo de patogenicidad en ratones inmunodeprimidos se
consideran opcionales en algunos de estos métodos.
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Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
b)
Métodos de identificación rápida
i)
MICRO-ID Listeria
El MICRO-ID Listeria es un sistema disponible comercialmente (Organon Teknika Corp., 100 Akzo Ave.,
Durham, NC 27712, EE.UU.) que ha sido validado por la AOAC (método 992.18) (4) para la identificación
presuntiva de las especies de Listeria aisladas a partir de muestras medioambientales y de alimentos.
Supone una alternativa a las pruebas bioquímicas convencionales de los aislados de Listeria spp.
mediante los métodos de la FDA y del USDA-FSIS. Se basa en el principio de que el inóculo de la prueba
contiene enzimas preformados que pueden detectarse después de 24 horas de incubación a 37°C. La
diferenciación de las especies de Listeria se basa en un derivado del código octal después de introducir
los valores numéricos de cada grupo de tres pruebas y en las reacciones obtenidas a partir de la prueba
CAMP y las características de hemólisis, que se ensayan por separado.
ii)
Sistema de identificación microbiana automatizada Vitek (Vitek Automicrobic System)
El Vitek Automicrobic System (bioMérieux Vitek, Inc., 595 Anglum Dr., Hazelwood, MO, EE.UU.) es un
sistema automatizado de identificación microbiana que puede emplearse para la identificación presuntiva
de las especies de Listeria de transmisión alimentaria y para la detección de aislados diferentes a Listeria.
La AOAC lo ha validado como método 992.19 (5). El sistema utiliza una cámara incubadora con un lector
óptico, una unidad de llenado/sellado para la inoculación del kit de la prueba y un ordenador. Cada tarjeta
de identificación de las bacterias Gram-positivas (GPI) y de las Gram-negativas (GNI+) contiene 30
pruebas bioquímicas. Los cambios se analizan mediante el ordenador, que asigna al microorganismo
problema un género y/o una especie. La identificación de las especies de Listeria requiere la utilización de
una tarjeta GPI y dos reacciones con la tarjeta GNI+. Sin embargo, para la identificación de algunas
listerias el análisis debe llevarse a cabo mediante la prueba CAMP, el ensayo de hemólisis y/o la prueba de
reducción de nitratos, como se describe en el método de la FDA.
Los microorganismos situados en la categoría “LM” se identifican como L. monocytogenes o L. innocua; en
la categoría “LI”, como L. ivanovii o L. seeligeri; en la categoría “LW”, como L. welshimeri; y en la categoría
“LG”, como L. grayi o L. murrayi (una subespecie de L. grayi). Los microorganismos de la categoría O se
clasifican como especies no-Listeria. Se deben realizar pruebas posteriores para identificar las especies
dentro de cada categoría de acuerdo con el método de la FDA.
Otros métodos disponibles comercialmente para la identificación de especies de Listeria incluyen el API
LISTERIA (bioMérieux), el MICROBACT 12L (Microgen), el Sistema MicroLog (Biolog.), el Sistema de
Identificación Microbiana Sherlock (MIS) (Microbial ID; basado en patrones de ácidos grasos) y el Sistema
Walk/Away (MicroScan).
iii)
Métodos inmunológicos de detección rápida
Se han desarrollado varios métodos inmunológicos para identificar L. monocytogenes en alimentos y los
siguientes métodos disponibles comercialmente están validados por uno o más sistemas oficiales de
validación (18, 46).
•
Enzimoinmunoensayo colorimétrico monoclonal (Listeria-Tek)
El Listeria-Tek es el método oficial 994.03 de la AOAC (8) y se ha diseñado para la detección de Listeria
spp. en productos lácteos, carnes y mariscos. Como en la prueba se utilizan anticuerpos monoclonales
(MAbs) pueden producirse reacciones cruzadas con otras Listeria spp., por tanto, la prueba no es
confirmatoria para L. monocytogenes.
El kit comercial se puede adquirir a partir de Organon Teknika Corp., 100 Akzo Ave, Durham, NC
27704, EE.UU.
Los cultivos de enriquecimiento que den positivo siguiendo este método se siembran por estría en medios
selectivos y las colonias sospechosas se identificarán mediante pruebas bioquímicas como
L. monocytogenes según el método de la FDA. Sólo será válido un resultado positivo, si los controles
negativo y positivo dan unas lecturas de absorbancia aceptables.
•
Método colorimétrico de detección mediante un enzimoinmunoensayo policlonal (TECRA® Listeria
Visual Immunoassay [TLVIA])
El TLVIA es el método oficial 995.22 de la AOAC (9) y se ha diseñado para la detección de Listeria spp. en
productos lácteos, mariscos, carne de ave y carnes (excepto carne cruda picada) y verduras de hoja.
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Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
El kit comercial está disponible a partir de TECRA International Pty Ltd, P.O. Box 788, Willoughby, NSW,
Australia.
Los cultivos de enriquecimiento que den positivo deben inocularse en medios selectivos y las colonias
sospechosas se identificarán de acuerdo a los criterios especificados en los métodos de la FDA y del
USDA.
•
Método Assurance® de enzimoinmunoensayo policlonal
El enzimoinmunoensayo Assurance® Listeria es el método oficial 996.14 de la AOAC (10) y puede
utilizarse para la detección de Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes, en productos lácteos, carnes
rojas, cerdo, productos avícolas, frutas, frutos secos, mariscos, pastas, verduras, quesos, piensos,
chocolate y huevos.
Las lecturas por encima del valor de corte se consideran presuntos positivos y a continuación los cultivos
enriquecidos se confirman mediante los procedimientos de cultivo e identificación que se describen en el
método de la FDA.
El kit comercial se puede adquirir a partir de BioControl Systems, Inc., 12822 SE 32nd St., Bellevue, WA
98005, EE.UU.
•
Ensayo visual de inmunoprecipitación (VIPTM)
TM
El ensayo VIP es el método oficial 997.03 de la AOAC (11). Puede utilizarse para la detección de
L. monocytogenes y otras Listeria spp. en productos lácteos, carnes rojas, cerdo, aves y productos
derivados, mariscos, frutas, verduras, frutos secos, pastas , chocolate, huevos y harina de huesos.
La prueba se lleva a cabo con un cultivo enriquecido de las muestras problema. Las pruebas con resultado
presunto positivo deben confirmarse mediante los procedimientos de cultivo e identificación que se
describen en el método de la FDA.
Las unidades VIP las comercializa BioControl Systems, Inc., 12822 SE 32
•
nd
St., Bellevue, WA 98005, USA.
Método de detección mediante ensayo VIDAS LIS
Este enzimoinmunoensayo fluorescente (ELFA) es el método oficial 999.06 de la AOAC (12). También ha
sido validado por la Asociación Francesa de Normalización (AFNOR) y por el Plan de Evaluación de los
Métodos Microbiológicos Europeos (EMMAS) (13). Se emplea para la detección de productos lácteos,
verduras, marisco, carnes crudas y de ave, así como para la detección de antígenos de Listeria spp. en
carnes procesadas y de ave.
Este inmunoensayo se realiza con un instrumento automatizado VIDAS®. El ordenador compara el valor
obtenido con un patrón y se genera un informe positivo o negativo. Los resultados positivos deben
confirmarse mediante métodos de cultivo estándar como se describe en el método de la FDA.
El sistema VIDAS lo comercializa bioMérieux, Inc., 595 Anglum Rd., Hazelwood, MO 63042, EE.UU.
Otros métodos inmunológicos disponibles comercialmente han conseguido la validación mediante sistemas
oficiales entre los que se encuentra el VIDAS Listeria monocytogenes (LMO) ELISA (bioMérieux), validado
por la AFNOR; el Transia Plate Listeria ELISA (Transia, Diffchamb Ltd), validado por la AFNOR; el
EIAFOSS Listeria automated ELISA (Foss Electric), validado por el Instituto de Investigación de la AOAC;
el método inmunocromatográfico REVEAL para Listeria (Neogen Corporation), validado por el Instituto de
Investigación de la AOAC; el método inmunocromatográfico Clearview Listeria Rapid Test (Oxoid), validado
por la AFNOR, el EMMAS y el Instituto de Investigación de la AOAC, y la prueba Listertest (Vicam) basada
en la separación inmunomagnética validada por el Instituto de Investigación de la AOAC (13).
Otros métodos inmunológicos disponibles comercialmente son el Transia Plate Listeria monocytogenes
ELISA (Transia, Diffchamb Ltd), la prueba con Dynabeads anti-Listeria (Dynal Ltd) basada en la separación
TM
inmunomagnética, el Listeria UniQue ELISA (TECRA), la prueba Microscreen Listeria de aglutinación en
latex (Microgen BioProducts Ltd),y el ensayo Listeria Rapid Test EIA (Oxoid).
iv)
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Métodos de reconocimiento de los ácidos nucleicos
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
Se han desarrollado varios métodos basados en el reconocimiento de los ácidos nucleicos para identificar
L. monocytogenes en alimentos. Algunos se han validado mediante uno o más sistemas oficiales de
validación y están disponibles comercialmente (39).
•
Ensayo GENE-TRAK para Listeria
El ensayo GENE-TRAK para Listeria es un método colorimétrico de hibridación del ADN para la detección
de las secuencias de Listeria, que ha sido validado por la AOAC como método 993.09 (6) para ser utilizado
con productos lácteos, carnes y mariscos. La AFNOR también ha validado este ensayo. Debido a que
existe la posibilidad de reacciones falso-positivas, las muestras positivas deben confirmarse mediante
métodos de cultivo estándar.
Las partes de la prueba que den resultado positivo en el ensayo de hibridación del ADN deben confirmarse
mediante la siembra por estría en placa de una suspensión microbiana en tampón fosfato salino
empleando un medio selectivo para Listeria, seguido de la identificación bioquímica de los aislados
presuntos Listeria, como se describe en el método de la FDA.
El ensayo GENE-TRAK para Listeria se puede adquirir a partir de GENE-TRAKTM Systems, 94 South
Street, Hopkinton, MA 01748, EE.UU.
•
Sistema BAX®
El USDA-FSIS ha adoptado el sistema BAX® basado en la PCR (Qualicon) (50) como su nuevo método de
detección de L. monocytogenes en muestras enriquecidas de carne roja y de ave. Este método consigue
reducir el tiempo del resultado de las muestras negativas verdaderas en 24 horas y reduce los resultados
falsos-positivos, con un límite de detección superior a 1 ufc/g en 25 g de muestra. A continuación todas las
muestras que se identifiquen como presunto-positivas para L. monocytogenes se deben confirmar
mediante cultivo según el método convencional.
•
Prueba GENE-TRAK para Listeria monocytogenes
TM
La prueba GENE-TRAK para L. monocytogenes (GENE-TRAK Systems) es un método basado en la
hibridación con una sonda que ha sido validado por la AFNOR (13).
•
Prueba confirmatoria Gen-Probe (AccuProbe®) para Listeria monocytogenes
La prueba Gen-Probe (AccuProbe®) Listeria monocytogenes Confirmatory Test (Gen-Probe) es otro
método basado en la hibridación con una sonda que ha sido validado por la AFNOR (13).
•
Método AD713
La FDA utiliza el método AD713 (25) para detectar L. monocytogenes que consiste en una combinación de
sondas: para el gen de la proteína asociada a la invasión y para el de la hemolisina (hly). Este método
combina la detección del gen de la hemolisina (también llamada listeriolisina O) de L. monocytogenes
utilizando el oligonucleótido sonda AD13 y la detección del gen de la proteína asociada a la invasión
mediante una sonda sintética, la AD07. Ambas sondas se utilizan en combinación (se denomina AD713)
para evitar los resultados falsos-negativos debidos a las mutaciones “silenciosas” en el gen (cambios de
nucleótidos que afectan a la capacidad de unión de la sonda al ADN pero no modifican la función del gen).
Las muestras positivas deben confirmarse mediante procedimientos convencionales como se describe en
el método de la FDA.
Otros métodos disponibles comercialmente y que están basados en el reconocimiento de los ácidos
nucleicos son el ensayo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Foodproof® Listeria
TM
monocytogenes (Biotecon Diagnostics) y el ensayo de la PCR PROBELIA (L. monocytogenes) (Sanofi
Diagnostics). Se ha desarrollado la aplicación de la PCR en tiempo real como método de detección
cuantitativo y específico para L. monocytogenes (28) demostrando tener un buen potencial para ser
utilizado en análisis de rutina. El Cuadro 2 recoge algunos de los sistemas comerciales rápidos para la
detección y la confirmación de Listeria.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
Cuadro 2. Algunos sistemas comerciales rápidos para la detección y la confirmación de Listeria1
Tiempo
aproximado
de la
prueba2
Compañía
Utilización
principal
Prueba
Nivel ID
Principio
MICRO-ID Listeria
L. monocytogenes/innocua
complejo
Reacción
enzimática
24 horas
Organon
Teknika
Confirmación
Vitek System
L. monocytogenes/innocua
complejo
Pruebas
bioquímicas
24 horas
bioMérieux
Confirmación
API Listeria
L. monocytogenes
Pruebas
bioquímicas
24 horas
bioMérieux
Confirmación
MicroLog System
L. monocytogenes
Uso de sustratos
como fuente de
carbono
4 o 24 horas
Biolog
Confirmación
MICROBACT 12L
L. monocytogenes
Utilización de
carbohidratos y
prueba de
microhemólisis
4–6 o
24 horas
Microgen
Confirmación
Sherlock Microbial
Identification
System (MIS)
L. monocytogenes/innocua
complejo
Patrones de ácidos
grasos
90 minutos
Microbial ID
Confirmación
Gen-Probe
(AccuProbe)
L. monocytogenes
Hibridación de
ácidos nucleicos
con sondas
30 minutos
Gen Probe
Confirmación
Microscreen
Listeria spp.
Aglutinación con
latex
1 minuto
Microgen
BioProducts
Confirmación
Listeria Tek
Listeria spp.
ELISA
50 horas
Organon
Teknika
Detección
TECRA Listeria
Visual
Immunoassay
(TLVIA)
Listeria spp.
ELISA
50 horas
TECRA
Detección
Assurance Listeria
EIA
Listeria spp.
ELISA
50 horas
BioControl
Systems
Detección
VIP Listeria
Listeria spp.
Inmunocromatografía
2 minutos
(después del
enriquecimiento)
BioControl
Systems
Detección
VIDAS Listeria (LIS)
Listeria spp.
ELISA
50 horas
bioMérieux
Detección
VIDAS Listeria
monocytogenes
(LMO)
L. monocytogenes
ELISA
50 horas
bioMérieux
Detección
Foodproof Listeria
monocytogenes
L. monocytogenes
PCR
48 horas
Biotecon
Diagnostics
Detección
Transia Plate
Listeria
Listeria spp.
ELISA
50 horas
Diffchamb
Detección
Transia Plate
Listeria
monocytogenes
L. monocytogenes
ELISA
50 horas
Diffchamb
Detección
Dynabeads antiListeria
Listeria spp.
Separación
inmunomagnética
48–72 horas
Dynal
Detección
EIAFOSS Listeria
Listeria spp.
ELISA
automatizado
48 horas
Foss Electric
Detección
1: Adaptado y extendido a partir de la ref. 13
2: Cuando se emplea para confirmación, la duración indicada de la prueba incluye el tiempo de enriquecimiento y
aislamiento en placas de agar
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
Cuadro 2 cont. Algunos sistemas comerciales rápidos para la detección y la confirmación de Listeria1
Tiempo
aproximado
de la
prueba2
Compañía
Utilización
principal
Hibridación de
ácidos nucleicos
con sondas
50 horas
Gene Trak
Detección
L. monocytogenes
Hibridación de
ácidos nucleicos
con sondas
50 horas
Gene Trak
Detección
REVEAL for Listeria
Listeria spp.
Inmunocromatografía
43 horas
Neogen
Detección
Clearview Listeria
(Oxoid Listeria
Rapid Test)
Listeria spp.
Immunocromatografía
43 horas
Oxoid
Detección
BAX for screening L.
monocytogenes
L. monocytogenes
PCR
48 horas
Qualicon
Detección
BAX for screening
Listeria Genus
Listeria spp.
PCR
48 horas
Qualicon
Detección
PROBELIA
L. monocytogenes
PCR
48 horas
Sanofi
Diagnostics
Pasteur
Detección
Listeria UniQue
Listeria spp.
ELISA
32 horas
TECRA
Detección
Listertest
Listeria spp.
Separación
inmunomagnética
24–48 horas
Vicam
Detección
SwabCheck System
Listeria spp.
ELISA
24 horas
Biopath
Detección
Prueba
Nivel ID
Principio
Gene Trak Listeria
Assay
Listeria spp.
Gene Trak test for L.
monocytogenes
1: Adaptado y extendido a partir de la ref. 13
2: Cuando se emplea para confirmación, la duración indicada de la prueba incluye el tiempo de enriquecimiento y
aislamiento en placas de agar.
v)
Tipificación
La identificación reglamentaria de L. monocytogenes no exige ninguna tipificación específica de los
aislados. Sin embargo, los esquemas de tipificación pueden ser de utilidad en las investigaciones
epidemiológicas, en el seguimiento de los casos medioambientales y en la vigilancia de los casos de salud
pública.
Listeria monocytogenes puede tipificarse mediante diferentes aproximaciones incluyendo el serotipado, el
fagotipado, la electroforesis de enzimas multilocus (MEE), el análisis del ADN mediante enzimas de
restricción (empleando enzimas con alta frecuencia de corte y electroforesis en gel convencional o
utilizando enzimas con baja frecuencia de corte y electroforesis en gel de campo pulsado [PFGE] para
separar los fragmentos), tipificación basada en la secuencia de los ácidos nucleicos y la amplificación
aleatoria del ADN polimórfico (RAPD).
Se recomienda que la tipificación de los aislados de L. monocytogenes se remita al centro de referencia
apropiado debido a la necesidad de reactivos específicos, de procedimientos que aseguren una calidad
rigurosa y de algún equipamiento sofisticado. Se puede encontrar una lista de centros internacionales y
métodos de tipificación en la ref. 14 (pp. 258–259).
•
Serotipado
Las cepas de Listeria pueden asignarse a 13 serotipos diferentes, basándose en su combinación de
antígenos somático (O) y flagelar (H). Aunque todas ellas se consideran patógenos potenciales, la mayoría
(>95%) de los aislados clínicos humanos, pertenecen a tres serotipos: 1/2a, 1/2b, y 4b. Comparado con
otros métodos de tipificación, el serotipado presenta un poder de discriminación bajo, pero puede
proporcionar una información valiosa para facilitar el descarte de aislados que no forman parte del brote.
Frecuentemente, los aislados procedentes de alimentos o de fuentes medioambientales no son tipificables
con los antisueros de tipificación estándar.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1231
Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
•
Fagotipado
La tipificación por bacteriófagos es una técnica con un buen poder de discriminación y que puede utilizarse
para tipificar un gran número de aislados. Sin embargo, las colecciones de fagos disponibles en la
actualidad no pueden tipificar una proporción alta de cepas (20–51% en el caso de la colección
internacional de tipificación de fagos). Debido a los requisitos rigurosos de estandarización y a la
naturaleza biológica de los reactivos, esta técnica se practica sólo en laboratorios especializados de
referencia nacionales e internacionales y está sujeta a una considerable variabilidad experimental y
biológica. A pesar de estos problemas, la tipificación con fagos sigue siendo el método más práctico y
adecuado de aplicación en casos de brotes agudos y extensos (23).
•
Electroforesis de enzimas multilocus
Esta técnica se basa en las diferencias en la secuencia de nucleótidos que provocan distintas movilidades
electroforéticas de ciertos enzimas metabólicos seleccionados en geles de almidón y puede emplearse en
la tipificación de cepas bacterianas relacionadas. Sin embargo, la MEE sólo es moderadamente
discriminatoria cuando se utiliza en investigaciones epidemiológicas que involucran a L. monocytogenes.
Algunas cepas pueden carecer de ciertas actividades enzimáticas y, por tanto, la técnica puede resultar
complicada. Debido precisamente a su naturaleza, los resultados procedentes de diferentes laboratorios
son muy variables (23).
•
Análisis del ADN cromosómico mediante endonucleasas de restricción
El análisis del ADN cromosómico mediante endonucleasas de restricción (REA) es un método útil de
tipificación de L. monocytogenes. Como estas enzimas son muy específicas en el reconocimiento de las
secuencias de nucleótidos, los fragmentos resultantes de la digestión del ADN, de tamaños y movilidad
electroforética diferentes, reflejan las diferencias genómicas, lo que resulta en unas “huellas dactilares”
específicas para cada una de las distintas cepas relacionadas. El método presenta un grado alto de
reproducibilidad debido a la especificidad de las endonucleasas de restricción. De las endonucleasas de
restricción probadas con L. monocytogenes en un estudio multicentro de la Organización Mundial de la
Salud (WHO), las más utilizadas fueron HaeIII, HhaI y CfoI (23). Sin embargo, debido al número elevado
de sitios potenciales de reconocimiento enzimático en el genoma bacteriano, a veces las huellas dactilares
complejas se desarrollan con baja resolución o con solapamiento de las bandas, lo que dificulta su
interpretación. La técnica no es adecuada, por tanto, para comparar un gran número de patrones de cepas
o para elaborar bases de datos dinámicas (23).
Cuando se combina el REA con un análisis de hibridación de tipo Southern, que emplee sondas
cromosómicas marcadas, sólo se detectarán los fragmentos de restricción específicos asociados con los
loci cromosómicos correspondientes, por lo que se analizará un número significativamente reducido de
fragmentos de ADN. Esta técnica se conoce como análisis del polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP). Cuando se utilizan sondas de ADN correspondientes a los RNA
ribosómicos, se detectan únicamente los fragmentos de restricción concretos asociados con los loci
cromosómicos de los ARNr. Esta técnica se denomina ribotipado y se utiliza ampliamente en la tipificación
de L. monocytogenes, principalmente con la endonucleasa de restricción EcoRI. Sin embargo, esta técnica
tiene un poder de discriminación menor que el fagotipado, el REA o la MEE. La compañía Qualicon ha
diseñado un sistema de ribotipado automático, el RiboPrinter, que genera, analiza y almacena los patrones
de huellas de ribotipado de diversas bacterias, incluida Listeria.
Si se emplean endonucleasas de restricción con baja frecuencia de corte para digerir ADN cromosómico
íntegro, tales como los enzimas ApaI, SmaI, NotI o AscI, se obtienen fragmentos muy grandes. A causa de
su tamaño, estos fragmentos grandes no se pueden separar cuando se someten a una electroforesis
convencional en gel de agarosa. Sin embargo, aplicando cambios periódicos de la orientación del campo
eléctrico a lo largo del gel, a través de pulsos, los fragmentos grandes pueden “avanzar lentamente“ en la
matriz de agarosa y separarse de acuerdo a sus diferencias de tamaño. Esta técnica se conoce como
electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y ha revolucionado la separación precisa de los fragmentos
de ADN de tamaño superior a 40 kilobases. La PFGE se aplica en la tipificación de L. monocytogenes y se
ha visto que es un método muy reproducible y discriminatorio. Particularmente, la PFGE es útil para la
tipificación de los aislados del serotipo 4b, los cuales no se tipifican de forma satisfactoria mediante la
mayor parte de los métodos de tipificación disponibles. Las principales desventajas de la PFGE son el
tiempo de duración del procedimiento (2–3 días) y el gasto de grandes cantidades de enzimas de
restricción que son caras, al igual que el equipamiento especializado necesario para llevarlo a cabo (23). El
Centro para la Prevención y Control de Enfermedades (CDC) de los EE.UU. ha establecido la PulseNet,
una red informática de laboratorios reguladores de alimentos y de salud pública que tipifica de manera
rutinaria mediante PFGE las bacterias patógenas de transmisión alimentaria. Los laboratorios de la
PulseNet emplean protocolos estandarizados rigurosos que pueden comparar rápidamente los patrones
obtenidos por PFGE procedentes de lugares diferentes, vía Internet. Listeria monocytogenes se incorporó
a la red PulseNet en 1999 (49).
1232
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
•
Tipificación basada en la secuencia de los ácidos nucleicos
Aunque se han publicado trabajos acerca del análisis de la secuencia de genes únicos como medio para
tipificar las cepas de L. monocytogenes, la determinación de la variación alélica de genes múltiples se
presenta como una metodología de tipificación muy prometedora para este microorganismo. Este enfoque
se ha descrito para un grupo reducido de otros microorganismos y se conoce como tipificación basada en
la secuencia multi locus (MLST) (48). Se han utilizado con un buen grado de discriminación entre las cepas
analizadas la amplificación directa y la secuenciación de nucleótidos (15, 44) así como una aproximación
alternativa que apunta a los cambios genéticos variables directamente en un formato de micromatriz de
ADN (43). Debido a que la MLST se basa en la secuencia de nucleótidos, es muy discriminatorio y
proporciona resultados precisos.
Los elementos de secuencia corta repetitiva están ampliamente distribuidos entre las bacterias y las
unidades palindrómicas, conocidas como palíndromes extragénicos repetitivos (REP), constituyen la familia
mejor caracterizada de secuencias bacterianas repetitivas. Los elementos REP están presentes en
L. monocytogenes y se ha utilizado con éxito una PCR basada en la secuencia de estos elementos (repPCR) para tipificar cepas de dicho microorganismo. Los cuatro principales grupos de cepas identificados
por este método coincidieron con el origen de su aislamiento (34).
•
Amplificación aleatoria del ADN polimórfico
Cuando en la PCR se emplean cebadores seleccionados de forma arbitraria bajo condiciones de baja
estringencia, con ADN cromosómico de L. monocytogenes como molde, los perfiles de los productos de la
amplificación generados son útiles para la tipificación de las cepas. La RAPD es una alternativa viable al
fagotipado y presenta un grado elevado de discriminación. Sin embargo, a pesar de su simplicidad relativa
y su capacidad discriminatoria, su desventaja principal es la reproducibilidad irregular de los perfiles. Las
condiciones de baja estringencia para templar los cebadores provoca una polimerización con eficiencias
diversas y, por tanto, las cantidades de ADN producidas pueden variar ampliamente entre los diferentes
productos de la amplificación procedentes de un aislado concreto, lo que dificulta la comparación e
interpretación de los perfiles de la RAPD. La técnica requiere un gran acuerdo de estandarización y
regularidad para obtener resultados fiables (23).
Basándose en los resultados del estudio multicentro de tipificación de L. monocytogenes de la WHO (21),
que compara diversos métodos de tipificación diferentes mediante la utilización de una colección bien
definida de aislados, se seleccionaron para la estandarización en Fase II, el serotipado, el fagotipado, el
REA, la PFGE y la RAPD. Finalmente este esfuerzo debería resultar en una colección seleccionada de
métodos estandarizados de tipificación de L. monocytogenes (23).
2.
Pruebas serológicas
Tradicionalmente las pruebas serológicas no se han utilizado para diagnosticar la listeriosis. Han sido poco
fiables, carentes de sensibilidad y de especificidad. Se han intentado sin éxito varios formatos, incluyendo la
técnica ELISA, la fijación del complemento y la microaglutinación, en el diagnóstico de casos de listeriosis
humana demostrada en cultivo, incluso en ausencia de inmunosupresión. Se ha observado una considerable
reacción cruzada con determinantes antigénicos de otros organismos Gram-positivos. Por otra parte,
L. monocytogenes es un microorganismo ubicuo y es muy común la exposición habitual de los animales y del
hombre a este microorganismo. Muchos individuos sanos son portadores intestinales (2–6%) y en el hombre se
ha descrito la prevalencia de anticuerpos séricos anti-L. monocytogenes en un nivel tan alto como del 53%. El
nivel de portadores en los animales es similar al de humanos, con algunas diferencias dependiendo de la
especie y una tasa algo mayor durante la estación de estabulación en comparación con la de pastoreo de los
animales (29,30).
El descubrimiento reciente de que la hemolisina de L. monocytogenes, la listeriolisina O (LLO), es el principal
factor de virulencia y que puede estimular una respuesta de anticuerpos, ha hecho reanudar el interés acerca de
la posibilidad de utilizar las pruebas serológicas para el diagnóstico de la listeriosis, en particular en los
pacientes afectados en el sistema nervioso central, con líquido cerebro espinal y sangre estériles, y en los casos
de listeriosis perinatal. En el diagnóstico de la listeriosis experimental de ovejas se aplica un ELISA indirecto
basado en la detección de los anticuerpos anti-LLO (37). Sin embargo, la LLO está relacionada antigénicamente
con varias citolisinas, entre ellas la estreptolisina O (SLO) de Streptococcus pyogenes, la pneumolisina de
S. pneumoniae y la perfringolisina de Clostridium perfringens. Los problemas de reactividad cruzada de los
anticuerpos anti-LLO con las citolisinas, particularmente con la SLO y la neumolisina, han obstaculizado el
desarrollo de pruebas serológicas específicas y fiables basadas en la detección de anticuerpos anti-LLO.
Además, los anticuerpos anti-LLO se encuentran en una proporción de individuos sanos y pacientes con
infecciones producidas por otras bacterias, hongos o virus (27%, en conjunto), aunque con títulos inferiores a los
presentados por pacientes con listeriosis. La absorción de los antisueros que se van a diagnosticar con la SLO
es sólo parcialmente efectiva para eliminar la reactividad cruzada completa. Estos ensayos experimentales se
han utilizado en algunas investigaciones epidemiológicas y como apoyo al diagnóstico de infecciones del
sistema nervioso central con resultado negativo en cultivo. Las formas recombinantes de la LLO se han probado
como alternativas a la LLO de tipo silvestre como antígeno de diagnóstico en ensayos de
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1233
Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
inmunoelectrotransferencia. Actualmente éste es un campo en evolución y todavía tendremos que esperar para
conseguir el desarrollo de pruebas serológicas validadas y fiables para el diagnóstico de la listeriosis.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Se ha comprobado que es muy difícil desarrollar vacunas efectivas contra L. monocytogenes que, al ser un
microorganismo intracelular, necesita de la participación de los linfocitos T efectores para desencadenar una
respuesta inmune efectiva. Se han estudiado vacunas experimentales utilizando animales de laboratorio con el
fin de conferir protección frente a la infección por L. monocytogenes mediante una serie de diferentes
aproximaciones, pero éstas todavía se encuentran lejos de estar disponibles para ser utilizadas en el hombre o
en los animales domésticos. Estos enfoques experimentales comprenden la inmunización con ADN plasmídico,
la señalización de los CD40 junto con L. monocytogenes inactivada por calor, el empleo de mutantes deficientes
en LLO inoculados junto con LLO encapsulada en liposomas, y la inmunización con antígenos listeriales e IL-12.
La modificación genética de L. monocytogenes se está considerando como un vector efectivo vacunal para la
expresión, secreción y transporte intracelular de antígenos extraños para inducir respuestas inmunes potentes
frente a antígenos víricos y células tumorales.
Sin embargo, el medio más práctico y factible de reducir el riesgo de listeriosis en humanos es a través de
medidas dietéticas y de preparación de alimentos que no sólo reducen el riesgo de adquirir listeriosis, sino que
también contribuyen a la prevención de otras infecciones comunes transmitidas por alimentos tales como las
causadas por Escherichia coli O157:H7, Salmonella y Campylobacter. Estas medidas preventivas comprenden
la cocción completa de los alimentos crudos de origen animal, el mantenimiento de las carnes no cocinadas
alejadas de las verduras, alimentos cocinados y alimentos preparados, el lavado a fondo de verduras frescas
antes de comerlas, el lavado de manos, cuchillos y tablas de corte después de el manejo de alimentos no
cocinados y evitar leche no pasteurizada o sus productos derivados. Las personas inmunodeprimidas, mujeres
gestantes y otros grupos de alto riesgo de contraer la listeriosis deberían evitar los alimentos que se han
asociado epidemiológicamente a esta enfermedad, p. ej. quesos frescos y paté. Estos individuos deberían evitar
también otros alimentos ya preparados a menos que sean calentados hasta ebullición antes de ser consumidos.
La industria alimentaria y las agencias de salud pública desempeñan un papel crucial en la prevención de la
listeriosis transmitida por alimentos mediante el desarrollo y puesta en práctica de programas efectivos HACCP
para reducir la presencia de L. monocytogenes en todos los puntos críticos durante la producción de alimentos y
en la cadena de distribución (desde la granja al mercado).
Igualmente, la falta de vacunas bien diseñadas y probadas para uso en animales, significa que el control de la
listeriosis en animales es más factible evitando las condiciones medioambientales que favorezcan su
presentación. Existe un nexo bien establecido entre la alimentación con ensilado y la listeriosis y, como
L. monocytogenes se encuentra distribuida ampliamente en la naturaleza, actuando como portadores los
animales y las aves, es inevitable la contaminación del ensilado y de los alimentos. Por tanto, se tendría que
reducir la probabilidad de multiplicación del microorganismo, lo que sucede con más frecuencia a valores de pH
mayores a 5, en particular en los casos en los que se produce una fermentación ineficaz o hay un desarrollo
concomitante de mohos. Habría que intentar que la producción del ensilado resultara de buena calidad, con un
corte temprano de la hierba y con la contaminación mínima de tierra o heces. Debería seleccionarse el mejor
ensilado para la alimentación, especialmente en el caso de las ovejas, evitando obviamente el material
enmohecido y que proceda de las pocas pulgadas superficiales del manojo. Se tendrían que eliminar las sobras
del ensilado (38).
REFERENCIAS
1.
ANDREWS W. (2002). Current State of Conventional Microbiological Methodology for the Examination of
Food. En: Workshop 102–15. Microorganisms in Foods: Now What? American Society for Microbiology,
Washington, DC, EE.UU.
2.
AFNOR1 (1997). Norme Française NF V 08-055. Microbiologie des aliments. Recherche de Listeria
monocytogenes. Méthode de Routine. Paris, Francia.
3.
ASSOCIATION FRANÇAISE DE NORMALISATION (AFNOR) (2000). Normalisation Française XP V 08-062.
Microbiologie des aliments. Méthode de dénombrement de Listeria monocytogenes. Méthode de Routine.
Paris, Francia.
1
AFNOR: Asociación Francesa de Normalización
1234
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
4.
AOAC2 OFFICIAL METHOD 992.18. (2000). Listeria species. Biochemical Identification Method (MICRO-ID
Listeria). En: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, Volumen I, Agricultural Chemicals;
Contaminants; Drugs, Horwitz W., ed. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, EE.UU., 141–144.
5.
AOAC OFFICIAL METHOD 992.19. (2000). Listeria species. Biochemical Identification Method (Vitek GPI and
GNI+). Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. En: Official Methods of Analysis of AOAC
INTERNATIONAL, Volumen I, Agricultural Chemicals; Contaminants; Drugs, Horwitz W., ed. AOAC
INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, EE.UU., 144–147.
6.
AOAC OFFICIAL METHOD 993.09. (2000). Listeria in Dairy Products, Seafoods, and Meats. Colorimetric
Deoxyribonucleic Acid Hybridization Method (GENE-TRAK Listeria Assay). Official Methods of Analysis of
AOAC INTERNATIONAL. En: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, Volumen I,
Agricultural Chemicals; Contaminants; Drugs, Horwitz W., ed. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD,
EE.UU., 147–150.
75. AOAC OFFICIAL METHOD 993.12. (2000). Listeria monocytogenes in Milk and Dairy Products. Selective
Enrichment and Isolation Method. Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. En: Official
Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, Volumen I, Agricultural Chemicals; Contaminants; Drugs,
Horwitz W., ed. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, EE.UU., 138–141.
8.
AOAC OFFICIAL METHOD 994.03. (2000). Listeria monocytogenes in Dairy Products, Seafoods, and Meats.
Colorimetric Monoclonal Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Method (Listeria-Tek). Official Methods of
Analysis of AOAC INTERNATIONAL. En: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, Volumen
I, Agricultural Chemicals; Contaminants; Drugs, Horwitz W., ed. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg,
MD, EE.UU., 150–152.
9.
AOAC OFFICIAL METHOD 995.22. (2000). Listeria in Foods. Colorimetric Polyclonal Enzyme Immunoassay
Screening Method (TECRA® Listeria Visual Immunoassay [TLVIA]). Official Methods of Analysis of AOAC
INTERNATIONAL. En: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, Volumen I, Agricultural
Chemicals; Contaminants; Drugs, Horwitz W., ed. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, EE.UU.,
152–155.
10. AOAC OFFICIAL METHOD 996.14. (2000). Listeria monocytogenes and Related Listeria Species Detection in
Selected Foods. Assurance® Polyclonal Enzyme Immunoassay Method. Official Methods of Analysis of
AOAC INTERNATIONAL. En: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, Volumen I,
Agricultural Chemicals; Contaminants; Drugs, Horwitz W., ed. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD,
EE.UU., 155–158.
11. AOAC OFFICIAL METHOD 997.03. (2000). Listeria monocytogenes and Related Listeria spp. in Selected
Foods. Visual Immunoprecipitate Assay (VIPTM). Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL.
En: Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, Volumen I, Agricultural Chemicals;
Contaminants; Drugs, Horwitz W., ed. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, EE.UU., 158–160.
12. AOAC OFFICIAL METHOD 999.06. (2000). Listeria in Foods. Enzyme-Linked Immunofluorescent Assay
(ELFA). VIDAS LIS Assay Screening Method. Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL. En:
Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, Volumen I, Agricultural Chemicals; Contaminants;
Drugs, Horwitz W., ed. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, EE.UU., 160–163.
13. BAYLIS C. (2000). The Catalogue of Rapid Microbiological Methods, Fourth Edition, Review No. 1, Campden
& Chorleywood Food Research Association, Chipping Campden, Gloucestershire, UK.
14. BILLE J. & ROCOURT J. (1996). WHO International Multicenter Listeria monocytogenes Subtyping Study –
rationale and set-up of the study. Int. J. Food Microbiol., 32, 251–262.
15. CAI S., KABUKI D.Y., KUAYE A.Y., CARGIOLI T.G., CHUNG M.S., NIELSEN R. & W IEDMANN M. (2002). Rational
design of DNA sequence-based strategies for subtyping Listeria monocytogenes. J. Clin. Microbiol., 40,
3319–3325.
16. COSSART P. & PORTNOY D.A. (2000). The cell biology of invasion and intracellular growth by Listeria
monocytogenes. En: Gram-Positive Pathogens, Fischetti V.A., Novick R.P., Ferretti J.J., Portnoy D.A. &
Rood J.A., eds. ASM Press, Washington, DC, EE.UU., 507–515.
17. DONNELLY C.W. (1999). Conventional methods to detect and isolate Listeria monocytogenes. En: Listeria,
Listeriosis, and Food Safety, Ryser E. & Marth E., eds. Marcel Dekker, New York, NY, EE.UU., 225–260.
18. DUNBAR S.A., VANDER ZEE C.A., OLIVER K.G., KAREM K.L. & JACOBSON J.W. (2003). Quantitative multiplexed
detection of bacterial pathogens: DNA and protein applications of the Luminex LabMAP system. J.
Microbiol. Methods, 53, 245–252.
2
AOAC: Asociación Oficial de Químicos Analistas
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1235
Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
19. DUSSURGET O., CABANES D., DEHOUX P., LECUIT M., BUCHRIESER C., GLASER P. & COSSART P. (2002). Listeria
monocytogenes bile salt hydrolase is a PrfA-regulated virulence factor involved in the intestinal and hepatic
phases of listeriosis. Mol. Microbiol., 45, 1095–1106.
20. ELD K., DANIELSSON-THAM M.-L., GUNNARSSON A. & THAM W. (1993). Comparison of a cold enrichment method
and the IDF method for isolation of Listeria monocytogenes from animal autopsy material. Vet. Microbiol.,
36, 185–189.
21. FARBER J.M., ED. (1996). Molecular typing of Listeria. Int. J. Food Microbiol., Special Issue, Elsevier,
Amsterdam, Netherlands, 251–355.
22. FENLON D.R. (1985). Wild birds and silage as reservoirs of Listeria in the agricultural environment. J. Appl.
Bacteriol., 59, 537–543.
23. GRAVES L.M., SWAMINATHAN B. & HUNTER S. (1999). Subtyping Listeria monocytogenes. En: Listeria,
Listeriosis, and Food Safety, Ryser E. & Marth E., eds. Marcel Dekker, New York, NY, EE.UU., 279–297.
24. GRAY M.L., STAFSETH J., THORP JR F., SHOLL L.B. & RILEY W.F. (1948). A new technique for isolating
Listerellae from the bovine brain. J. Bacteriol., 55, 471–476.
25. HILL W.E., DATTA A.R., FENG P., LAMPEL K.A. & PAYNE W.L. (2001). Identification of foodborne bacterial
pathogens by gene probes: Listeria monocytogenes: combination of invasion-associated protein (iap) and
hemolysin (hly) gene probes – AD713. En: Bacteriological Analytical Manual Online,
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-24.html, 24.16 – 24.17.
26. HIRD D.W. & GENIGEORGIS C. (1990). In: Listeriosis in Food Animals: Clinical Signs and Livestock as a
Potential Source of Direct (Nonfoodborne) Infection for Humans, Miller A.J., Smith J.L. & Somkutti G.A.,
eds. Elsevier, Amsterdam, Países Bajos, 31–39.
27. HITCHINS A.D. (1998). Listeria monocytogenes. En: Bacteriological Analytical Manual, US Food and Drug
Administration, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, EE.UU., 10.01–10.11
28. HOUGH A.J., HARBISON S.A., SAVILL M.G., MELTON L.D. & FLETCHER G. (2002). Rapid enumeration of Listeria
monocytogenes in artificially contaminated cabbage using real-time polymerase chain reaction. J. Food
Prot., 65, 1329–1332.
29. HUSU J.R. (1990). Epidemiological studies on the occurrence of Listeria monocytogenes in the feces of
dairy cattle. J. Vet. Med. [B], 37, 276–282.
30. IIDA T., KANZAKI M., MARUYAMA T., INOUE S. & KANEUCHI C. (1991). Prevalence of Listeria monocytogenes in
intestinal contents of healthy animals in Japan. J. Vet. Med. Sci., 53, 873–875.
31. INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (1996). Microbiology of food and animal feeding stuffs –
Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes – Part 1: Detection
method. International Standard ISO 11290-1, Geneva, Switzerland.
32. INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (1998). Microbiology of food and animal feeding stuffs –
Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes – Part 2: Enumeration
method. International Standard ISO 11290–2, Geneva, Suiza.
33. JACQUET C., GOUIN E., JEANNEL D., COSSART P. & ROCOURT J. (2002). Expression of ActA, Ami, InlB, and
listeriolysin O in Listeria monocytogenes of human and food origin. Appl. Environ. Microbiol., 68, 616–622.
34. JERSEK B., GILOT P., GUBINA M., KLUN N., MEHLE J., TCHERNEVA E., RIJPENS N. & HERMAN L. (1999). Typing of
Listeria monocytogenes strains by repetitive element sequence-based PCR. J. Clin. Microbiol., 37, 103–
109.
35. LOPEZ J., KARPOWICZ E., HARGROVE W. & BECKER S. (1992). Comparison of the Intestinal Cell Uptake of
Listeria monocytogenes Strains Isolated From Human Clinical Cases of Listeriosis and From Meat
Products, 92nd General Meeting Abstracts, American Society for Microbiology, P-38, 330.
36. LOPEZ J., SINGH U., KARPOWICZ E., HARGROVE W. & ADAMS S. (1993). Comparison of the Intracellular Survival
and Multiplication of Listeria monocytogenes Strains Isolated From Human Clinical Cases of Listeriosis and
From Meat Products, 93rd General Meeting Abstracts, American Society for Microbiology, P-80, 346.
37. LOW J.C., DAVIES R.C. & DONACHIE W. (1992). Purification of listeriolysin O and development of an
immunoassay for diagnosis of listeric infection in sheep. J. Clin. Microbiol., 30, 2505–2708.
38. LOW J.C. & DONACHIE W. (1997). A review of Listeria monocytogenes and listeriosis. Vet. J., 153, 9–29.
1236
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.10.14. — Listeria monocytogenes
39. NORTON D.M. (2002). Polymerase chain reaction-based methods for detection of Listeria monocytogenes:
toward real-time screening for food and environmental samples. J. AOAC Int., 85 (2), 505–515.
40. QUINN P.J., CARTER M.E., MARKEY B. & CARTER G.R. (1999). Clinical Veterinary Microbiology. Mosby
International, Edimburgo, Escocia, Gran Bretaña.
41. ROBERTS A.J. & W IEDEMANN M. (2003). Pathogen, host and environmental factors contributing to the
pathogenesis of listeriosis. Cell. Mol. Life Sci., 60, 904–918.
42. ROCOURT J. & BILLE J. (1997). Foodborne listeriosis. World Health Stat. Q., 50, 67–73.
43. RUDI K., KATLA T. & NATERSTAD K. (2003). Multi locus fingerprinting of Listeria monocytogenes by sequencespecific labeling of DNA probes combined with array hybridization. FEMS Microbiol. Lett., 220, 9–14.
44. SALCEDO C., ARREAZA L., ALCALA B., DE LA FUENTE L. & VAZQUEZ J.A. (2003). Development of a multilocus
sequence typing method for analysis of Listeria monocytogenes clones. J. Clin. Microbiol., 41, 757–762.
45. SCHLECH W.F. 3RD, LAVIGNE P.M., BORTOLUSSI R.A., ALLEN A.C., HALDANE E.V., W ORT A.J., HIGHTOWER A.W.,
JOHNSON S.E., KING S., NICHOLLS E.S. & BROOME C.V. (1983). Epidemic listeriosis – evidence for transmission
by food. N. Engl. J. Med., 318, 203–206.
46. SEWELL A.M., W ARBURTON D.W., BOVILLE A., DALEY E.F. & MULLEN K. (2003). The development of an efficient
and rapid enzyme linked fluorescent assay method for the detection of Listeria spp. from foods. Int. J. Food
Microbiol., 81, 123–129.
47. SLUTSKER L. & SCHUCHAT A. (1999). Listeriosis in humans. En: Listeria, Listeriosis, and Food Safety, Ryser
E. & Marth E., eds. Marcel Dekker, New York, NY, EE.UU., 75–95.
48. SPRATT B.G. (1999). Multilocus sequence typing: molecular typing of bacterial pathogens in an era of rapid
DNA sequencing and the internet. Curr. Opin. Microbiol., 3, 312–316.
49. SWAMINATHAN B. (2001). Listeria monocytogenes. En: Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers,
Second Edition, Doyle M.P., Beuchat L.R. & Montville T.J., eds. ASM Press, Washington, DC, EE.UU.,
383–409.
50. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE – FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE (FSIS) (2002).
Procedure for the Use of Listeria monocytogenes BAX Screening Test, Effective April 29, 2002. En:
Microbiology Laboratory Guidebook On Line, http://www.fsis.usda.gov/OPHS/microlab/mlgbook.htm, MLG
8A.00, 1–4.
51. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE – FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE (FSIS) (2002). Isolation
and Identification of Listeria monocytogenes from Red Meat, Poultry, Egg and Environmental Samples,
Revision
03,
April
29,
2002.
En:
Microbiology
Laboratory
Guidebook
On
Line,
http://www.fsis.usda.gov/OPHS/microlab/mlgbook.htm, MLG 8.03 pp 1–20.
52. W ALKER J.K. & MORGAN J.H. (1993). Ovine ophthalmitis associated with Listeria monocytogenes. Vet. Rec.,
132, 636.
53. W ALKER R.L. (1999). Listeria. En: Veterinary Microbiology, Hirsh D.C. & Zee Y.C., eds. Blackwell Science,
Malden, Massachusetts, EE.UU., 225–228.
54. W ESLEY G.N. (1999). Listeriosis in animals. En: Listeria, Listeriosis, and Food Safety, Ryser E. & Marth E.,
eds. Marcel Dekker, Nueva York, NY, EE.UU., 39–73.
55. W IEDMANN M., ARVIK T., BRUCE J.L., NEUBAUER J., DEL PIERO F., SMITH M.C., HURLEY J,, MOHAMMED H.O. &
BATT C.A. (1997). Investigation of a listeriosis epizootic in sheep in New York state. Am. J. Vet. Res., 58,
733–737.
*
* *
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
1237
SECCION 2.4.
ENFERMEDADES DE OVEJAS Y CABRAS EN LA
LISTA B
CAPÍTULO 2.4.1.
EPIDIDIMITIS OVINA
(Brucella ovis)
RESUMEN
Brucella ovis produce una enfermedad clínica o subclínica en el ganado ovino que se caracteriza
por lesiones genitales en los carneros y placentitis en las ovejas. Por consiguiente, las
consecuencias principales de la enfermedad son una disminución de la fertilidad en los carneros,
abortos poco frecuentes en las ovejas, y una subida de la mortalidad perinatal. La enfermedad se
ha descrito en Argentina, Australia, Brasil, Canadá, Chile, Francia, Alemania, Hungría, México,
Nueva Zelanda, Perú, Rumanía, Rusia, República Eslovaca, Africa del Sur, España, Estados
Unidos de América y Uruguay, aunque probablemente se presenta en la mayoría de los países que
crían ovejas.
Identificación del agente: La existencia de lesiones clínicas (epididimitis unilateral u,
ocasionalmente, bilateral) en los carneros puede ser indicativa de la existencia de la infección,
aunque son necesarios estudios de laboratorio para confirmar el diagnóstico. La confirmación de
laboratorio puede basarse en métodos directos o indirectos. El diagnóstico directo se realiza por
medio del aislamiento bacteriológico en medios selectivos adecuados para B. ovis a partir de
muestras de semen o tejidos de los carneros, o flujos vaginales y leche de las ovejas. Se están
desarrollando métodos de biología molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa y la
electroforesis de campo pulsado. Sin embargo, para el diagnóstico de rutina se prefiere el
diagnóstico indirecto basado en pruebas serológicas.
Pruebas serológicas: Se pueden utilizar la técnica de fijación de complemento (TFC), la prueba
de inmunodifusión en gel de agarosa (IGDA), y el enzimoinmunoensayo (ELISA), empleando
antígenos de superficie solubles obtenidos a partir de B. ovis. Se están probando en ensayos de
campo algunos ELISAS que utilizan proteínas recombinantes y anticuerpos monoclonales. La
sensibilidad de las pruebas IGDA y ELISA es parecida y a veces la del ELISA es mayor que la de
la TFC. En cuestión de sensibilidad, una combinación de las técnicas IGDA y ELISA parece ofrecer
los mejores resultados. Sin embargo, respecto al coste y la simplicidad, la prueba IGDA es el
ensayo más factible para el diagnóstico de B. ovis. No obdstante, el ensayo obligatorio para el
comercio internacional continúa siendo el TFC.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Los cultivos del inóculo para la
producción de antígeno o vacuna deben obtenerse a partir de laboratorios reconocidos
internacionalmente. Para la prevención de la infección de los carneros por B. ovis, puede utilizarse
de manera segura y efectiva una dosis única estándar de vacuna viva de B. melitensis Rev. 1 (109
unidades formadoras de colonias) administrada subcutáneamente o en la conjuntiva. Esta cepa de
vacuna debe cumplir los estandares mínimos de calidad: una concentración adecuada, ausencia
de disociación, adecuada virulencia residual e inmunogenicidad, y ausencia de agentes externos
(ver el Capítulo 2. 4. 2. Brucelosis caprina y ovina [excluyendo la infección por B. ovis]).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
635
Capítulo 2.4.1. — Epididimitis ovina (Brucella ovis)
A. INTRODUCCIÓN
Brucella ovis causa una infección genital en el ganado ovino que se manifiesta por epididimitis, abortos poco
frecuentes y aumento en la mortalidad de los corderos. La transmisión pasiva a través de la oveja parece ser una
vía de infección frecuente, aunque también lo es la transmisión de carnero a carnero 1. (2). Las ovejas
pueden excretar B. ovis en los flujos vaginales y la leche, y por lo tanto, la transmisión oveja-carnero y oveja
lactante-carnero también pueden ser mecanismos determinantes de la infección.
La demostración de la existencia de lesiones genitales (epididimitis unilateral u, ocasionalmente, bilateral)
mediante palpación de los testículos de los carneros puede ser un indicio de la presencia de esta infección en un
rebaño. Sin embargo, este diagnóstico clínico no es suficientemente sensible porque solamente un 50% de los
carneros infectados con B. bovis presentan epididimitis (2). Es más, el diagnóstico clínico es extremadamente
inespecífico debido a la existencia de muchas otras bacterias que causan epididimitis clínica. Los
microorganismos que más frecuentemente causan epididimitis en los carneros incluyen Actinobacillus seminis, A.
actinomycetencomitans, Histophilus ovis, Haemophilus spp., Corynebacterium pseudotuberculosis ovis, B.
melitensis y Chlamydophila abortus (antiguamente Chlamydia psittaci) (4, 5, 8, 10, 12, 22, 28, 31). Debe hacerse
hincapié en que muchas lesiones epididimales palpables en los carneros son granulomas espermáticos estériles
provocados por un trauma.
Aunque el ganado vacuno, las cabras y los ciervos han demostrado ser susceptibles a B. ovis en experimentos
de transmisión artificial, los casos naturales solamente se han descrito en ciervos (19). Hasta la fecha no se han
descrito casos en humanos, y B. ovis se considera no-zoonósico. Sin embargo en las áreas donde la infección
por B. melitensis coexiste con B. ovis, es necesario un cuidado especial cuando se manejan las muestras, las
cuales deberían transportarse al laboratorio en contenedores herméticos.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
a)
Recogida de muestras
Las muestras más valiosas para el aislamiento de B. ovis a partir de animales vivos son el semen, frotis
vaginales y la leche. Para la recogida de frotis vaginales y leche, ver las instrucciones que se dan en el
Capítulo 2.4.2. La brucelosis caprina y ovina (excluyendo la infección por B. ovis). El semen (fluidos
genitales) se puede recoger fácilmente en frotis tomados de la cavidad prepucial después de la electroeyaculación. Si no existe un electro-eyaculador disponible, los frotis pueden ser recogidos a partir de la
vagina de ovejas libres de brucelosis inmediatamente después del apareamiento natural.
Para el aislamiento de B. ovis después de la necropsia, los órganos preferidos en cuanto a la probabilidad
de aislamiento son el epididimo, la vesícula seminal, las ampollas de los conductos deferentes y los nódulos
linfáticos inguinales en los carneros, y el útero y los nódulos linfáticos ilíacos y supramamarios en las
ovejas. Sin embargo, para obtener una sensibilidad máxima, se debe realizar una búsqueda completa que
incluya otros órganos y nódulos linfáticos (del bazo, craneales, escapulares, prefemorales y testiculares).
También se deben examinar los corderos muertos y las placentas. Los sitios preferidos para el aislamiento
a partir de corderos abortados o nacidos muertos son el contenido abomasal y el pulmón.
Las muestras para el cultivo deben refrigerarse y transportarse al laboratorio para ser cultivadas lo antes
posible después de la recogida. El organismo permanece viable durante al menos 72 horas a temperatura
ambiente, y la supervivencia se mejora a 4 °C o, preferiblemente, mediante congelación de las muestras de
tejido.
b)
Métodos de tinción
Los frotis vaginales o de semen se pueden examinar siguiendo la tinción por el método de Stamp (1, 7) (ver
Capítulo 2.4.2.), y los cocobacilos característicos deben ser visibles en muchos de los animales infectados
1
636
En los sistemas de producción semiextensivos (más frecuentes en los países de la Europa Mediterránea) los carneros
normalmente se alojan juntos. La transmisión directa de carnero a carnero durante los periodos de ausencia de
reproducción es bastante frecuente y se ha sugerido que tiene lugar mediante varias vías, incluyendo la mucosa rectal.
Sin embargo, la mayoría de las infecciones de carnero a carnero se producen a través de la vía oral. Los carneros
estabulados establecen jerarquías (combates cabeza contra cabeza), y es frecuente que los carneros “dominados”,
después de ser “montados” por los carneros dominantes, laman el prepucio de los carneros dominantes como un acto de
sumisión. Si estos carneros dominantes están infectados, la probabilidad de tener B. ovis en el prepucio (secreción en el
semen) es muy alta.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.1. — Epididimitis ovina (Brucella ovis)
(29). El exámen de frotis de tejidos sospechosos teñidos por el método de Stamp (tracto genital de carnero,
nódulos linfáticos inguinales, placentas, y contenido abomasal y pulmón de los fetos) puede también
permitir un diagnóstico presuntivo rápido.
Sin embargo, también en tales muestras pueden estar presentes otras bacterias con morfología o
características tintoriales similares (B. melitensis, Coxiella burnetii y Chlamydophila abortus), haciendo difícil
el diagnóstico para el personal con poca experiencia. Los resultados microscópicos siempre deben
confirmarse mediante el cultivo del microorganismo.
c)
Cultivo
El mejor método directo de diagnóstico es el aislamiento bacteriológico en medios de cultivo adecuados. las
muestras de semen, frotis vaginales, o leche se pueden extender directamente en placas con el medio de
cultivo adecuado e incubarse a 37 °C en una atmósfera con CO2 al 5-10%. Los tejidos deben macerarse y
homogenizarse antes de sembrarlos en una pequeña cantidad de solución salina o tampón fosfato estéril
(PBS) con un homogenizador o una licuadora.
El crecimiento aparece después de 3-4 días, pero los cultivos no deben descartarse como negativos hasta
que han transcurrido 7 días. Las colonias de B. ovis se hacen visibles (0.5-2.5 mm) después de 3-4 días de
incubación, y son rugosas, redondeadas, brillantes y convexas.
Brucella ovis puede ser aislada en medios no selectivos, tales como el agar-sangre base enriquecido con
suero ovino o bovino estéril al 10%, o en medio de agar-sangre con sangre ovina estéril al 5-10%. Sin
embargo, el inóculo frecuentemente contiene otras bacterias que a menudo enmascaran el crecimiento de
B. ovis. Por consiguiente, puede preferirse el uso de medios selectivos. Se han descrito varios medios
selectivos para B. ovis. Se recomienda el medio modificado de Thayer-Martin (3, 13). Brevemente, puede
prepararse con medio base GC (38 g/litro; Biolife Laboratories, Milan, Italia) suplementado con hemoglobina
(10 g/litro; Difco) y metanosulfonato de colistina (7,5 mg/litro), vancomicina (3 mg/litro), nitrofurantoina (10
mg/litro), nistatina (100.000 Unidades Internacionales [UI]/litro = 17,7 mg) y anfotericina B (2,5 mg/litro)
(todos los productos de Signa Chemical, St Louis, Estados Unidos de América . Las soluciones de trabajo
se preparan como sigue:
Solución A: añadir 500 ml de agua destilada al medio base GC, calentar la mezcla cuidadosamente hasta
ebullición mientras se agita continuamente y autoclavar a 120 °C durante 10 minutos.
Solución B: resuspender la hemoglobina en 500 ml de agua destilada, añadiendo el agua lentamente para
evitar grumos. Una vez disuelta, añadir una barilla magnética y autoclavar a 120 °C durante 20 minutos.
Solución de antibiótico (preparada en el día): la colistina, nistatina y vancomicina se resuspenden en una
mezcla de metanol/agua (1/1); la nitrofurantoina se resuspende en 1 ml de una solución estéril de NaOH 0,1
M. Para la anfotericina B, se recomienda preparar una solución de base de 10 mg/ml de anfotericina B con
10 mg disueltos en 1 ml de dimetil sulfóxido estéril (C2H6OS, para análisis; ACS) y añadidos después a 9 ml
de PBS (10 mM , pH 7,2 ). Cualquier solución de stock que sobre puede almacenarse varios días a 4 °C.
Todas las soluciones de antibióticos deben filtrarse a través de filtros de 0,22 µm antes de añadirse al
medio de cultivo.
Una vez autoclavados, estabilizar la temperatura de ambas soluciones (45-50 °C) con agitación continua.
Mezclar ambas soluciones (añadiendo A sobre B), evitando la formación de burbujas. Añadir las soluciones
de antibióticos mientras se agita continuamente y con cuidado. Repartir en placas estériles.
Una vez preparadas, las placas no deben almacenarse durante largos periodos de tiempo, y siempre se
recomienda el medio recién preparado. Este medio también es adecuado para el aislamiento de B.
melitensis (ver Capítulo 2.4.2).
Todos los medios de cultivo deberían someterse a un control de calidad con la cepa de referencia para
asegurar que permiten su crecimiento.
Otra combinación de antibiótico adecuada, aunque menos efectiva, es: vancomicina (3 mg/litro); colistina
(7,5 mg/litro); nistatina (12.500 UI/litro); y nitrofurantoina (10 mg/litro).
d)
Identificación y tipificación
Las colonias de Brucella ovis son no-hemolíticas. Son circulares, convexas, tienen bordes enteros, son
siempre de tipo rugoso cuando se obervan con iluminación indirecta, y son positivas en la prueba de la
acriflavina (1, 7). Brucella ovis carece de actividad ureasa, no reduce el nitrato a nitrito, es catalasa positivo
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
637
Capítulo 2.4.1. — Epididimitis ovina (Brucella ovis)
y oxidasa negativo, no produce H2S y, aunque no crece en presencia de violeta de metilo, generalmente
crece en presencia de concentraciones estándar de fuchsina básica y tionina. Los cultivos no se lisan por la
dilución corriente de prueba (RTD), o 104 RTD, de los fagos de Brucella de los grupos Tbilissi (Tb),
Weybridge (Wb) e Izatnagar (Iz), mientras que se lisan por el fago R/C (1, 7). La mayoría de los laboratorios
no se encuentran equipados para una identificación completa, y es necesario un programa práctico para la
identificación presuntiva. La mayoría de los aislados de B. ovis pueden identificarse correctamente por sus
características de crecimiento, la observación directa empleando luz reflejada indirecta, la tinción de Gram o
Stamp, y las pruebas de la catalasa, oxidasa, ureasa y acriflavina. Sin embargo, la identificación definitiva
debe ser llevada a cabo por laboratorios de referencia con experiencia en identificación y tipificación de
Brucella. Un método de electroforesis en gel de campo pulsado puede distinguir B. ovis de otras especies
de Brucella (7). Además, B. ovis se puede distinguir de otras especies de Brucella por medio de los
patrones de polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción mediante reacción en cadena de la
polimerasa (PCR RFLP), para los genes omp2a, omp2b, omp25 y omp31, que codifican las proteínas
fundamentales de la membrana externa de todas las especies de Brucella (27).
2.
Pruebas serológicas
Los ensayos más eficaces y utilizados son la prueba de fijación de complemento (TFC), la prueba de doble
inmunodifusión en gel de agarosa (IGDA) y el enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA). Varios países han
adoptado varias técnicas diagnósticas estándar para B. ovis, pero la única prueba prescrita por la OIE y la Unión
Europea para el comercio internacional es la TFC. Sin embargo, se ha demostrado que el ensayo IGDA muestra
una sensibilidad parecida a la de la TFC, y es una prueba más simple de realizar. Aunque se carece de
estandarización, numerosos estudios independientes han mostrado que el ELISA es más sensible que los
ensayos TFC o IGDA.
•
Antígenos
Cuando las células rugosas de Brucella se extraen con solución salina mediante calor (método salino
caliente, HS), se consiguen extractos antigénicos solubles en agua, cuyo componente mayoritario precipita
con sueros frente a Brucella rugosas (9, 18). Por esta razón los extractos HS han sido mencionados como
el “antígeno específico rugoso” o, cuando se obtienen a partir de B. ovis, como el “antígeno específico de B.
ovis”. Sin embargo, la caracterización química de los extractos HS de B. ovis ha puesto de manifiesto que
éstos se encuentran enriquecidos con lipopolisacárido rugoso (R-LPS), con proteínas de la membrana
externa del grupo 3, y con otros componentes de la membrana externa (20). Por tanto, los extractos HS
contienen determinantes de LPS específicos para B. ovis, pero también componentes antigénicos
adicionales, algunos de ellos compartidos con B. melitensis y otras Brucella rugosas o lisas (23). Tales
componentes son responsables de la reactividad cruzada que se observa a veces con el método HS en
sueros de ovejas infectados con B. melitensis o vacunadas con Rev. 1 (20). Debido a su solubilidad en
agua y alto contenido en epitopos relevantes de la superficie celular, el extracto HS es el mejor antígeno de
diagnóstico, y ha sido muy utilizado para el diagnóstico serológico de la infección por B. ovis.
Brucella ovis REO 198, una cepa CO2 y suero-independiente, está recomendada como la fuente de
antígenos HS para ser utilizados en las técnicas serológicas. Esta cepa se puede obtener del INRA2. Los
medios sólidos descritos en la Sección B.1.c. son adecuados para el crecimiento de B. ovis REO 198. El
antígeno HS se prepara como sigue:
2
638
i)
Crecer exponencialmente una cepa adecuada de B. ovis, preferiblemente aeróbica y no suero
dependiente, por ejemplo REO 198, de una de las siguientes formas: durante 48 horas en matraces
con caldo tripticasa-soja en un incubador orbital a 37°C y 150 rpm; o en botellas de Roux o agar
tripticasa-soja u otro medio adecuado, con un 5% de suero añadido (no necesario cuando se utiliza la
cepa REO 198); o en un fermentador de producción como se ha descrito para B. abortus, pero con la
adición al medio de suero al 5% (no necesario cuando se utiliza la cepa REO 198).
ii)
Las células se lavan dos veces y se resuspenden en solución salina al 0.85% (12 g de células secas o
30 g de células concentradas húmedas en 150 ml).
iii)
La suspensión celular se autoclava a 120°C durante 25-30 minutos.
iv)
Después de enfriar, la suspensión se centrifuga (15.000 g, 4°C, 15 minutos) y el líquido sobrenadante
se filtra y dializa frente a agua destilada (3 x 100 volúmenes) a 4°C durante al menos 2 días.
v)
El líquido dializado se ultracentrifuga (100.000 g, 4°C, 6-8 horas) y el sedimento se resuspende en un
pequeño volumen de agua destilada y se liofiliza.
Institut national de la recherche agronomique (INRA) Laboratorie de Pathologie Infectieuse et Immunologie, 37380
Nouzilly, France
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.1. — Epididimitis ovina (Brucella ovis)
El HS se resuspende entonces bien en agua destilada (para su uso en la prueba IGDA), tampón salino
veronal (para su uso en la TFC), o tampón carbonato/bicarbonato o PBS (para su uso en el ELISA), y se
titula frente a un conjunto adecuado de sueros positivos y negativos.
El HS resuspendido se mantiene a 4°C con fenol al 0,5% como conservante (solamente para el uso en la
prueba IGDA) o liofilizado. Se debe evitar la congelación y descongelación (9). El antígeno TFC debe
estandarizarse frente al Suero Estándar Internacional anti-B. ovis3.
a)
Prueba de fijación de complemento (la prueba prescrita para el comercio internacional)
No existe un método estandarizado para la TFC, pero es mejor realizar la técnica por el método de
microtitulación. Algunas trabajos indican que la fijación fría es más sensible que la fijación caliente (6, 21,
24), pero es menos específica. Las reacciones anticomplementarias, frecuentes con suero de oveja, son,
sin embargo, más frecuentes con la fijación fría.
Se han propuesto varios métodos para la TFC utilizando diferentes concentraciones de hematíes de oveja
(SRCBCs) (se recomienda normalmente una suspensión al 2-3%), sensibilizadas con un volumen igual de
suero de conejo anti-SRBC diluido para contener varias veces (generalmente de dos a cinco veces) la
concentración mínima necesaria para producir un 100% de lisis de los SRBCs en presencia de una solución
titulada de complemento de cobaya. Esta última se titula independientemente (en presencia o ausencia de
antígeno según el método), para determinar la cantidad de complemento necesario para producir bien un
50% o un 100% de lisis de SRBCs sensibilizados en una unidad de volumen de una suspensión
estandarizada; se definen como la unidad hemolítica 50% o 100% del complemento (C´H50 o C´H100),
respectivamente. Generalmente se recomienda titular el complemento antes de cada grupo de ensayos y se
prefiere un macrométodo para la determinación óptima del C´H50. Por lo general, en la prueba se utilizan
1,25-2 C´H100 o 5-6 C´H50.
El tampón salino con barbital (veronal) (VBS) es el diluyente estándar para la TFC. Se prepara a partir de
comprimidos disponibles comercialmente, de lo contrario se puede preparar de acuerdo con la fórmula
descrita en otro lugar (ver el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina). El suero de ensayo debe inactivarse durante
30 minutos en un baño de agua a 60-63°C, y diluirse (diluciones dobles) en VBS. La solución de base del
antígeno HS (2,5-20 mg/ml en VBS) se diluye en VBS como se determinó previamente mediante titulación
(titulación en sistema de doble entrada). Normalmente sólo se prueba una dilución de suero (generalmente
la 1/10).
Utilizando placas de microtitulación estándar de 96 pocillos con fondo redondo (en U), la técnica se realiza
normalmente como sigue:
i)
Se colocan 25 µl de suero problema inactivado en los pocillos de la primera y segunda filas. Se
añaden volúmenes de 25 µl de tampón TFC en todos los pocillos excepto los de la primera fila. Se
preparan diluciones seriadas dobles transfiriendo volúmenes de suero de 25 µl de la segunda fila en
adelante.
ii)
Se añaden en cada pocillo volúmenes de 25 µl de antígeno diluido hasta la concentración de trabajo y
25 µl de complemento diluido hasta el número de unidades necesarias.
iii)
Se preparan pocillos control que contienen 75 µl en cada caso de sólo diluyente, suero + complemento
+ diluyente, antígeno + complemento + diluyente, y complemento + diluyente. Cada vez que se realiza
la TFC se incluirá un suero control que de una reacción positiva mínima para verificar la sensibilidad
de la prueba.
iv)
Las placas se incuban a 37°C durante 30 minutos, o a 4°C durante toda la noche, y se añade en cada
pocillo un volumen (25 o 50 µl, dependiendo de la técnica) de SRBCs sensibilizados. Las placas se
reincuban a 37°C durante 30 minutos.
v)
Se leen los resultados después de haber centrifugado las placas a 1.000 g durante 10 minutos a 4°C,
o dejarlas reposar a 4 °C durante 2-3 horas para permitir depositarse a las células no lisadas. El grado
de hemólisis se compara con estándares correspondientes a 0, 25, 50, 75 y 100 % de lisis. El título del
suero problema es la dilución más alta a la cual hay un 50% o menos de hemolisis.
•
Estandarización de los resultados de la prueba de fijación del complemento.
Existe un sistema de unidades basado en el Estándar Internacional para el Suero anti-Brucella ovis
(Estándar Internacional 1985 [ ver nota al pie 2]). Este suero contiene 1.000 Ul/ml. Si este suero se
prueba con un método determinado y da, por ejemplo, un título de 2.000, entonces el factor para un
3
A la venta en el OIE Reference Laboratory for Brucellosis, VLA Weybridge, Addlestone, Surrey KT 15 3NB, United
Kingdom.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
639
Capítulo 2.4.1. — Epididimitis ovina (Brucella ovis)
suero desconocido probado mediante ese método se puede hallar a partir de la fórmula: 1.000/200 x
título del suero de ensayo = número de ICFTU (unidades internacionales TFC) de anticuerpo en el
suero de ensayo por ml. Es recomendable que cualquier país que utilice la TFC a escala nacional
obtuviera un acuerdo entre los distintos laboratorios que realizan la prueba mediante el mismo
método, para garantizar la obtención del mismo nivel de sensibilidad y especificidad frente a un
conjunto adecuado de sueros procedentes de ovejas con aislamientos positivos de B. ovis, y de ovejas
libres de Brucella. Los resultados deberían expresarse siempre en ICFTU, calculados con relación a
aquellos obtenidos en una titulación en paralelo con un suero estándar, que a su vez puede calibrarse
frente al Estándar Internacional.
Interpretación de los resultados: generalmente los sueros que dan un título equivalente a 50 ICFTU/ml
o más se consideran positivos en la UE.
b)
Prueba de inmunodifusión en gel de agarosa
La prueba IGDA (2) utiliza los siguientes reactivos: Agar Noble o agarosa de alta calidad, cloruro sódico
(NaCl), y tampón borato (preparado con ácido bórico [12,4 g]; cloruro potásico [14,5 g]; agua destilada
[1.600 ml]; ajustado a pH 8,3 con una solución de NaOH 0,2 M, y llevado hasta 2.000 ml con agua
destilada).
Para preparar los geles, disolver 1g de agarosa (o agar Noble), 10 g de NaCl en 100 ml de tampón borato
hirviendo mientras se agita continuamente. Cubrir los portaobjetos, colocados sobre una superficie plana,
con la cantidad necesaria del gel fundido para formar un lecho de 2,5 mm de profundidad
(aproximadamente 3,5 ml para los portaobjetos estándar). Después de que el gel ha solidificado (15-20
minutos), se recortan los pocillos utilizando un punzón para geles. Los pocillos deberán ser de 3 mm de
diámetro y separados 3 mm, y estar dispuestos según un patrón hexagonal alrededor de un pocillo central
que también tiene 3 mm de diámetro. La técnica se puede adaptar a placas de Petri u otros moldes.
Los sueros a examinar se colocan en pocillos alternativos separados por un suero positivo control (infección
demostrada mediante bacteriología), con el antígeno a su concentración óptima en el pocillo central. Los
resultados se leen después de una incubación durante 24 y 48 horas a temperatura ambiente en una
cámara húmeda. Una reacción positiva se manifiesta por la presencia de una línea claramente definida de
precipitado entre el pocillo central y los pocillos de los sueros problema que muestra una identidad total o
parcial con la de los controles positivos. También pueden aparecer líneas de precipitado que no dan una
identidad total y pueden corresponder a componentes antigénicos minoritarios de los extractos HS (los
anticuerpos frente a estos componentes pueden ser también frecuentes en las infecciones debidas a B.
melitensis). Estas reacciones también deben considerarse positivas. Antes de una lectura definitiva, es
importante lavar los portas durante 1 hora en una solución en agua de citrato sódico al 5% para limpiar
líneas de precipitación inespecíficas.
El antígeno usado en la prueba IGDA es el HS (2,5-20 mg/ml) diluido en agua destilada, y que contiene
como conservante fenol al 0,5% (este antígeno conservado se puede almacenar durante al menos 1 mes a
4 °C). Las diluciones del antígeno se prueban con un conjunto de 20-30 sueros de carneros infectados
naturalmente con B. ovis y con un conjunto de sueros de ovejas libres de Brucella. La concentración óptima
de antígeno es aquella que da la línea de precipitación más clara con todos los sueros de los carneros
infectados con B. ovis siendo negativo con los sueros de las ovejas libres de Brucella.
c)
Enzimoinmunoensayo
Se han propuesto diversas variaciones de este ensayo. La prueba que se describe aquí es un ELISA
indirecto que utiliza ABTS (2,2´-azino-bis-[ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico]) como cromógeno, aunque
son también adecuados otros procedimientos. Los ensayos se realizan en placas de ELISA de 96 pocillos
de fondo plano. Las diluciones de los reactivos y el suero se preparan en PBS, pH 7.2, mediante la adición
de Twenn 20 al 0,05% (PBST). Las diluciones del antígeno se preparan en un tampón
carbonato/bicarbonato, pH 9,6, o alternativamente en PBS. pH 7.2. Las placas se lavan después de cubrir
con el antígeno y normalmente entre incubaciones con PBST, cuando sea necesario. El antígeno (HS) y el
conjugado se titulan mediante el sistema de doble entrada, y se seleccionan las diluciones que
proporcionan la mejor relación entre los sueros positivos y negativos. Los anticuerpos secundarios (IgG anti
ovina [cadenas H+L]) por lo general se conjugan a peroxidasa de rábano (HRPO), aunque se pueden usar
otros enzimas o conjugados (tales como la proteína G). Se ha encontrado un anticuerpo monoclonal frente
a IgG1 bovina conjugada con HRPO que es adecuado para su uso en el ELISA (26). Si se usa un
conjugado a peroxidasa, el cromógeno, normalmente ABTS, se diluye en un tampón de substrato
(compuesto de ácido cítrico y citrato sódico, pH 4). Se añade el substrato, peróxido de hidrógeno (H2O2), al
tampón de substrato y se incuban las placas durante 15-60 minutos a temperatura ambiente. La reacción se
puede detener con azida sódica 1 mM, y el cambio de color se lee a 405-414 nm (para más detalles ver el
Capítulo 2.3.1.).
640
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.1. — Epididimitis ovina (Brucella ovis)
El antígeno usado en el ELISA es el HS en la solución de base a 1 mg/ml en tampón de cobertura, titulada
en un sistema de doble entrada con diferentes concentraciones de antígeno, conjugado y sustrato, frente a
un suero estándar o frente a diluciones de un conjunto de sueros procedentes de ovejas con aislamientos
positivos de B. ovis, y de ovejas libres de Brucella, para determinar la dilución más sensible y específica
(por lo general 5–10 µg/ml).
•
Procedimiento del ensayo
i)
Las placas de microensayo de calidad de cultivo celular se antigenan mediante la adición en cada
pocillo de 100 µl de una dilución de un antígeno predeterminado en tampón carbonato, pH 9,6. Las
placas se incuban durante 2 horas a 37°C. Alternativamente, el antigenado puede llevarse a cabo
también durante toda la noche a 4°C con 100 µl de la dilución del antígeno correspondiente en PBS,
pH 7.2. Las placas se lavan después cuatro veces para eliminar el antígeno no unido, y se secan
golpeando fuertemente boca abajo sobre un papel absorbente. Las placas antigenadas se pueden
utilizar inmediatamente o secarse y almacenarse a 4°C (la estabilidad en estas condiciones es
aceptable durante al menos un mes).
ii)
Sueros: Diluir las muestras de suero problema y los controles positivo y negativo al 1/200 añadiendo
un mínimo de 10 µll de suero a 2 ml de PBST. Esta dilución de suero es normalmente la óptima
cuando se utilizan conjugados monoclonales y policlonales. Sin embargo, cuando se utiliza el
conjugado de proteína G-peroxidasa, ladilución óptima es la 1/50 (14). Añadir por duplicado
volúmenes de 100 µl de suero por pocillo a las placas de microtitulación. Las placas se tapan, se
incuban a 37°C durante 1 hora y se lavan tres veces con el tampón de lavado PBST.
iii)
Conjugado: El conjugado titulado se diluye en PBST, se añade en los pocillos (100 µl) y la placa se
tapa y se incuba durante 1 hora 37°C. Después de la incubación las placas se lavan de nuevo tres
veces con PBST.
iv)
Substrato: Se añade a las placas la solución de ABST en tampón de substrato (100 µl/pocillo) y las
placas se incuban durante 15-60 minutos a temperatura ambiente con agitación continuada.
v)
Lectura e interpretación de los resultados: La absorbancia se lee automáticamente en un
espectrofotómetro a 405-414 nm. Los valores de absorbancia se pueden expresar como porcentajes
de la absorbancia media del control positivo, o preferiblemente transformarse en unidades ELISA
calculadas bien manualmente, o utilizando un ordenador y un programa de aproximación de curva a
partir de una curva estándar construida con los resultados de las series de las diluciones control
positivas. El umbral debe calcularse probando un grupo suficientemente grande de sueros de oveja
libres de Brucella, y la sensibilidad del ensayo ser evaluada en un grupo suficiente de sueros de
animales infectados con B. ovis.
Varios estudios comparativos han mostrado que el ensayo ELISA presenta mejor sensibilidad que la prueba
IGDA o la TFC (16, 21, 25, 32, 33). La combinación del ensayo IGDA y ELISA proporciona una sensibilidad
óptima, debido a la existencia de algunos sueros ELISA-negativos y IGDA-positivos (16). Sin embargo, la
combinación de las pruebas CF y ELISA o CF y IGDA no mejora la sensibilidad del ELISA (16). Además, la
TFC tiene otras importantes desventajas como la complejidad, la inactivación obligatoria del suero, la
actividad anticomplementaria de algunos sueros, la dificultad de realizarlo con suero hemolisado, y los
fenómenos de prozona. Debido a su sensibilidad, simplicidad y fácil interpretación, el ensayo IGDA es muy
factible para el diagnóstico de rutina en laboratorios no especializados.
Se sabe poco sobre la existencia de resultados falsos positivos en los ensayos serológicos B. ovis como
consecuencia de infecciones debidas a bacterias que muestran epitopos de reacción cruzada con B. ovis.
Se ha descrito que el agente del pedero ovino (Dichelobacter nodosus) presenta reacciones cruzadas con
B. ovis (30), pero el alcance y las consecuencias prácticas de esta reactividad cruzada en de diagnóstico de
B. ovis se desconocen.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
La vacunación es probablemente el método más económico y práctico para el control a medio plazo de B. ovis
en áreas con una alta incidencia de la infección. Para un control a largo plazo, se bebería tener en consideración
el efecto de la vacunación sobre el diagnóstico serológico, y deben implementarse programas de acreditación de
ausencia de B. ovis. La cepa viva de B. melitensis Rev. 1 (ver Capítulo 2.4.2) es probablemente la mejor vacuna
disponible para la profilaxis de la infección por B. ovis (2). Una sola dosis estándar (109 unidades formadoras de
colonias) de Rv. 1 administrada subcutáneamente (en un volumen de 1 ml), o en la conjuntiva (en un volumen de
25-30 µl) a carneros de 3-5 meses de edad confiere una inmunidad adecuada frente a B. ovis. La vacunación en
la conjuntiva tiene la ventaja de minimizar la intensidad y duración a largo plazo de la respuesta serológica
provocada por la vacunación subcutánea, mejorando de ese modo la especificidad de las pruebas serológicas
(2). Cuando se usa en animales jóvenes, la vacuna Rev. 1 es suficientemente inocua y los efectos secundarios
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
641
Capítulo 2.4.1. — Epididimitis ovina (Brucella ovis)
parecen ser poco frecuentes. Sin embargo, existe una información limitada con respecto a la inocuidad de la
vacuna Rev. 1 cuando se utiliza en carneros adultos. Un estudio encontró que la vacunación subcutánea o
conjuntival de carneros de 13 meses no produjo efectos secundarios indeseables, y protegió a los carneros
frente a B. ovis, aunque el número de animales en este estudio fue limitado (15). Este descubrimiento debería
reinvestigarse usando un número mayor de carneros, ya que en países con cría extensiva y altos niveles de
incidencia sería aconsejable vacunar tanto a carneros jóvenes como adultos sanos. Sin embargo, la vacuna de
B. melitensis Rev.1 no debería utilizarse en países afectados por B. ovis pero libres de B. melitensis, y deberían
usarse otras vacunas que no causan una respuesta serológica. En la ovejas, la vacuna viva de B. abortus RB51
no ha desmostrado tener éxito frente a B. ovis (11) y actualmente no se encuentran disponibles vacunas
alternativas.
REFERENCIAS
1.
ALTON G.G., JONES L.M., ANGUS R.D. & VERGER J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis Laboratory. INRA,
Paris, France.
2.
BLASCO J.M. (1990). Brucella ovis. En: Animal Brucellosis, Nielsen K. & Duncan J.R., eds. CRC Press, Boca
Raton, Florida, USA, 351–378.
3.
BROWN G.M., RANGER C.R. & KELLEY D.J. (1971). Selective media for the isolation of Brucella ovis. Cornell
Vet., 61, 265–280.
4.
BULGIN M.S. & ANDERSON B.C. (1983). Association of sexual experience with isolation of various bacteria in
cases of ovine epididymitis. J. Am. Vet. Med. Assoc., 182, 372–374.
5.
BURGESS G.W. & MCDOWELL J.W. (1981). Escherichia coli epididymitis and seminal vesiculitis in a ram. Aust.
Vet. J., 57, 479–480.
6.
BURGESS G.W. & NORRIS M.J. (1982). Evaluation of the cold complement fixation test for diagnosis of ovine
brucellosis. Aust. Vet. J., 59, 23–25.
7.
CORBEL M.J., GILL K.P.W. & THOMAS E.L. (1978). Methods for the identification of Brucella. Ministry of
Agriculture, Fisheries and Food, UK, ADAS, RCV 22.
8.
DE LONG W.J., W ALDHALM D.G. & HALL R.F. (1979). Bacterial isolates associated with epididymitis in rams
from Idaho and eastern Oregon flocks. Am. J. Vet. Res., 40, 101–102.
9.
DIAZ R. & BOSSERAY N. (1973). Identification d’un composé antigénique spécifique de la phase rugueuse (R)
des Brucella. Ann. Rech. Vet., 4, 283–292.
10. EKDAHL M.O., MONEY D.F. & MARTIN C.A. (1968). Some aspects of epididymitis of rams in New Zealand. N. Z.
Vet. J., 16, 81–82.
11. JIMENEZ DE BAGUES M.P., BARBERAN M., MARIN C.M. & BLASCO J.M. (1995). The Brucella abortus RB51
vaccine does not confer protection against Brucella ovis in rams. Vaccine, 13, 301–304.
12. LIVINGSTONE C.W. & HARDY W.T. (1964). Isolation of Actinobacillus seminis from ovine epididymitis. Am.
J. Vet. Res., 25, 660–663.
13. MARIN C.M., ALABART J.L. & BLASCO J.M. (1996). Effect of antibiotics contained in two Brucella selective
media on growth of B. abortus, B. melitensis and B. ovis. J. Clin. Microbiol., 34, 426–428.
14. MARIN C.M., ALONSO-URMENETA B., MORIYON I., PEREZ S. & BLASCO J.M. (1998). Comparison of polyclonal,
monoclonal and protein G peroxidase conjugates in an enzyme-linked immunosorbent assay for the
diagnosis of Brucella ovis in sheep. Vet. Rec., 143, 390–394.
15. MARIN C.M., BARBERAN M., JIMENEZ DE BAGUES M.P. & BLASCO J.M. (1990). Comparison of subcutaneous and
conjunctival routes of Rev. 1 vaccination for the prophylaxis of Brucella ovis infection in rams. Res. Vet. Sci.,
48, 209–215.
16. MARIN C.M., JIMENEZ DE BAGUES M.P., BLASCO J.M., GAMAZO C., MORIYON I. & DIAZ R. (1989). Comparison of
three serological tests for Brucella ovis infection of rams using different antigenic extracts. Vet. Rec., 125,
504–508.
642
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.1. — Epididimitis ovina (Brucella ovis)
17. MICHAUX-CHARACHON S., BOURG G., JUMAS-BILAK E., GUIGUE-TALET P., ALLARDET-SERVENT A., O’CALLAHAN D. &
RAMUZ M. (1997). Genome structure and phylogeny in genus Brucella. J. Bacteriol., 179, 3244–3249.
18. MYERS D.M., JONES L.M. & VARELA-DIAZ V. (1972). Studies of antigens for complement fixation and gel
diffusion tests in the diagnosis of infections caused by Brucella ovis and other Brucella. Appl. Microbiol., 23,
894–902.
19. RIDLER A. (2001) Brucella ovis infection in deer. Surveillance, 28 (3), 6–8.
20. RIEZU-BOJ J.I., MORIYON I., BLASCO J.M., MARIN C.M. & DIAZ R. (1986). Comparison of lipopolysaccharide and
outer membrane protein-lipopolysaccharide extracts in an enzyme-linked immunosorbent assay for the
diagnosis of Brucella ovis infection. J. Clin. Microbiol., 23, 938–942.
21. RIS D.R., HAMEL K.L. & LONG D.L. (1984). Comparison of an enzyme-linked immunospecific assay (ELISA)
with the cold complement fixation test for the serodiagnosis of Brucella ovis infection. N. Z. Vet. J., 32, 18–
20.
22. RODOLAKIS A. & BERNARD K. (1977). Isolement de Chlamydia des organes génitaux de béliers atteints
d’épididymite. Bull. Acad. Vet. Fr., 50, 65–70.
23. SANTOS J.M., VERSTREATE D.R., PERERA V.Y. & W INTER A.J. (1984). Outer membrane proteins from rough
strains of four Brucella species. Infect. Immun., 46, 188–194.
24. SEARSON J.E. (1982). Sensitivity and specificity of two microtitre complement fixation tests for the diagnosis
of Brucella ovis infection in rams. Aust. Vet. J., 58, 5–7.
25. SPENCER T.L. & BURGESS G.W. (1984). Enzyme-linked immunosorbent assay for Brucella ovis specific
antibody in ram sera. Res. Vet. Sci., 36, 194–198.
26. VIGLIOCCO A.M., SILVA PAULO P.S., MESTRE J., BRIONES G.C., DRAGHI G., TOSSI M. & NIELSEN K. (1997).
Development and validation of an indirect enzyme immunoassay for detection of ovine antibody to Brucella
ovis. Vet. Microbiol., 54, 357–368.
27. VIZCAINO N., CLOECKAERT A., VERGER J.M., GRAYON M. & FERNANDEZ L. (2000). DNA polymorphism in the
genus Brucella. Microbes Infect., 2, 1089–1100.
28. WEBB R.F. (1983). Clinical findings and pathological changes in Histophilus ovis infections of sheep. Res.
Vet. Sci., 35, 30–34.
29. WEBB R.F., QUINN C.A., COCKRAM F.A. & HUSBAND A.J. (1980). Evaluation of procedures for the diagnosis of
Brucella ovis infection in rams. Aust. Vet. J., 56, 172–175.
30. WHITINGTON R.J., SAUNDERS V.F. & EGERTON J.R. (1996). Antigenic cross-reactions between the causative
agent of ovine footrot, Dichelobacter nodosus, and other bacteria. Small Rumin. Res., 22, 55–67.
31. W ILLIAMSON P. & NAIRN M.E. (1980). Lesions caused by Corynebacterium pseudotuberculosis in the scrotum
of rams. Aust. Vet. J., 56, 496–498.
32. WORTHINGTON R.W., STEVENSON B.J. & DE LISLE G.W. (1985). Serology and semen culture for the diagnosis of
Brucella ovis infection in chronically infected rams. N.Z. Vet. J., 33, 84–86.
33. WORTHINGTON R.W., WEDDELL W. & PENROSE M.E. (1984). A comparison of three serological tests for the
diagnosis of B. ovis infection in rams. N.Z. Vet. J., 32, 58–60.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Epididimitis ovina (Brucella ovis) (ver Cuadro en la parte
3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista actualizada:
www.oie.int)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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CAPÍTULO 2.4.2.
BRUCELOSIS CAPRINA Y OVINA
(No debida a Brucella ovis)
RESUMEN
La principal causa de la brucelosis caprina y ovina es Brucella melitensis (biotipos 1, 2 y 3). Se han
observado casos esporádicos causados por B. abortus, pero la enfermedad clínica es rara.
Brucella melitensis es endémica en la región mediterránea, pero la infección está extendida por
todo el mundo. Se considera que América del Norte (excepto Méjico) está libre del agente, como
ocurre en el norte de Europa, sudeste de Asia, Australia y Nueva Zelanda.
Clínicamente, la enfermedad se caracteriza por uno o más de los siguientes síntomas: aborto,
retención placentaria, orquitis, epididimitis y, raramente, artritis, con excreción de los
microorganismos en descargas uterinas y en la leche. El diagnóstico depende del aislamiento de
Brucella de material de abortos, de secreciones de la ubre o de tejidos extraídos post-mortem. El
diagnóstico preliminar se puede hacer determinando respuestas específicas mediadas por células
o respuestas serológicas frente a los antígenos de Brucella.
Brucella melitensis es muy patógena para el hombre y causa una de las zoonosis más graves del
mundo. Todos los tejidos infectados, los cultivos y el material potencialmente contaminado, deben
manejarse a un alto nivel de contención para bioriesgos.
Identificación del agente: La evidencia preliminar de Brucella se obtiene por demostración de la
morfología de Brucella, mediante la tinción de los microorganismos mediante la técnica modificada
para alcohol-ácido resistentes , en material de abortos o descargas vaginales, especialmente si tal
demostración está apoyada por pruebas serológicas. Los métodos recientemente desarrollados,
basados en la reacción en cadena de la polimerasa, constituyen medios adicionales de detección.
Siempre que sea posible, las especies de Brucella deben aislarse por cultivo de descargas uterinas
o tejidos seleccionados, como ganglios linfáticos, testículos o epidídimos, usando medios normales
o selectivos. Las especies y biotipos deben identificarse mediante lisis por fagos y por criterios de
cultivo, bioquímicos y serológicos.
Pruebas serológicas y alérgicas cutáneas: La prueba del rosa de bengala de aglutinación en
placa y la de fijación de complemento se recomiendan para análisis de rebaños y de animales
individuales. La prueba de aglutinación del suero no se considera fiable para utilizarla en pequeños
rumiantes. Para grupos de muestras , no existen pruebas útiles, como la prueba del anillo de leche
en el ganado bovino. La prueba alérgica cutánea con brucelina puede utilizarse como una prueba
de análisis o complementaria en rebaños no vacunados, siempre que se utilice una preparación
purificada y estandarizada de antígeno libre de lipopolisacárido (LPS). Los resultados deben
interpretarse con relación a los síntomas clínicos, la historia, y los resultados de exámenes
serológicos y de cultivo.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Brucella melitensis cepa Rev.1
continúa siendo la vacuna de referencia para inmunizar ovejas y cabras con riesgo de infección por
B. melitensis, y respecto a la cual se debe comparar cualquier otra vacuna. La producción de
antígenos de Brucella o de vacuna Rev.1 se basa en un sistema de lotes de inóculos. Los cultivos
de siembra usados como antígenos para pruebas serológicas y cutáneas y como vacunas deben
originarse en centros de referencia. Deben cumplir unos estándares mínimos en cuanto a
viabilidad, uniformidad (colonias lisas), infectividad residual e inmunogenicidad, si resultaran
aplicables. Las preparaciones de brucelina para la prueba intradérmica deben carecer de
644
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.2. — Brucelosis caprina y ovina (No debida a Brucella ovis)
lipopolisacárido liso y no producir reacciones inflamatorias inespecíficas o interferir con pruebas
serológicas. Los antígenos para diagnóstico serológico deben prepararse de cepas lisas de B.
abortus, cepas 1119-3 o 99, y satisfacer un mínimo de estándares para pureza, sensibilidad y
especificidad.
A. INTRODUCCIÓN
La brucelosis en ovejas y cabras (no debida a Brucella ovis) está causada principalmente por uno de
los tres biotipos de B. melitensis. Se han observado en cabras y ovejas casos esporádicos debidos a B. abortus
o B. suis, pero los síntomas clínicos son raros. Patológica y epidemiológicamente, la infección de ovejas y cabras
por B. melitensis es muy similar a la infección del ganado bovino por B. abortus (ver Capítulo 2.3.1. Brucelosis
bovina). En la mayoría de los casos, la ruta primaria de transmisión de Brucella es la placenta, los líquidos fetales
y las descargas vaginales expelidas por las ovejas y cabras infectadas cuando abortan o cuando tienen un parto
a término. La excreción de Brucella es también común en secreciones de la ubre y en el semen y se puede aislar
Brucella de varios tejidos, como los ganglios linfáticos de la cabeza y los asociados con la reproducción, y
también de lesiones artríticas (2).
La brucelosis se ha descrito igualmente en el camello de una joroba (Camelus dromedarius) y de dos jorobas
(C. bactrianus) y parece relacionada con contactos con grandes y pequeños rumiantes infectados con B. abortus
o B. melitensis. Además se ha observado brucelosis debida a B. abortus en el búfalo doméstico (Bubalus
bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus
elaphus) y también en el búfalo americano (Synceris caffer) y varias especies de antílopes africanos. Las
manifestaciones de la brucelosis en estos animales son similares a las del ganado bovino u ovejas y cabras.
El manual de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de bioseguridad para laboratorios clasifica a Brucella (y
en particular a B. melitensis) en el Grupo de Riesgo III. La brucelosis es muy transmisible al hombre y causa una
enfermedad febril aguda -la fiebre ondulante- que puede progresar hasta una forma crónica y producir graves
complicaciones que afectan al músculo esquelético, sistema cardiovascular y sistema nervioso central. A
menudo la infección se debe a una exposición ocupacional y se adquiere fundamentalmente por vía oral,
respiratoria o conjuntival, aunque, para el público en general, la ingestión de productos lácteos constituye el
principal riesgo. Los veterinarios y granjeros que manejan animales infectados y fetos abortados o placentas
presentan un riesgo ocupacional. La brucelosis es una de las infecciones más fáciles de adquirir en el laboratorio
y deben observarse precauciones muy estrictas de seguridad cuando se manejan cultivos y muestras muy
infectadas, como los productos del aborto. Se han realizado recomendaciones específicas sobre precauciones
de seguridad a observar con materiales contaminados por Brucella (para más detalles, ver el Capítulo I.1.6.
Seguridad humana en el laboratorio veterinario de microbiología y referencias 1, 28, 67 y 68 del Capítulo 2.3.1.
Brucelosis bovina). La manipulación de cultivos vivos o de material contaminado de animales infectados en el
laboratorio es peligrosa, así como el manejo de grandes volúmenes de Brucella, y debe realizarse bajo un nivel
de contención 3 o superior, como indica el Capítulo I.1.6, para reducir la exposición ocupacional.
La evidencia genética e inmunológica indica que todos los miembros del género Brucella están estrechamente
relacionados y se ha propuesto (aunque aún no se ha aceptado por el Subcomité de Taxonomía) que el género
contiene una única especie de la que las especies clásicas (B. abortus, B. melitensis, etc.) serían meros biotipos
(para una revisión, ver el Capítulo 2.3.1., referencia 36). No obstante, hay diferencias reales en cuanto a la
preferencia de hospedadores y a la epidemiología mostrada por las principales variantes, así como evidencia
molecular de variación genómica. Desde un punto de vista práctico, es conveniente mantener la clasificación en
las seis especies clásicas consideradas: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis.
Las primeras tres se subdividen en biotipos según propiedades de cultivo y serológicas (ver Cuadros 1 y 2 en el
Capítulo 2.3.1). En la última década se han aislado cepas de Brucella de mamíferos marinos que no pueden
adjudicarse a ninguna de las especies anteriormente reconocidas. Hay investigaciones en marcha para
establecer su correcta posición taxonómica y se ha propuesto que pudieran corresponder a dos nuevas especies
del género, B. cetaceae y B. pinnipediae (ver Capítulo 2.3.1, referencias 10 y 18). Finalmente, Brucella muestra
una estrecha relación genética con algunos patógenos vegetales y simbiontes de los géneros Agrobacterium y
Rhizobium, así como con patógenos animales (Bartonella) y bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum).
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
Consultar el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina.
2.
Pruebas serológicas
Cuando el examen bacteriológico no resulta practicable, el diagnóstico de la infección por Brucella se basa con
frecuencia en métodos serológicos (2, 18). Los anticuerpos anti-Brucella se detectan en el suero por pruebas
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
645
Capítulo 2.4.2. — Brucelosis caprina y ovina (No debida a Brucella ovis)
rutinarias. Los procedimientos más utilizados para el diagnóstico de infecciones por cepas lisas de Brucella en
ovejas y cabras son las pruebas con antígeno de Brucella tamponado, es decir la de aglutinación en tarjeta y la
de aglutinación de rosa de bengala (RB) en placa, que son esencialmente idénticas, y la prueba de fijación de
complemento (CFT). La prueba del anillo de leche, que ha sido tan útil en el ganado bovino, resulta ineficaz en
los pequeños rumiantes.
Los métodos más ampliamente utilizados en los pequeños rumiantes son la prueba RB (RBT) y la CFT. La RBT
no es completamente específica, pero resulta adecuada como prueba de análisis preliminar para la detección de
rebaños infectados o para garantizar la ausencia de infección en rebaños libres de brucelosis. No obstante,
debido a la relativa falta de sensibilidad de ambos métodos, no son raras las discrepancias entre los resultados
obtenidos por RBT y CFT en poblaciones de ovejas y cabras infectadas (6): Los resultados de ambas pruebas
deben, por tanto, considerarse simultáneamente para aumentar la posibilidad de detectar individuos afectados y
mejorar el control de la enfermedad en áreas donde no se ha erradicado por completo (1, 4, 6). Si en programas
de erradicación no se puede utilizar en paralelo la CFT con la RBT, por razones prácticas o económicas, se
recomienda mejorar la sensibilidad de la RBT utilizando 75 µl de suero y 25 µl de antígeno en lugar de
volúmenes iguales. Esta sencilla modificación aumenta la sensibilidad de la RBT y disminuye las discrepancias
entre los resultados de las dos pruebas (6). Como los anticuerpos inducidos por Rev.1 no pueden distinguirse de
los inducidos por la cepa salvaje, las pruebas serológicas de la brucelosis deben interpretarse en función del
estado de vacunación del rebaño. Además estas pruebas no son lo suficientemente específicas como para
diferenciar reacciones serológicas debidas a B. melitensis de las reacciones falsas positivas (FPSR) debidas a
bacterias con reacción cruzada como Yersinia enterocolitica O:9.
Se han obtenido buenos resultados diagnósticos en ovejas y cabras con enzimoinmunoensayos (ELISAs)
indirectos o competitivos utilizando varios antígenos pero, en general, los de alto contenido en lipopolisacárido
(LPS) de tipo liso son los más fiables. Estos ELISAs tienen una sensibilidad similar o mejor que que RBT y que
CFT, pero como las pruebas clásicas, las pruebas ELISA son incapaces de distinguir entre animales infectados y
animales vacunados recientemente con la vacuna Rev.1 (19) o animales infectados con bacterias con reacción
cruzada. Se ha aplicado una proteína periplásmica muy inmunogénica de B. abortus (20) y B. melitensis (11) al
diagnóstico de la brucelosis en varias especies hospedadoras. ELISAs indirectos y competitivos con este
antígeno pueden ser pruebas sensibles y específicas para diagnosticar la infección por B. melitensis en ovejas, y
se ha descrito que son capaces de diferenciar entre animales vacunados con Rev.1 y animales infectados (10,
13). Todos estos ELISAs tienen ventajas potenciales en sensibilidad y especificidad respecto a RBT y CFT, pero
aún se necesita mucho trabajo sobre la estandarización de los reactivos utilizados para el diagnóstico de la
infección por B. melitensis en ovejas y cabras (15).
•
Sueros de referencia
El suero primario de referencia para la estandarización de RBT y CFT en ovejas y cabras es el Suero Estándar
Internacional de la OIE (OIEISS; ver Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina)
•
Producción de células
Consulte el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina. Las únicas cepas recomendadas para la preparación de RBT y
CFT en ovejas y cabras son las cepas 99 o 1119 de Brucella abortus serotipo 1.
a)
Prueba de antígeno de Brucella tamponado (prueba prescrita para el comercio internacional)
•
Prueba del rosa de bengala de aglutinación en placa
Consulte el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina.
•
Producción de antígeno
Consulte el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina. Adviértase que normalmente se utiliza antígeno RB producido
con B. abortus para pruebas de B. melitensis.
•
Procedimiento de la prueba
Consulte el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina.
b)
Prueba de fijación de complemento (prueba prescrita para el comercio internacional)
•
Producción de antígeno
Consulte el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina. Adviértase que normalmente se utiliza antígeno FC producido
con B. abortus para pruebas de B. melitensis.
646
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.2. — Brucelosis caprina y ovina (No debida a Brucella ovis)
•
Procedimiento de la prueba
Consulte el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina.
3.
Otras pruebas
a)
Prueba cutánea de la brucelina
Una prueba alternativa de diagnóstico es la prueba cutánea de la brucelina, que puede utilizarse para
analizar rebaños no vacunados siempre que se emplee una preparación antigénica purificada y
estandarizada (libre de LPS) (por ejemplo, brucelina INRA).
La prueba cutánea de la brucelina tienen una elevada sensibilidad para el diagnóstico de la infección por B.
melitensis en pequeños rumiantes y, en ausencia de vacunación, se considera la prueba diagnóstica más
específica (2, 4, 15, 17). Esta prueba tiene un valor particular para interpretar FPSR debidos a infección con
bacterias que muestran reacción cruzada (los animales con FPSR siempre son negativos en la prueba
cutánea), especialmente en áreas libres de brucelosis.
Pese a su elevada sensibilidad no todos los animales infectados de brucelosis son positivos en esta prueba
y, además, los animales vacunados con Rev.1 pueden reaccionar durante años a la misma (15). Por ello,
esta prueba no se recomienda como diagnóstico único o a efectos del mercado internacional.
Para obtener resultados adecuados es esencial utilizar preparaciones estandarizadas de brucelina que no
contengan LPS, ya que este antígeno puede provocar reacciones inflamatorias mediadas por anticuerpos o
inducir anticuerpos que interfieren con el posterior análisis serológico. Una preparación de ese tipo es la
brucelina INRA, que se prepara a partir de una cepa rugosa de B. melitensis y está comercializada1.
•
Procedimiento de la prueba
i)
En el párpado inferior se inyecta intradérmicamente 0,1 ml de brucelina
ii)
La prueba se estima a las 48 horas
iii)
Cualquier reacción visible o palpable de hipersensibilidad, como una reacción edematosa que provoca
una elevación de la piel o un engrosamiento del párpado (> 2 mm), se considera una reacción positiva.
Aunque en ausencia de vacunación la prueba con brucelina intradérmica es una de las pruebas más
específicas de la brucelosis, el diagnóstico no se debe de hacer basándose exclusivamente en reacciones
intradérmicas positivas y debe estar apoyado por pruebas serológicas adecuadas. La inoculación
intradérmica de brucelina puede provocar una anergia temporal en la respuesta inmune celular. Se
recomienda por tanto un intervalo de 6 semanas entre dos pruebas repetidas en el mismo animal.
b)
Pruebas con hapteno nativo
Las pruebas de precipitación en gel basadas en haptenos nativos2 (ver Capítulo 2.3.1) son también
interesantes para ovejas y cabras ya que son muy específicas para distinguir las respuestas serológicas de
animales infectados (positivos) y de animales vacunados con Rev.1 (normalmente negativos).
La sensibilidad diagnóstica óptima (cerca del 90%) se obtiene por pruebas de doble difusión en gel (DGD) o
inmunodifusión radial inversa para ovejas y cabras, respectivamente (14, 19).
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
C1. Brucelina
Consulte el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina.
1
2
Brucellergène OCB®, Synbiotics Europe, 2 rue Alexander Fleming, 69007 Lyon, France.
El procedimiento detallado puede obtenerse del Departamento de Sanidad Animal, Servicio de Investigación Agraria
DGA, Apartado 727, 50080 Zaragoza, España.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.4.2. — Brucelosis caprina y ovina (No debida a Brucella ovis)
C2. Vacunas
Vacuna con Brucella melitensis cepa Rev.1
La vacuna de uso más extendido para la prevención de la brucelosis en ovejas y cabras es la vacuna de Brucella
melitensis Rev.1, que continúa siendo la vacuna de referencia con la que comparar otras vacunas. La vacuna
Rev.1 se utiliza como una suspensión liofilizada de B. melitensis viva, biotipo 1, cepa Rev.1, para inmunizar
ovejas y cabras. Normalmente se suministra a corderos y cabritos a los 3-6 meses de edad por inyección
subcutánea única. La dosis estándar está entre 0,5 x 109 y 2 x 109 organismos viables. La vacunación
subcutánea induce fuerte interferencia en pruebas serológicas y no se recomienda en programas combinados
del erradicación (14, 19). Sin embargo, cuando esta vacuna se administra vía conjuntival a corderos y cabritos de
3-6 meses produce una protección similar sin inducir una respuesta de anticuerpos persistente, facilitando así la
aplicación de programas de erradicación combinados con vacunación (14, 19). Cuando se utiliza la vacuna
Rev.1 se debe tener cuidado en evitar la contaminación del ambiente o causar infección en humanos. En muchos
países en desarrollo y en áreas endémicas, la vacunación de toda la población es la mejor opción para el control
de la enfermedad (5). Sin embargo, se sabe que la vacuna Rev.1 causa a menudo abortos y excreción del
microorganismo en la leche cuando los animales se vacunan durante la gestación, con dosis completa o reducida
(5). Estos efectos laterales se reducen considerablemente cuando los animales adultos se vacunan
conjuntivalmente (dosis completa) antes de la monta o durante el último mes de la gestación. En consecuencia,
cuando la vacunación masiva es el único medio de controlar la enfermedad, se debe recomendar una campaña
de vacunación utilizando la dosis estándar de Rev.1 administrada por vía conjuntival cuando los animales no
están gestantes o después de los partos (5).
La vacunación subcutánea de animales jóvenes y la vacunación de adultos, incluso con dosis reducidas,
conduce a una persistencia duradera de anticuerpos vacunales en una gran proporción de animales vacunados,
lo que crea importantes interferencias en el diagnóstico serológico de la brucelosis. Como se ha indicado, la
vacunación conjuntival reduce este problema. Por tanto, el diagnóstico serológico de la brucelosis debe tener en
cuenta el estado de vacunación del rebaño y la distribución global de frecuencias de los títulos de anticuerpos
detectados en el grupo de animales probados.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
El inóculo original de Brucella melitensis biotipo 1 cepa Rev.1 para producción de vacunas se puede
obtener comercialmente3. Recientemente, la Farmacopea Europea4 ha producido una cepa europea
Rev.1 de referencia que posee las características del inóculo Rev.1 original.
La producción de vacunas vivas de Brucella se basa en el sistema de lotes de siembra descrito antes
(Sección B.2.) para los antígenos de RBT y CFT. Las cepas deben cultivarse en un medio adecuado. La
cepa Rev.1 debe tener las propiedades de B. melitensis biotipo 1, salvo que debe crecer más lentamente.
Además, cuando se incuba en aire (las atmósferas con CO2 alteran los resultados) a 37°C, crece en medio
sólido con estreptomicina (2,5 µg/ml) y su crecimiento se inhibe en presencia de bencilpenicilina sódica
(3 µg [5 Unidades Internacionales]/ml), tionina (20 µg/ml) o fucsina básica (20 µg/ml). Recientemente, se ha
utilizado para una caracterización adicional de la vacuna la amplificación por medio de la reacción en
cadena de la polimerasa y otras técnicas moleculares (3, 12). También debe cumplir las características del
inóculo original en cuanto a virulencia residual e inmunogenicidad en ratones.
b)
Método de cultivo
Entre los medios sólidos satisfactorios para multiplicar la cepa Rev.1 están el agar suero-dextrosa y el agar
tripticasa-soja, a los que se puede añadir 5% de suero o 0,1% de extracto de levadura (2, 21). La cepa
Rev.1 no crece bien en agar patata.
Para la producción de vacuna, Rev.1 se puede cultivar en condiciones similares a las descritas para S99 y
S1119-3 (ver Capítulo 2.3.1.), excepto que Rev.1 suele necesitar 3-5 días para crecer, se sustituye la
solución salina con fenol por un estabilizador para liofilización, y los microorganismos no se inactivan sino
que se guardan a 4°C mientras se realiza el examen de control de calidad que se describe más adelante.
Además, se recomienda específicamente en la producción de vacunas con Rev.1 que: cada lote de inóculo
(es decir, el cultivo empleado como siembra del medio para la producción de vacuna) no debe tener más de
tres pases del inóculo original y que la recogida de un lote de vacuna no tenga más de tres pases de un lote
3
4
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Disponible en Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Laboratoire de Pathologie Infectieuse et
Immunologie, 37380 Nouzilly, Francia.
Disponible en European Pharmacopoeia, BP 907, 67029 Strasbourg Cedx 1, France.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.2. — Brucelosis caprina y ovina (No debida a Brucella ovis)
de inóculo o de un inóculo original. Antes de uso, se debe realizar un cultivo del inóculo original para
verificar la ausencia de disociación. El método recomendado para preparar material de inóculo se presenta
en la referencia 2. El siguiente estabilizador para liofilización (esterilizado por filtración) es de valor
demostrado: hidrolizado enzimático de caseína (2,5 g); sacarosa (5 g); glutamato sódico (1 g); agua
destilada (100 ml).
c)
Validación como vacuna
Diversos estudios independientes confirman el valor de la cepa Rev.1 de B. melitensis como vacuna para
proteger ovejas y cabras de la brucelosis. Su virulencia no cambia por pases en ovejas o cabras gestantes.
Pueden presentarse abortos cuando la vacuna Rev.1 se inocula en ovejas o cabras gestantes. Los
abortos inducidos por la vacuna no se evitan con dosis reducidas, y dosis con una concentración tan baja
como 106, usadas subcutánea o conjuntivalmente, inducen abortos y aparición de microorganismos de la
vacuna en la leche (5).
Una vacuna Rev.1 es eficaz si posee las características de la cepa original Rev.1, es decir, las de B.
melitensis biotipo 1, cepa de referencia 16M (ATCC No. 23456), excepto aquellas específicas para la cepa
Rev.1 (2, 17), y si resulta ser satisfactoria respecto a inmunogenicidad y virulencia residual (8) (ver más
adelante).
2.
Método de fabricación (2, 21)
Para la producción de vacuna de B. melitensis cepa Rev.1, se pueden seguir los procedimientos descritos antes
para los antígenos (2) excepto que las células se recogen en un estabilizador para liofilización y se precipitan por
centrifugación. Una producción individual está constituida por la masa obtenida de un fermentador o la masa de
las células agrupadas de una serie de cultivos en frascos Roux que fueron inoculados a la vez con el mismo lote
de inóculo. Se puede juntar más de una producción individual para formar el producto final utilizado para rellenar
los recipientes de un lote de vacuna. Antes de juntarse, cada producción individual debe probarse respecto a
pureza, concentración celular, disociación e identidad. El volumen del producto final se ajusta añadiendo el
suficiente estabilizador para que contenga un número apropiado de microorganismos viables. Después de ajustar
la concentración celular, se llevan a cabo pruebas para comprobar la identidad, ausencia de disociación y
ausencia de organismos contaminantes (ver más adelante).
3.
Control del proceso
Deben realizarse controles del proceso verificando el crecimiento de la vacuna Rev.1 en medio sólido y líquido
para comprobar la identidad y asegurar pureza y ausencia de disociación a formas rugosas durante la
preparación de los lotes de inóculo, recogidas individuales, acumulación final y lotes de llenado. Al menos el 99%
de las células en los lotes de inóculo y el 95% de las células en los lotes finales deben estar en la fase lisa.
La concentración celular debe establecerse en las preparaciones acumuladas y determinarse con precisión en
los lotes finales. La inmunogenicidad y la virulencia residual (50% del tiempo de persistencia o 50% del tiempo de
recuperación) debe también determinarse tanto en los lotes de inóculo como en los lotes finales.
4.
Control de lotes
Con vacuna liofilizada, las pruebas de control deben realizarse con la vacuna reconstituida en la forma en que se
va a utilizar.
a)
Esterilidad (o ausencia de microorganismos extraños)
La vacuna Rev.1 debe ser probada para comprobar la ausencia de contaminación bacteriana y fúngica
como se describe en el Capítulo I.1.5.
b)
Inocuidad
La vacuna Rev.1 es per se un producto virulento y debe mantenerse con virulencia mínima para que sea
eficaz (ver Sección C2.4.c. del Capítulo 2.3.1.). Se debe realizar una prueba de inocuidad en ovejas y
cabras cuando se inicia un nuevo proceso de fabricación o cuando se espera una modificación de la
inocuidad de la preparación de la vacuna. Este control debe realizarse como sigue: la prueba utiliza
12 corderos y 12 cabritos hembras de 4-6 meses. Seis hembras jóvenes de cada especie se inoculan con
una o tres dosis recomendadas. Cada lote se mantiene por separado. Todos los animales se observan
durante 21 días y no deben presentarse reacciones locales o sistémicas. Si la prueba da buenos resultados
para una dosis y una vía de administración concretas con un lote representativo de la vacuna, no tiene que
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
649
Capítulo 2.4.2. — Brucelosis caprina y ovina (No debida a Brucella ovis)
repetirse en lotes de inóculo o de vacuna preparados con el mismo inóculo original y con el mismo proceso
de fabricación.
c)
Potencia
Una vacuna Rev.1 es eficaz si presenta las mismas características que la cepa original Rev.1, es decir, si
es satisfactoria respecto a identidad, uniformidad, inmunogenicidad y virulencia residual (9). Los lotes
también deben probarse para determinar el número de microorganismos viables.
•
Identidad
La vacuna Rev.1 reconstituida no debe contener microorganismos extraños. La Brucella melitensis
presente en la vacuna se identifica por pruebas morfológicas, serológicas y bioquímicas y por cultivo
incubando en aire a 37°C. La cepa Rev.1 se inhibe por adición a un medio adecuado de 3 µg (5 UI)
por ml de bencilpenicilina sódica, tionina (20 µg/ml) o fucsina básica (20 µg/ml); la cepa crece en
medio sólido con 2,5 µg por ml de estreptomicina.
•
Uniformidad (determinación de disociación de fase)
Consultar el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina.
A veces se pueden ver en el tamaño de las colonias de Rev.1 pequeñas diferencias difíciles de
observar. Las colonias pequeñas (de 1-1,2 mm de diámetro) son típicas de Rev.1 pero pueden
aparecer colonias mayores dependiendo del medio utilizado, de la cantidad de humedad en la
atmósfera de incubación y de la presencia o ausencia de CO2. La frecuencia de variación del tamaño
colonial se presenta por lo general en una proporción de 1 colonia grande por cada 103 pequeñas.
Ambas variante son de tipo liso (S). Para evitar un aumento de esta variación de tamaño en pases
sucesivos, es importante seleccionar siempre colonias pequeñas en la preparación de los lotes de
inóculo.
•
Determinación de bacterias vivas
Consultar el Capítulo 2.3.1. Brucelosis bovina.
•
Virulencia residual (tiempo de persistencia al 50% o tiempo de recuperación al 50%)
Los mismos procedimientos indicados para determinar el tiempo de recuperación al 50% (RT50) de la
vacuna S19 (ver Capítulo 2.3.1) se aplican a Rev.1, excepto que el lote de inóculo a probar de B.
abortus S19 (vacuna problema) y el cultivo de siembra original de S19 (cepa de referencia) se
reemplazan, respectivamente, por el correspondiente lote de inóculo de B. melitensis Rev.1 a probar
(vacuna problema) y por el cultivo original de siembra de B. melitensis Rev.1 como cepa de referencia.
Para la cepa original de referencia Rev.1, RT50 y los límites de confianza son 7,9 + 1,2 semanas. Para
ser eficaz, un lote de inóculo concreto de vacuna Rev.1 debe mantener una virulencia residual similar.
Si esta prueba da buenos resultados con un lote representativo de la vacuna problema, no tiene que
repetirse en lotes de inóculo o de vacuna preparados con el mismo inóculo original y con el mismo proceso
de fabricación
•
Inmunogenicidad en ratones
Los mismos procedimientos indicados para determinar la inmunogenicidad de la vacuna S19 (ver
Capítulo 2.3.1) se aplican a Rev.1, excepto que el lote de inóculo a probar de B. abortus S19 (vacuna
problema) y el cultivo de siembra original de S19 (cepa de referencia) se reemplazan,
respectivamente, por el correspondiente lote de inóculo de B. melitensis Rev.1 a probar (vacuna
problema) y por el cultivo original de siembra de B. melitensis Rev.1 como cepa de referencia.
Las condiciones del experimento control son satisfactorias cuando: i) la respuesta en ratones no
vacunados (media de Y) es al menos de 4,5; la respuesta en ratones vacunados con la vacuna de
referencia Rev.1 es menor de 2,5; y iii) la desviación estándar calculada en cada lote de seis ratones
es inferior a 0,8.
Si esta prueba da buenos resultados con un lote representativo de la vacuna problema, no tiene que
repetirse en lotes de inóculo o de vacuna preparados con el mismo inóculo original y con el mismo proceso
de fabricación
d)
Duración de la inmunidad
Se acepta que la vacunación subcutánea o conjuntival de ovejas y cabras con dosis estándar de
Rev.1 confiere una inmunidad sólida y duradera. Sin embargo, la evidencia en el campo indica que la
inmunidad adquirida desciende con el tiempo, y se recomienda la revacunación en áreas endémicas.
650
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.2. — Brucelosis caprina y ovina (No debida a Brucella ovis)
El uso de dosis reducidas de Rev.1 produce una inmunidad menos efectiva, mientras que los efectos
laterales, como las respuestas de anticuerpos o la inducción de aborto, no se eliminan por completo.
e)
Estabilidad
La vacuna con la cepa Rev.1 preparada de stocks de inóculos de origen apropiado tiene propiedades
estables siempre que se cumpla el control del proceso y de lotes antes descrito y no muestre tendencia a
reversión de la virulencia. La vacuna liofilizada exhibe una pérdida gradual de microorganismos viables,
pero debe mantener su potencia durante el periodo de vida útil recomendado. Esto se logra asegurando
que el número de viables inmediatamente después de la liofilización supere en mucho el mínimo requerido.
El mantenimiento en frío durante la distribución de la vacuna asegura su viabilidad.
f)
Conservantes
En las vacunas vivas con Rev.1 no se deben utilizar conservantes antimicrobianos. Para la preparación de
la vacuna liofilizada se recomienda un estabilizador como se describe en la Sección C2.4.f. del Capítulo
2.3.1.
g)
Precauciones (riesgos)
Aunque Brucella melitensis Rev.1 es una cepa atenuada, es capaz de causar enfermedad en humanos. Los
cultivos celulares y las suspensiones deben manejarse en condiciones apropiadas de contención de
biorriesgo (ver Capítulo I.1.6). La reconstitución y posterior manipulación de la vacuna debe efectuarse con
cuidado para evitar la inyección accidental o la contaminación ocular o dérmica. Los residuos de vacunas y
de equipos de inoculación deben descontaminarse con un desinfectante adecuado (de composición
fenólica, iodófora o aldehídica) a la concentración recomendada. Debe buscarse consejo médico en caso
de exposición accidental. La eficacia del tratamiento de infecciones causadas por Rev.1 en humanos no se
ha establecido adecuadamente. Si ocurre una contaminación por Rev.1, se recomienda un tratamiento
combinado con deoxiciclina y rifampicina.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Ver sección C2.4.b del Capítulo 2.3.1.
b)
Potencia
Para vacuna liofilizada, la potencia debe determinarse en el producto final. Las pruebas son las descritas en
la Sección C2.4.c. del Capítulo 2.3.1.
REFERENCIAS
1.
ALTON G.G. (1990). Brucella melitensis. In: Animal Brucellosis, Nielsen K.H. & Duncan J.R., eds. CRC
Press, Boca Raton, Florida, USA, 383–409.
2.
ALTON G.G., JONES L.M., ANGUS, R.D. & VERGER J.M. (1988). Techniques for the Brucellosis Laboratory.
INRA, Paris, France.
3.
BARDENSTEIN S., MANDELBOIM M., FICHT T.A., BAUM M. & BANAI M. (2002). Identification of the Brucella
melitensis vaccine strain Rev.1 in animals and humans in Israel by PCR analysis of the PstI site
polymorphism of its omp2 gene. J. Clin. Microbiol., 40, 1475–1480.
4.
BLASCO J.M. (1992). Diagnosis of Brucella melitensis infection in small ruminants. In: Prevention of
Brucellosis in the Mediterranean Countries, Plommet M., ed. Pudoc Scientific, Wageningen, The
Netherlands, 272–277.
5.
BLASCO J.M. (1997). A review on the use of B. melitensis Rev 1 vaccine in adult sheep and goats. Prev. Vet.
Med., 31, 275–283.
6.
BLASCO J.M., GARIN-BASTUJI B., MARIN C.M., GERBIER G., FANLO J., JIMENEZ DE BAGUES M.P. & CAU C. (1994).
Efficacy of different rose bengal and complement fixation antigens for the diagnosis of Brucella melitensis
infection in sheep and goats. Vet. Rec., 134, 415–420.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
651
Capítulo 2.4.2. — Brucelosis caprina y ovina (No debida a Brucella ovis)
7.
BOSSERAY N. (1991). Brucella melitensis Rev.1 attenuated vaccine: Stability of markers, residual virulence
and immunogenicity in mice. Biologicals, 19, 355–363.
8.
BOSSERAY N. (1992). Le vaccin Rev.1: dérive des caractères d’immunogénicité et de virulence indépendante
des marqueurs classiques. In: Prevention of Brucellosis in the Mediterranean Countries, Plommet M., ed.
Pudoc Scientific, Wageningen, The Netherlands, 182–186.
9.
BOSSERAY N. (1993). Control methods and thresholds of acceptability for anti-Brucella vaccines. Dev. Biol.
Stand., 79, 121–128.
10. CLOECKAERT A., BAUCHERON S., VIZCAINO N. & ZYGMUNT M.S. (2001). Use of recombinant BP26 protein in
serological diagnosis of Brucella melitensis infection in sheep. Clin. Diag Lab. Immunol., 8, 772–775.
11. CLOECKAERT A., DEBBARH H.S., VIZCAINO N., SAMAN E., DUBRAY G. & ZYGMUNT M.S. (1996). Cloning, nucleotide
sequence and expression of the Brucella melitensis bp26 gene coding for a protein immunogenic in infected
sheep. FEMS Microbiol. Lett., 140, 139–144.
12. CLOECKAERT A., GRAYON M. & GRÉPIENT O. (2002). Identification of Brucella melitensis vaccine strain Rev.1
by PCR-RFLP based on a mutation in the rpsL gene. Vaccine, 20, 2546–2550.
13. DEBBARH H.S., ZYGMUNT M.S., DUBRAY G. & CLOECKAERT A. (1996). Competitive ELISA using monoclonal
antibodies to the Brucella melitensis bp26 protein to evaluate antibody response in infected and
B. melitensis Rev1 vaccinated sheep. Vet. Microbiol., 53, 325–337.
14. DÍAZ-APARICIO E., MARÍN C., ALONSO B., ARAGÓN V., PÉREZ S., PARDO M., BLASCO J.M., DÍAZ R. & MORIYÓN I.
(1994). Evaluation of serological tests for diagnosis of Brucella melitensis infection of goats. J. Clin.
Microbiol., 32, 1159–1165.
15. GARIN-BASTUJI B., BLASCO J.M., GRAYON M. & VERGER J.M. (1998). Brucella melitensis infection in sheep:
present and future. Vet. Res., 29, 255–274.
16. GRILLO M.J., BOSSERAY N. & BLASCO J.M. (2000). In vitro markers and biological activity in mice of seed lot
strains and commercial Brucella melitensis Rev.1 and Brucella abortus B19 vaccines. Biologicals, 28, 119–
127.
17. JOINT FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS/W ORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT
COMMITTEE ON BRUCELLOSIS (1986). Technical Report Series 740, Sixth Report. WHO, Geneva, Switzerland.
18. MACMILLAN A. (1990). Conventional serological tests. In: Animal Brucellosis, Nielsen K.H. & Duncan J.R.,
eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 153–197.
19. MARIN C.M., MORENO E., MORIYON I., DIAZ R. & BLASCO J.M. (1999) Performance of competitive and indirect
enzyme-linked immunosorbent assays, gel immunoprecipitation with native hapten polysaccharide, and
standard serological tests in diagnosis sheep brucellosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 6, 269–272.
20. ROSSETTI O., ARESE A., BOSCHIROLI L. & CRAVERO S. (1996). Cloning of Brucella abortus gene and
characterisation of expressed 26 kilodalton periplasmic protein: potential use for diagnosis. J. Clin.
Microbiol., 34, 165–169.
21. WORLD HEALTH ORGANIZATION (1977). Requirements for Brucella melitensis strain Rev.1 vaccine (Live – for
veterinary use). World Health Organization (WHO) Technical Report Series No. 610, 28th Report, Annex 4.
WHO, Geneva, Switzerland, 85–97.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Brucelosis ovina y caprina (excluida la Brucella ovis)
(véase el Cuadro de la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consúltese la Web de la OIE para una
lista actualizada: www.oie.int).
652
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO 2.4.3.
AGALAXIA CONTAGIOSA
RESUMEN
La agalaxia contagiosa es una enfermedad grave de ovejas y cabras que se caracteriza por
mamitis, artritis, queratoconjuntivitis y, en ocasiones, por aborto. En ovejas y cabras la causa
principal de la enfermedad es Mycoplasma agalactiae, pero M. capricolum subespecie capricolum
(Mcc), M. mycoides subespecie mycoides LC (MmmLC; LC = colonias grandes) y M. putrefaciens
producen una enfermedad clínicamente similar, más frecuente en cabras, que puede acompañarse
de neumonía. En camélidos sudamericanos (alpacas, llamas y vicuñas) se han detectado
anticuerpos contra MmmLC y Mcc, pero no se han aislado micoplasmas.
Identificación del agente: El diagnóstico definitivo requiere el aislamiento de los micoplasmas
causantes a partir de los animales afectados, que se identifican por pruebas bioquímicas,
serológicas y, cada vez más, moleculares, del tipo de la reacción en cadena de la polimerasa. La
leche, los frotis oculares y de oído, y los líquidos articulares son las muestras más adecuadas. Los
cuatro micoplasmas crecen relativamente bien en la mayor parte de los medios para micoplasmas.
Pruebas serlógicas: La detección de anticuerpos en el suero por la prueba de fijación de
complemento o enzimoinmunoensayo (ELISA) proporciona un diagnóstico rápido de la
enfermedad pero pueden resultar poco sensibles en rebaños con infección crónica. Con
frecuencia, para analizar rebaños se han utilizado pruebas ELISA indirectas en programas de
control de M. agalactiae. Para confirmar la infección en áreas consideradas libres de agalaxia
contagiosa resulta generalmente necesario el aislamiento y la identificación. Las pruebas
serológicas para M. putrefaciens no están muy extendidas.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: En Europa meridional se utilizan
con frecuencia vacunas comerciales inactivadas con formalina contra M. agalactiae, pero no se
consideran muy eficaces. En condiciones experimentales, las vacunas contra M. agalactiae
inactivadas con saponina o con fenol resultan más protectoras que las inactivadas con formalina.
En Turquía se utilizan vacunas vivas contra M. agalactiae, y se ha descrito que confieren más
protección que las vacunas inactivadas. En algunos países se emplean vacunas autógenas contra
MmmLC y, en ocasiones, contra Mcc. No existen vacunas contra M. putrefaciens debido a que la
enfermedad que causa no se considera suficientemente grave o extendida
A. INTRODUCCIÓN
La agalaxia contagiosa es una enfermedad conocida desde hace casi 200 años que se caracteriza por mamitis,
artritis y queratoconjuntivitis. Se presenta en Europa, Asia occidental, los EE.UU. y norte de África, y está
causada sobre todo por Mycoplasma agalactiae (5). En los últimos años, en muchos países también se han
aislado de ovejas y cabras con mamitis y artritis M. capricolum subespecie capricolum (Mcc) y M. mycoides
subespecie mycoides LC (MmmLC; LC = colonias grandes). Los síntomas clínicos de estas infecciones fueron lo
suficientemente similares a los de la agalaxia contagiosa como para inducir a Perreau (23) a sugerir que estas
infecciones también se pueden considerar como agalaxia contagiosa. Además, M. putrefaciens también causa
mamitis y artritis en cabras, que son indistinguibles de las originadas por M. agalactiae, MmmLC y Mcc (10). El
acuerdo del grupo de trabajo sobre agalaxia contagiosa de la Acción COST1 826 de la Comunidad Europea
sobre micoplasmosis en rumiantes, que se reunió en Tolouse, Francia, en 1999, estableció que los cuatro
micoplasmas deben ser considerados como agentes etiológicos de la agalaxia contagiosa.
1
Cooperación Europea en el área de Investigación Científica y Técnica
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
653
Capítulo 2.4.3. — Agalactia contagiosa
La enfermedad causada por M. agalactiae se puede reconocer clínicamente por una temperatura elevada,
inapetencia, alteraciones en la consistencia de la leche en ovejas productoras, con descenso y ulterior
desaparición de la producción láctea, cojera y, en algunos animales, queratoconjuntivitis (5). Las hembras
gestantes pueden abortar. En ocasiones, se puede encontrar Mycoplasma agalactiae en lesiones pulmonares
(17), pero la presencia de neumonía no es un síntoma constante. La aparición de bacteremia es común, sobre
todo en el caso de MmmLC y Mcc, y podría explicar el aislamiento del microorganismo de sitios donde se
presenta sólo esporádicamente.
Como resultado de la infección con MmmLC puede aparecer mamitis, artritis, pleuresía, neumonía y
queratoconjuntivitis. MmmLC presenta una de las distribuciones geográficas más amplias de los micoplasmas de
rumiantes, encontrándose en todos los continentes que crían pequeños rumiantes y donde se describe la
agalaxia contagiosa y la pleuroneumonía caprina, incluyendo Sudamérica (5, 19); no obstante, la falta en muchos
países de servicios de diagnóstico para enfermedades producidas por micoplasmas hace que su presencia sea
probablemente minusvalorada. MmmLC está fundamentalmente restringido a las cabras, pero en ocasiones se
ha aislado de ovinos con balanopostitis y vulvovaginitis (35) y del ganado bovino (24). Por lo general los casos
son esporádicos, pero la enfermedad puede ser persistente y extenderse lentamente dentro de un rebaño.
Después del parto, aumenta la oportunidad de diseminación en animales lactantes, pues los cabritos que toman
el calostro y la leche infectada resultan afectados. La septicemia que se origina, con artritis y neumonía, da lugar
a una elevada mortalidad en los cabritos (9, 30).
Mcc está distribuido ampliamente y es muy patógeno, sobre todo en el norte de África (4), pero la frecuencia de
su aparición es baja (5). Las cabras son más afectadas por lo general que las ovejas, y los síntomas clínicos de
fiebre, septicemia, mamitis y artritis aguda pueden conducir con rapidez a la muerte (5, 6). En las necropsias se
puede observar neumonía. Las lesiones articulares graves que se ven en infecciones experimentales con este
microorganismo se acompañan de un edema periarticular subcutáneo que afecta a tejidos distantes de la
articulación (6). Como consecuencia de un brote esporádico de infección por Mcc se observaron en Inglaterra
lesiones genitales en ovejas (13).
Mycoplasma putrefaciens es corriente en rebaños de cabras de leche en Europa occidental, y puede aislarse de
animales con síntomas clínicos o sin ellos (18). En California, EE. UU., también se asoció con un brote extenso
de mamitis y agalaxia, que condujo a artritis aguda en cabras y que se acompañó de abortos y muertes (pero sin
pirexia) (10). En España, Mycoplasma putrefaciens fue el causante principal de un brote de poliartritis en cabritos
(29).
En los camélidos de Sudamérica, como las llamas, alpacas y vicuñas, se han detectado anticuerpos contra
MmmLC y Mcc, pero no contra M. agalactiae, aunque no se han aislado todavía los micoplasmas (20). Estos
camélidos se presentan afectados de una serie de enfermedades semejantes a las producidas por micoplasmas,
como poliartritis y neumonía, de modo que es probable que en el futuro se detecten micoplasmas que incluyan
MmmLC y Mcc.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación de los agentes
a)
Selección de las muestras
Las muestras preferidas a partir de animales vivos son: frotis nasales y secreciones; leche de hembras con
mamitis o de hembras con apariencia sana pero con una alta mortalidad o morbilidad en las crías; líquido
articular en casos de artritis; frotis oculares en casos de enfermedad ocular; sangre para detección de
anticuerpos de animales afectados y no afectados (21). El canal auricular también es una fuente muy rica
de micoplasmas patógenos, aunque en la práctica la presencia en esta zona de micoplasmas no patógenos
puede hacer difícil la confirmación (8). Los micoplasmas se pueden aislar de la sangre durante la fase
aguda de la enfermedad cuando hay micoplasmemia. En el caso de animales muertos, las muestras deben
incluir: nódulos linfáticos de la ubre y nódulos asociados con ella, líquido articular, tejido pulmonar (de la
zona entre el tejido afectado y el sano) y líquido pleural/pericárdico. Las muestras deben enviarse con
rapidez al laboratorio de diagnóstico, acondicionadas con humedad y en frío. Los cuatro micoplasmas
responsables son relativamente fáciles de aislar de órganos internos, articulaciones y leche, y crecen bien
en la mayoría de los medios de cultivo para micoplasmas, originando en 3-4 días colonias de tamaño
mediano a grande.
b)
Medios de micoplasmas
La técnica normal empleada en el aislamiento de micoplasmas es válida para los cuatro micoplasmas
responsables (21). Se han descrito muchos medios para cultivar estos micoplasmas. La composición del
medio de Eaton, de aplicación general es la siguiente:
654
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.3. — Agalactia contagiosa
En 700 ml de agua destilada se disuelven 21 g de medio base (sin cristal violeta) para PPLO (organismos
semejantes a los de la peluroneumonía) de Becton Dickinson (Oxford, Inglaterra). Al caldo base para PPLO
se añaden 100 ml de extracto de levadura recién preparado, 200 ml de suero de caballo sin calentar, 1 g de
glucosa, 0,5 ml de ampicilina (200.000 Unidades Internacionales [UI]/ml), y 12,5 ml de rojo fenol al 0,2%. Se
ajusta el pH entre 7,6 y 7,8 y se esteriliza por filtración. Para preparar el medio sólido, se añaden 10 g de
agar LabM No.1 (Bury, Inglaterra), o de un agar de calidad equivalente, y se distribuye en placas de Petri
estériles.
Para reducir la contaminación bacteriana de las muestras clínicas, puede ser necesario añadir como
componente del medio de transporte acetato de talio (250 mg/litro), que es tóxico e inhibidor para algunos
micoplasmas, pero no para los que causan agalaxia contagiosa, aunque debería de omitirse una vez que
los micoplasmas comiencen a crecer in vitro. Una alternativa adecuada al acetato de talio puede ser sulfato
de colistina (37,5 mg/ml).
•
Procedimiento de la prueba
i)
Hacer diluciones decimales (101-106) de la muestra líquida (leche, líquido sinovial, frotis oculares o del
oído) o del homogenizado tisular en medio líquido apropiado.
ii)
Extender unas cuantas gotas de cada muestra en el medio sólido y distribuir un inóculo del 10% (v/v)
en el medio líquido.
iii)
Extender directamente los frotis en el medio sólido.
iv)
Incubar los medios líquidos inoculados (con preferencia con agitación suave) y los medios sólidos a
37°C en una atmósfera con humedad y con 5% de dióxido de carbono.
v)
Examinar diariamente los caldos de cultivo para observar signos de crecimiento (indicados por una
turbidez fina u opalescencia) o para detectar variaciones en el pH indicadas por cambios de color, y
examinar los medios sólidos a aumentos de x35 para detectar las típicas colonias con aspecto de
“huevo frito”.
vi)
Si no se observa crecimiento de micoplasmas después de 7 días, volver a cultivar un inóculo del 10%
(v/v) del cultivo en medio líquido fresco y extender 50 µl de éste en medio sólido.
vii)
Repetir el paso (v). Si no se observan micoplasmas después de 21 días de incubación, los resultados
se consideran negativos.
viii) Si aparece contaminación bacteriana (detectable por una turbidez excesiva), esterilizar por filtración
pasando 1 ml del caldo contaminado por un filtro de 0,45 µm y llevar a medio líquido fresco.
Con frecuencia las muestras clínicas contienen más de una especie de micoplasma, por lo que se
considera necesario purificar las colonias por clonación antes de realizar la identificación serológica, en
particular cuando se trata de las pruebas de inhibición de crecimiento y de formación de láminas (GIT y FIT,
respectivamente). Sin embargo, la clonación es un proceso largo que dura al menos 2 semanas. La prueba
de inmunofluorescencia (7), las de inmunounión puntual (26) y, más recientemente, las pruebas basadas en
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (ver sección B.1.e) no requieren clonación ya que estas
pruebas pueden detectar los micoplasmas patógenos en cultivos mixtos, con el consiguiente ahorro de
tiempo.
c)
Pruebas bioquímicas
La primera prueba que debe realizarse en los aislamientos clonados es la de la susceptibilidad a la
digitonina, que permite separar a los micoplasmas de los acoleplasmas; estos últimos son contaminantes
comunes cuyo crecimiento puede encubrir los micoplasmas de interés. Entre las pruebas más útiles para
diferenciar los cuatro micoplasmas está el cultivo en medio líquido con glucosa (1%), arginina (0,2%) y
difosfato de fenoftaleína (0,01%), el cultivo en medio sólido con suero de caballo o yema de huevo para la
demostración de formación de membranas o manchas, y el cultivo sobre caseína o suero coagulado en
agar para la prueba de proteolisis (27). Sin embargo, cada vez con mayor frecuencia, se ha visto que estas
características bioquímicas pueden ser variables para los micoplasmas individuales y por tanto tienen poco
valor diagnóstico. La característica bioquímica más destacable que diferencia M. putrefaciens de los otros
micoplasmas es el olor a putrefacción que produce en medio líquido. Otras características que pueden ser
útiles incluyen: la producción de films y manchas en la superficie del caldo y en medio sólido causada por
M. agalactiae, y en menor medida por M. putrefaciens; y la actividada proteolítica de Mcc y MmmLC sobre
caseína y suero coagulado.
Recientemente se ha descrito una prueba bioquímica rápida y muy práctica que se basa en la actividad C8esterasa de M. agalactiae (14). Después de añadir el substrato cromogénico SLPA-octanoato (un éster de
nueva síntesis formado por un ácido graso de 8 átomos de carbono y un cromóforo fenólico) el micoplasma
forma colonias rojizas en medios sólidos en 1 hora. Esta actividad es compartida por M. bovis, aunque este
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
655
Capítulo 2.4.3. — Agalactia contagiosa
micoplasma se encuentra raramente en los pequeños rumiantes. Los aislamientos no necesitan clonación
puesto que M. agalactiae puede detectarse con facilidad en cultivos mixtos. Para distinguir con rapidez
entre M. agalactiae y M. bovis pueden utilizarse pruebas de PCR si fuera necesario (ver sección B.1.e).
d)
Identificación serológica
La identificación de los aislamientos utilizando antisueros específicos se suele realizar mediante las pruebas
GIT, FIT (28) o por la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) (7). Una prueba de inmunounión puntual
recientemente desarrollada, que se realiza en placas de microtitulación, ofrece muchas mejoras (rapidez,
mejores rendimientos) respecto a otras pruebas (26). Para M. agalactiae, la inhibición de la formación de
films puede ser a menudo más fiable ya que la inhibición del crecimiento no se observa con todos los
aislamientos; también puede utilizarse para serodiagnóstico. La producción de films por los micoplasmas
puede inducirse incorporando una suspensión de yema de huevo al 10% en los medios sólidos.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Inocular al menos dos diluciones de cultivos líquidos clonados (10-1 y 10-2) en medios sólidos presecados, permitiendo que 50 µl de los cultivos recorran la placa inclinada utilizando la técnica de la
“gota pendiente” (21). Extraer con una pipeta el líquido sobrante.
ii)
Dejar secar las placas. Es posible aplicar dos o tres gotas pendientes bien separadas en cada placa
de 90 mm.
iii)
Aplicar al cultivo discos de papel de filtro que contengan 30 µl de antisuero específico; asegurar una
adecuada separación de los discos (al menos 30 mm).
iv)
Incubar las placas como si se tratara de cultivos de micoplasmas y examinar ocularmente cada día
contra un fondo luminoso.
•
Interpretación de los resultados
Una zona de inhibición superior a 2 mm, medida desde el disco de papel al borde del crecimiento del
micoplasma, se considera significativa. Puede ocurrir una inhibición parcial con antisuero débil o en
condiciones de cultivo mixto. Se obtienen reacciones más fuertes si se añaden 60 µl de antisuero a pocillos
de 6 mm de diámetro realizados en el agar con un agujereador para corchos o un instrumento similar (28).
En la prueba IFI, se aplican antisueros específicos a colonias en medio sólido. El antisuero homólogo
permanece unido después de lavados y se demuestra añadiendo antiglobulina conjugada con fluoresceína,
lavando a continuación, y observando las colonias con un microscopio de epifluorescencia (7). Deben
incluirse microorganismos conocidos como controles positivos y negativos, y un suero control negativo.
Tradicionalmente los antisueros para estas pruebas serológicas se han preparado contra las cepas tipo de
las diversas especies de Mycoplasma, y la mayoría de los aislamientos de campo se identifican fácilmente
utilizando estos antisueros. Sin embargo, a medida que se van examinando más cepas, se han encontrado
algunas que reaccionan muy débilmente con estos antisueros, aunque reaccionan bien con antisueros
contra otras cepas representativas de la especie. En M. putrefaciens no se ha descrito la variación
intraespecífica en composición antigénica, pero ocurre en alguna medida con cepas de M. agalactiae y de
Mcc. Por tanto, puede resultar necesario que los laboratorios de diagnóstico dispongan de varios antisueros
capaces de identificar todas las cepas de las especies.
e)
Métodos de reconocimiento de los ácidos nucleicos
En muchos laboratorios se utilizan ensayos de PCR que son muy sensibles. Cuando se utilizan con
muestras clínicas, pueden suponer un sistema rápido de alerta que permite una investigación más completa
en el caso de que los resultados sean positivos. No obstante, los resultados negativos no deben
considerarse definitivos. Se han desarrollado varios ensayos de tipo PCR que son específicos para M.
agalactiae y que muestran niveles similares de sensibilidad aunque se basan en secuencias genómicas
diferentes (11, 31, 32). Pueden utilizarse directamente con muestras nasales, oculares, sinoviales o
tisulares; se han usado con muestras lácteas y se ha descrito que resultan más sensibles que el cultivo
(32), aunque en ocasiones la presencia de inhibidores indefinidos puede interferir con la prueba (5). Las
PCRs también se pueden utilizar, con más fiabilidad, sobre micoplasmas creciendo en cultivo. Un resultado
positivo debe confirmarse por aislamiento e identificación del micoplasma mediante procedimientos
estándar, particularmente en un área anteriormente libre de agalaxia contagiosa.
Se han descrito pruebas de PCR para MmmLC y Mcc (3) y en la actualidad está siendo sometida a
evaluación en Inglaterra una prueba de PCR para M. putrefaciens.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.3. — Agalactia contagiosa
•
Procedimiento de la prueba
Los siguientes cebadores, que se basan en el gen uvrC, son específicos para M. agalactiae (31). Cada
laboratorio puede necesitar optimizar las condiciones de PCR. En cada ensayo deben incluirse ADNs
control positivos y negativos.
MAGAUVRC1-L
CTC-AAA-AAT-ACA-TCA-ACA-AGC
MAGAUVRC1-R
CTT-CAA-CTG-ATG-CAT-CAT-AA
i)
Extraer el ADN de aislados de Mycoplasma o de material clínico utilizando el método apropiado (3).
ii)
Realizar los métodos de PCR en mezclas de reacción de 50 µl que contienen: 1 µl de ADN muestra,
20 pmoles de cada cebador (ver arriba), 1 mM de cada dNTP, 10 mM de Tris/HCl, pH 8.3, 1,5 mM de
MgCl2, 50 mM KCl y 1,25 mU de ADN polimerasa Taq.
iii)
Someter la muestra a 35 ciclos de amplificación en un termociclador con los parámetros siguientes:
30 segundos a 94°C, 30 segundos a 50°C temperatura de enfriamiento y 1 minuto a 72°C.
iv)
Analizar los productos de la PCR por electroforesis en agarosa al 0,7%, a 110 V durante 2 horas, y
visualizar tiñendo con bromuro de etidio. Un fragmento de 1,7 kb indica la presencia de M. agalactiae.
2.
Pruebas serológicas
a)
Fijación de complemento
Perreau et al. (25) describieron una prueba estándar de fijación de complemento (FC) para M. agalactiae
que se ha aplicado también a otros micoplasmas relacionados con el síndrome de la agalaxia contagiosa.
Los antígenos se preparan de microorganismos lavados, estandarizados mediante opacidad, que se lisan
por ultrasonidos o mediante lauril sulfato sódico y que a continuación se dializan. Los sueros se inactivan a
60°C durante 1 hora, y la prueba se realiza en placas de microtitulación con fijación durante toda la noche
en frío o a 37°C durante 3 horas. Se añade el sistema hemolítico y la prueba se lee después de que la lisis
completa aparezca en el control de antígeno. Para los micoplasmas siguientes, un resultado positivo es la
fijación completa a una dilución del suero de 1/40 o superior: M. agalactiae, Mcc y MmmLC. La prueba de
fijación de complemento se considera como una prueba poblacional y al menos se prueban diez sueros de
cada rebaño, con preferencia de casos agudos y de convalecencia.
Utilizando M. agalactiae algunos sueros de rebaños sanos reaccionan en esta prueba hasta una dilución de
1/20, pero raramente reaccionan con los otros dos antígenos. Sin embargo, en rebaños infectados con M.
agalactiae, los sueros que dan una reacción homóloga a 1/80 pueden presentar reacción cruzada con los
otros dos antígenos hasta 1/40, que es el umbral positivo. A menudo es difícil realizar la prueba de fijación
de complemento si la calidad de los sueros problema es baja; cuando es posible, se prefiere la realización
de enzimoinmunoensayos (ELISA).
b)
Enzimoinmunoensayo
Para la detección de anticuerpos contra M. agalactiae se ha descrito que las pruebas ELISA que utilizan
antígenos sonicados o tratados con Tween 20 son más sensibles que la prueba FC (5). Los problemas de
inespecificidad se han superado utilizando en la prueba conjugados monoclonales o de proteína G (15). La
utilización de estos conjugados posibilita el probar sueros de un amplio espectro de especies de mamíferos,
que incluye a los camélidos. Existen varios kits ELISA comercializados que están siendo utilizados en
Francia e Inglaterra para análisis a gran escala (5, 20). En una reunión sobre ensayos de pruebas
serológicas para M. agalactiae organizado en 1998 bajo los auspicios de la Acción 826 COST de la
Comunidad Europea para las micoplasmosis en rumiantes, las preparaciones ELISA comerciales
funcionaron mejor que las preparaciones “caseras”.
En la actualidad hay pruebas ELISA disponibles para los otros tres micoplasmas causantes de la
enfermedad, aunque en algunos laboratorios se realizan pruebas “caseras”.
c)
Prueba de inmunotransferencia
Las pruebas de inmunotransferencia se han descrito como las más sensibles y específicas para
M. mycoides subespecie mycoides SC, que es el agente etiológico de la pleuroneumonía bovina contagiosa
(ver Capítulo 2. 1. 6.). También se han descrito pruebas de inmunotransferencia para M. agalactiae (20, 33).
Se observaron bandas notables de aproximadamente 80 y 55 kDa con sueros con anticuerpos frente a
M. agalactiae, mientras que con sueros de rebaños sanos no se apreciaron bandas o fueron muy débiles y
de diferentes tamaños. La dilución de los sueros a 1/50 mejora la diferenciación entre sueros positivos y
negativos (20).
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Capítulo 2.4.3. — Agalactia contagiosa
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
En los países mediterráneos europeos y en el oeste asiático se emplean mucho las vacunas para prevenir la
agalaxia contagiosa debida a M. agalactiae. No se ha adoptado universalmente ninguna vacuna concreta y no se
han desarrollado métodos estándar de preparación y evaluación.
1.
Vacunas para la infección por Mycoplasma agalactiae
a)
Vacunas inactivadas para la infección por Mycoplasma agalactiae
En Europa, donde no son aceptables las vacunas vivas para M. agalactiae, se ha centrado la atención en el
uso de microorganismos muertos, fundamentalmente empleando formalina y un adyuvante como el
hidróxido de aluminio en emulsión con aceite. Los títulos de las preparaciones antes de la inactivación son
muy altos (108-1010 unidades formadoras de colonias por ml) y derivan de cepas de laboratorio. En
algunas partes de Italia se han utilizado durante muchos años vacunas autógenas hechas a partir de leche
y homogenizados de cerebro y glándula mamaria de ovejas infectadas, aunque su eficacia no ha sido
probada. Es probable, sin embargo, que su uso se descarte debido a la reciente relación establecida con
brotes graves de scrapie en ovejas y cabras (1).
En España, una vacuna inactivada con formol ha suministrado alguna protección en infecciones
experimentales de cabras con M. agalactiae pero, a pesar de tres vacunaciones anuales durante 6 años, no
se evitó la enfermedad clínica tras la introducción de animales con infección natural (16). Además las
vacunas inactivadas con formol no redujeron la presencia de M. agalactiae en la leche en comparación con
animales control infectados (22). En algunos casos es posible que la aparente falta de protección por las
vacunas pueda ser el resultado de la infección con uno de los otros cuatro micoplasmas implicados en el
síndrome de la agalaxia contagiosa (12).
Más recientemente, las vacunas inactivadas con fenol o con saponina han permitido una protección
superior en infecciones experimentales en comparación con las vacunas tratadas con formalina, hipoclorito
sódico o inactivadas por calor (34).
b)
Vacunas vivas para la infección por Mycoplasma agalactiae
En Turquía se han utilizado durante muchos años vacunas vivas atenuadas contra M. agalactiae y se ha
descrito que proporcionan una mejor protección en ovejas y corderos que las vacunas inactivadas (36). Sin
embargo, pueden producir una infección transitoria con excreción de micoplasmas.
Las vacunas vivas no deben utilizarse en animales lactantes y deben formar parte de un plan regional en el
que se vacunen simultáneamente todos los rebaños cuyos animales sea probable que entren en contacto.
2.
Vacunas para infección por Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC
Existe poca información reciente publicada sobre la disponibilidad de vacunas contra MmmLC, aunque se piensa
que las vacunas inactivadas son de amplia utilización en muchos países mediterráneos, lo que sugiere que su
producción y empleo son localizados (5). En ensayos experimentales en Israel, una preparación de MmmLC
inactivada con formalina y emulsionada con aceite mineral y sorbitol suministró alguna protección contra una
infección virulenta a cabritos de 1 día y de 6 semanas de edad (2). Excepto en lo que se refiere a unas cuantas
pruebas de campo, la vacuna no se ha usado nunca con amplitud debido a que la frecuencia de la enfermedad
causada por MmmLC ha descendido notablemente en las dos últimas décadas.
3.
Mycoplasma capricolum subsp. capricolum y M. putrefaciens
Aunque las infecciones por Mcc y M. putrefaciens son graves, su prevalencia es relativamente baja y, como es
previsible, se ha realizado muy poco trabajo relacionado con la vacunación preventiva de estas infecciones.
REFERENCIAS
1.
AGRIMI U., RU G., CARDONE F., POCCHIARI M. & CARAMELLI M. (1999). Epidemic of transmissible spongiform
encephalopathy in sheep and goats in Italy. Lancet, 353, 560–561.
2.
BAR-MOSHE B., RAPAPPORT E. & BRENNER J. (1984). Vaccination trials against Mycoplasma mycoides subsp.
mycoides (large-colony type) infection in goats. Israel J. Med. Sci., 20, 972–974.
658
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.3. — Agalactia contagiosa
3.
BASHIRUDDIN J.B., TAYLOR T.K. & GOULD A.R. (1994). A PCR-based test for the specific identification of
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC in clinical material. J. Vet. Diagn. Invest., 6, 428–434.
4.
BENKIRANE A., AMGHAR S. & KIRCHHOFF H. (1993). Analysis of membrane proteins of Mycoplasma capricolum
strains by SDS-PAGE and immunoblotting. J. Vet. Med. B, 40, 119–124.
5.
BERGONIER D., BERTHOLET X. & POUMARAT F. (1997). Contagious agalactia of small ruminants: current
knowledge concerning epidemiology, diagnosis and control. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 16, 848–873.
6.
BOLSKE G., MSAMI H., HUMLESLO N.E, ERNO H. & JONSSON L. (1988). Mycoplasma capricolum in an outbreak
of polyarthritis and pneumonia in goats. Acta Vet. Scand., 29, 331–338.
7.
BRADBURY J.M. (1998). Identification of mycoplasmas by immunofluorescence. En: Mycoplasma Protocols,
Miles R.J. & Nicholas R.A.J., eds. Humana Press, Totowa, USA, 119–125.
8.
DA MASSA A.J. & BROOKS D.L. (1991). The external ear canal of goats and other animals as a mycoplasma
habitat. Small Rum. Res., 4, 85–93.
9.
DA MASSA A.J., BROOKS D.L. & ADLER H.E. (1983). Caprine mycoplasmosis: widespread infection in goats
with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (large-colony type). Am. J. Vet. Res., 44, 322–325.
10. DA MASSA A.J., BROOKS D.L., HOLMBERG C.A. & MOE A.I. (1987). Caprine mycoplasmosis: an outbreak of
mastitis and arthritis requiring the destruction of 700 goats. Vet. Rec., 120, 409–413.
11. DEDIEU L., MADY V. & LEFEVRE P. C. (1995). Development of two PCRs for the identification of mycoplasmas
causing contagious agalactia. FEMS Microbiol. Lett., 129, 243–250.
12. GIL M.C., HERMOSO DE MENDOZA M., REY J., ALONSO J.M. POVEDA J.B. & HERMOSO DE MENDOZA J. (1999).
Aetiology of caprine contagious agalactia syndrome in Extramudura, Spain. Vet. Rec., 144, 24–25.
13. JONES G.E., RAE A.G., HOLMES R.G., LISTER S.A., JONES J.M., GRATER G.S. & RICHARDS N. (1983). Isolation of
exotic mycoplasmas from sheep in England. Vet. Rec., 113, 540.
14. KHAN L., LORIA G., ABU-AMERO K., NICHOLAS R.A.J., HALABLAB M. & MILES R.J. (2001). Distinctive biochemical
characteristics of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis. En: Mycoplasmas of Ruminants:
Pathogenicity, Diagnostics, Epidemiology and Molecular Genetics, Vol. 5, Poveda J.B., Fernandez A., Frey
J. & Johansson K.-E., eds. European Commission, Brussels, Belgium, 60–63.
15. LAMBERT M., CALAMEL M., DU FOUR P., CABASSE E., VITU C. & PEPIN M. (1998). Detection of false-positive sera
in contagious agalactia with a multiantigen ELISA and their elimination with a protein G conjugate. J. Vet.
Diagn. Invest., 10, 326–330.
16. LEON VIZCAINO L., GARRIDO ABELLAN F., CUBERO PABLO M.J. & PERALES A. (1995). Immunoprophylaxis of
caprine contagious agalactia due to Mycoplasma agalactiae with an inactivated vaccine. Vet. Rec., 137,
266–269.
17. LORIA G.R., PIRANO C., W ORTH D.R., CARACAPPA S. & NICHOLAS R.A.J. (1999). Identification and antibiotic
susceptibility of mycoplasmas associated with contagious agalactia in Sicily. En: Mycoplasmas of
Ruminants: Pathogenicity, Diagnostics, Epidemiology and Molecular Genetics, Vol 3, Stipkovits L.,
Rosengarten R., Frey J., eds. European Commission, Brussels, Belgium, 116–118.
18. MERCIER P., LENFANT D., POUMARAT F. & PERRIN G. (2001). Prevalence of mycoplasma infection within French
milking caprine herds. En: Mycoplasmas of Ruminants: Pathogenicity, Diagnostics, Epidemiology and
Molecular Genetics, Vol. 5, Poveda J.B., Fernandez A., Frey J. & Johansson K.-E., eds. European
Commission, Brussels, Belgium, 130–133.
19. NASCIMENTO E.R., NASCIMENTO M.G.F., FREUNDT E.A. & ANDERSEN H. (1986). Isolation of Mycoplasma
mycoides from outbreaks of caprine mycoplasmosis in Brazil. Brit. Vet. J., 142, 246–257.
20. NICHOLAS R.A.J. (1998). Surveillance for contagious agalactia in Great Britain. En: Mycoplasmas of
Ruminants: Pathogenicity, Diagnostics, Epidemiology and Molecular Genetics, Vol. 2, Leori G., Santini F.,
Scanziani E. & Frey J., eds. European Commission, Brussels, Belgium, 95–97.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
659
Capítulo 2.4.3. — Agalactia contagiosa
21. NICHOLAS R.A.J. & BAKER S.E. (1998). Recovery of mycoplasmas from animals. En: Mycoplasma Protocols,
Miles R.J. & Nicholas R.A.J. eds. Humana Press, Totowa, USA, 37–44.
22. PEPIN M., SANCHIS R., ABADIE G., LAMBERT M., DUFOUR P. & GUIBERT J.-M. (2001). Experimental vaccination
against Mycoplasma agalactiae using an inactivated vaccine. En: Mycoplasmas of Ruminants:
Pathogenicity, Diagnostics, Epidemiology and Molecular Genetics, Vol. 5, Poveda J.B., Fernandez A., Frey
J. & Johansson K.-E., eds. European Commission, Brussels, Belgium, 162–165.
23. PERREAU P. (1979). Les mycoplasmoses de la chèvre. Cah. Med. Vet., 48, 71–85.
24. PERREAU P. & BIND J.L. (1981). Infection naturelle du veau par Mycoplasma mycoides subsp. mycoides
(biotype chevre). Bull. Acad. Vet. Fr., 52, 575–581.
25. PERREAU P., LE GOFF C. & GIAUFFRET A. (1976). Le diagnostic sérologique de l’agalactie contagieuse des
petits ruminants: un test de fixation du complément. Bull. Acad. Vet. Fr., 49, 185–192.
26. POUMARAT F.(1998). Identification of mycoplasmas by dot immunobinding on membrane filtration (MF Dot).
En: Mycoplasma Protocols, Miles R.J. & Nicholas R.A.J., eds. Humana Press, Totowa, USA, 113–118.
27. POVEDA J.B. (1998). Biochemical characteristics in mycoplasma identification. En: Mycoplasma Protocols,
Miles R.J. & Nicholas R.A.J., eds. Humana Press, Totowa, USA, 69–78.
28. POVEDA J.B. & NICHOLAS R.A.J. (1998). Serological identification of mycoplasmas by growth and metabolic
inhibition tests. En: Mycoplasma Protocols, Miles R.J. & Nicholas R.A.J., eds. Humana Press, Totowa, USA,
105–111.
29. RODRIGUEZ J.L., POVEDA J.B., GUTIERREZ C., ACOSTA B. & FERNANDEZ A. (1994). Polyarthritis in kids
associated with Mycoplasma putrefaciens. Vet. Rec., 135, 406–407.
30. RODRIGUEZ J.L., POVEDA J.B., OROS J., HERRAEZ P., SIERRA M.A. & FERNANDEZ A. (1995). High mortality in
goats associated with the isolation of a strain of Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Large Colony
Type). J. Vet. Med. B, 42, 587–593.
31. SUBRAHAMANIAM S., BERGONIER D., POUMARAT F., CAPUAL S., SCHLATTER Y., NICOLET J. & FREY J. (1998).
Species identification of Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae based on the uvrC gene by PCR.
Mol. Cell. Probes, 12, 161–169.
32. TOLA S., ANGIOI A., ROCCHIGIANI A.M., IDINI G., MANUNTA D., GALLERI G. & LEORI G. (1997). Detection of
Mycoplasma agalactiae in sheep milk samples by polymerase chain reaction. Vet. Microbiol., 54, 17–22.
33. TOLA S., MANUNTA D., COCCO M., TURRININ F., ROCCHIGIANI A.M., IDINI G., ANGIOI A. & LEORI G. (1997).
Characterisation of membrane surface proteins of Mycoplasma agalactiae during natural infection. FEMS
Microbiol. Lett., 154, 355–362.
34. TOLA S., MANUNTA D., ROCCA S., ROCCHIGIANI A.M., IDINI G., ANGIOI A. & LEORI G. (1999). Experimental
vaccination of against Mycoplasma agalactiae using different inactivated vaccine. Vaccine 17, 2764–2768.
35. TRICHARD C.J.V., JORDAN P., PROZESKY L., JACOBSZ E.P. & HENTON M.M. (1993). The identification of
Mycoplasma mycoides subsp.mycoides LC as the aetiological agent of balanoposthitis and vulvovaginitis in
sheep in South Africa. Onderstepoort J. Vet. Res., 60, 29–37.
36. TURKASLAN J. (1990). Control of important mycoplasma diseases in Turkey with special emphasis on CCPP
and contagious agalactia. IOM Lett., 1, 184–185.
*
* *
660
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
CAPÍTULO 2.4.4/5.
ARTRITIS/ENCEFALITIS CAPRINA Y MAEDI—VISNA
RESUMEN
El Maedi–visna (MV) o neumonía progresiva ovina de las ovejas (NPO) y la artritis/encefalitis
caprina (AEC) de las cabras son infecciones víricas persistentes causadas por lentivirus
estrechamente relacionados. Los análisis filogenéticos por comparación de las secuencias
nucleotídicas del virus de MV (MVV) y del virus de la AEC (CAEV) han demostrado que se trata de
lentivirus muy relacionados. La principal vía de transmisión del virus de MV/NPO a corderos o del
CAEV a cabritos es a través del calostro o por la leche durante la lactancia. Se han identificado
lentivirus ovinos en la mayoría de los países que crían ovejas, con la notable excepción de
Australia y Nueva Zelanda. La distribución del CAEV es mayor en países industrializados y parece
coincidir con el movimiento internacional de razas europeas de cabras lecheras. Las formas
clínicas y subclínicas de MV y de AEC se asocian con lesiones inflamatorias progresivas por
células mononucleares en los pulmones, articulaciones, ubres y sistema nervioso central. La
mamitis con induración es común en ambas especies y su significación económica puede ser
subestimada. La característica principal en ovejas infectadas es una respiración dificultosa
asociada con emaciación causada por una neumonitis progresiva, mientras que en cabras la
principal enfermedad es una poliartritis. Sin embargo, la mayoría de las ovejas y cabras infectadas
por lentivirus son asintomáticas, aunque permanecen como portadores persistentes del virus y son
capaces de transmitir la infección por el calostro, la leche y las secreciones respiratorias. El
sistema más práctico y fiable de confirmar un diagnóstico de MV o de AEC es una combinación de
serología con examen clínico. Aunque la serología representa el método más económico para
diagnosticar animales con infección persistente y clínicamente normales, hay que tener en cuenta
que ocurren errores en las pruebas y que su frecuencia depende de los datos de eficacia de la
prueba serológica en particular que se utiliza. Los métodos serológicos son de mayor valor para el
análisis de poblaciones que para la detección de animales individuales seropositivos.
Identificación del agente: Se puede intentar el aislamiento de virus de casos clínicos o
subclínicos vivos co–cultivando leucocitos de sangre periférica o de leche con cultivos celulares
ovinos o caprinos adecuados, como células del plexo coroideo (MVV) o de la membrana sinovial
(CAEV). Sin embargo, esto resulta lento y no siempre eficaz. En las necropsias, el aislamiento de
virus es de realización más fácil mediante cultivos de los tejidos afectados, como pulmón, plexo
coroideo, membrana sinovial o ubres. Además se pueden obtener post–mortem macrófagos
alveolares del pulmón y co–cultivarlos con células susceptibles. Los efectos citopáticos son
característicos y consisten en la aparición de células estrelladas refráctiles y sincitios. La presencia
de MVV o de CAEV se puede confirmar mediante métodos de inmunomarcaje y por microscopía
electrónica.
Se han descrito métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos – reacción en cadena de la
polimerasa, Southern Blotting e hibridación in situ– que se usan en la actualidad en muchos
laboratorios para la detección rápida de los agentes.
Pruebas serológicas: La mayoría de las ovejas y cabras infectadas poseen anticuerpos
específicos detectables por varias pruebas serológicas diferentes. Dos de las más utilizadas son la
prueba de inmunodifusión en medio sólido y el enzimoinmunoensayo (ELISA). En la fecha de
publicación, se ha propuesto el ELISA como prueba prescrita para el comercio internacional.
Consulte la página web de la OIE para la versión más reciente de este capítulo. También se llevan
a cabo técnicas de inmunotransferencia de tipo Western y de inmunoprecipitación, pero sólo en
laboratorios especializados. Para poblaciones de cabras lecheras puede ser apropiada una prueba
de anticuerpos en leche. El tiempo requerido para la seroconversión después de la infección puede
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
661
Capítulo 2.4.4/5. — Artritis/encefalitis caprina y Maedi—Visna
ser relativamente prolongado e impredecible, suponiendo meses más que semanas. Sin embargo,
después de la seroconversión, la respuesta de anticuerpos persiste generalmente y las ovejas y
cabras que son positivas para anticuerpo se consideran portadoras de virus.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No hay productos biológicos
disponibles.
A. INTRODUCCIÓN
El Maedi–visna (MV) o neumonía progresiva ovina de las ovejas (NPO) y la artritis/encefalitis caprina (AEC) de
las cabras son infecciones víricas persistentes causadas por lentivirus estrechamente relacionados. Los análisis
filogenéticos por comparación de las secuencias nucleotídicas del virus de MV (MVV) y de la AEC (CAEV)
muestran claras indicaciones de una transmisión cruzada interespecífica entre ovejas y cabras de importancia
epidemiológica, sin demostrar qué virus ha surgido del otro (16, 19, 27, 32). Las enfermedades MV/NPO y AEC
se caracterizan por la persistencia duradera del agente causal en los monocitos y macrófagos del hospedador, y
por un tiempo variable entre la infección y la inducción de una respuesta de anticuerpos antivíricos
serológicamente detectable. La mayoría de las ovejas y cabras infectadas no manifiestan enfermedad clínica,
pero permanecen persistentemente infectadas y son capaces de transmitir virus (2–4).
Maedi–visna es un nombre islandés que describe dos de los síndromes clínicos reconocidos en ovejas
infectadas por el virus de MV (MVV). "Maedi" significa "respiración dificultosa" y describe la enfermedad asociada
a una neumonitis intersticial progresiva, y "visna" significa "contracción" o "deterioro", que son signos asociados
con una meningoencefalitis paralizante. Mientras la principal manifestación de la infección por MVV es una
enfermedad pulmonar progresiva, el principal síntoma clínico de la infección por CAEV es una poliartritis crónica
con sinovitis y bursitis. La encefalitis ocurre fundamentalmente por la infección de CAEV en cabritos de 2 a
6 meses de edad. En ambos síndromes se presenta mamitis con induración. Los pulmones de las ovejas
afectadas de MV no colapsan cuando se extraen del tórax y a menudo retienen la marca de las costillas. Los
pulmones y los ganglios linfáticos aumentan de peso (hasta 2–3 veces su peso normal). Las lesiones se
distribuyen por los pulmones, que se presentan uniformemente decolorados o moteados de color gris–marrón y
con una textura firme. Las ubres afectadas por MV presentan induración difusa y los ganglios linfáticos asociados
pueden agrandarse.
Cuando se sospecha un caso clínico de MV/NPO o AEC, se puede obtener la confirmación del diagnóstico
combinando la evaluación clínica, la serología y, cuando resulte necesario, el examen histológico de tejidos
adecuados recogidos en las necropsias. Los tejidos importantes para examen son los pulmones para la
neumonitis intersticial progresiva, el cerebro y la médula espinal para la meningoencefalitis, las ubres para la
mamitis con induración, las articulaciones afectadas y el líquido sinovial para la artritis y los riñones para la
vasculitis (5, 7, 8, 21, 22). La naturaleza de la reacción inflamatoria es similar en cada sitio y consiste en una
reacción intersticial de células mononucleares, en ocasiones con grandes agregados de células linfoides y
formación de folículo.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del antígeno
Normalmente no se intenta el aislamiento y la caracterización del MVV o del CAEV en el diagnóstico rutinario.
Debido a la naturaleza persistente de estas infecciones, el establecimiento de un estado positivo respecto a
anticuerpos es suficiente para identificar los portadores de virus. Sin embargo, debido a la lenta seroconversión
después de la infección, en animales infectados recientemente la serología puede ser negativa.
Existen dos enfoques para aislar el MVV y el CAEV: uno se utiliza con el animal vivo, y el segundo con tejidos de
necropsias.
a)
Aislamiento a partir del animal vivo
•
Virus Maedi—visna
El ADN del provirus de MV se transporta por los monocitos circulantes y los macrófagos tisulares. Por tanto
el aislamiento del virus a partir del animal vivo requiere disponer, con precauciones asépticas, de
preparaciones de leucocitos derivados de la sangre periférica o de la leche durante la lactancia, y cultivarlos
junto con células indicadoras. Con este fin se suelen utilizar células del plexo coroideo (SCP) de ovejas.
Estas células indicadoras se pueden preparar como cultivos de explantes primarios de corderos fetales o
recién nacidos que estén libres de virus y multiplicar su número después de tres o cuatro pases antes de
guardarlas en nitrógeno líquido. Las células SCP son adecuadas para co–cultivo hasta 10 o 15 pases.
662
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.4/5. — Artritis/encefalitis caprina y Maedi—Visna
Aunque las células continúan creciendo bien posteriormente, su susceptibilidad al MVV puede resultar
reducida.
Las preparaciones de leucocitos se pueden obtener de sangre periférica como capas leucocitarias por
centrifugación durante 15 minutos a 1.000 g de muestras tratadas con heparina, ácido etilén diamino tetra–
acético (EDTA) o citrato. Se aspiran las células, se suspenden en solución salina equilibrada de Hanks
(HBSS) y se purifican más mediante centrifugación a 400 g durante 40 minutos con una solución
amortiguadora adecuada (por ejemplo, con Ficoll Paque [Pharmacia]). Las células que se sitúan en la
interfase se lavan mediante centrifugación una o dos veces con HBSS a 100 g durante 10 minutos, y el
precipitado celular final se resuspende en medio a una concentración aproximada de 106 células/ml;
normalmente, las células se cultivan durante 10–12 días en bolsas de Teflon y después se añaden a una
monocapa lavada de células SCP ligeramente subconfluentes en un recipiente de 25 cm2 de área.
De modo similar, se pueden obtener los leucocitos de la leche, lavarlos por centrifugación, resuspenderlos y
finalmente añadirlos a cultivos de SCP en monocapa.
Estos cultivos se mantienen a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2, cambiando el medio y realizando
pases cuando sea necesario. Se examinan para evidenciar efecto citopático (ECP), que se caracteriza por
la aparición de células refráctiles estrelladas con procesos dendríticos y formación de sincitios. Los cultivos
deben mantenerse durante varias semanas antes de desecharlos como no infectados. Una vez que se
sospecha ECP deben prepararse cultivos en cubres. Éstos se fijan y se observa el antígeno vírico por
inmunomarcaje, por lo general mediante inmunofluorescencia indirecta o por métodos con
inmunoperoxidasa. Además, las células de cualquier monocapa que resulte sospechosa se depositan por
centrifugación y se realizan preparaciones para identificar partículas características de lentivirus por
microscopía electrónica de transmisión. La presencia en el sobrenadante del cultivo celular de transcriptasa
inversa es una indicación de la presencia de retrovirus.
•
Virus de la artritis/encefalitis caprina
Los mismos principios que se aplican en el aislamiento de MVV son aplicables al aislamiento de CAEV. El
CAEV se aisló originalmente mediante explante de la membrana sinovial de una cabra artrítica (5). Las
muestras más adecuadas de las que obtener preparaciones de leucocitos de cabras vivas infectadas por
CAEV son la sangre periférica, la leche y posiblemente el líquido aspirado de las articulaciones. Las células
de la membrana sinovial de la cabra (GSM) son células indicadoras adecuadas. Si se sospecha ECP, se
realizan pruebas para la detección del antígeno vírico, como se describe arriba.
b)
Aislamiento de tejidos de necropsias
•
Virus de la artritis/encefalitis caprina y virus Maedi—visna
Las muestras de los tejidos sospechosos tales como pulmón, membranas sinoviales, ubres, etc., se
recogen de modo aséptico y tan frescas como sea posible en HBSS estéril o en medio de cultivo celular. Se
trocean muy finamente en una placa Petri utilizando escalpelos y se recogen con una pipeta Pasteur
fragmentos individuales que se transfieren a recipientes de 25 cm2, colocando cuidadosamente en cada
recipiente unos 20–30 fragmentos y una gota de medio de crecimiento sobre cada uno de ellos. A
continuación los recipientes se incuban a 37°C en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 y se deja durante
unos días para que los explantes individuales se adhieran al plástico. Se puede añadir con cuidado medio
fresco y de los fragmentos empezarán a crecer células, Cuando exista suficiente crecimiento, los cultivos se
dispersan con tripsina para permitir el desarrollo de monocapas. Éstas se examinan para observar ECP y
cualquier sospecha de crecimiento vírico se confirma del mismo modo que en los co–cultivos.
Los cultivos de macrófagos adherentes son fáciles de establecer con material de lavados pulmonares
(lavado broncoalveolar post–mortem) y pueden probarse para producción vírica por pruebas serológicas,
microscopía electrónica o por ensayo de la transcriptasa inversa en 1–2 semanas. Los aislamientos víricos
se pueden llevar a cabo por co–cultivo de macrófagos con células SCP o GSM como se describe arriba
para los leucocitos.
c)
Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos
La mayoría de los laboratorios de diagnóstico de enfermedades víricas están equipados con los
procedimientos básicos para el cultivo celular antes descrito. Actualmente, muchos laboratorios pueden
llevar a cabo también métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos. En el caso de MVV y CAEV estos
métodos, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) seguida de transferencia tipo Southern e
hibridación in situ (15), se pueden aplicar a la detección y el reconocimiento de secuencias específicas del
ácido nucleico en el ADN del provirus MVV o CAEV. Se han descrito técnicas de PCR para la detección de
NPO y AEC que son de uso rutinario. Estas técnicas moleculares están jugando un papel importante en
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Capítulo 2.4.4/5. — Artritis/encefalitis caprina y Maedi—Visna
programas de erradicación como suplemento de la serología y para determinar el estado de infección en
animales que no pueden diagnosticarse definitivamente mediante serología (17).
Una importante cuestión sobre el uso de la PCR es su especificidad. Debido a la posibilidad de amplificar
secuencias del ADN genómico del hospedador, el producto amplificado debe comprobarse por hibridación,
tratamiento con endonucleasas de restricción dirigidas contra una secuencia interna o mediante
secuenciación del amplicón. La utilización de uno de estos procedimientos eliminará la posibilidad de falsos
positivos. La sensibilidad puede mejorarse con la utilización de PCR anidada.
2.
Pruebas serológicas
Las infecciones por lentivirus ovinos y caprinos son persistentes, de modo que la detección de anticuerpos es un
instrumento serológico útil para identificar a los portadores de virus. Los virus de MV y de NPO son
antigénicamente indistinguibles por métodos que emplean antisueros policlonales. Sin embargo, la estrecha
relación antigénica entre el MVV y el CAEV no supone la misma eficacia en su utilización para detectar
anticuerpos heterólogos (18).
Los ensayos de uso más común son la inmunodifusión en gel de agar (IGDA) (6, 10, 31) y el
enzimoinmunoensayo (ELISA) (13, 14, 33). La IGDA es específica, reproducible y fácil de realizar, pero se
requiere experiencia para interpretar los resultados. El ELISA es económico y algunas fases del proceso se
pueden automatizar, lo que hace posible el análisis de gran número de sueros. Sin embargo, la sensibilidad y
especificidad del ELISA depende de la calidad del antígeno. En el caso de los virus de MV/NPO o de AEC, la
producción de preparaciones antigénicas satisfactorias limita su aplicación rutinaria. Están apareciendo
modificaciones de ELISAs para MV/NPO y para AEC, como el uso de proteína antigénica recombinante (25, 26),
métodos en "sandwich" de doble anticuerpo, y anticuerpos monoclonales (14), que pueden dar lugar a una
aplicación más amplia. Durante varios años se han utilizado en algunos países europeos protocolos de ELISA en
programas de control y erradicación de MVV en ovejas (24) y de CAEV en cabras. En general, sin embargo, la
IGDA continúa siendo la prueba más utilizada.
a)
Inmunodifusión en gel de agar (prueba prescrita para el comercio internacional)
Hay dos antígenos víricos de MV/NPO y de AEC que son importantes en serología, una glicoproteína de la
envoltura vírica denominada gp135 y una proteína interna p28. Ambas se conservan en una preparación
antigénica constituida por medio recogido de cultivos celulares infectados que se concentra
aproximadamente 50 veces por diálisis con polietilén glicol. Normalmente se utiliza la cepa WLC–1 del virus
de NPO1.
Es importante reconocer que la sensibilidad de la prueba IGDA para detectar anticuerpo anti–CAEV
depende del antígeno empleado (1, 18). Se ha demostrado que una prueba IGDA con gp135 de CAEV
aporta más sensibilidad que una prueba IGDA con p28 de CAEV (1). Además, se ha comprobado que en
comparación con la inmunoprecipitación, la sensibilidad de la prueba IGDA para anticuerpos anti–CAEV es
35% mayor con antígeno de CAEV que con antígeno del virus de la NPO (18). La explicación más probable
para esta diferencia en sensibilidad entre el antígeno de los virus de AEC y NPO para detectar anticuerpos
anti–CAEV es que aunque la prueba de precipitación requiere sólo la unión de un único epítopo por el
anticuerpo para dar un resultado positivo, la precipitación en gel de agar requiere múltiples interacciones
entre epítopo–anticuerpo. Pese a que los virus de la NPO y la AEC están estrechamente relacionados
antigénicamente, no se conoce el grado de relación antigénica, y es probable que existan menos
interacciones anticuerpo/antígeno en el sistema heterólogo. Cuando se utiliza el antígeno apropiado, la
eficacia de la prueba IGDA es elevada. En comparación con la inmunoprecipitación, la IGDA para detectar
anticuerpos anti–CAEV tiene un 92% de sensibilidad y un 100% de especificidad si se utiliza antígeno de
CAEV (18).
En ovejas infectadas con MVV y en cabras infectadas con CAEV, la respuesta de anticuerpo precipitante
predominante que se detecta va normalmente dirigida contra el antígeno gp135. La respuesta anti–p28 se
presenta por lo general a títulos inferiores que la respuesta anti–gp135.
En algunas cabras infectadas con CAEV hay evidencias que sugieren que en una proporción de individuos
se produce una respuesta anti–gp135 en ausencia de una respuesta anti–p28 y viceversa (9, 26). Por tanto,
para validar la prueba, se necesitan sueros estándar que produzcan tanto líneas de precipitado anti–gp135
como anti–p28.
1
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Este virus ha sido distribuido por el Dr. Howard Lemkuhl, National Animal Disease Center, United States Department of
Agriculture, P.O. Box 70, Ames, Iowa, EE.UU.
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El medio de gel es 0,7–1% de agarosa en tampón Tris 0,05 M, pH 7,2, con 8% de NaCl. La prueba se
realiza en placas Petri o en bandejas de plástico de 10 cm2. La disposición y el tamaño de los pocillos
determinan el número de sueros probados por placa. Se pueden adoptar varias disposiciones pero la
hexagonal con un pocillo central es la normal: por ejemplo, un modelo con pocillos periféricos grandes
(5 mm de diámetro) y pequeños (3 mm de diámetro) alternados, separados entre sí 2 mm y separados
2 mm de un pocillo central de 3 mm de diámetro con el antígeno. Los pocillos periféricos grandes son para
los sueros problema y los pequeños para los sueros estándar. En cada prueba debe incluirse también un
control positivo débil. Las placas se incuban durante una noche a temperatura ambiente en una cámara
húmeda y se examinan después para observar las líneas de precipitado. Si es necesario, las placas pueden
incubarse durante otras 24 horas.
Una consideración importante es la necesidad de personal experimentado para interpretar la IGDA. La
interpretación de los resultados depende del antígeno utilizado. En la ref. 1 se pueden encontrar ejemplos
de IGDAs con diferentes preparaciones antigénicas y una guía para la interpretación de los resultados.
b)
Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el comercio internacional)
Se han descrito varios protocolos para ELISA. En la actualidad, la opción más práctica para el diagnóstico
rutinario es un ELISA que utiliza virus completos purificados (12, 30, 33). El antígeno se obtiene de
sobrenadantes de cultivos celulares infectados mediante centrifugación diferencial y tratamiento con
detergente, y se utiliza para antigenar microplacas. Los reactivos se añaden secuencialmente como sigue:
i)
suero problema
ii)
inmunoglobulina de conejo anti–cabra, conjugada con peroxidasa de rábano
iii)
revelador de color,
con tiempos de incubación, temperaturas y procedimientos de lavado en cada fase especificados. Se
incluyen controles positivos y negativos, y los resultados de la prueba se miden como absorbancia en un
fotómetro (30).
Se ha descrito recientemente un ELISA competitivo (C–ELISA) para la detección de anticuerpos anti–gp135
(de CAEV) en cabras (11, 12). Esta prueba se ha utilizado también para detectar anticuerpos contra el virus
de la neumonía progresiva ovina en ovejas (11). El C–ELISA utiliza un anticuerpo monoclonal (MAb 74A)
que se une a un epítopo conformacional de gp135 de CAEV (23). Con relación a la inmunoprecipitación
como estándar de comparación, la sensibilidad y especificidad de C–ELISA es de 100% y 96,4%,
respectivamente.
La técnica ELISA puede aplicarse también a la leche, pero como los títulos de anticuerpos contra los
lentivirus en la leche son más bajos (posiblemente el 10% del correspondiente al suero), es de esperar una
menor sensibilidad (18). Debido a que la vía primaria de transmisión del CAEV es por el calostro y la leche,
el ensayo de muestras de leche para la detección de anticuerpos anti–CAEV o anti–MVV no suministra
información temporal adecuada para evitar la transmisión, especialmente a la descendencia de la gestación
inmediata (17).
El ELISA es fácil de realizar en laboratorios con un equipamiento adecuado (espectrofotómetro) y reactivos.
Es una técnica conveniente para análisis a gran escala, sobre todo para diagnóstico veterinario, ya que es
fiable para demostrar anticuerpos frente a lentivirus de pequeños rumiantes (SRLVs) en ovejas y cabras.
Requiere un antígeno relativamente puro.
Se ha descrito la producción de antígenos que se emplean en ELISAs. La preparación antigénica debe
contener al menos unos de los antígenos principales de los SRLVs, es decir, de la envoltura (gp135 =
proteína de superficie [SU] y gp44 = proteína transmembrana [TM]) y de la cápsida (p25) (33). Estos
antígenos pueden presentarse en preparaciones de virus completos o como proteínas recombinantes o
péptidos sintéticos (12, 17, 28, 29, 33). Por ejemplo, se ha producido en Escherichia coli el producto génico
recombinante del gen gag fusionado con la glutatión S–transferasa. Los antígenos recombinantes
producidos en E. coli son una fuente importante de antígeno para estandarización y distribución
internacional. En ELISAS indirectos (I–ELISAs) se han utilizado antígenos recombinantes o péptidos
sintéticos.
En el I–ELISA, se antigenan los pocillos de la microplaca. Se añaden a los pocillos muestras de suero
diluido que reaccionan con los antígenos unidos al soporte sólido. El material no unido se elimina por
lavados después de un tiempo de incubación adecuado. El conjugado (por ejemplo, Ig anti–rumiante
marcada con peroxidasa) reacciona con los anticuerpos específicos unidos al antígeno y el conjugado que
no reacciona se elimina por lavados después de un tiempo de incubación adecuado. Después se añade
substrato del enzima. La velocidad de conversión del substrato es proporcional a la cantidad de anticuerpos
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Capítulo 2.4.4/5. — Artritis/encefalitis caprina y Maedi—Visna
unidos. La reacción se detiene después de un tiempo adecuado y el color desarrollado se mide
espectrofotométricamente.
En un C–ELISA para SRLVs se han utilizado MAbs específicos que definen epítopos de proteínas
superficiales, para capturar antígenos de la envoltura superficial (24): el C–ELISA supera el problema de la
pureza del antígeno, ya que la especificidad de esta prueba sólo depende del MAb utilizado.
En C–ELISA, las muestras de suero con anticuerpos anti–SRLVs inhiben la unión del MAb marcado
enzimáticamente al antígeno de SRLV fijado a los pocillos de plástico. La unión del MAb marcado
enzimáticamente se detecta añadiendo el substrato del enzima y cuantificando la aparición del consiguiente
producto coloreado. Un color fuerte indica un bloqueo escaso o inexistente de la unión del MAb marcado
con enzima y, por tanto, la ausencia de anticuerpos contra SRLV en las muestras de suero. Por el contrario,
un color débil debido a la inhibición de la unión del MAb marcado enzimáticamente con el antígeno de la
fase sólida, indica la presencia de anticuerpos contra SRLV en las muestras de suero.
•
Materiales y reactivos
Placas de microtitulación con 96 pocillos de fondo plano, antigenadas previamente o de forma reciente con
antígeno SRLV; lector de microplacas (espectrofotómetro; filtros de 405, 450, 490 y 620 nm); incubador a
37°C con humedad; pipetas de 1–, 8– y 12–canales con puntas de plástico desechables; agitador de
microplacas (opcional); frigorífico; congelador.
Sueros control positivos y negativos; conjugado (por ejemplo, anti–inmunoglobulina de rumiante marcada
con peroxidasa); diluyente concentrado 10 veces (por ejemplo, solución salina tamponada con
fosfato/Tween); agua destilada; solución de lavado concentrada 10x; substrato o cromógeno (por ejemplo,
ABTS [ácido 2–2´–azino–bis–(3–etilbenzotiazolina–6 sulfónico)] o TMB [3, 3´, 5, 5´–tetrametilbenzidina]);
solución de parada (por ejemplo, detergente, ácido sulfúrico).
•
ELISA indirecto: procedimiento de la prueba
i)
Diluir las muestras de suero, incluyendo los sueros control, hasta la dilución apropiada (por ejemplo,
1/20) y distribuir 0,1–0,2 ml por pocillo (por duplicado en ELISA bifásico). Utilizar los sueros control
positivo y negativo suministrados por el fabricante y un suero interno del laboratorio como referencia
positiva para comparar los títulos entre pruebas diferentes.
ii)
Cubrir la placa con tapadera e incubar a temperatura ambiente o a 37°C durante 30–90 minutos.
Vaciar el contenido y lavar tres veces con solución de lavado a temperatura ambiente.
iii)
Añadir a los pocillos la dilución apropiada de conjugado recién preparado (o,1 ml por pocillo). Cubrir
cada placa e incubar como en el paso ii. Lavar de nuevo tres veces.
iv)
Añadir a cada pocillo 0,1 ml de solución cromogénica de substrato recién preparada o lista para el uso
(por ejemplo, ABTS en tampón citrato fosfato, pH 5,0, y solución de H2O2 al 30% [0,1 µl/ml]).
v)
Agitar la placa; después de incubar, detener la reacción con solución de parada (por ejemplo,
añadiendo 0,1 ml de ácido sulfúrico a cada pocillo).
vi)
Leer la absorbancia de cada pocillo con el lector de microplacas a 405 nm (ABTS) o 450–620 nm
(TMB). Los valores de absorbancia se emplean para calcular los resultados.
vii)
Interpretación de los resultados
En los kits comerciales, las interpretaciones y los criterios de validación se suministran con el kit.
Por ejemplo: calcular la absorbancia media (Ab) de la muestra de suero y de los controles de suero
positivo (Abpos) y negativo (Abneg) y, para cada suero, calcular el porcentaje:
Ab - Abneg
Abpos - Abneg x 100
Interpretar los resultados del siguiente modo:
Ab < 30%
suero negativo
666
Ab 30–40%
suero dudoso
Ab > 40%
suero positivo
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•
ELISA competitivo: procedimiento de la prueba
i)
Añadir a placas antigenadas 0,05 ml de suero sin diluir y de controles positivos y negativos.
ii)
Incubar 1 hora a temperatura ambiente.
iii)
Vaciar la placa y lavarla tres veces con solución diluida de lavado.
iv)
Añadir a cada pocillo 0,05 ml de conjugado diluido de anticuerpo–peroxidasa. Mezclar bien e incubar
durante 30 minutos a temperatura ambiente.
v)
Después de incubar 30 minutos, vaciar la placa y repetir el proceso de lavado descrito en el paso iii.
vi)
Añadir a cada pocillo 0,05 ml de solución de substrato (por ejemplo, TMB). Mezclar, tapar la placa con
papel de aluminio. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. No vaciar los pocillos.
vii)
Añadir a cada pocillo 0,05 ml de solución de parada. No vaciar los pocillos.
viii) Inmediatamente después de añadir la solución de parada, leer la placa con un lector de placas (a 620,
630 o 650 nm).
ix)
Interpretación de los resultados
Ejemplo. Cálculo: % de inhibición = 100 – [(Ab de la muestra x 100)/ Ab media del control negativo)].
Para cabras, si una muestra problema causa una inhibición > 33,2 % es positiva; si causa una
inhibición < 33,2% es negativa. Para ovejas, si una muestra problema causa una inhibición > 20,9%,
es positiva; si causa una inhibición < 20,9%, es negativa.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
No existen productos biológicos disponibles. Se han descrito MAbs que reconocen epítopos conformacionales de
la glicoproteína gp135 de la envoltura del CAEV (23).
REFERENCIAS
1.
ADAMS D.S. & GORHAM J.R. (1986). The gp135 of caprine arthritis encephalitis virus affords greater sensitivity
than the p28 in immunodiffusion serology. Res. Vet. Sci., 40, 157–160.
2.
ADAMS D.S., KLEVJER–ANDERSON P., CARLSON J.L., MCGUIRE T.C. & GORHAM J.R. (1983). Transmission and
control of caprine arthritis–encephalitis virus. Am. J. Vet. Res., 44, 1670–1675.
3.
CORK L.C. (1990). Pathology and epidemiology of lentiviral infection of goats. En: Maedi–Visna and Related
Diseases, Petursson G. & Hoff–Jørgensen R., eds. Kluwer Academic Press, Dordrecht, The Netherlands,
119–127.
4.
CRAWFORD T.B. & ADAMS D.S. (1981). Caprine arthritis–encephalitis: clinical features and presence of
antibody in selected goat populations. J. Am. Vet. Med. Assoc., 178, 713–719.
5.
CRAWFORD T.B., ADAMS D.S., CHEEVERS W.P. & CORK L. C. (1980). Chronic arthritis in goats caused by a
retrovirus. Science, 207, 997–999.
6.
CUTLIP R.C., JACKSON T.A. & LAIRD O.A. (1977). Immunodiffusion test for ovine progressive pneumonia. Am.
J. Vet. Res., 38, 1081–1084.
7.
CUTLIP R.C., LEHMKUHL H.D., BROGDEN K.A. & MCCLURKIN A.W. (1986). Vasculitis associated with ovine
progressive pneumonia virus infection in sheep. Am. J. Vet. Res., 46, 61–64.
8.
CUTLIP R.C., LEHMKUHL H.D., WOOD R.L. & BROGDEN K.A. (1985). Arthritis associated with ovine progressive
pneumonia. Am. J. Vet. Res., 46, 65–68.
9.
DAWSON M. (1985). The detection of precipitating antibodies to lentivirus antigens in goat sera using two
immunodiffusion assays. En: Slow Viruses in Sheep, Goats and Cattle, Sharp J.M. & Hoff–Jørgensen R.,
eds. Commission of the European Communities, EUR 8076, 233–238.
10. DAWSON M., BIRONT P. & HOUWERS D.J. (1982). Comparison of serological tests used in three state veterinary
laboratories to identify maedi–visna virus infection. Vet. Rec., 111, 432–434.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
667
Capítulo 2.4.4/5. — Artritis/encefalitis caprina y Maedi—Visna
11. HERRMANN L.M., CHEEVERS W.P., MARSHALL K.L., MCGUIRE T.C., HUTTON M.M., LEWIS G.S., KNOWLES D.P.
(2003). Detection of serum antibodies to ovine progressive pneumonia virus in sheep by using a caprine
arthritis–encephalitis virus competitive–inhibition enzyme–linked immunosorbent assay. Clin. Diagn. Lab.
Immunol., 10, 862–865.
12. HERRMANN L.M., CHEEVERS W.P., MCGUIRE T.C., ADAMS D.S., HUTTON M.M., GAVIN W.G. & KNOWLES D.P.A.
(2003). A competitive–inhibition enzyme–linked immunosorbent assay (cELISA) for detection of serum
antibodies to caprine arthritis–encephalitis virus (CAEV): a diagnostic tool for successful eradication. Clin.
Diagn. Lab. Immunol., 10, 267–271.
13. HOUWERS D.J., GIELKENS A.L.J. & SCHAAKE J. (1982). An indirect enzyme–linked immunosorbent assay
(ELISA) for the detection of antibodies to maedi–visna virus. Vet. Microbiol., 7, 209
14. HOUWERS D.J. & SCHAAKE J. (1987). An improved ELISA for the detection of antibodies to ovine and caprine
lentiviruses, employing monoclonal antibodies in a one–step assay. J. Immunol. Methods, 98, 151–154.
15. JOHNSON L.K., MEYER A.L. & ZINK M.C. (1992). Detection of ovine lentivirus in seronegative sheep by in situ
hybridization, PCR and cocultivation with susceptible cells. Clin. Immunol. Immunopathol., 65, 254–260.
16. KARR B.M., CHEBLOUNE Y., LEUNG K. & NARAYAN O. (1996). Genetic characterization of two penotypically
distinct North American ovine lentiviruses and their possible origin from caprine–arthritis encephalitis virus.
Virology, 225, 1–10.
17. KNOWLES D.P. (1997). Laboratory diagnostic tests for retrovirus infections of small ruminants. Vet. Clin.
North Am. Food Anim. Pract., 13, 1–11.
18. KNOWLES D.P., EVERMANN J.F., SCHROPSHIRE C., VANDER SCHALIE J., BRADWAY D., GEZON H.M. & CHEEVER
W.P. (1994). Evaluation of agar gel immunodiffusion serology using caprine and ovine lentiviral antigens for
detection of antibody to caprine–arthritis encephalitis virus. J. Clin. Microbiol. 32, 243–245.
19. LEROUX C., CHASTANG J., GREENLAND T. & MORNEX J.F. (1997). Genomic heterogenetity of small ruminant
lentiviruses: existence of heterogeneous populations in sheep and of the same lentiviral genotypes in sheep
and goats. Arch. Virol., 142, 1125–1137.
20. MOTHA M.J. & RALSTON J.C. (1994). Evaluation of ELISA for detection of antibodies to CAE in milk. Vet.
Microbiol., 38, 359–367.
21. OLIVER R.E., GORHAM J.R., PARISH S.F., HADLOW W.J. & NARAYAN O. (1981). Ovine progressive pneumonia:
pathologic and virologic studies on the naturally occurring disease. Am. J. Vet. Res., 42, 1554–1559.
22. OLIVER R.E., GORHAM J.R., PERRYMAN L.E. & SPENCER G.R. (1981). Ovine progressive pneumonia:
experimental intrathoracic, intracerebral and intra–articular infections. Am. J. Vet. Res., 42, 1560–1564.
23. OZYORUK F., CHEEVERS W.P., HULLINGER G.A., MCGUIRE T.C., HUTTON M. & KNOWLES D.P. (2001). Monoclonal
antibodies to conformational epitopes of the surface glycoprotein of caprine arthritis–encephalitis virus:
potential application to competitive–inhibition enzyme–linked immunosorbent assay for detecting antibodies
in goat sera. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 8, 44–51.
24. PÉPIN M., VITU C., RUSSO P., MORNEX J.F. & PETERHANS E. (1998). Maedi–visna virus infection in sheep: a
review. Vet. Res., 29, 341–367.
25. POWER C., RICHARDSON S., BRISCOE M. & PASICK J. (1995). Evaluation of two recombinant Maedi–Visna virus
proteins for use in an enzyme–linked immunosorbent assay for the detection of serum antibodies to ovine
lentiviruses. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2, 631–633.
26. RIMSTAD E., EAST N., DEROCK E., HIGGINS J. & PEDERSEN N.C. (1994). Detection of antibodies to caprine
arthritis/encephalitis virus using recombinant gag proteins. Arch. Virol., 134, 345–356.
27. ROLAND M., MOONEY J., VALAS S., PERRIN G. & MAMOUN R.Z. (2002). Characterization of an Irish caprine
lentivirus strain–SRLV phylogeny revisited. Virus Res., 85, 29–39.
28. ROSATI S., KWANG J., TOLARI F. & KEEN J.E. (1994). A comparison of whole virus and recombinant
transmembrane ELISA and immunodiffusion for detection of ovine lentivirus antibodies in Italian sheep
flocks. Vet. Res. Commun., 18, 73–80.
668
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.4/5. — Artritis/encefalitis caprina y Maedi—Visna
29. SAMAN E., VAN EYNDE G., LUJAN L., EXTRAMANIA B., HARKISS G., TOLARI F., GONZALEZ L., AMORENA B., W ATT
N.J. & BADIOLA J.J. (1999). A new sensitive serological assay for detection of lentivirus infections in small
ruminants, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 6, 734–740.
30. SIMARD C.L. & BRISCOE M.R. (1990). An enzyme–linked immunosorbent assay for detection of antibodies to
maedi–visna virus in sheep. A simple technique for production of antigen using sodium dodecyl sulfate
treatment. Can. J. Vet. Res., 54, 446–450.
31. SIMARD C.L. & BRISCOE M.R. (1990). An enzyme–linked immunosorbent assay for detection of antibodies to
Maedi–visna virus in sheep. Comparison to conventional agar gel immunodiffusion test. Can. J. Vet. Res.,
54, 451–456.
32. VALAS S., BENOIT C., GUIONAUD C., PERRIN G. & MAMOUN R.Z. (1997). North American and French caprine
arthritis–encephalitis viruses emerge from ovine maedi–visna viruses. Virology, 237, 307–318.
33. ZANONI R.G., VOGT H.R., POHL B., BOTTCHER J., BOMMELI W. & PETERHANS E. (1994). An ELISA based on
whole virus for the detection of antibodies to small–ruminant lentiviruses. J. Vet. Med. B, 41, 662–669.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Artritis/encefalitis caprina y Maeda–Visna (ver Cuadro en
la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la página web de la OIE para una lista más
actualizada: www.oie.int).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
669
CAPÍTULO 2.4.6.
PLEURONEUMONIA CAPRINA CONTAGIOSA
RESUMEN
La pleuroneumonía caprina contagiosa (PNCC) es una enfermedad grave de las cabras causada
por Micoplasma capricolum subespecie capripneumoniae (Mccp). Este microorganismo está
estrechamente relacionado con otros tres micoplasmas: M. mycoides subespecie mycoides que
forma colonias grandes (LC, de "large colonies"), M. mycoides subespecie capri, y M. capricolum
subespecie capricolum. A diferencia de la auténtica PNCC, que está limitada a la cavidad torácica,
las enfermedades causadas por los otros tres micoplasmas se acompañan de lesiones evidentes
en otros órganos y/o partes del cuerpo además de la cavidad torácica.
Los caso típicos de PNCC se caracterizan por fiebre muy elevada (41–43°C), altas tasas de
morbilidad y mortalidad en rebaños susceptibles que afectan a todas las edades y a ambos sexos,
y aborto en cabras preñadas. Después de aproximadamente 2–3 días de fiebre alta,
aparecen síntomas respiratorios. La respiración es acelerada y dolorosa, y en algunos casos se
acompaña de un gruñido. Es frecuente una tos violenta y productiva. En las fases finales los
animales son incapaces de moverse – se mantienen en pie con sus patas anteriores abiertas, el
cuello se presenta rígido y extendido y a veces la saliva gotea continuamente de la boca. El
examen post-mortem revela pleuroneumonía fibrinosa con masiva hepatización pulmonar y
pleuresía, acompañada de acumulación de líquido pleural de color pajizo.
Identificación del agente: El diagnóstico definitivo requiere el cultivo del microorganismo
causante a partir de muestras de tejido pulmonar y/o líquido pleural tomado post–mortem. Después
de la clonación y la purificación, los aislamientos se identifican por varias pruebas bioquímicas,
inmunológicas y moleculares. Recientemente se ha descrito una prueba basada en la reacción en
cadena de la polimerasa que es específica, sensible y directamente aplicable a material clínico,
como el pulmón y el líquido pleural.
Pruebas serológicas: Las pruebas serológicas para identificar la causa de la pleuroneumonía en
cabras u ovejas no se han utilizado con amplitud. Tales pruebas se emplean a nivel poblacional
más que para el diagnóstico en animales individuales. La prueba de fijación de complemento
continúa siendo la prueba serológica de mayor difusión para la PNCC, excepto en Kenia, donde se
utiliza la aglutinación con látex. También se emplea la hemaglutinación indirecta. Se ha
desarrollado un enzimoinmunoensayo competitivo específico pero no tiene una disponibilidad
general. Como ocurre con otras pruebas serológicas, no detecta todos los animales
potencialmente reaccionantes, pero su especificidad y adecuación para ensayos a gran escala lo
convierten en una prueba apropiada para investigaciones epidemiológicas.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se dispone de una vacuna contra
la PNCC causada por Mccp que está comercializada por el Instituto de Producción de Vacunas
Veterinarias de Kenia1.
A. INTRODUCCIÓN
La pleuroneumonía caprina contagiosa (PNCC) es una enfermedad grave de las cabras que se presenta en
muchos países de África y de Asia donde la población caprina total supera los 500 millones (1). La PNCC aguda
clásica está causada por Mycoplasma capricolum subespecie capripneumoniae (Mccp) (17), originalmente
conocido como biotipo F38. Este microorganismo se aisló por primera vez en Kenia y se consideró la causa de la
1
670
Kenya Veterinary Vaccines Production Institute, P.O. Box 53260, Nairobi, Kenya. E–mail: kevevapi@africaonline.co.ke
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.6.— Pleuroneumonía caprina contagiosa
PNCC (18–21); con posterioridad se ha aislado en Sudán, Túnez, Omán, Turquía, Chad, Uganda, Etiopía,
Nigeria, Tanzania, Eritrea y los Emiratos Árabes Unidos. Varios grupos de investigación han reproducido
experimentalmente una enfermedad con Mccp que resulta indistinguible de la PNCC que ocurre naturalmente.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
El diagnóstico de los brotes de enfermedades respiratorias en cabras, y de PNCC en particular, es complicado,
especialmente donde resulta endémica. Debe distinguirse de otros síndromes clínico–patológicos similares tales
como: la peste de los pequeños rumiantes, a la que son susceptibles también las ovejas; la pasteurelosis, que
puede diferenciarse por la distribución de las grandes lesiones pulmonares, y lo que se ha llamado síndrome de
"mastitis, artritis, queratitis, neumonía y septicemia" o más a menudo síndrome de la agalaxia contagiosa (38).
Como el largo nombre implica, la neumonía se acompaña de grandes lesiones en otros órganos. La enfermedad
causada por Mccp es fácilmente contagiosa y mortal para cabras susceptibles de todas las edades y de ambos
sexos, no afecta a las ovejas o al ganado bovino, y se caracteriza histopatológicamente por un edema intersticial
intralobular de los pulmones (13).
1.
Identificación del agente
a)
Microscopía de exudados pulmonares y frotis de impresión o cortes
Mccp tiene una morfología in vivo filamentosa ramificada que puede observarse por microscopía de fondo
oscuro en exudados o suspensiones de tejido de las lesiones o en el líquido pleural. Alternativamente, los
frotis de cortes de lesiones pulmonares se pueden teñir por el método de May–Grünwald–Giemsa y
observar por microscopía de campo claro. Los otros micoplasmas caprinos tienen una morfología
cocobacilar o de filamentos cortos. Ninguna de estas técnicas proporciona un diagnóstico definitivo.
b)
Métodos de reconocimiento de ácidos nucleicos
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar un segmento conservado del gen
del ARNr 16 S del grupo mycoides. El producto de la PCR se analiza después con enzimas de restricción
para la identificación del segmento amplificado del Mccp. La prueba se utiliza directamente con materiales
clínicos como tejido pulmonar y líquido pleural (3). Sin embargo, el aislamiento de Mccp continúa siendo la
prueba confirmativa.
c)
Pruebas de precipitación en gel para detectar antígeno en muestras de tejido
Mccp libera un polisacárido antigénico (32) contra el que se ha producido un anticuerpo monoclonal
específico (MAb) (WM–25) (33, 34). Este MAb precipita en gel de agar con el polisacárido producido por
Mccp, y se utiliza para identificar al agente causante en los casos de PNCC, en especial cuando las
muestras no son ya adecuadas para cultivos debido a su deterioro durante el transporte.
d)
Aislamiento de micoplasmas
i)
Selección de muestras
Las mejores muestras de necropsias son las lesiones pulmonares, particularmente de la interfase
entre áreas consolidadas y no consolidadas, el líquido pleural y los nódulos linfáticos mediastínicos. Si
no se puede realizar un examen microbiológico inmediatamente, las muestras o el pulmón completo
se pueden guardar congeladas a –20°C durante períodos considerables (meses) sin pérdida aparente
de la viabilidad de los micoplasmas. Durante el transporte las muestras se deben mantener siempre
tan frías como sea posible, pues la viabilidad de los micoplasmas disminuye con rapidez si aumenta la
temperatura. Las muestras de pulmón pueden enviarse a otros laboratorios en forma congelada.
ii)
Tratamiento de muestras
Los frotis se suspenden en 2–3 ml de medio de cultivo. Las muestras de tejido se trocean mejor con
tijeras y luego se agitan vigorosamente o se homogenizan en medio2 utilizando 1 g de tejido con 9 ml
de medio. Los tejidos no deben ser molidos. Por lo general, la suspensión se prepara con un medio
para micoplasmas, pero si se va a realizar un examen bacteriológico en paralelo, se puede utilizar un
medio bacteriológico de elevada calidad, como el caldo nutritivo, para disponer de una suspensión
adecuada para ambos tipos de examen. El líquido pleural, o una suspensión de tejido o de frotis, se
diluyen en serie en el medio seleccionado para micoplasmas al menos haciendo tres diluciones
decimales (hasta una dilución nominal de 10–4). Las diluciones deberían sembrarse en medio sólido.
2
Por ejemplo, con el Stomacher 80, A.J. Seward, London, United Kingdom (UK)
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
671
Capítulo 2.4.6.— Pleuroneumonía caprina contagiosa
iii)
Medios de micoplasmas
El medio utilizado por MacOwan y Minette para cultivar a Mccp (19) se denomina "gota caldo carne–
hígado de cabra" (viande foie goat, VFG) e incluye caldo de carne de cabra e hígado y suero de cabra.
Otros medios alternativos adecuados son el WJ (12), el medio de Hayflick modificado, y la triptosa
modificada de Newing (14)3. Los medios enriquecidos con 0,2% (o hasta el 0,8%) de piruvato sódico
funcionan considerablemente mejor tanto para el aislamiento primario como para la producción
antigénica de Mccp (24, 25). Esta es la base del medio de Thiaucourt (38, 40) y del medio de
Thiaucourt modificado (3). La composición de estos dos últimos medios es la siguiente:
•
Medio de Thiaucourt
A. Solución autoclavada (121°C durante 15 minutos): caldo Bacto PPLO (organismos semejantes a
los de la pleuroneumonía) sin cristal violeta (Difco) (21 g); agua desionizada (700 ml).
B. Solución filtrada por membrana: suero de caballo (o, alternativamente, de cerdo o de asno)
inactivado a 56°C durante 30 minutos (200 ml); extracto fresco de levadura (100 ml); glucosa (solución
estéril 0.5 g/ml) (2 ml); y piruvato sódico (solución estéril 0.5 g/ml) (8 ml).
La solución B se añade asépticamente a la A. Para evitar contaminaciones en los aislamientos
primarios se puede añadir ampicilina (0,1 g/litro) y acetato de talio (250 mg/litro). El pH final del medio
debe ser 7,4–7,6.
•
Medio de Thiaucourt modificado
A. Solución autoclavada (121°C durante 15 minutos): caldo Bacto PPLO sin cristal violeta (Difco)
(17,5 g); agua destilada en destilador de vidrio (650 ml).
B. Solución filtrada por membrana: suero de caballo (alternativamente de cerdo o asno) inactivado a
56°C durante 30 minutos (250 ml); extracto fresco de levadura (100 ml); 50% de glucosa (4 ml); 25%
de piruvato sódico (8 ml); 5% de acetato de talio (4 ml); ampicilina (250 mg) y 0,5% de rojo fenol
(4 ml). El pH se ajusta a 7,8 con hidróxido sódico o con ácido clorhídrico. La solución B se añade
asépticamente a la A.
En el laboratorio de referencia de la OIE en Kenia (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual) se utilizan
rutinariamente el caldo de triptosa modificado de Newing (14) y las placas de agar (medio de Gourlay)
(9) para el aislamiento y el mantenimiento de Mccp.
iv)
Producción de medio, almacenamiento y control de calidad
Algunos componentes del medio, como el suero, el extracto de levadura y el agua desionizada deben
controlarse regularmente antes de incorporarse a los medios para micoplasmas en cuanto a su
capacidad para permitir el crecimiento. Para estos análisis se deben utilizar aislamientos naturales de
pocos pases.
os medios líquidos se pueden guardar antes de su uso a –25°C por lo menos durante 6 meses, pero la
penicilina o sus análogos no deben añadirse hasta la distribución final. Los medios líquidos se
dispensan en viales (1,8 ml o 2,7 ml) o tubos con tapón de rosca (4,5 ml) y se guardan hasta
3 semanas a 4°C. Los medios sólidos se hacen con agarosa (0,9% [p/v]), agar Noble (1,5% [p/v]) o
agar purificado (0,6% [p/v]). Cuando se usan placas, que se llenan hasta 6–8 mm, deben ser tan
recientes como sea posible y se pueden guardar antes de uso a 4°C como máximo durante 2
semanas. Todos los medios de cultivo deben someterse a controles de calidad y favorecer el
crecimiento de especies de Mycoplasma a partir de inóculos pequeños. La cepa de referencia debe
cultivarse en paralelo con la muestra sospechosa para comprobar que las pruebas funcionan
correctamente.
v)
Cultivo
Los cultivos se incuban a 37°C. Las placas se cultivan mejor en una atmósfera húmeda con 5% de
CO2, 95% de aire o N2 o en una jarra de anaerobios con una fuente de humedad.
Los cultivos líquidos se examinan diariamente para observar evidencias de crecimiento en forma de
cambio de color y aparición de material floculento. Una turbidez fuerte indica contaminación
bacteriana; los cultivos que la presenten deben filtrarse por una membrana con poro de 0,45 µm antes
de volver a cultivarlos. Los medios líquidos se vuelven a cultivar por inoculación de medio líquido
fresco con una décima parte de su volumen o mediante extensión en medio sólido con un asa de
cultivo.
Los cultivos en placa se examinan cada 1–3 días con un estereomicroscopio (5–50 aumentos) y con
luz incidente y transmitida. Si son negativas, las placas se eliminan a los 14 días. El subcultivo se
realiza por transferencia de bloques cortados del agar que lleven colonias aisladas a medio sólido
(sobre el que se aprietan los bloques invertidos) o a medio líquido. Alternativamente, se toma con una
pipeta Pasteur un trozo de agar con una colonia y se descarga en medio líquido fresco.
3
672
Un medio comercial llamado Mycoplasma Experience está disponible en Mycoplasma Experience, Reigate, Surrey, UK.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.6.— Pleuroneumonía caprina contagiosa
La clonación y purificación de los aislados se lleva a cabo por transferencia repetida de colonias
aisladas que representen cada tipo morfológico observado. La morfología colonial varía con el medio
utilizado, la especie de micoplasma, el número de pases y la edad del cultivo.
En los primeros pases, muchas especies de micoplasmas, incluyendo M. capricolum subespecie
capricolum (Mcc), producen colonias de morfología extraña, frecuentemente pequeñas, sin centro y de
forma irregular: A menudo este efecto se asocia con el empleo de medio poco adecuado. Con los
pases, tales aislados muestran la morfología colonial convencional en "huevo frito", excepto
M. ovipneumoniae, que mantiene la forma de colonias sin centro. Las colonias de M. mycoides
subespecie mycoides de colonias grandes (MmmLC) y Mcc pueden tener hasta 3 mm de diámetro.
La filtración de los cultivos líquidos por filtros de 0.45 µm, antes de los subcultivos, favorece la
purificación al excluir agregados celulares.
Los cultivos que se sospecha que son formas L bacterianas deben examinarse para observar si
revierten a la forma bacteriana mediante tres a cinco pases en medio sólido para micoplasmas del que
se omiten los antibióticos y el acetato de talio.
Los medios líquidos utilizados para el aislamiento primario que no muestren indicación de crecimiento
a los 7 días, deberían subcultivarse.
Los cultivos de cada muestra, incluyendo un subcultivo, deben examinarse durante 3 semanas como
mínimo antes de eliminarse. Si las titulaciones en medio líquido son totales (hasta 10–10), también se
leen a las 3–4 semanas y se expresan como unidades cambiadoras de color por volumen transferido.
El crecimiento en las placas se expresa como unidades formadoras de colonias (FCU) por ml.
e)
Identificación de micoplasmas
i)
Reacción en cadena de la polimerasa
Una vez que se ha cultivado el microorganismo, se puede comprobar que es Mccp por PCR en 1 día.
La prueba se basa en la amplificación de un segmento del gen del ARNr 16S. El fragmento
amplificado es común a todo el grupo mycoides. Sin embargo, cuando el amplicón se digiere con
endonucleasa PtsI, y los productos de digestión enzimática se analizan por electroforesis en gel de
agarosa y se tiñen con bromuro de etidio, en el caso de Mccp se observa un modelo singular de rotura
con tres fragmentos (3).
Recientemente se ha usado PCR y posterior secuenciación para establecer la epidemiología
molecular de PNCC. Estas pruebas se pueden realizar en muestras secas, como líquido pleural en
papel de filtro. La secuenciación permite una identificación exacta de la especie (lugar de rotura del
ARNr 16S y una detección específica del "locus H2") (16,28).
ii)
Pruebas bioquímicas
Las cepas de campo deben someterse a tres pases, y preferiblemente clonarse, antes de proceder a
la identificación.
Las pruebas bioquímicas no pueden identificar un aislamiento de modo inequívoco, que sólo puede
hacerse hasta el presente por medios serológicos o genéticos. La variación intraespecífica en algunas
reacciones bioquímicas es con frecuencia considerable, pero algunas pruebas tienen utilidad como
sistema de análisis preliminar y para apoyar los resultados serológicos.
Las pruebas de uso más corriente son el metabolismo de glucosa, la hidrólisis de arginina, la
formación de "films y manchas", la reducción del cloruro de tetrazolio (aeróbica y anaeróbicamente), la
actividad fosfatasa, la digestión del suero y la sensibilidad a la digitonina. Las tres primeras pruebas
son rutinarias en los procesos de aislamiento y cultivo. La fermentación de la glucosa se detecta por
cambios ácidos (amarillo), y la hidrólisis de arginina por cambios alcalinos (rojo) en medio líquido, con
rojo fenol como indicador. El uso de arginina no se puede determinar con medios convencionales para
aislamiento y cultivo ya que los medios para demostrar la ruta de la arginina deiminasa deben
contener una alta concentración de arginina y carecer de glucosa. La formación de "films y manchas"
se detecta por un aparente arrugamiento de la superficie del agar debido a la deposición en él de un
film iridiscente de lípido junto al desarrollo de manchas negras en el medio en las proximidades de las
colonias viejas. Este fenómeno, producido en tres micoplasmas de pequeños rumiantes, se demuestra
en medios sólidos que contengan 20% o más de suero, con preferencia de caballo o de cerdo. La
adición al medio de una emulsión de yema de huevo al 10% mejora la sensibilidad de la prueba.
El resto de pruebas bioquímicas requiere medios y reactivos específicos. La prueba de reducción del
tetrazolio corrobora la evidencia de la naturaleza de los aislamientos de M. agalactiae, ya que este
microorganismo no es glicolítico ni hidroliza la arginina. La digestión del suero (7) distingue a los miembros
de los micoplasmas de rumiantes, y la producción de fosfatasa (4) distingue a Mcc de otros miembros de
esta agrupación. La sensibilidad a la digitonina diferencia a los miembros del orden Mycoplasmatales de los
miembros del orden Acholesplasmatales (8).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
673
Capítulo 2.4.6.— Pleuroneumonía caprina contagiosa
iii)
Identificación serológica
Los antígenos de micoplasmas utilizados en producción de suero hiperinmune están a menudo
contaminados con constituyentes del medio. Los anticuerpos estimulados por estos contaminantes
pueden causar reacciones positivas falsas en pruebas serológicas de identificación. Este problema se
evita por absorción del antisuero con el medio utilizado para producir el antígeno (10 mg de medio
liofilizado por ml de antisuero), o cultivando el micoplasma empleado como antígeno en medio que
contenga componentes del animal homólogo, por ejemplo, crecimiento en medio VFG para inmunizar
cabras.
Debido a la estrecha relación serológica entre los miembros de la "agrupación M. mycoides" (cluster), los
aislamientos de casos de PNCC deberían identificarse preferiblemente al menos por dos de los tres
métodos que se describen a continuación.
•
Prueba de inhibición del crecimiento
De las pruebas disponibles, la prueba de inhibición del crecimiento (growth inhibition test, GIT) es la prueba
más simple y específica, pero también la menos sensible. Se basa en la inhibición directa del crecimiento
en medio sólido por suero específico hiperinmune y detecta sobre todo antígenos de superficie (6).
Mccp parece serológicamente muy homogéneo y se observan amplias zonas de inhibición sin colonias con
antisuero contra la cepa tipo, sea cual sea el origen de la cepa probada (12). Cuando se emplea antisuero
policlonal, Mccp presenta reacciones cruzadas en el GIT con el grupo 7 bovino de Leach (PG50), M.
equigenitalium y M. primatum, pero se ha producido un MAb específico para Mccp en el GIT (33). El MAb
reaccionante, WM25, es específico para aislamientos (de Mccp) por el método de inhibición del crecimiento
en disco, que excluye M. agalactiae, Mcc y otros miembros de la "agrupación M. mycoides" asociados a
cabras, pero no al grupo 7 bovino (que no se encuentra en cabras): el último, sin embargo, puede excluirse
por pruebas de fluorescencia indirecta en las colonias (2). Una pequeña proporción de aislados de Mccp
también reaccionan de modo cruzado en GIT con antisuero a Mcc. Las cepas del grupo 7 de Leach se
encuentran a veces en cabras, pero es raro. Los resultados deben interpretarse con precaución ya que se
han identificado equivocadamente mediante GIT algunas cepas bovinas utilizando el antisuero "específico".
•
Procedimiento de la prueba
i)
Se utilizan tres diluciones decimales de cultivo líquido en fase logarítmica media a avanzada,
dependiendo del vigor del crecimiento del aislado en agar.
ii)
Las placas con agar se secan durante 30 minutos a 37°C.
iii)
Se impregnan discos estériles de papel de 6–7 mm de diámetro con una gota (10–20 µl) de antisuero
sin diluir. Los discos se pueden usar húmedos, en cuya forma se pueden guardar a –20°C, o se
pueden liofilizar (6), lo que permite su almacenamiento a 4°C.
iv)
Utilizando una placa por cada dilución de cultivo, se pipetea 1 ml ó 2,5 ml en placas de 5 o de 10 cm
de diámetro, respectivamente. El inóculo se dispersa uniformemente sobre la placa y se retira el
exceso.
v)
Las placas se secan a 20–30°C durante 15–20 minutos, a ser posible en una cabina de siembra, hasta
que no quede líquido visible en la superficie. Debe quedar suficiente humedad para permitir que los
discos liofilizados se adhieran a la superficie del medio sólido.
vi)
Se colocan cuidadosamente varios discos, cada uno impregnado con un antisuero diferente (que se
selecciona teniendo en cuenta el origen de la muestra, las reacciones bioquímicas y la morfología
colonial del aislado), sobre las placas con agar; los aislados de casos de PNCC deberían probarse con
antisueros contra Mccp, MmmLC, Mcc, M. mycoides subespecie capri (Mmc) y M. ovipneumoniae.
También debe incluirse en las placas un disco con 1,5% de digitonina.
vii)
Las placas se incuban a 37°C durante 2–6 días. Una incubación inicial a 27°C durante la noche puede
aumentar la sensibilidad de la prueba. La inhibición por digitonina suele ser fácilmente aparente; sin
embargo, la inhibición por antisuero puede ser más difícil de interpretar, presentándose supresión en
vez de inhibición del crecimiento dependiendo de la especie de micoplasma, la densidad de la colonia
y la potencia del antisuero. Se observan a menudo colonias "avanzadas" en las zonas de inhibición.
Alrededor de los discos se observan ocasionalmente bandas circulares de precipitina. Una zona de
2 mm o superior se considera una inhibición positiva.
•
Prueba de precipitación en crecimiento
La prueba de precipitación en crecimiento detecta antígenos solubles citoplásmicos y extramembranosos
que se liberan de los cultivos en crecimiento y difunden a través del medio sólido de crecimiento
reaccionado con el antisuero contra el micoplasma (15). Como en la prueba de la precipitina en gel, existen
fuertes reacciones cruzadas dentro de la agrupación mycoides. Si la inhibición del crecimiento se realiza
674
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.6.— Pleuroneumonía caprina contagiosa
utilizando MAb WM254, que es específico para Mccp, se lleva a cabo simultáneamente tanto la inhibición
específica como la aparición de una línea de precipitina durante el crecimiento.
•
Prueba de inmunofluoresecencia indirecta
Entre los diversos métodos serológicos, las pruebas de inmunofluorescencia directa e indirecta son las más
eficaces para identificar la mayoría de los micoplasmas (29). Son simples, rápidas y sensibles, además de
económicas en cuanto al uso de antisuero. Se han descrito varias formas, pero la más común y tal vez la
mejor sea la prueba indirecta con anticuerpo fluorescente (IFI) aplicada a colonias sin fijar en medio sólido.
Un antisuero contra una sola cepa es suficiente para identificar aislados naturales de esa especie, y los
antisueros se diluyen antes de uso. Los cultivos no tienen que clonarse, pero la prueba se suele aplicar
después de que varios pases hayan indicado si el cultivo contiene más de una especie y cuales son las
características de crecimiento de los microorganismos presentes.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Se secan dos placas con agar a 37°C durante 30 minutos. Cada una se inunda con una dilución
diferente de cultivo líquido problema, seleccionando las diluciones en función del vigor del crecimiento
de la cepa en medio sólido. Alternativamente, se extiende una gota de cultivo no diluido sobre una
placa de 5 cm mediante una varilla de vidrio en forma de L.
ii)
Las placas se incuban a 37°C hasta que se inicia el crecimiento. Si la prueba IFI no se puede realizar
en el momento, las placas se pueden guardar a 4°C hasta 4 semanas.
iii)
Se cortan varios bloques de aproximadamente 0,5–1 cm2 de las áreas que contengan numerosas
colonias no confluentes. Los bloques de cada cultivo sólido se cortan con la misma forma geométrica
para reconocer el origen, y con diferente forma para cada aislamiento. En diversos portas se
distribuyen varios bloques de cada aislamiento (con la superficie de las colonias hacia arriba),
utilizando cada porta para un antisuero distinto contra micoplasmas. La superficie de cada bloque se
identifica para futura referencia cortando una esquina.
iv)
Sobre cada bloque de agar, y hasta que se cubre la superficie por completo, se pipetea
cuidadosamente suero de conejo anti–micoplasma (ra–m) o suero normal de conejo (NRS; como
control, sobre un bloque duplicado) a una dilución adecuada en solución salina normal o tamponada
con fosfato (PBS), pH 7,2. La dilución óptima de ra–m se determina por titulación cruzada con el suero
con inmunoglobulina anti–conejo conjugada con isotiocinato de fluoresceína (FITC) que se utiliza (a–r
Ig–FITC).
v)
Los bloques tratados se incuban en sus portas a temperatura ambiente durante 30 minutos en una
cámara húmeda.
vi)
Todos los bloques de un porta se pasan a un tubo de 10 ml que contiene aproximadamente 7 ml de
PBS.
vii)
Los tubos se rotan a 18–30 rpm durante 10 minutos. El PBS se decanta a continuación y se reemplaza
con PBS fresco, y los tubos se rotan de nuevo durante 10 minutos.
viii) Se decanta el PBS y los bloques se colocan con las colonias hacia arriba en sus respectivos portas. El
exceso de líquido se absorbe.
ix)
Todos los bloques se inundan con una dilución óptima de a–r Ig–FITC.
x)
Los bloques se incuban de nuevo durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara
húmeda, luego se pasan a tubos que contienen PBS fresco y se lavan dos veces con rotación, como
antes.
xi)
Los bloques se devuelven a sus respectivos portas con la superficie de las colonias hacia arriba y se
examinan en un microscopio de epi–fluorescencia utilizando los ajustes recomendados por el
fabricante para FITC.
•
Notas sobre la prueba de inmunofluorescencia indirecta
xii)
Las diluciones de trabajo de ra–m y de a–r Ig–FICT deben mantenerse a 4°C, lo que limita su
caducidad a aproximadamente 1 semana.
xiii) Los aislamientos de PNCC deben examinarse con antisueros contra Mccp, MmmLC, Mmc
(M. mycoides, subespecie capri) y Mcc, con los controles positivos correspondientes de sus cepas
tipo, es decir Mccp, cabra Y, PG3 y cabrito California, respectivamente.
4
Disponible en el Kenya Agricultural Reserach Institute (KARI), P.O. Box 57811, Nairobi, Kenya.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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Capítulo 2.4.6.— Pleuroneumonía caprina contagiosa
xiv) Para cada cultivo debe incorporarse siempre un control negativo (tratado con NRS).
xv)
f)
La interpretación de la prueba IFI puede resultar difícil. Algunas especies producen autofluorescencia,
particularmente los acoleplasmas. Incluso en cultivo puro, una proporción de colonias puede no
marcarse con el antisuero específico; esto es frecuente en particular en Mcc. Alternativamente, los
resultados poco claros se pueden achacar al uso de un cultivo en medio sólido que se ha dejado
crecer en exceso o al empleo de un antisuero que se ha estropeado con la dilución y el tiempo.
Otras pruebas de identificación
Otras pruebas que a veces se utilizan en la identificación de micoplasmas caprinos son la inhibición del
metabolismo (37) y la inhibición de la reducción del tetrazolio (35). Se ha desarrollado una sonda génica,
F38–12, capaz de distinguir Mccp (36).
Para detectar el antígeno de la PNCC se ha descrito una prueba de aglutinación de látex específica del
antígeno polisacarídico (23). En esta prueba, se recubren bolas de látex con inmunoglobulina policlonal (de
conejo) dirigida contra el polisacárido de Mccp y utilizada para detectar el antígeno en el suero de cabras
con PNCC. Esta prueba parece barata, fácil de realizar en el campo y útil para detectar PNCC en sus
primeras fases.
2.
Pruebas serológicas
La serología no se ha aplicado mucho para identificar la causa de los brotes de pleuroneumonía en cabras y
ovejas. Las infecciones endémicas con MmmLC y Mmc pueden producir un fondo de títulos positivos a estos
microorganismos en algunos animales aparentemente sanos (12), y bajo condiciones experimentales puede
ocurrir seroconversión a M. mycoides en cabras sin síntomas clínicos de la enfermedad. Los casos agudos
causados por Mccp raramente muestran títulos positivos al microorganismo antes de la muerte (21, 26, 38),
quizás porque los anticuerpos son "eclipsados" por los antígenos circulantes de micoplasma (26). Por la prueba
de fijación de complemento (FC) y por la prueba de hemaglutinación indirecta (IHA) se observa que la
seroconversión a Mccp en animales infectados experimentalmente se inicia a los 7–9 días después de la
aparición de los síntomas clínicos, alcanza un máximo entre los 22 y 30 días y desciende después rápidamente
(26). Estas observaciones indican que la serología debe aplicarse a un rebaño, no a nivel individual, y que
siempre que sea posible deben examinarse muestras de sueros pareados recogidas con 3–8 semanas de
separación.
a)
Prueba de fijación de complemento (prueba prescrita para el comercio internacional) (19)
En sus diversas formas, la prueba FC continúa siendo la prueba serológica más usada para el diagnóstico
de la pleuroneumonía contagiosa bovina (10, 27). En la PNCC, la prueba FC se ha utilizado para detectar la
infección por Mccp (19) y se ha encontrado que es más específica, aunque menos sensible, que la prueba
IHA (26). Su principal desventaja es el alto nivel de experiencia técnica que se requiere para realizar la
prueba (10).
Un método de realización de la prueba es el siguiente. Para preparar el antígeno, se centrifugan 2 litros de
un cultivo de título superior a 109 FCU/ml, a 40.000 g durante 1 hora a 5°C. El precipitado se resuspende y
se lava tres veces en solución salina fisiológica antes de guardarlo en volúmenes de 0,5–1,0 ml a –20°C.
Un medio líquido estéril tratado como antes constituye un antígeno de sedimento, y un medio líquido
liofilizado y reconstituído a 200 mg/ml constituye un segundo antígeno de control. Antes de la prueba, el
antígeno se diluye 1/60 y se ultrasonica durante 3 minutos a baja potencia en un recipiente con agua
helada. El sonicado se centrifuga a 1.250 g durante 30 minutos para eliminar cualquier resto y se guarda a
–20°C. Si se almacena durante más de 2–3 semanas, el antígeno debe ser recentrifugado,
•
Procedimiento de la prueba
Las pruebas en placas de microtitulación se realizan utilizando volúmenes de 0,025 ml; dos volúmenes
contienen tres dosis hemolíticas medias de complemento y una concentración final de 1,5% (v/v) de
eritrocitos de oveja (SRBCs), dispuestos del siguiente modo en placas de microtitulación de fondo cóncavo:
i)
676
Lo siguiente se mezcla e incuba a 37°C durante 45 minutos:
•
25 µl de diluciones dobles del suero problema (calentado a 56°C durante 30 minutos)
comenzando con la dilución 1/2;
•
25 µl de antígeno (la dilución del antígeno debe determinarse mediante titulación utilizando un
suero positivo conocido);
•
25 µl de complemento (3 unidades hemolíticas).
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.6.— Pleuroneumonía caprina contagiosa
ii)
Se mezclan 25 µl de SRBCs sensibilizadas a una concentración final de 1,5% (v/v) y las placas se
incuban a 37°C durante 45 minutos.
iii)
Las placas se mantienen a 4°C durante 1 hora para permitir que sedimenten las células no lisadas.
iv)
Lectura de los resultados: El título será la dilución más alta que fije el 50% de complemento, es decir,
con 50% de hemolisis.
•
Controles
En todas las pruebas FC se requieren ciertos controles:
b)
i)
Sistemas indicadores (RBCs + hemolisina) solos, para comprobar que los eritrocitos (RBCs) no se
lisan espontáneamente.
ii)
Sistema indicador con sólo complemento, para mostrar que hay suficiente complemento para lisar las
células.
iii)
Sistema indicador con sólo antígeno, y sin complemento, para comprobar que el antígeno solo no lisa
las células.
iv)
Sistema indicador con sólo suero, y sin complemento, para mostrar que el suero solo no lisa a las
células.
v)
Sistema indicador con complemento y antígeno para detectar cualquier actvidad anticomplementaria
del antígeno.
vi)
Sistema indicador con complemento y suero para detectar cualquier actividad anticomplementaria del
suero.
Prueba de hemaglutinación indirecta (26)
La prueba IHA (5) se ha utilizado para el diagnóstico de la PNCC (26).
Normalmente la prueba IHA se realiza con RBCs frescos o tratados con glutaraldehído. Los primeros son
más sensibles pero muestran mayor variabilidad entre pruebas y requieren la sensibilización de las células
con antígeno cada vez que se realiza la prueba. El tratamiento de los RBCs con glutaraldehído reduce la
sensibilidad pero su utilización aumenta la utilidad de la prueba, ya que los RBCs sensibilizados duran
1 año o más si se mantienen en refrigeración, y requieren poca manipulación adicional antes de su uso en
la prueba.
Se ha examinado la especificidad de la prueba IHA para la "agrupación M. mycoides" utilizando suero
hiperinmune de conejo y RBCs tratados con glutaraldehído y sensibilizados con suspensiones de células de
micoplasmas ligeramente sonicadas (12). Las células sensibilizadas con MmmLC y Mccp mostraron
reacción cruzada con antisueros contra las otras tres especies, pero las células sensibilizadas con Mmc y
Mcc reaccionaron solamente con el antisuero contra Mccp.
El polisacárido producido por Mccp se une a RBCs no tratados de cabra y, por tanto, se ha utilizado con
éxito en una prueba IHA para identificar animales con PNCC natural y experimental (32).
En estudios de campo realizados en Omán y en Sudán se han utilizado células sensibilizadas con los
cuatro micoplasmas caprinos. Las conclusiones de los dos estudios fueron diferentes. El estudio de Omán
reveló una extensa seropositividad a Mmc, mientras que los casos que reaccionaban con Mcc estaban
limitados a rebaños en los que se había demostrado la presencia de Mcc mediante cultivo (12). Por el
contrario, en Sudán la mayoría de los animales con síntomas de PNCC fueron seropositivos para MmmLC
en comparación con los otros micoplasmas probados, y solamente el 7% reaccionó con antígeno de Mcc.
En ambos estudios se detectó seropositividad a dos o más antígenos en varios animales.
c)
Prueba de aglutinación con látex
En una prueba de aglutinación en porta se han utilizado bolas de látex sensibilizadas con el polisacárido
producido por Mccp y que se presenta en sobrenadantes de cultivo (11, 30). Esta prueba se usa ahora
rutinariamente en Kenia. Se trata de una prueba útil en caso de un brote porque puede realizarse utilizando
una gota de sangre.
Tanto los resultados de la prueba de FC como los de la de IHA resaltan las dificultades inherentes al
diagnóstico serológico de la PNCC cuando se usan células enteras o preparaciones de membranas como
antígeno. La utilización de antígenos más definidos, como el polisacárido elaborado por Mccp, proporciona
una mayor especificidad, ya que no hay reacciones cruzadas con sueros contra los otros tres micoplasmas
caprinos principales.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
677
Capítulo 2.4.6.— Pleuroneumonía caprina contagiosa
d)
Enzimoinmunoensayo competitivo (39)
Esta prueba se basa en la especificidad del MAb para el epítopo del Mccp y la capacidad de las cabras
infectadas por Mccp para producir anticuerpos contra este epítopo. Se provoca que los dos anticuerpos
compitan para el epítopo Mccp en placas recubiertas con el antígeno. Se ha descrito que la prueba es
específica y que detecta anticuerpos de larga duración tras la infección. Sin embargo, como ocurre con
otras pruebas serológicas, no detecta todos los reaccionantes (detecta entre el 30–60% de los individuos de
un rebaño infectado) (39). El enzimoinmunoensayo competitivo es más fácil de realizar que la prueba FC, y
es adecuado para procesar muchas muestras simultáneas. Por tanto, es apropiado para investigaciones
epidemiológicas. La validación del procedimiento está aún pendiente.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
La primera vacuna experimental contra Mccp contenía Mccp vivo tras muchos pases de cultivo (22). Su
inoculación intratraqueal resultó inocua y protegió a las cabras contra una infección inducida experimentalmente.
Sin embargo, el trabajo más reciente se ha concentrado en vacunas con formas inactivadas. La utilizada
actualmente en Kenia (donde se han usado vacunas inactivadas contra Mccp durante muchos años) contiene
Mccp liofilizado suspendido en saponina; esta composición tiene una caducidad de al menos 14 meses. La dosis
óptima de 0,15 mg de micoplasma proporciona protección durante más de 1 año (31).
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
El inóculo original se aisló de pulmones de una cabra enferma. Se trata del aislado Yatta tras 15 pases en
cultivo celular, que por GIT y PCR se ha confirmado que corresponde a Mccp. El inóculo inicial debe estar
puro y exento de otros contaminantes.
b)
Método de cultivo
El inóculo inicial se mantiene en forma liofilizada en ampollas de 1 ml. El inóculo de trabajo se prepara
amplificando el inóculo original en caldo de Newing modificado en cultivos de 4 litros. Su crecimiento de
detiene en la fase de cultivo anterior a la formación de filamentos.
En este cultivo se comprueba su esterilidad antes de distribuirlo en alícuotas de 20 ml y se guarda
congelado a –20°C.
c)
Validación como vacuna
El inóculo inicial debe prepararse a partir de muestras de pulmón o de líquido pleural de una cabra que
muera de neumonía, con todos los síntomas clínicos de PNCC. Debe confirmarse que el aislamiento es
Mccp por GIT o por PCR. Debe analizarse para comprobar su esterilidad, seguridad, potencia y la ausencia
de agentes extraños.
2.
Método de producción
Para producción de la vacuna, se establece primero un inóculo de trabajo amplificando una alícuota del inóculo
original liofilizado en caldo de Newing modificado (14), hasta obtener 4 litros de cultivo. Este cultivo se reparte en
alícuotas de 20 ml que se congelan a –20°C. La vacuna se cultiva en recipientes de 5 litros con 4 litros de caldo
de Newing modificado. Cada recipiente se muestrea asépticamente para pruebas de control de esterilidad antes
de inocular 20 ml de inóculo de trabajo en cada uno de los 4 litros de medio. Los recipientes se incuban a 37°C
durante 4–6 días dependiendo de la rapidez de crecimiento del micoplasma. Cuando los filamentos sedimentan,
el antígeno se recoge por centrifugación a 2.600 g de los recipientes no contaminados. (Los filamentos son finos
y blancos y a veces se unen como formando un pino invertido. Esto ocurre a los 4–6 días, cuando se hacen más
pesados y sedimentan). El precipitado se resuspende en solución salina estéril y se centrifuga para eliminar los
restos del medio de cultivo. El precipitado se resuspende de nuevo en un pequeño volumen de solución salina
estéril hasta preparar una solución viscosa.
Se añade saponina para inactivar los micoplasmas a razón de 3 mg de saponina por 1 ml de antígeno. Las
preparaciones se dejan durante la noche con agitación a 4°C con un agitador magnético.
NOTA: La saponina también actúa como un adyuvante. De esta suspensión se toman asépticamente tres
muestras y se prueban para control de esterilidad, determinación de proteína y pruebas de inocuidad.
678
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.6.— Pleuroneumonía caprina contagiosa
La cantidad de proteína expresada en mg/ml se determina mediante tubos estándar de opacidad y esto
determina el número total de dosis en el lote de vacuna.
3.
Control del proceso
Durante la producción, se realizan las siguientes pruebas para confirmar que el producto permanece puro y
seguro. Estas pruebas se realizan por personal de acreditación de calidad. Cada contenedor se muestrea
asépticamente antes de la inoculación para determinar la esterilidad.
Después de la maduración del cultivo, solamente se juntan para centrifugar aquellos cultivos que no muestren
signos de contaminación; los contaminados se descontaminan y se eliminan después de autoclavarlos.
Tras la inactivación con saponina se toma asépticamente una muestra para comprobar la esterilidad, otra para
comprobar la inocuidad y otra para determinación de proteína.
a)
Prueba de esterilidad
Esta prueba tiene como objetivo comprobar la ausencia de contaminantes fúngicos y bacterianos. Se
inoculan dos tubos de tioglicolato, que contienen 15 ml de caldo, cada uno con 1 ml de la muestra. Los
tubos se incuban a 37°C para detectar aerobios, microaerófilos y anaerobios. El otro medio utilizado es
caldo de hidrolizado de soja y caseína. Se inoculan cuatro tubos con 12 ml de muestra cada uno.
Dos tubos se incuban a 37°C y otros dos a temperatura ambiente (25°C) para detectar contaminantes
fúngicos y bacterianos. Todos los medios se incuban 14 días con controles. La ausencia de crecimiento
demuestra que la muestra no está contaminada.
b)
Prueba de inocuidad
Esta prueba muestra la presencia de micoplasmas vivos en la vacuna: en un tubo se añaden 0,3 ml
de antígeno inactivado a 2,7 ml de caldo de Newing modificado y se hacen diluciones decimales de 10-1 a
10-10. Se establece un control positivo con un cultivo viable de M. capripneumoniae y un control negativo
mediante tres tubos de medio no inoculado. Se incuban todos a 37°C durante 12 días. Si no hay
crecimiento en los tubos inoculados con la muestra de prueba, la vacuna supera la prueba.
c)
Estimación del contenido de proteína
Esta prueba emplea tubos de opacidad de Brown. El antígeno se deposita en tubos similares a los que
contienen los estándares y se compara su opacidad visualmente con la de cada estándar comenzando por
la más baja. Después de la determinación, se diluye el antígeno con solución salina normal para que la
vacuna final contenga 2 mg de proteína/ml.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
La prueba de esterilidad del lote final se realiza como se describe en la Sección C.3.a. excepto que se
juntan cuatro botellas de cada de cada lote y se utilizan muestras de ese conjunto.
b)
Inocuidad
Debe demostrarse que cada lote de vacuna contra la PNCC es seguro en animales de laboratorio. Se
inoculan dos cobayas en la pata posterior por ruta intramuscular con 0,5 ml que contengan cinco dosis de
vacuna y otros dos por vía peritoneal.
Si la vacuna es segura, los cobayas no deben mostrar signos de enfermedad a los 14 días de observación
y, en análisis post–mortem no deben mostrar abscesos en el sitio de la inoculación o en la cavidad
peritoneal, respectivamente. Si durante el período de observación ocurren muertes relacionadas con las
vacunas, la vacuna no supera la prueba. Tampoco la supera si en examen post–mortem se observan
abscesos en el sitio de la inoculación y en el peritoneo.
c)
Potencia
En el Instituto de Investigaciones Agrícolas de Kenia, Muguga, Kenia, se está desarrollando una prueba de
potencia.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
679
Capítulo 2.4.6.— Pleuroneumonía caprina contagiosa
d)
Duración de la inmunidad
La vacuna protege a las cabras durante 14 meses. Se recomienda, no obstante, una dosis de refuerzo al
cabo de 1 año.
e)
Estabilidad
La vacuna tiene una duración de un año si se guarda a 4°C. Antes de uso debe agitarse vigorosamente
para lograr una distribución uniforme del antígeno.
f)
Conservantes
En la actualidad no se utilizan conservantes en la vacuna.
g)
Precauciones
Los efectos laterales de la vacuna contra la PNCC incluyen el desarrollo de inflamación en el sitio de la
inoculación y fiebre durante 1–2 días después de la vacunación, acompañada por inapetencia. La
inflamación puede durar entre 1 y 14 días y es debida al adyuvante de saponina. La autoinyección
accidental origina una irritación grave.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Cada lote de vacunas debe probarse para seguridad en animales de laboratorio como se describe en C.4.b.
b)
Potencia
Cuando se haya establecido la prueba de potencia, será necesario que cada lote de vacuna se pruebe para
comprobar su potencia.
REFERENCIAS
1.
ACHARYA R.M. (1992). Goat production. En: Recent advances in goat production. Fifth International
Conference on Goats, New Delhi, India, March 1992, 49–94.
2.
BELTON D., LEACH R.H., MITCHELMORE D.L. & RURANGIRWA F.R. (1994). Serological specificity of a monoclonal
antibody to mycoplasma strain F38, the agent of contagious caprine pleuropneumonia. Vet. Rec., 134, 643–
646.
3.
BOLSKE G., MATTSSON J.G., BASCUNANA C.R., BERGSTROM K., W ESONGA H. & JOHANSSON K.E. (1996).
Diagnosis of contagious caprine pleuropneumonia by detection and identification of Mycoplasma capricolum
subsp. capripneumoniae by PCR and restriction enzyme analysis. J. Clin. Microbiol., 34, 785–791.
4.
BRADBURY J.M. (1983). Phosphate activity. En: Methods in Mycoplasmology, Vol. 1, Razin S. & Tully J.G.,
eds. Academic Press, New York, USA, 363–366.
5.
CHO H. J., RUHNKE H.L. & LANGFORD E.V. (1976). The indirect haemagglutination test for detection of
antibodies in cattle naturally infected with mycoplasmas. Can. J. Comp. Med., 40, 20–29.
6.
DIGHERO M.W., BRADSTREET C.M.P. & ANDREWS B.E. (1970). Dried paper discs for serological identification of
human mycoplasmas. J. Appl. Bacteriol., 33, 750–757.
7.
FREUNDT E.A. (1983). Proteolytic activity. En: Methods in Mycoplasmology, Vol. 1, Razin S. & Tully J.G.,
eds. Academic Press, New York, USA, 367–371.
8.
FREUNDT E.A., ANDREWS B.E., ERNO H., KUNZE M. & BLACK F.T. (1973). The sensitivity of Mycoplasmatales to
sodium–polyanethol–sulfonate and digitonin. Zentralbl. Bant Parasitkde, (I Abt), A225, 104–112.
9.
GOURLAY R.N. (1964). Antigenicity of Mycoplasma mycoides. 1. Examination of body fluids from cases of
contagious bovine pleuropneumonia. Res. Vet. Sci., 5, 473–482.
10. GOURLAY R.N. (1983). Serological tests for the diagnosis of contagious bovine pleuropneumonia. En: The
Diagnosis of Contagious Bovine Pleuropneumonia and Other Infections with Mycoplasma mycoides
subspecies mycoides, Hall S.A., ed. CEC publication EUR 8654, Luxembourg, 27–32.
680
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Capítulo 2.4.6.— Pleuroneumonía caprina contagiosa
11. HOUSHAYMI B., TEKLEGHIORGIS T., W ILSMORE A.F., MILES R.J. & NICHOLAS R.A.J. (2002). Investigations of
outbreaks of contagious caprine pleuropneumonia in Eritrea. Trop. Anim. Health Prod., 34, 383–389.
12. JONES G.E. & W OOD A.R. (1988). Microbiological and serological studies on caprine pneumonia in Oman.
Res. Vet. Sci., 44, 125–131.
13. KALINER G. & MACOWAN K.J. (1976). The pathology of experimental and natural contagious caprine
pleuropneumonia in Kenya. Vet. Med. [B], 2, 652–661.
14. KIBOR A.C. & W AIYAKI P.G. (1986). Growth of mycoplasma F38 in medium B (modified Hayflick) and
Newing’s typtose medium. Bull. Anim. Health Prod. Afr., 34, 157–159.
15. KROGSGAARD–JENSEN A. (1972). Mycoplasma: growth precipitation as a serodiagnostic method. Appl.
Microbiol., 23, 553–558.
16. LORENZON S., W ESONGA H., YGESU L., TEKLEGHIORGIS T., MAIKANO Y., ANGAYA M., HEDRIKX P. & THIAUCOURT F.
(2002). Genetic evolution of Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae strains and molecular
epidemiology of contagious caprine pleuropneumonia by sequencing of locus H2. Vet. Microbiol., 85, 111–
123.
17. LEACH R.H., ERNO H. & MACOWAN K.J. (1993). Proposal for designation of F38–type caprine mycoplasmas as
Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae subsp. nov. and consequent obligatory relegation of
strains currently classified as M. capricolum (Tully, Garile, Edward, Theodore & Erno, 1974) to an additional
new subspecies, M. capricolum subsp. capricolum subsp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 603–605.
18. MACMARTIN D.A., MACOWAN K.J. & SWIFT L.L. (1980). A century of classical contagious caprine
pleuropneumonia: from original description to aetiology. Br. Vet. J., 136, 507–515.
19. MACOWAN K.J. & MINETTE J.E. (1976). A mycoplasma from acute contagious caprine pleuropneumonia in
Kenya. Trop. Anim. Health Prod., 8, 91–95.
20. MACOWAN K.J. & MINETTE J.E. (1977). The role of mycoplasma strain F38 in contagious caprine
pleuropneumonia in Kenya. Vet. Rec., 101, 380–381.
21. MACOWAN K.J. & MINETTE J.E. (1977). Contact transmission of experimental contagious caprine
pleuropneumonia (CCPP). Trop. Anim. Health Prod., 9, 185–188.
22. MACOWAN K.J. & MINETTE J.E. (1978). The effect of high passage mycoplasma strain F38 on the courses of
contagious caprine pleuropneumonia (CCPP). Trop. Anim. Health Prod., 10, 31–35.
23. MARCH J.B., GAMMACK C. & NICHOLAS R. (2000). Rapid detection of contagious caprine pleuropneumonia
using a Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae capsular polysaccharide–specific antigen
detection latex agglutination test. J. Clin. Microbiol