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Marcación de SONDAS
 SONDA: secuencia de DNA o RNA marcada y complementaria




a un ac. nucleico.
La técnica consta de los siguientes pasos:
Extracción del ac. Nucleico
Separación con ER y electroforesis en gel de agarosa
Blotting a soporte de nitrocelulosa e hibridación con la sonda
marcada.
 SOUTHERN: SE TRATA EL GEL (de nitrocelulosa) CON HCl
PARA DESNATURALIZAR EL ADN, SE NEUTRALIZA CON
NaOH Y SE TRANSFIERE A LA MEMBRANA EN SOLUCION
DE ALTA FUERZA IONICA
 NORTHERN: NO ES NECESARIO EL TRATAMIENTO, SOLO
MANTENER ARN SIN ESTRUCTURA SECUNDARIA
Marcación de SONDAS
TECNICAS MAS USADAS
 OLIGONUCLEOTIDES PROBES
 NICK – TRANSLATION
 RANDOM PRIMER EXTENSION
 α–32P–d NTP, α-35S–d NTP, α–125 I–d NTP:
GENERALMENTE d CTP
 biotina-11-d UTP, digoxigenina-11-d UTP
Marcación de SONDAS
 La sonda puede ser o no radiactiva y se
denominan calientes o frías respectivamente.
 La sensibilidad del ensayo esta dado por la
cantidad de secuencia a detectar y la
intensidad de la señal
 Actualmente detectan cantidades < nanogramo
Oligonucleotide probes
Nick-Translation
Están involucradas dos enzimas: DNasa 1, DNA
polimerasa I.
DNA doble cadena para marcar.
La DNAsa I, introduce un nick (Agujero) al azar en una
de las cadenas del DNA.
La DNA pol I, que posee actividad 5’-3’ exonucleasa:
remueve el d NTP del extremo 5’ y el nick se va
trasladando.
Se separa el DNA marcado del resto por precipitación
con Etanol o columna Sephadex.
Random Primer
Fue descubierto por Feinberg y
Volgestein (1986)
 Secuencia de hexanucleotidos
aleatorios (Todos los posibles)
 Fragmento Klenow de Pol I (Sin

actividad exonucleasa 5`- 3`)
Método:




Desnaturalización del
dsDNA para obtener
ssDNA
Añaden
hexanucleotidos y
permite
emparejamiento
Añadir subunidad
Klenow, dCTP y dNTP
marcados
Obtención cadena
complementaria de
DNA marcada

Se separa el
marcado del
resto por
precipitación con
etanol o
columna
Sephadex
Nick-Translation
Random priming
Oligonucleotides Probes
Nick-Translation
La apoptosis es una forma de muerte celular que se caracteriza por el
encogimiento del citoplasma y condensación de la cromatina nuclear.
Ello implica la acción de endonucleasas endógenas, lo que se traduce en la
degradación del ADN cromosómico y la célula posteriormente se rompe.
La aparición de apoptosis en los tejidos se detectaba por métodos, como:
(1) Electroforesis en gel de DNA exógeno.
(2) Microscopía electrónica, e
(3) Histológicamente, evaluando
la morfología.
Estas técnicas tienen problemas inherentes.
“El desarrollo de las técnicas de in situ labelling-end y
Nick-translation in situ ha mejorado y facilitó la
detección, cuantificación y distribución de la apoptosis
a nivel celular en tanto en cultivos celulares y cortes
de tejido.
Los métodos de in situ labelling-end y Nick-translation
se basan en el principio de que las endonucleasas
endógenas activadas durante la apoptosis crean
mellas (o nicks) en el ADN lo que proporciona un
medio por el cual dichas células puede ser
detectadas.”
Las regiones activas de la cromatina son estructuralmente
distintas de segmentos del genoma que no se transcriben.
La conformación de los genes activos hace que sean sensibles a
la DNasa I (lo que puede mantenerse incluso en los cromosomas
mitótico).
“Hemos desarrollado una técnica –Nick-translation dirigido - que permite
distingir entre cromosomas X activos e inactivos.”
Los cromosomas X están compuestos cada uno por:
• Las regiones X cromosómicas, y
• Dos segmentos de característica autosómica que las flanquean.
Después de Nick-translation:
Un cromosoma X activo:
Se marca específicamente en las regiones autosómicas
y en las regiones X cromosómicas.
El cromosoma X inactivo:
Se marca sólo en las regiones autosómicas y en una
pequeña porción que corresponde a la traducción tardía
de los segmentos iniciales de las regiones X.
“Nuestra técnica abre la posibilidad de seguir la cinética de
inactivación y reactivación del cromosoma X durante la
embriogénesis, el estudio de los genes activos o inactivo en el
cromosoma X y cartografía de tejidos específicos de grupos de
genes.”
Random-priming
“Ofrece posibilidades únicas
de ingeniería para los
pequeños péptidos.”
Se utiliza la técnica de Randompriming para levantar diferentes
partes de un gen determinado,
luego unirlos y mediante la
inserción en vectores expresión
se obtiene el nuevo péptido.
Las X indican la reciente introducción de
mutaciones
Las condiciones para la síntesis por Random-primig
pueden ser fácilmente ajustadas para un gen dado.
La técnica permite realizar sustitución de un gran
número de aminoácidos (más que por mutagénesis
puntual por PCR)
Oligonucleotide probes
Las técnicas moleculares se utilizan para estudiar y
caracterizar la composición microbiana del queso Fontina
Se analizaron muestras de leche, cuajada y queso en diferentes
momentos de la maduración
La identificación taxonómica, basada en el uso de los
sondas de oligonucleótidos para rRNA 16S y 23S, se
aplican en experimentos de hibridación de colonias
para permitir la identificación de las cepas y para
investigar las poblaciones involucradas en producción
de Fontina
Las especies dominantes:
Enteroccocus faecium y Streptococcus
thermophilus.
Presentes en menor cantidad:
E. faecalis, Lactococcus lactis subsp. lactis,
L. lactis subsp. cremoris mesófilos y termófilos y
los lactobacilos.