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Tercera reunión de producción vegetal y primera de producción animal del noa
MICROPROPAGACIÓN DE PORTAINJERTOS DE PALTO
Eugenia E. Enrico, Roxana J. Enrico y Alfredo Grau
Laboratorio de Investigaciones Ecológicas de las Yungas (LIEY)
CC 34 (4107) - Yerba Buena, TUCUMAN – ARGENTINA
Tel./fax 54 381 425 3728
E-mail: eugenrico@uolsinectis.com.ar
RESUMEN
Segmentos uninodales del palto (Persea americana Mill.) se micropropagaron en
medio de Murashige y Skoog (1962), con dosis crecientes de BAP. La brotación fue
superior al 70% en todos los tratamientos, mientras que con el aumento de BAP
hasta un valor máximo de 1,125 mg.L-1, aumentan tanto la longitud del brote como el
número de hojas. En la siguiente etapa para la multiplicación de yemas se utilizó
como medio de cultivo MS/2, con dos dosis de BAP: 0,3 mg.L-1 (PM1) y 3 mg.L-1
(PM2) respectivamente, durante 30 días. Los explantes que mostraron mayor
proliferación de yemas fueron los provenientes del medio de iniciación con 0,375
mg.L-1 de BAP cultivados en PM1 y los del medio con 1,125 mg.L-1cultivados en
PM2. Los vástagos producidos se transfirieron a medio de enraizamiento, MS con
macronutrientes reducidos a un tercio de la concentración estándar, primero con 5,5
mg.L-1 de IBA, durante tres días y luego sin auxina por 40 días. Los porcentajes de
enraizamiento fueron bajos, hasta un 10% sin embargo, se obtuvieron plantas
completas, vigorosas y con sistemas radiculares funcionales.
SUMMARY
Nodal segments of avocado (Persea americana Mill.) were grown in vitro in
Murashige and Skoog (1962) media, with the increasing BAP. Bud sprouting was
above 70% in all treatments. Shoot length and leaf number increased with BAP
concentration up to 1,125 mg.L-1. For bud multiplication MS/2 medium was used, with
two BAP levels: 0,3 mg.L-1 (PM1), and 3 mg.L-1 (PM2), for 30 days. BAP at 0,375
mg.L-1 transferred to PM1 and BAP at 1,125 mg.L-1 transferred to PM2 showed
higher bud proliferation. The elongating shoots were transferred to rooting medium,
MS with macronutrients at one-third and 5,5 mg.L-1 of IBA for three days, and then
moved to auxin free medium for 40 days. While rooting percentages were low (10%),
vigorous, complete plants, with functional root systems were obtained.
INTRODUCCIÓN
En el Noroeste Argentino el cultivo de palto (Persea americana Mill.) se encuentra en
expansión y constituye un interesante recurso económico para la zona. Un problema
tradicional del cultivo se presenta por el uso de plantines provenientes de semilla
como pie de injerto. Al tratarse de una especie altamente heterocigótica el uso de
este material resulta en una gran variabilidad en el comportamiento en el campo
(Ben Ya’acov, 1987). Otro problema típico del cultivo es la infección provocada por
Phytophtora en las raíces, que exige una costosa inversión en agroquímicos.
El cultivo in vitro se presenta como una alternativa válida para reducir la variabilidad
en los portainjertos. Por otro lado la micropropagación permitiría también la
multiplicación de líneas tolerantes a Phytophtora.
Tercera reunión de producción vegetal y primera de producción animal del noa
Se han logrado cultivos in vitro con relativo éxito para esta especie (Pliego-Alfaro &
Murashige, 1987; Biasi et al., 1994; Barceló-Muñoz et al., 1999; Witjaksono et al.,
1999). En este trabajo se pretende poner a punto una técnica de micropropagación
de portainjertos de palto para nuestra región, con un costo competitivo, partiendo de
material juvenil.
MATERIALES Y MÉTODOS
Plantas madres: Se eligieron semillas de origen sexual, de árboles madre, de
variedades mejicanas nativas de Persea americana Mill., conocidas vulgarmente con
el nombre de “anisadas”, que se usan con éxito como portainjerto en nuestra región.
Las semillas fueron cortadas transversalmente aproximadamente a 1,5 cm del
extremo distal con el objeto de acelerar la germinación. La zona del corte fue tratada
con sulfato de cobre y las semillas se germinaron en almácigo. Al alcanzar 20 cm
los plantines fueron transferidos a recipientes plásticos individuales. Se mantuvieron
en invernadero, se fertilizaron con NPK (15:15:15,) y se pulverizaron cada 15 días
con Benomyl al 1,5%, para mantener la mayor sanidad posible hasta que
alcanzaron 30cm de longitud. Estos ensayos se realizaron entre Noviembre de 2002
y Marzo de 2003.
Cultivo in vitro: El cultivo se realizó en tres etapas: iniciación, multiplicación y
enraizamiento. En todas las etapas se utilizó como medio de cultivo básico MS
(Murashige & Skoog, 1962) a diferentes concentraciones, suplementado con dosis
crecientes de reguladores de crecimiento, 30 g.L-1 de sacarosa y 6,5 g.L-1 de Agar.
En todos los casos, el pH se ajustó a 5,8, previo a la esterilización. Los medios se
colocaron en tubos de vidrio de 18 mm de diámetro por 100 mm de altura, con 4ml
de medio cada uno. Posteriormente, se esterilizaron en autoclave a 121°C a 1,05
Kg. cm-2 durante 20 min. Se colocó un explante, segmento uninodal, por tubo. Los
cultivos se incubaron a 26  1°C, con un fotoperíodo de 16 horas de luz (75
µmol.m-2.seg-1).
Desinfección: Se seleccionaron tallos jóvenes, a los que se quitaron las hojas y se
cortaron en secciones de 20 a 25 cm de largo, sumergiéndolos en etanol 70%,
durante 30 segundos. Estos segmentos se separaron en porciones uninodales de 1
a 1,5 cm y se desinfectaron en una solución de hipoclorito de sodio comercial (55
g.L-1 Cl-), al 25% durante 15 minutos.
Iniciación del cultivo: se realizó un experimento variando las concentraciones de
citocinina, bencil-aminopurina (BAP), adicionadas al medio MS con la concentración
de sales reducida a la mitad. Las concentraciones de BAP empleadas fueron 0-0,371,12-1,87-2,62 mg.L-1 (PB0, PB1, PB2, PB3, PB4, respectivamente). Una vez
cultivados, los explantes se incubaron en estos medios durante 60 días, realizando
toma de datos a los 35 y a los 53 días. Los parámetros medidos fueron longitud del
brote y número de hojas, tomado como equivalente del número de yemas axilares
producidas.
Multiplicación del cultivo: Se usó material proveniente de la etapa de iniciación, que
fue cultivado en dos tratamientos. Se utilizó como medio de cultivo MS con las sales
reducidas a la mitad de la concentración estándar, con dos dosis de BAP: 0,3 (PM1)
y 3 mg.L-1 (PM2) respectivamente. Este ensayo se mantuvo por 30 días. Se midieron
los mismos parámetros que para la etapa de iniciación del cultivo.
Enraizamiento del cultivo: se utilizó medio MS con los macronutrientes reducidos a
un tercio de la concentración estándar. Los explantes estériles provenientes de la
etapa de multiplicación se colocaron primero en un medio con 5,5 mg.L-1 de ácido
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indol butírico (IBA), durante tres días. Luego se transplantaron al mismo medio sin
auxinas por 40 días.
Adaptación ex vitro: La adaptación ex vitro fue gradual, disminuyendo la humedad
relativa de 100% a 65% en el término de una semana. Se transplantaron en macetas
plásticas de 250 mL, con mezcla tierra:perlita (60:40).
RESULTADOS
Iniciación del cultivo: Se observó un porcentaje de brotación superior al 70 % en
todos los niveles de citocinina empleados. La longitud de brote y el número de hojas
producidas se incrementan proporcionalmente con el aumento de las dosis de BAP,
hasta un valor máximo de 1,125 mg.L-1; a partir de esta dosis los parámetros citados
decrecen (Figs. 1 y 2). Este comportamiento se mantiene al transcurrir mayor tiempo
en el medio. La diferencia registrada a los 53 días consistió en un aumento de los
parámetros citados. Se observó producción de callos independientemente del
tratamiento aplicado.
Figura 1: Número de yemas, equivalentes al número de hojas producidas por los
explantes cultivados en etapa de iniciación, obtenidas a los 35 y a los 53 días.
Nro.
15
10
5
0
PB0 PB1 PB2 PB3 PB4
Tratam iento
Nro.yemas(35días)
Nro.yemas(53días)
Figura 2: Longitud de brote alcanzada por los explantes cultivados en etapa de
iniciación, medida a los 35 y a los 53 días.
Long.(mm)
40
30
20
10
0
PB0 PB1 PB2 PB3 PB4
Tratam iento
Long.Brote(35días)
Long.Brote(53días)
Multiplicación del cultivo: Cuando los explantes fueron transferidos al medio de
multiplicación, después de 60 días de permanencia en medio de iniciación, se
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observó que, independientemente del medio de iniciación empleado, los parámetros
medidos decrecían con un aumento en la dosis de BAP empleadas, excepto en los
explantes que provenían del medio de iniciación que contenía 1,125 mg.L-1 (PB2,
Tabla 2). Los explantes que mostraron mayor proliferación de yemas, equivalentes al
número de hojas producidas, fueron los cultivados en los tratamientos 3 y 6 (Tabla
2). Se ha observado que esta especie tiene muy buena persistencia in vitro,
pudiendo permanecer en excelente estado por el término aproximado de 8 meses.
Tabla 2: Producción de hojas y longitud de brote en los explantes durante la etapa
de multiplicación.
Tratamiento
1
Combinación de Medios
No.de Hojas
iniciación-multiplicación
PB0-PM1
5,4
Longitud de
Brote (cm)
2,04
2
PB0-PM2
3,2
0,68
3
PB1-PM1
8,0
1,20
4
PB1-PM2
4,0
0,95
5
PB2-PM1
1,8
0,23
6
PB2-PM2
7,8
1,46
7
PB3-PM1
5,8
1,40
8
PB3-PM2
4,0
0,93
9
PB4-PM1
5,4
0,92
10
PB4-PM2
4,7
0,53
Enraizamiento: Los porcentajes de enraizamiento obtenidos hasta el momento son
bajos con las dosis de auxinas empleadas , no superaron el 10%. Sin embargo, se
lograron obtener plantas completas, con sistemas radiculares funcionales (Fig. 3).
La exposición de los explantes, por periodos superiores a tres días, a dosis de
auxinas inferiores a la probada (1 mg/L de IBA), inhibió completamentela producción
de raíces.
Figura 3: Vástago enraizado.
Tercera reunión de producción vegetal y primera de producción animal del noa
Aclimatación: Las plantas completas producidas in vitro, transferidas a macetas
luego de 4 meses de cultivo, tuvieron una supervivencia superior al 85% (Fig. 4).
Figura 4: Planta completa de Persea americana a los 20 días de trasplantada ex
vitro.
DISCUSIÓN
Previo a este trabajo, se realizaron ensayos de cultivo sobre medio MS, con
diferentes concentraciones salinas (MS x 1; MS x 0,5; MS x 0,25), para obtener
proliferación de vástagos y supervivencia satisfactorias. Los resultados obtenidos
mostraron como óptimo al MS con sales reducidas a la mitad de la concentración
estándar. La dilución del medio MS ha sido recomendada con anterioridad para el
cultivo de palta por Barceló-Muñoz et al. (1990) y específicamente, la dilución MS x
0,5, ha sido empleada para promover el crecimiento de yemas axilares por VegaSolarzano (1989) y concuerda con otros autores que la emplearon para reducir la
oxidación de los explantes (Biasi et al., 1994) y la necrosis apical (Pliego-Alfaro,
1981).
En la etapa de iniciación del cultivo el alto porcentaje de brotación observado en
todos los tratamientos podría deberse a los contenidos endógenos de las plantas
madres que se encontraban en plena etapa de crecimiento. Ya que se han
observado valores similares en el tratamiento control, sin el agregado de reguladores
de crecimiento.
Con respecto a las dosis de BAP empleadas, el tratamiento PB2 resultó ser en el
que se obtuvo mayor proliferación de yemas axilares, seguido del tratamiento PB1
(Figs.1 y 2), cuyos resultados no mostraron elevada diferencia con el anterior. En
cuanto al tiempo de duración, se estima que resultan suficientes 45 días de
permanencia en cultivo de iniciación, para que el alargamiento de los entrenudos
permita la adecuada separación entre las yemas producidas.
De acuerdo con los resultados obtenidos en la etapa de multiplicación, la
combinación de medios iniciación-multiplicación adecuada para lograr la mayor
proliferación de yemas con el menor empleo de reguladores de crecimiento, fue
PB1-PM1 (tratamiento 3, Tabla 2).
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La etapa de mayor dificultad fue el enraizamiento, aparentemente debido a que la
dosis de auxina empleada fue baja de acuerdo a lo indicado por otros autores
(Pliego-Alfaro, 1988; Biasi et al., 1994; Witjaksono et al., 1999), sin embargo, las
plantas que produjeron raíces pudieron continuar su crecimiento con éxito ex vitro.
La exposición prolongada a la auxina en el medio de cultivo inhibió la emergencia y
alargamiento de las raíces, por lo que se recomienda mantener los vástagos en
contacto con este regulador de crecimiento como máximo por 72 horas. Biasi et al.
(1994) confirma requerimientos diferenciados de auxina en el proceso de
rizogénesis, siendo ésta necesaria para la inducción y actuando como inhibidora del
crecimiento y alargamiento radicular. Estos resultados preliminares son muy
promisorios, y están en curso ensayos para confirmar y optimizar la metodología.
BIBLIOGRAFÍA
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