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Aislamiento de Acidos Nucleicos:
DNA Genómico
JA Cardé, PhD
Biol 4019 - Lab Biología Celular Molecular
Universidad de Puerto Rico, Aguadilla
Objetivos
• Explicar diferentes métodos de aislamiento de
ácidos nucleicos.
• Contrastar las ventajas y desventajas de los
diferentes métodos de aislamiento de ácidos
nucleicos.
• Describir las funciones de las diferentes
soluciones utilizada en las técnicas de aislamiento
de ácidos nucleicos.
• Realizar una extracción de DNA utilizando los
métodos de lísis hipotónica, o lísis enzimática y
fenol - cloroformo.
Introducción
Introducción
• Molécula muy resistente: estable
• El DNA aislado puede ser genómico o extracromosomal
(figura 1). El DNA genómico es de gran tamaño
• El DNA extracromosomal es aislado de bacterias en
forma de fagos o plásmidos.
• En este módulo estudiaremos las técnicas de aislamiento
de DNA genómico.
• La mayor preocupación es la contaminación.(otro DNA,
RNA o proteinas)
DNA Genómico vs Extracromosomal
•
•
•
•
•
•
Tamaño
Estabilidad
Métodos de aislamiento
Lisis
Aislamiento
Purificación
Lísis
• El rompimiento o lísis celular es el primer paso
para obtener el DNA genómico.
• Varias técnicas son utilizados para provocar
lísis celular.
• Entre ellas se encuentran:
– lisis hipotónica - osmosis
– lisis enzimática - enzimas
Métodos: Lisis Hipotónica
• Se utiliza una solución hipotónica:
baja concentración de sales
– Se provoca la hinchazón de la célula
y el rompimiento de la membrana
plasmática y/o de la pared celular.
• Se añaden detergentes:
degradación de membranas
– Detergentes no iónicos, i.e. Tween
20 y Triton X-100
– Para células de mamíferos
– Detergentes iónicos i.e. SDS
– para células con pared celular o
cutícula externa que la protege
DEB
Reactivo
Volumen
SDS
50 mg
Concentración
Final
0.5 %
Tris 1M pH 8.0
0.1ml
10mM
EDTA 0.5M
0.5 ml
25 mM
NACl 5M
0.4 ml
0.2M
SDS – detergente – lípidos, membrana
NaCl – sal, crea ambiente hipotónico
EDTA – quelante; inhibe enzimas que degradan DNA
Tris – amortiguador mantiene pH
C1V1 = C2V2
Métodos: Lisis Hipotónica
• Fuerza Mecánica
• Homogenizadores – Fuerza mecánica manual
– Frio
• Nitrógeno líquido
– Burbujas de nitrogeno rompen la
celula, por diferencias en presion
– Frio
• Glass Beads - Jeringas
– Células con pared celular,
(levadura)
– Eucariotas
•
Aislamiento: Fenol / Cloroformo
• Lisis = Membrana / pared destruida
• Componentes intracelulares libres en la solución
• Aislamiento:
• Fenol / Cloroformo : Para aislar, lo que implica
dejar los mas solo posible al DNA
– Fenol – denaturalizar las proteínas
– Fenol : Cloroformo (1:1) separa la solución en dos
fases
• Acuosa: moléculas polares; ej DNA y RNA
• Orgánica: moléculas no polares ; ej proteínas, lípidos
– Cloroformo añadido a la fase acuosa, remover
residuos de moléculas no polares
Aislamiento:Extracción Fenólica
• Fenol : Cloroformo (1:1)
separa la solución en
dos fases
• Acuosa: moléculas
polares; ej DNA y
RNA
• Orgánica: moléculas
no polares ; ej
proteínas, lípidos
Precipitación : Sales, Alcohol, Centrifiugación…
Proximo Lab
RNA
• mRNA, rRNA, tRNA…
• Protocolos y reactivos para cada
tipo
• Su aislamiento es mucho más
difícil que el de DNA
• Poca estabilidad PLT?
• Se sugiere el uso de reactivos y
amortiguadores preparados por
compañías especializadas.
• Hay que ser bien bien estricto y
OCD!!!
Purificación: Precipitación Etanólica
• Lisis = Membrana / pared
destruida
• Componentes intracelulares libres
en la solución
• Aislamiento =
– Acidos nucleicos limpios pero
no puros, residuos orgánicos
(proteinas, fenol/cloroformo
• Purificación – Precipitarlos
con Sales y Etanol
• Sacarlo de los residuos
contaminantes
• Salting out
– solubilidad
Purificación: Precipitación Alcohólica
• Purificación – Precipitarlos con Sales y
Etanol
• Sacarlo de los residuos contaminantes
• Salting out - solubilidad – Alcohol -
Etanol
• Constante dieléctrica menor que el agua
• Aumenta las interacciones entre sal y DNA
• Precipitación - Centrifugación
Métodos: Lisis Enzimática
• Se utilizan las mismas soluciones y detergentes
anteriormente de la hipotónica
• Además enzimas que catalizan la reacción.
• La degradación de los peptidoglicanos presentes
en la pared celular (i.e. bacterias Gram positivas).
• Entre las enzimas utilizadas en esta técnica se
encuentran lisozima y proteinasa K.
• Pues o no, ser seguida por extracción fenólica y precipitación con
sales y alcohol
Materiales
4 M Acetato de amonio (Sodio)
Agitadores de vidrio
Centrífuga clínica
Cloroformo
Cultivo de Bacterias
DEB
Etanol al 95 %
Fenol
MIcrocentrifuga
Micropipetas
Microtubos de 1.5 ml
Mosquitos
Pipetas desechables
Plato agitador
Propipetas
Puntas para micropipetas
Tubos de ensayo de 5 ml
Protocolo: Mosquito
1) Coloque un mosquito en un tubo de 1.5 ml. Añada 500
µl del amortiguador DEB*.
2) Utilizando un agitador de vidrio previamente esterilizado
homogenice el mosquito hasta que no observe pedazos
grandes del mismo.
3) Añada 500 µl de fenol y mezcle utilizando el vortex.
4) Centrifugue por 10 minutos a 12,000 rpm.
5) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 ml
(figura 2) y añada 250 µl de fenol y 250 µl de cloroformo.
Mezcle utilizando el vortex.
Protocolo: Mosquito
6) Centrifugue por 5 minutos a 12,000 rpm.
7) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 ml y
añada 250 µl de cloroformo. Mezcle utilizando el
vortex.
8) Centrifugue por 5 minutos a 12,000 rpm.
9) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 ml y
añada 27 µl de 4M acetato de amonio y 473 µl de 95 %
etanol.
10) Coloque el tubo de 1.5 ml sobre el plato agitador y
agite por 10 minutos. Guarde el tubo a – 20 ºC hasta el
Protocolo I: Bacterias - Isotónica
1) Centrifugue por 10 minutos el tubo de ensayo que
contiene bacterias en un medio líquido.
2) Descarte el sobrenadante y retenga el precipitado de
bacterias. Añada 1 ml del amortiguador DEB* y 1 ml
de fenol. Mezcle utilizando el vortex hasta que no
observe el precipitado de bacterias.
3) Centrifugue por 10 minutos a 4,000 rpm. Observe dos
fases: acuosa y orgánica.
4) Transfiera la fase acuosa a un tubo limpio y añada 500
µl de fenol y 500 µl de cloroformo. Mezcle utilizando el
vortex.
.
Protocolo: Isotónica cont
5) Centrifugue por 5 minutos a 4,000 rpm.
6) Transfiera el sobrenadante a un tubo de ensayo limpio y
añada 500 µl de cloroformo. Mezcle utilizando el vortex.
7) Centrifugue por 5 minutos a 4,000 rpm.
8) Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 ml y
añada 27 µl de 4M acetato de amonio y 473 µl de 95 %
etanol.
9) Coloque el tubo de 1.5 ml sobre el plato agitador y agite
por 10 minutos. Guarde el tubo a – 20 ºC hasta el próximo
laboratorio.
Protocolo Bacteria II – Enzimática
•1) Centrifugue a 4,500 g por 20 min, decanta el
sobrenadante.
•2) Añada 1 ml de Buffer de Lysis con 15 µl de
Proteinasa K (200 µg/ml).
•3) Incubar por 30 min a 56 ˚ C.
•4) Incubar por 10 min a 95 ˚ C
•5) Añada 20 µl de RNasa (1.5 mg/ml) y déjelo a 37
˚ C por 30 minutos.
•6) Deje por 15 min a 70 ˚ C
Protocolo de Bacteria II … continuación
•7) Añadir (Lavar) igual volumen de 95 % de etanol.
– Guardar a -20 por una semana.
•8) Centrifugue a 12,000 rpm por 5 minutos
•9) Lavar 3 X veces con 70 % etanol. (1
•10) Después de cada lavada centrifugar a 12,000 rpm
por 5 minutos.
•11) Hidratar con 30-50 % de TE.
Preguntas
 ¿Por qué necesitamos utilizar un sistema de homogenización
cuando aislamos DNA de mosquito?
 Mencione y explique 3 métodos para prevenir la contaminación del
DNA.
 Cuando la solución acuosa de DNA se mezcla con fenol y/o
cloroformo las proteínas se mueven a la fase formada por el fenol
dejando así el DNA en la fase acuosa. Explique este fenómeno
haciendo referencia a la estructura y enlaces de las
macromoléculas.
 Mencione y explique 3 técnicas utilizadas para el aislamiento de
DNA que no se hayan discutido en clase.
 Explique la función de los 4 reactivos del DEB.
Virtual Labs
• DNA Extraction
• Plant DNA Extraction
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