Download trabajo práctico nº 6: enzimas

UNIVE RS IDAD NACIO NAL DE MISIO NE S
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES
TRABAJO PRÁCTICO Nº 6: ENZIMAS
1.Nucleasas
2. Endonucleasas de Restricción (ER)
3. Fosfomonoesterasas
4. Polinucleótido Kinasas
5. ADN ligasas
6. ADN polimerasa I
7. ADN polimerasa dependiente de
ARN (transcriptasa reversa)
8.Deoxynucleotidil tranferasa terminal
9. Polimerasa poly A
GENERALIDADES:
La habilidad de manipular ADN in vitro depende exclusivamente de la
disponibilidad de enzimas purificadas que corten, modifiquen y unan moléculas de una
manera específica. Al momento, ningún método puramente químico puede alcanzar
tanto la selectividad o el rango de reacciones enzimáticas para re-estructurar el ADN.
Por otro lado sólo un pequeño número de enzimas proveen las herramientas esenciales
para preparar moléculas de ADN recombinante (ADNr).
Muchas de estas enzimas se descubrieron bajo circunstancias no relacionadas a la
utilidad que tienen en la manipulación de ADN. Además cada enzima posee un rol vital
en la química-genética del organismo de donde deriva. La utilidad de las enzimas como
herramientas depende en parte de su disponibilidad y estabilidad, pero mucho más
importante es su pureza, particularmente la ausencia de interferencia en la actividad
enzimática.
1.
NUCLEASAS:
-Herramientas para manipular ADN o ARN.
Cada enzima puede ser descripta según su especificidad y según la reacción que
catalizan. Así, algunas enzimas, como ER sólo clivan ADN, ARNasa pancreáticas sólo
hidrolizan ARN. Otras enzimas encuentran irrelevante la presencia del 2´OH en la
ribosa y por lo tanto utilizan indistintamente el ARN o ADN como sustrato.
Existen nucleasas que prefieren polinucleótidos en simple cadena, otras
prefieren doble cadena, y otras que les resulta indistinta la condición.
Se las caracteriza también como EXO o ENDO Nucleasas:
Las EXO requieren substratos polinucleotídicos con terminaciones accesibles y
comienzan el corte en o cerca de la terminación de la cadena. Algunas pueden tener
preferencia por el extremo 5´ o 3´ o pueden no tener preferencia por un extremo en
particular. Pueden generar productos polinucleotídicos cortos, pero muchas generan
nucleótidos monofosfato pues hidrolizan la cadena de a un residuo por vez.
Las ENDO no requieren terminaciones disponibles en su sustrato y por tanto
pueden hidrolizar moléculas circulares. Clivan siempre uniones fosfodiester internas y
producen fragmentos polinucleotídicos de tamaño variable.
Las nucleasas se distinguen dependiendo de que lado del puente fosfodiester
internucleotídico hidrolizan. Algunas cortan entre el P y el 3´OH, obteniendo productos
5´fosfomonoesteres (Fig. 1).
Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos 2010
1
UNIVE RS IDAD NACIO NAL DE MISIO NE S
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES
5´- pA pCp - 3´
5´- pA – OH 3´
5´- pCp - 3´
Fig. 1: ejemplo de corte entre el P y el 3´OH,
obteniendo productos 5´fosfomonoesteres
Otras clivan entre el P y el 5´ OH resultando productos con 3´fosfomonoésteres. Fig.2
5´- pAp
5´- pAp –3´
Cp – 3´
5´OH- Cp – 3´
Fig. 2: ejemplo de corte entre el P y el 5´OH,
obteniendo productos 3´fosfomonoesteres
1.1 NUCLEASAS ESPECÍFICAS DE CADENA SIMPLE
1.1.a ENDONUCLEASAS:
Algunas hidrolizan cadenas simples de ADN unas mil veces más rápido que
moléculas dobles. Esta especificidad es experimentalmente útil de muchas maneras
diferentes: para la construcción de ADNr, para el análisis de heteroduplex, inclusive
para el análisis de la expresión génica.
Muchas nucleasas específicas de simple cadena se han purificado y caracterizado
para utilizarlas como reactivos. Ej: nucleasa S1. Estas enzimas requieren condiciones
específicas de reacción para su actividad óptima y para la correcta discriminación entre
moléculas de simple o doble cadena. El clivaje de las uniones fosfodiester para estas
enzimas genera 5´NMP y 3´OH (Fig. 3):
Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos 2010
2
UNIVE RS IDAD NACIO NAL DE MISIO NE S
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES
a. Extremos simple cadena, en ADN
doble cadena (ADNdc), se convierten
en extremos romos.
a.
b. ADNdc con pequeñas regiones mal
apareadas son clivadas en 2 fragmentos
en el punto del error de apareamiento.
b.
c.
c. ADN con horquilla se cliva para
originar 2 cadenas.
d.
d. ADNdc con “gap”, se convierte en
dos ADNdc por destrucción del gap.
e.
Fig. 3: Diferentes tipos de cortes generados por las endonucleasas .
e. ADNdc con loop simple cadena se
convierten en 2 fragmentos de ADNdc
por destrucción del loop y clivaje de la
cadena opuesta.
1.1.b EXONUCLEASAS:
Ejemplo 1: Exo VII es específica para cadenas simples de ADN. Posee una
actividad exonucleolítidica inusual; inicia la digestión a partir de ambos extremos 5´y 3´
de la cadena (muchas de las exonucleasas conocidas operan en uno u otro extremo). Así
mismo, genera oligonucleótidos de hasta 25 nucleótidos de longitud con extremos 5
´NMP, es decir que NO digiere de a un nucleótidos por vez.
Ejemplo 2 : Nucleasa Bal 31: (deoxiribonucleasa). Actúa como una endonucleasa
de ADNsc, incluyendo en regiones de ADNsc ubicadas en ADNdc, del mismo modo
que lo hacen otras endonucleasas específicas. No obstante el ADNdc queda intacto. Esta
enzima tiene actividad exonucleasa, presumiblemente porque reconoce el carácter de
cadena simple parcial (o inestabilidad del duplex) clivando ambas cadenas en ambos
extremos, es decir, degradando en sentido 3´- 5´ y 5´- 3´ simultáneamente. Como
resultado, la molécula doble cadena se acorta progresivamente. Si se determina
empíricamente la tasa de acortamiento, entonces Bal 31 puede utilizarse para acortar
fragmentos de ADN a una longitud deseada. Aunque el corte de cada molécula de ADN
en una población no es sincrónica, pueden obtenerse realmente un grupo de productos
cercanos al tamaño elegido. Luego de una digestión exhaustiva con Bal 31, los
oligonucleótidos intermediarios son completamente degradados en 5´mononucleótidos.
Ejemplo 3: RNasa H. Corresponde a un grupo de enzimas llamadas RNAasas H
pues degradan significativamente la hebra de ARN de un híbrido duplex ARN/ADN.
(Ej. la RNasa H de E.coli es una endonucleasa cuyos productos son oligonucleótidos
con extremos 5´ NMP).
Las células eucariotas contienen una endonucleasa RNasa H. Las actividades de
exonucleasa RNasa H, está asociada con exoIII E.coli y una actividad de transcriptasa
reversa codificada por retrovirus. Degrada el ARN a 5´NMP en dirección 3´- 5´. Los
productos de la transcriptasa reversa RNasaH son oligos 5´ fosforilados generalmente
de entre 2 a 10 nucleótidos de longitud.
2.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN (ER):
Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos 2010
3
UNIVE RS IDAD NACIO NAL DE MISIO NE S
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES
La evolución dotó a diferentes especies de bacterias con endonucleasas únicas que
les permiten reconocer el ADN propio del exógeno. De esta forma, la naturaleza provee
a los científicos de una gran lista de reactivos exquisitamente específicos para la
disección del ADN. Dos características fundamentales de las ER son importantes para el
estudio del ADN:
1) La remarcada especificidad con que las ER reconocen secuencias
nucleotídicas cortas en la molécula de ADN.
2)
La existencia de muchas ER diferentes, cada una reconociendo una
secuencia específica.
2.1 Tres tipos de ER:
I y III: Ambas son complejos proteicos que incluyen la actividad de restricción y
metilación. Son muy interesantes pero no son útiles para la construcción de moléculas
de ADNr.
Las de tipo I se une al ADN en secuencias de reconocimiento y luego provocan
cortes doble cadena a distancias variables del sitio de reconocimiento, al menos entre
400 pb y 7 kb de distancia del mismo.
La hidrólisis enzimática del ADN requiere la presencia de Mg 2+, ATP y Sadenosil-metionina (SAM), este último activa la enzima. La hidrólisis de ATP
acompaña el corte, luego la enzima se vuelve inactiva como una ENDO y se transforma en
una potente ATPasa (son ATPasa ADN dependientes, son además metilasas sitio
específicas generando residuos 6-metiladenina)
Ejemplo:
*
Ecoli K12
5´- AACNNNNNNGTGC 3´ - TTGNNNNNNCACG *
Donde:
N = cualquier base
Aunque la acción de la ENDO ocurre a distancia de este sitio, la metilación tiene
lugar dentro del sitio, en la segunda A de la cadena superior y en al única A en la cadena
inferior. Solo un sitio completamente no metilado provee un sustraro para la actividad
ENDO.
El representado en el ejemplo es un sitio típico de ER I en donde existe secuencias
cortas separadas por 6 a 8 pares de bases inespecíficas y aunque la secuencia
oligonucleotídica sea específica para cada enzima la posición del los residuos de A que
serán metilados es siempre la misma.
Tipo III: aquí también ambas actividades están juntas, nucleasa mas metilasa. No
obstante, así como requieren S-adenosil-metionina y ATP para el clivaje del ADN, no
catalizan la hidrólisis del ATP.
Provocan cortes en ADNdc a aproximadamente 25 pb del sitio de reconocimiento
y en presencia de ATP y SAM la misma enzima cataliza la metilación sitio específica.
Son proteínas heterodiméricas.
Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos 2010
4
UNIVE RS IDAD NACIO NAL DE MISIO NE S
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES
Debido a que las ER tipo I no cortan al ADN en un set de fragmentos
reproducibles y, ambos tipos I y III están complicadas con la actividad de metilación,
ninguna es utilizada como reactivo en la generación de moléculas recombinantes.
Tipo II: son herramientas críticas para la construcción de moléculas de
recombinación y para análisis de la estructura del ADN. Estas enzimas reconocen y se
unen a cortas secuencias nucleotídicas específicas en el ADN, pero a diferencia de I y
III catalizan el corte de ADN doble cadena en uniones fosfodiester, dentro de la
secuencia de reconocimiento.
Más allá de la longitud total de una molécula de ADN la misma siempre es
clivada en la misma cantidad de fragmentos por una ER tipo II y la longitud de los
fragmentos generados esta definida por la distancia entre los sitios específicos de
reconocimento de esa enzima.
Hidrolizan uniones fosfodiester entre el 3´OH y el fosfato, generando 5
´fosfomonoesteres por un lado y el 3´OH por otro. Usualmente se requiere un catión
divalente (Mg2+) pero no requiere ATP ni SAM.
Ejemplo: Típica ER II : Eco RI
Reconoce y cliva ADN cada vez que ocurre la secuencia
5´- GAATTC – 3´
Como es característico para un grupo de ER II la secuencia de reconocimiento es
un palíndromo, la misma secuencia ocurre precisamente en sentido opuesto en la cadena
complementaria. La actividad de hidrólisis ocurre en la unión fosfodiester entre la G y
A de una cadena.
Ejemplo: La hidrólisis tiene lugar en dos pasos, primero una cadena y luego la
otra
5´pG pApApTpTpCp3´
3´pC pTpTpApAp Gp 5´
5´pGOH3´
5´pApApTpTpCp3´
3´pCpTpTpAp5´
3´OH Gp5´
Extremos cohesivos: debido a que EcoRI provoca cortes “protruyentes” en ambas
cadenas, el fragmento de ADN resulta en terminaciones de cadena simple, cortas,
conteniendo las cuatro bases 5´- AATT-3´. Dependiendo de las condiciones de sal y
temperatura, estas colas complementarias se mantienen unidas por puentes de hidrógeno
o se separan. Generando un cambio en las condiciones, estas colas terminales pueden
reasociarse.
Estas terminaciones generadas por EcoRI se las conoce con el nombre de
“extremos cohesivos o pegajosos” pues pueden re-aparearse las bases. Una
Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos 2010
5
UNIVE RS IDAD NACIO NAL DE MISIO NE S
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES
consecuencia de este tipo de cortes es que el fragmento obtenido por EcoRI de dos
diferentes ADN (ej. ADN de E. Coli y ADN de Levadura) pueden hibridar por tener
extremos cohesivos complementarios; las diferencias en la secuencia dentro de sendas
dobles hélices no interfiere en la reunión.
A diferencia de las ER tipo I y III, las tipo II no catalizan la metilación, esta
actividad está ubicada en otra proteína. La EcoRI enzimáticamente activa es un dímero,
formado por dos cadenas polipeptídicas de un peso molecular de 31000 KDa. Dada la
estructura homodimérica, uno podría esperar que la ER pueda interactuar
simétricamente con la secuencia idéntica en las dos cadenas, en el sitio de
reconocimiento y clivarlas ambas simultáneamente. No obstante la hidrólisis ocurre de
a pasos, la proteína interactúa con un total de 10 pb, las 6 del sitio de reconocimiento
más algunos pb mas flanqueantes al sito. Estas últimas están influenciando la selección
de la cadena que será clivada en primer lugar. De igual forma las bases flanqueantes
afectan la tasa de corte general en sitios de reconocimiento específicos, de manera que
diferentes sitios en un único ADN son hidrolizados a diferentes velocidades. El análisis
de rayos X de cristales del complejo entre la E y el oligonucleótido 5
´TCGCGAATTCGCG-3´ han dado una descripción detallada de la forma en que el
ADN y la proteína interactúan, los puentes de hidrógeno se forman entre 2 argininas y 1
glutamato (en cada subunidad) y los pares de bases en el sitio de reconocimiento. Como
consecuencia la estructura del B-ADN se desenrrolla parcialmente. Se conoce poco de
otras tipos II, no obstante parecen similares a EcoRI en estructura y función.
2.2 Diversidad de ER Tipo II :
Aproximadamente 400 diferentes ER Tipo II han sido descriptas, entre las cuales
aparecen 90 sitios de reconocimiento diferentes.
Dos enzimas que poseen el mismo sitio de reconocimiento se conocen como
isoesquisómeros no necesariamente cortan en la misma posición y de la misma forma.
2.3 Reconocimiento palindrómico y sitio de corte:
Normalmente la secuencia de reconocimiento va desde 4 a 8 pb. Hinf I, reconoce
5pb en la que el residuo central puede ser cualquiera de los 4 nucleótidos. Bgl I,
reconoce 6 pb pero deben estar separadas en el medio por cualquier 5 bases. Not l,
posee 8 pb de reconocimiento.
Otra distinción a tener en cuenta es la naturaleza de las terminaciones la que
pueden ser: 5´ protruyentes o 3´protruyentes.
Las ER con diferentes sitios de reconocimiento y corte pueden generar idénticos
extremos cohesivos, ej: los fragmentos de ADN generados por las ER Mbo I, Bam HI
y BCL I podrán reunirse unos con otros pues generan idénticos extremos cohesivos.
No obstante segmentos generados a partir de diferentes ADNsc clivados con Bgl I
pueden no reasociarse unos con otros pues las colas de los fragmentos pueden contener
cualquier secuencia trinucleotídica.
Otros tipos de ER II, a menudo reconocen palíndromos específicos pero clivan las
uniones fosfodiesteres en la mitad del sitio de reconocimiento generando fragmentos de
ADN cuyos extremos están completamente apareados y se los conoce como fragmentos
con extremo romo o “blunt ended”
2.4 Mapeado de fragmentos de ADN con ER Tipo II
Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos 2010
6
UNIVE RS IDAD NACIO NAL DE MISIO NE S
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES
Las ER proveen un modo de romper genomas complejos o segmentos largos de
ADN, en un set de pequeñas unidades.
Estas pequeñas unidades pueden separase unas de otras en base a su tamaño por
varios métodos convenientes, el más utilizado es la electroforesis de los fragmentos de
ADN en geles semisólidos de agarosa o poliacrilamida. Generalmente la movilidad de
un fragmento doble cadena es inversamente proporcional al log de su tamaño. Así,
teniendo un marcador de tamaño conocido, uno puede determinar el tamaño de un
fragmento dado con una regla y un gráfico simple. Usualmente menos de un µg de
ADN es suficiente para dicho análisis, dado que los fragmentos de ADN son detectados
cuando se los tiñe con BrEt.
El set de fragmentos generados con una ER particular provee una huella digital
característica del ADN digerido. Mediante el análisis de los fragmentos producidos por
varias ER de forma particular y combinada, uno puede deducir el orden de los
fragmentos dentro de la molécula original. El resultado es un mapa físico. Los genomas
complejos o las moléculas ADN largas generan patrones de fragmentos complejos, y su
análisis puede requerir programas especiales computarizados.
2.5 Protección por metilación:
 Metilasas: Los genomas bacterianos que producen las ER tipo II están
protegidos de la autodestrucción por sistemas de modificación. Metilasas
específicas reconocen la mismas secuencias diana que sus endonucleasas afines
y transfieren un grupo metilo desde la S- adenocil metionina a adeninas
especificas (generando un N6-metil adenina) o a citosina específicas (generando
5 metil citosina) dentro del sitio, imposibilitando así el clivaje por
endonucleasas.
La metilación, al igual que el clivaje ocurren simétricamente en ambas cadenas.
Las metilasas estudiadas, incluyendo Eco RI son proteínas monoméricas y la
metilación de las dos cadenas ocurre en pasos separados.
Aunque reconocen la misma secuencia y han evolucionado conjuntamente las
metilasas y los tipo II son proteínas particularmente diferentes.
Identificación de sitio metilados en el ADN: Además de los sistemas de restricción –
metilación, la metilación es una característica común en el ADN. Así algunos sitios
correctos de restricción dentro de varios ADNsc resisten el clivaje por
endonucleasas particulares.
3.
FOSFOMONOESTERASAS
Frecuentemente resulta necesario que los grupos fosfomonoésteres sean
removidos de los extremos de la cadena de ADN, sobre todo en el curso de
experimentos con ADNr o en análisis de ADN. Una variedad de fosfomonoesterasas (o
fosfatasas) se conocen desde hace ya varios años. Aquellas provenientes de E. coli e
intestinales de terneros son altamente puras.
Las fosfatasas hidrolizan ambos fosfomonoésteres terminales en el 5´ y 3´ tanto en
ADN como ARN.
Los grupos fosfomonoésteres localizados en mellas en ADN duplex o aquellos
que cuelgan en cadenas simples superponibles, tales como los generados por el clivaje
Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos 2010
7
UNIVE RS IDAD NACIO NAL DE MISIO NE S
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES
por Pst I y son removidos por las fosfatasas, bajo suaves condiciones desnaturalizantes
(por ejemplo a altas temperaturas).
4.
POLINUCLEOTIDO KINASAS
Las kinasas constituyen una gran clase de enzimas que catalizan la fosforilación
de varios diferentes bioquímicos. Desde pequeñas moléculas hasta macromoléculas muy
largas incluyendo polipéptidos y polinucleótidos. La pK es ampliamente usada como
reactivo en experimentos con ADNr se purifica de E.coli infentada con Fago T4, la
enzima la codifica el bacteriófago. El ATP es el donante de fosfato y ADP es uno de los
productos de reacción.
La reacción estérica fosforila específicamente 5´OH terminales en el ADN o
ARN, los 3´OH terminales no son fosforilados.
Un uso importante que se les da al las pKs es el marcaje de extremos 5´ de la
cadena de polinucleotidos con P32 usando ATP marcado radiactivamente en el fosfato
γ. La acción consecuentemente de las fosfatasas y polinuclótido kinasa reemplaza un 5´
fosfomonoester no marcado con uno radioactivo, sin generar ninguna otra modificación
en la cadena.
5.
ADN Ligasa
La metodología del ADNr requiere la reunión in vitro de segmentos de ADN de
diferentes fuentes.
Los extremos cohesivos que ciertas enzimas de restricción generan, realmente
permiten que los segmentos puedan reunirse por apareamiento, pues los puentes de
hidrógeno que mantiene juntos los segmentos son realmente débiles; y son estables bajo
las condiciones requeridas en la metodología. Los ADN ligasas reúnen las moléculas
covalentemente por que catalizan la formación de puentes fosfodiésteres entre
nucleótidos adyacentes.
Para conseguir una ligación exitosa las cadenas a ser unidas deben estar
aproximadamente alineadas una con otra, como lo están luego de aproximarse mediante
extremos cohesivos. El mismo alineamiento existe, si el fosfodiester es simplemente
una mella en un duplex, dado que las dos cadenas se mantienen en su lugar. La T4
ligasa es capaz de reunir extremos romos de doble cadena generando en ambos uniones
fosfodiester requeridas.
6.
ADN pol I
De E. coli, son enzimas que catalizan varias otras reacciones importantes, dos de
las cuales son especialmente significativas en la metodología de ADNr. Una, es la
actividad 3´--5´ exonucleasa y la otra es la 5´--3´ exonucleasa. Ambas actividades
nucleotídicas generan productos con terminaciones 5´-fosfomonoesteres. Las dos
actividades exonucleotídicas son catalizadas por diferentes regiones de la molécula de
DNA pol I y pueden separarse físicamente tratando a la enzima con enzimas
proteolíticas. Cuando esto ocurre la 3´--5´exo y la actividad polimerizante permanecen
asociadas con un polipéptido COOH2 terminal largo. Mientras que la actividad 5´--3´
exo esta en un fragmento pequeño.
•
Nick Translation
Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos 2010
8
UNIVE RS IDAD NACIO NAL DE MISIO NE S
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES
Varios usos se realizan a partir de las distintas reacciones catalizadas por la ADN
pol I. Uno de los usos mas importantes dependen de la habilidad de la ADN pol I de
catalizar simultáneamente ambas: la polimerización y la digestión exonucleasa 5´--3´.
La exonucleasa degrada la cadena en dirección 5´--3´ comenzando a partir del extremo
5´ del inicio de una de las cadenas de una doble hélice, mientras que luego reconstituye
la cadena por la adición de nuevos residuos mononucleótidos al extremo 3´OH que
bordea a la mella original, no ocurre síntesis neta de ADN. La posición de la mella así
progresa en la cadena lo que da nombre al mecanismo “Nick Traslation”. Este proceso
con α 32P deoxinucleotido trifosfato como resultado es ampliamente usado para preparar
fragmntos de ADN α radioactivos.
•
Completar
La ADN pol puede convertir fragmentos de ADN con extremos cohesivos en
fragmentos con extremos romos si el extremo sobresaliente es el 5´. El extremo 3´OH
sirve como primer, el 5´ sobresaliente como templado y el extremo 3´ se completa por
adición de residuos deoxinucleótidos. El fragmento COOH terminal de la pol I
generado por proteólisis se prefiere para el llenado de manera de evitar la actividad 5´-3´ exonucleasa que de otra manera detiene el templado.
Los extremos cohesivos pueden transformarse en extremos romos con una
nucleasa específica de cadena simple, pero de esta forma se pierden residuos.
7.
ADN pol dependiente de ARN (RT)
Estas enzimas se purifican desde virus tumorales de ARN (por lo general de la
familia Retroviridae). La acción catalizada por las enzimas RT es análoga a la reacción
de las ADN pol y también requieren cebadores o primers. El templado de ARN es
generalmente de cadena simple y se sintetiza también solo una única cadena de ADN,
complementaria con un molde generando un híbrido ADN-ARN.
Comunmente se cataliza como primer un poli dT, ya que aparea con los
poliribonucleotidos comunmente hallados en el RNAm de eucariotas, permitiendo así la
síntesis de un ADN copia (ADNc) a partir del ARN.
El ADNc ahora puede convertirse en ADN de doble cadena luego de tratar el
híbrido con ARNasa H o hidrólisis alcalina que remueve el ARN molde original. El
ADNc sirve como primer y templado para la síntesis de la otra cadena, la reacción
puede catalizarse por la ADN pol I o por la RT. Aparentemente se formaría una
horquilla cerca del 3´OH de la primera cadena, proyectando el primer. El duplex final
tiene la horquilla en un extremo y ésta es clivada por una nucleasa específica de simple
cadena. Para conseguir dos cadenas de ADN complementarias (un duplex de ADNc).
Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos 2010
9
UNIVE RS IDAD NACIO NAL DE MISIO NE S
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES
8.
Desoxinucleotidil transferasa Terminal
•
Polimerización sin templado
En un sentido la desoxinucleotidil-transferasa terminal (transferasa teminal,
coloquialmente) es una polimerasa que cataliza la síntesis de polideoxiribonucleotidos
desde nucleótidos trifosfato con la generación de pirofosfato inorgánico. A diferencia de
las ADN pol verdaderas, no requiere de un templado y en realidad no copia nada.
El producto de la polimerización refleja los dNTPs utilizados como sustrato. Si se
adhiere dATP a la reacción, el producto es un polideoxiadenilnucleotido (poli dA) que
se incorpora al extremo 3´ del primer si se utiliza dGTP, se adicionará al primer un poli
dG.
Debido a que la transferasa terminal no utiliza templados el producto es una
cadena simple. Si el primer es una molécula de doble cadena entonces la cola terminal 3
´ siempre se genera en el extremo del duplex. La transferasa terminal prefiere primers
simples a cadenas dobles.
9.
Síntesis de extremos cohesivos
Se pueden adicionar extremos cohesivos a moléculas de ADN. Esto incluye
fragmentos de largas cadenas de ADN obtenidos al azar por corte mecánico, fragmentos
generados por cortes con ER que generan extremos romos, o fragmentos producidos por
ADNasas específicas. Por ejemplo si polidT se adiciona a un set de fragmentos de ADN
y polidA a otro, y luego las dos muestras se mezclan, los fragmentos se reunirán.
Cualquier gap que tenga lugar por desigualdad en la longitud de las colas de
polidT y polidA pueden completarse con ADN pol I. Finalmente las moléculas pueden
unirse con una ADN ligasa. Este fue el primer mecanismo utilizado en la construcción
de ADNr.
El descubrimiento de las endonucleasas de restricción que generan extremos
cohesivos simplificó el método, no obstante el uso de las transferasas terminales es, en
algunos casos, el método de elección.
10.
Polimerasa Poly A
Como las transferasas terminales, esta enzima adiciona residuos nucleotídicos al
extremo 3´ de una cadena, sin necesidad de templado. No obstante, es específica de
ARN. El templado de elongación son polirribonucleótidos y ATP es el sustrato (GTP,
CTP, UTP o dATP, no pueden sustituir al ATP). Posee un rol altamente específico en
ADNr: se utiliza para la adición de colas poliA a moléculas de ARN en preparaciónes
de síntesis de ADNc.
Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos 2010
10