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CINÉTICA ENZIMÁTICA
E + S
SE
E + P
•
•
•
•
•
Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos.
Unidades del Metabolismo
Regulan la vel. de las reac. quím. espontáneas (DG-).
No promueven reacciones no-espontáneas (DG +).
Incrementan la Vel. De reacción 103 a 1012 veces sin
afectar el sentido de la reacción.
• No forman parte del producto de la reacción.
PROPIEDADES GENERALES
• AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
– De 106 to 1012 veces vs sin enzima.
– Aún más rápido que los catalizadores químicos.
• CONDICIONES DE REACCIÓN
– Temperatura 25-40 oC (algunas hasta 75 oC)
– pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5
– Presión atmosférica normal
• CAPACIDAD DE REGULACIÓN
–
–
–
–
–
Por concentración de sustrato
Por concentración de enzima
Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)
Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima)
Por regulación alostérica
• ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN
– Interacción estereoespecífica con el sustrato
– No hay productos colaterales
ALTA
ESPECIFICIDAD
DE REACCIÓN
INTERACCIÓN
ESTEREO
ESPECÍFICA
CON SU
SUSTRATO
Los Substratos
se acercan a la Enzima
(sitio Activo)
Substratos
HO-
HEnzima
Los reactivos
interaccionan
con la enzima
(sitio activo)
Cambia la
configuración de la
enzima
Substrato
de glucosa
Sitio de
enlace
La unión del sustrato produce un cambio conformacional
de la enzima hexoquinasa (cinasa), la cual es monomérica.
Se realiza la
reacción
catalítica
Concent.
Leonor Michelis y Maud Menten (1913)
Tiempo
ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN
Vo = V
max
[S]
Km + [S]
Cinética enzimática en función de la
concentración de sustrato
Vmax
KM
Km de algunas enzimas
ENZIMA
Catalasa
SUSTRATO
H2O2
Hexoquinasa
Anhidrasa carbónica
Quimotripsina
Km (mM)
25.0
ATP
0.4
D-Glucosa
0.05
D-Fructosa
1.5
HCO3-
9.0
Gliciltirosinilglicina
108.0
N-Benzoiltirosinamida
2.5
-Galactosidasa
D-Lactosa
4.0
Treonina deshidrogenasa
L-Treonina
5.0
La KM es un parámetro de
Actividad Enzimática
• La KM es inversamente proporcional
con la actividad de la enzima.
• Valor de KM grande, baja actividad
• Valor de KM pequeño, alta activida
Enzimas: pueden catalizar reacciones donde hay 2 S =
Hexocinasa
ATP + Glucosa  ADP + 6-fosfato de glucosa
2 Rutas
•Desplazamiento Simple, los 2 S se unen a la E
A + B + E
 EAB  C + D
•Doble desplazamiento o ping-pong
A + B + E  AE  BE + C
D
Determinación Cuantitativa de la Cinética Enzimática
1. La reacción global
2. Procedimeinto analítico para determinar elS que
desaparece o el P que aparece
3. Sí el E requiere Cofactores (iónes o coenzimas)
4. La dependencia de la actividad enzimática con la
[S] o se la KM del S.
5. El pH óptimo
6. Un intervalo de temperatura en la que la E es
estable y muestra actividad elevada.
Actividad enzimática y variación del pH
Enzima
Vo
1
3
7
11
14
pH óptimo
Pepsina
1.5
Tripsina
7.7
Catalasa
7.6
Arginasa
9.7
Fumarasa
7.8
Ribonucleasa
7.8
pH
Vo
Vo
4
37
85
Temperatura oC)
Vo
10
50
100
Coenzima
10
30 50 70 100
Tiempo (min)
1.0 Unidad de Actividad Enzimática (U):
La cantidad que transforma 1.0 mmol (10-6 M) de S /min,
a 25 0C, en las condiciones de medida óptima.
Actividad específica:
Es el no. de U de una E / mg de proteína.
Es decir: una medida de la pureza de la E.
Al purificarla, el valor llega a un máximo y es estable.
Número de recambio
No. de moléculas de S transformadas /unidad de tiempo,
por una molécula de E ( o por un solo sitio catalítico)
Enzima
No. de Recambio
Anhidrasa carbónica
B-Amilasa
B-Galactosidasa
Fosfoglucomutasa
36 000 000
1 000 000
12 000
1 240
¿Vmax?
¿KM?
Transformación de los Dobles Recíprocos
(Lineweaver-Burk)
pendiente
Gráfica de Eadie-Hofstee
Vmax
Vo
V max
KM
Vo
[S]
Cuando:
Vo= Vmax Todos los sitios activos están
ocupados y no hay moléculas de E libre.
KM= [S] Sí... ½ Vmax
KM representa la cantidad de sustrato
necesaria para fijarse a la mitad de la E
disponible y producir la mitad de la Vmax
KM representa la concentración del sustrato en
una célula
Inhibidores
Reactivos químicos específicos que pueden
inhibir a la mayor parte de las enzimas.
Irreversibles
INHIBIDORES
Reversibles
Inhibidor Irreversible
• Inhibición permanente
• Unión irreversible por medio de enlaces covalentes.
• Modificaciones químicas de los gps. catalíticos.
• Modificada la enzima, está siempre inhibida.
Para distinguirlo de los reversible se someten a
diálisis y si no se separan enzima e inhibidor, éste es
permanente.
Inhibidor Irreversible
Fluorofosfato de diisopropilo
(DFP)
Acetilcolina
Acetilcolinesterasa
Acetato + Colina
Inhibidor Irreversible
Fluorofosfato de diisopropilo
(DFP)
Acetilcolinesterasa
Tripsina
Elastasa
Fosfoglucomutasa
Cocoonasa (larvas de
gusanos de seda
Malatión
Fluorofosfato de diisopropilo
(DFP)
Iodoacetamida
Serina
Cisteína
Histidina
Inhibidor Reversible
• La unión del inhibidor y la enzima es
reversible.
• Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la
actividad.
Hay 3 tipos:
Competitiva
No Competitiva
Acompetitiva (Alostérica)
Antibióticos
Insecticidas
Hervicidas
Venenos
Diferentes Medicamentos
Inhibición
enzimática Dolor
Inflamación
Infecciones virales
Cáncer
Inhibición Competitiva
Vmax igual
KM diferente
Inhibidores Competitivos
Malonato
Deshidrogenasa del ácido succínico
Sulfas
Infecciones microbianas
Antihipertensores: Captopril y Enalopril
Alopurinol
Controla la gota
Fluoruracilo
Cáncer
Inhibición No Competitiva
El inhibidor NO se une al sitio activo
NO se puede revertir con un exceso de sustrato
Vmax diferente
KM igual
Cinéticas de Inhibición
Competitivo
Vmax igual
KM diferente
1
V
No competitivo
Vmax diferente
KM igual
0
No inhibitor
1/[S]
Inhibición acompetitiva
El inhibidor se une a una SUBUNIDAD reguladora
I
La subunidad catalítica
une al sustrato y
cataliza la reacción