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SISTEMAS LIGADOS Trx-Glutatión EN PLATHELMINTOS Curso de Biología Parasitaria 2007 SOD TPX GPX SISTEMA TIORREDOXINA red NADPH Tiorredoxina reductasa NADP+ red red Tiorredoxina peroxidasa Blancos red Tiorredoxina ox ox ox ox SISTEMA GLUTATIÓN NADPH NADP+ red ox Glutatión reductasa Glutatión ox red ox red Glutarredoxina Glutatión red peroxidasa ox red Blancos ox TIORREDOXINA GLUTATIÓN REDUCTASA NADPH NADP+ red Blancos ox red Tiorredoxina glutatión reductasa dominio Grx dominio TR Tiorredoxina ox red red Tiorredoxina peroxidasa Blancos ox ox ORGANIZACIÓN DE LA TR, GR, Grx y TGR TR CVNVGC FAD NADPH región interfase GR CVNVGC FAD NADPH región interfase CVNVGC FAD NADPH región interfase Grx TGR GSH CPYC CPYC GCUG GSH dominio Grx dominio TR GCUG OBTENCIÓN Y ANÁLISIS UN ADNc DE LA TR DE F. hepatica TCTGTATATTAGTGCATGTCATCTAAAATGGCTCCAATTCCCGATGATACTTCTTCGTGG 60 GCTAAAACGGCCGTATTTGACTTTGTGGTCCCGACGCCCCAGGATACTACACGGGGTTTG 480 GGCTATCGAACTCAGCTTCGCAGCATTAACGTAGAGTATGTTAATGCTTTTGCTGAGGTG 720 GTCGATCCGCATACAATAAAATACACGAAGAAAAACAAGGAAACCGGCACCGTGACCGCA 780 TCCGTAGCGATGAAGGCTGGTGCAACCAAGGCTGATTTCGACCGTACCATAGGGATTCAC 1740 CCCACTTGTTTTGAGGGGTTTACTACAATGCACGTGACAAAAGACTCGGGCGCCAGCGCT 1800 AAGGTGACCGCTTGCTGAGGTTAATTCCCTGCTGGAGGTTTTCAGTCGGTTATGTTTATC 1860 CGTTCACTTTCCAACCAATCCGTGTTTTGTGAAAAGACCCTGAGCTTGGTAAATCCTATC 2040 CCGTCCCGGGAGCCAAGTTGTAGGGGATGCCCGCATGGGCCAAACGAACGGCAGCCCCCC 2100 CCCCCCCCCTTCTTTGATTACGAAATCTCTCATTTAACATGTTGTGCAGTCTTTATGTCT 2160 TTCTCCGAAAAAAAAAAAAAA 2301 EL ELEMENTO SECIS C U C G-C C-G C-G C-G U-A A lazo 3 nt CU C bucle de U G adenosinas A AA U G-C G-C U-A U-A C-G tallo inferior G U A-U G G U U-A C-G C-G C-G A-G núcleo G-A SECIS GUUUUGUAAG A A - T GCCCGCAUGGG 2012 2067 tallo superior 5 pb ANÁLISIS DE LA SECUENCIA AMINOACÍDICA Fasciola SmanTGR EgraTGR 1 1 1 ----------------------------------------MAPIPDDTS---------------------------------------------------MPPADGTS-----------------------MFGCHCLRRACTPLSAIACFFNPRRTAMAPIGGSAEQV--------- Fasciola 9 SmanTGR 8 EgraTGR 38 ---------SWVKKTINSSAVLLFSKS--------RCPYC RAVKQIFNDDKVNHAVIELD ---------QWLRKTVDSAAVILFSKT--------T CPYCKKVKDVLAEAKIKHATIELD ---------EKLRNKINNAAVLVFAKS--------F CPYC KKVMERFNNLKIPFGYLDLD Grx Fasciola 53 KRPDGAKIQQVLSQISGISTVPQVFVRGEFVGDSSTISKLKKEDKLTEVIKK-NTYDYDL SmanTGR 52 QLSNGSAIQKCLASFSKIETVPQMFVRGKFIG DSQTVLKYYSNDELAGIVNE-SKYDYDL EgraTGR 82 LKKNGSDYQ KMLQEITGRTTVPQVFFRGEFIG GCDDVMAID-DDTIVKKANE-MKY DYDM Fasciola 112 VVIGGGSGGLAASKEAARFGA K TAVFDFV V PT PQDTTRGLGGTCVNVGCIPKKLMHQAAL SmanTGR 111 IVIGGGSGGLAAGKEAAKYGAK TAVLDY V E PTPIGT TWGLGGTCVNVGCIPKKLMHQAG L EgraTGR 140 VIIGGGSGGLALA KESAKSG AKVALLDFV V PT PMGT T WGLGGTCVNVGC IPKKLMHQAA L sitio de unión al FAD centro redox Fasciola 292 V VGASYVALECAGFLTRFGF DTTVMVRSIFLRGFDQQ MADMIGEYMKEHGT KFVRSCVPT SmanTGR 291 VI GASYVALECAGFLASLGG DVTVMV RSILLRGFDQQ MAEKVGDYMENHGV KF AKLCV PD EgraTGR 318 CV GASYVSLECAGFLSSIGC DVTVMVRSIFLRGFDQ Q MAGLISDYIAKYG V KFVRPCVPT sitio de unión al NADPH Fasciola 584 TK DSG -ASAKVTACUG SmanTGR 584 TK KSG-VSPIVSGCU G EgraTGR 610 TK SSG-ASATVTGCU G selenocisteína PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA NATIVA 66 kDa ENSAYOS DE ACTIVIDAD TR, Grx y GR NADP+ + 2 TNB NADPH + DTNB NADPH red TGR NADP+ GSSG + NADPH + H+ red Tiorredoxina ox ox 2GSH + NADP+ (actividad TR) red Insulina ox (actividad GR) ESSE + GSH GSSE + ESH (reacción espontánea) GSSE + GSH GSSG + ESH (actividad Grx) LA ENZIMA PURIFICADA POSEE ACTIVIDAD TR ox Targets red red red Thioredoxin reductase (TR) Thioredoxin Targets NADPH NADP+ red ox ox NADPH red Glutathione reductase NADP+ ox red Glutathione ox ox red red Glutaredoxin Targets ox ox LA ENZIMA PURIFICADA POSEE ACTIVIDAD GR NADPH NADP+ Thioredoxin reductase (TR) red Glutathione reductase NADP+ ox red Thioredoxin Targets ox ox NADPH red red Glutathione ox red Glutaredoxin ox ox red targets ox LA ENZIMA PURIFICADA POSEE ACTIVIDAD GRX El dominio Grx recibe electrones de dominios TR y también podría recibir del sistema glutatión ox Targets red red red Thioredoxin reductase (TR) Thioredoxin Targets NADPH NADP+ red ox ox NADPH red Glutathione reductase NADP+ ox red Glutathione ox red Glutaredoxin ox ox red Targets ox La fusión de dominios hace posible la transferencia de electrones a blancos de ambos sistemas NADPH NADP+ red Blancos ox red Tiorredoxina glutatión reductasa dominio Grx dominio TR Tiorredoxina ox red red Tiorredoxina peroxidasa Blancos ox ox A partir del gen de la TGR se producen dos isoformas de ARNm por empalme alternativo en trans 1 2 SL Grx TR región codificante SL Grx TR Las isoformas de ARNm codifican para variantes citosólica y mitocondrial mit MFGCHCLRRACTPLSAIACFFNPRRTAMAPIGGSAE.. cit MAPIGGSAE.. ¿Hay TGR en los compartimientos mitocondrial y citosólico? Mic Mit Cit Nuc Tot 66 kDa Echinococcus granulosus posee variantes mitocondriales y citosólicas de TGR Entonces... Tiene E. granulosus TR, GR and Grx convencionales? En otros plathelmintos: In Taenia crassiceps: Tracing GR and TR activities resulted in purification of TGR (Rendon et al. 2004) In Schistosoma mansoni: Auranofin inhibits both TR and GR activities in crude extracts (Alger and Williams, 2003) Datamining transcriptomes could provide some answers October 2003: Schistosoma transcriptomes released . Schistosoma mansoni (140.000 ESTs, covering 90-95% of the gene complement) . Schistosoma japonicum (45.000 ESTs) . Echinococcus granulosus and Echinococcus multilocularis (10.000 ESTs–Oct 2004) S. mansoni S. japonicum cTGR mtTGR GR TR 38* 4 0 0 18* 2 0 0 cGrx mtGrx cTrx1 0 8* 6 0 0 26 cTrx2 mtTrx cTPx1 2 15 12 1 3 29 cTPx2 mtTPx cGPx secGPx 30 16 39 10 20 10 20 1 Similar results in E. granulosus and E. multilocularis . absence of GR and TR . presence of cytosolic and mitochondrial Trx and TPx En plathelmintos, se postula a la TGR como la responsable de llevar a cabo ambas funciones, GR y TR ESTUDIO DE INMUNOPROTECCIÓN EN CONEJOS CONTRA F. hepatica semana 4 semana 0 1º inmunización - 100 μg FhTGR - PBS semana 6 2º inmunización semana 18 Desafío Sacrificio - 50 metacercarias - 100 μg FhTGR - PBS Nº de Parásitos promedio ± DS parásitos/animal Grupo FhTGR 0,3 ± 0,8 2; 0; 0; 0; 0; 0 Grupo Control 9 ± 1,8 10; 12; 8; 8; 7; 9 Schistosoma mansoni Utilizando un ARNi, se observó que la TGR es esencial para la vida del parásito. Auranofin: inhibidor de la TGR. En ensayos in vitro y utilizando concentraciones fisiológicas se observó que los parásitos mueren rápidamente. Además, tratando a ratones infectados con este compuesto se observó una reducción del 60% de los parásiros encontrados.
