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CONCEPTOS BÁSICOS BIOLOGÍA MOLECULAR I DR.JP FLORES G. Biología Molecular en Patología Las pruebas moleculares permiten examinar la estructura y expresión de genes específicos o proteínas en tejidos normales, anormales o neoplásicos . Con la finalidad de evaluar posibilidades de diagnóstico, tratamiento o pronóstico en una gran variedad de patologías . DNA Ácidos Nucleicos Secuencias de nucleótidos unidos consistentes en : Base Nitrogenada Azúcar de 5 carbonos Grupo fosfato La secuencia de las bases es la forma en que la información genética es almacenada Bases • Pirimidinas Citosina ( C= ) Timina ( T= ) Uracilo ( U= ) • Purinas Adenina ( A= ) Guanina ( G= ) Las bases C= , A= y G= se encuentran en el DNA y en el RNA. Sin embargo la base T= es específica para el DNA y el U= es específica para RNA. Complejo DNA/Proteína RNA mensajero RNA ribosomal Transcripción Amplificación Cromosoma/Gene Delecion Duplicación Traslocación Inversión Replicación celular 1 Hr. Reactivación 6 a 12Hs. 3 a 4 Hs. 2 a 4 Hs. Replicación celular • Conceptos sobre replicación celular: 1. Interfase 2. Duplicación del material fenotípico y genético 3. Doblar tamaño trascripción y trasducción de los genes 4. Diploide de cromosomas Cromosoma/Gene Conceptos Cancer • • • • Cancer es una enfermedad genética Protooncogenes (dominantes) Genes supresores (Recesivos) Genes que regulan la muerte celular programada o Apoptosis • Genes relacionados con la reparación del ADN. (Inestabilidad ADN) Conceptos Cancer 1. Inmortalización 2. Transformación 3. Ventajas de crecimiento 4. Metastasis 5. Contenido ADN aneuploide 6. Alts. Genéticas Biología del crecimiento tumoral • Transformación • Crecimiento • Invasión local • Metástasis Cinética del crecimiento Angiogénesis Heterogeneidad Masa tumoral: formada por descendientes clonales de una célula transformada . Cinética del crecimiento • Regulación del ciclo vital alterado (Rb, p53 y ciclinas) Vel de crecim Fracción de crecimiento elevada Posteriorm disminuye (20%) (# de células tumorales en proliferación, [FC]) Duración de ciclo vital igual o mayor Crecimiento producción = pérdida celular Cinética de Crecimiento • Quimioterapia actúa sobre células que se encuentran en su ciclo celular. Tumor Factor de crecimiento Agresivo No Sin agresivo cirugía Cirugía Respuesta Aplicación de quimiotx Angiogénesis Tumoral • Elemento Nutritivos y O2 • Factores de crecimiento (PDGF, GM-CSF, IL-1) • Metástasis Distancia de máxima difusión de óxígeno (1-2mm) Normal = p53 Nat sx trombospondina - 1 Tumor =p53 mutada célula Niveles trombop. antiangiogénesis Angiogénesis libre mutación clon Fenotipos de angiogénesis Multiples mutaciones tumor También hay Control de anti-angiogénesis sx Trombospondina -1 Degradacción del plasminógeno, colágena y transrretina sx •Angiostatina •Endostatina •Vasculostatina Progresión y heterogeneidad de los tumores • Progresión tumoral: Preneoplásico - tumor benigno -tumor maligno • La malignidad se adquiere de forma progresiva 1 Crecimiento acelerado Capacidad de invasión Metástasis Biología del crecimiento tumoral • Transformación • Crecimiento • Invasión local • Metástasis Cinética del crecimiento Angiogénesis Heterogeneidad Invasión de la matríz extracelular • Proceso activo que se divide en varios pasos 1) Separación de células tumorales del resto de la masa. 2) Fijación a los componentes de la matríz. 3) Degradación de la matríz extracelular. 4) Emigración de las células tumorales. • Membrana basal y tejido conjuntivo. • Colágeno, proteoglucanos y glucoproteinas. Disminución de cadherina E r/o Mutación cateninas. Rc laminina, fibronectina y expresión de integrinas. Enzimas proteolíticas (propias del huesped) Serina, Cisteina de la matríz (MPM) Factores de motilidad autocrino (timosina, fc.Crecim. hepatocitario) Productos de degradación de los componentes de la matríz. Diseminación vascular y asentamiento de las células tumorales • Penetran en circulación y se agupan entre ellas y con células sanguineas (plaquetas) • Viajan como embolo y se extravasan hacia organo diana (moleculas de adherencia - CD44) • Tropismo orgánico Ca próstata - esqueleto Ca broncogenico - suprarrenal y encéfalo Neuroblastomas - hígado y hueso Tropismo Orgánico • Células tumorales: molécula adherencia con preferencia a células endoteliales del órgano diana. • Célula diana: liberan sustancias quimiotácticas. • Organo diana: ambiente desfavorable. Genética molecular de las metástasis • “Gen metastásico” • Genes supresores de la metástasis. - Gen de cadherina E. - Gen de inhibidor histico metaloproteasas. - nm23 ca mamario - KA I-1 (crom IIp II-2) ca próstata - Kiss-1 (crom IIp) melanoma maligno Carcinogénesis • 1.- Cambio en la función de un gen • 2.- Función anormal de un gen • 3.- Cambios estructurales de los genes • Sin alteración cromosómica no existe transformación neoplásica Factores ambientales Virus, radiación Célula suceptible Diferenciación genes Proliferación Apoptosis Genes asociados a proliferación celular Mecanismos moleculares CA Colon Mutaciones APC Y MCC Perdida de gpos. Metilo ADN Mutaciones del Gen RAS Perdida de Gen DCC Perdida de P53 Adenoma plano Oncogenes Oncogen Función Tumor HST Crecimiento Ca.gástrico NEU/ERB-2 Crecimiento Ovario,mama TRK Crecimiento Ca.tiroides,Colon HaRAS,K-RAS, Trasduccion Ca.vejiga,Colon de proteínas ABL Cinasas de proteínas MYC/BCL2 Factores de Trasduccion Neuroblastoma Nucleares Leucemia/Linfoma Linfomas Seminars in Oncology Vol.23:4-21 1996 Gen supresor tumoral • Alteración de la funcionalidad de ambos alelos de un gen que regula la diferenciación celular o la supervivencia la pérdida de estos resulta en la transformación maligna. P53 Guardian ADN Genes Supresores Tumorales Gene S. Familiar T.Esporádicos c/Mutación Mx de Acción RB1 Retinoblastoma RB,OSC,Pulmón,Mama Ciclo Celular P53 S.Li-Fraumeni 50% canceres Daño DNA P16 Melanoma,Ca.Pancreas Ca.pancreas,Gliomas Inhibidor CDK hMSH-2 Ca.Colon Ca.Colon,Endometrio Reparación DNA hMLH-1 APC Pólipos adenomatosos Ca.Colon Wnt factores crecimiento BRCA1 Ca.Mama,Ovario Ovario(raro) Reparación DNA ? BRCA2 Ca.Mama,Ovario,Páncreas Ca.Páncreas Reparación DNA? NF-1 Neurofibromatosis tipo 1 Neuroblastoma Melanoma Ras NF-2 Neurofibromatosis tipo 2 Meningioma, Mesotelioma M.Citoesqueleto Shwanoma,Ependimoma Molecula de Estrogeno Receptor de estrogenos ADN Respuesta Mediada RNAm Evidencia a favor de Efecto hormonal en Adenocarcinoma de Mama 1. Pacientes con ooforectomia rara vez desarrollan cancer de mama 2. Pacientes con S de Turner rara vez desarrollan ca de mama 3. Xenoestrogenos favorecen el desarrollo de ca de mama 4. Los pacientes con RE positivos responden a terapias con tamoxifen Agentes Carcinógenos Químicos Microorganismos oncogénicos Energía radiante Carcinogénesis Química • John Hill - rapé -pólipos • Percival Pott - hollín - ca escroto • Hidrocarburos aromáticos policíclicos • Sustancias sintéticas • Fármacos Fase de la carcinogenesis química • Iniciación y promoción INICIACION Naturales ó sintéticos acción directa acción indirecta ó procarcinógenos • Activación (carcinogeno) (destoxificación) Inactivación • Monooxigenosa dependiente de citocromo P-450 • CYP1A1, Stransferasa (BST), edad, sexo, nutrición CARCINOGENOS QUIMICOS • Indicador mutágeno • Diana DNA • Cada carcinógeno produce una “huella dactilar” molecular China y Africa aflatoxina B1 • Ca. Hepatocelular - mutación p53 mutación 249 p53. Otras Otras regiones V Hepatitis B. Otras mutaciones en p53 • P/iniciación: Celulas alteradas por carcinógeno deben sufrir al menos 1 ciclo de proliferación PROMOCION • Capacidad carcinogénica de alguna sustacias cuando se administra un promotor que por si mismo no es tumorgénico • TPA, Acido ocadoico INICIADOR PROMOTOR NUEVAS MUTACIONES Proliferación y Actividad de un oncogen Nada Lesión Lesión hiperplásica preneoplasica expansion cronal de células indicadas Tumor maligno CARCINOGENOS QUIMICOS • Agentes alquilantes de acción directa • Hidrocarburos aromáticos policíclicos • Aminas aromáticas y colorantes nitrogenados • Carcinógenos naturales • Nitrosaminas y amidos • Agentes diversos • Promotores de la carcinogenesis química CARCINOGENESIS POR RADIACIÓN • Rayos UV (UVA, UVB, UVC) • R. Ionizante (electomagnetico o particular) RAYOS ULTRAVIOLETA UVA 320-400nm UVB 280-320nm carcinógeno UVC 200-280nm carcinógeno, filtrado por capa 0Z0NO • Epidemiología - Ca. Espinocelular, basocelular, melanoma • Factores: Tipo de UV, Intensidad exposición, cantidad melanina NER ( nucleotide excision repair) 1) Reconocimiento 2) Incision 3) Eliminación 4) SX parche 5) Unión del parch sobrepasa capacidad sol NER error en transcripción • Xeroderma pigmentoso DNA dañado XERODERMA PIGMENTOSUM • Autosómico recesivo • Fotosensibilidad extrema • riesgo ca(2000 veces) • Anomalías neurológicas • Incapacidad p/reparar DNA por lesiones UV • 7 variantes RADIACIÓN LONIZANTE • Cualquier célula podrá transformarse en cancerosa si recibe una cantidad suficiente de energía radiante • Ca provocado por radiación: - Leucemias - Ca. Tiroides - Mama, pulmón y glándula salival • Piel, hueso y TGI: son los menos involucrados EJEMPLOS • Rayos roetgen - Ca. Piel • Mineros de elem radioactivos – – Ca. Pulmón (10 v+) • Bombas Hiroshima y Naggsaki – – 7 a: leucemias mama, tiroides – a: tumor solido colon, pulmón • R. Terapeuticos: Cabeza y Cuello = 9% CA tiroides : Columna x E.A= leucemia (10-12 v+) • Accidente Chernobil - Ca. Tiroides CARCINÓGENOS VIRALES Y MICROBIANOS • Virus DNA oncogenicos (VPH, VEB) • Virus RNA oncogenicos ( VLTH-1) • Bacterias (Helicobacter pylori) VIRUS DNA ONCOGENICOS -VPH • • • • • • 70 Tipos VPH 1, 2, 4, 7 prod papilomas escamosos benignos 6, 11 condiloma genital con escaso pontencial maligno 16, 18 (31, 33, 35, 51) Ca in situ 85% y Ca invasores Lesión preneoplásica - Forma episómica del VPH Lesión neoplásica - Forma integrada del VPH. (clonal) NL - - (-) transcripción - - - - - - - - - - - - - - - E1 / E2 E6/E7 E6 PRB INFECT - - - Interrupción - - codifica E6/E7 VPH 16, 18, 31 VPH - - - - Interrupción - - codifica E6/E7 bajo riesto ---------- E6 ciclo normal Regulación del ciclo células alterado p53-P cant gran afinidad E6 P53-a cant 7 veces > riesgo de Ca. que poca afinidad Alteración leve del ciclo celular Virus DNA oncogénico VEB Antigenos Tumorales • AET - Solo en células tumorales, desencadenan a células T citotóxica y se presentan sobre la celular por molecula I MHC. • AAT - Genes en células normales (pero no expresado) y en células tumorales. Fam. Genes MAGE, GAGE, BAGE, RAGE. • Expresión excesiva de antigenos c-erb B2 (o neu) - en células tumorales su expresión y activa a linfos T CD8 citotox. • Antigenos virales E7 del VPH-16 • Antigenos de diferenciación CD10 (CALLA) - Leucemias y Linfomas B Ag prostático específico Mecanismos Efectores Antitumorales Inmunovigilancia • SIDA, XLP. Otras inmuno del - 220 veces > prob. de Cancer • Dx sanos - mecanismos p/evadir inmunodeficiencia - células tumorales no expresan HLA clase I - no expresan moleculas coestimulantes - inhiban respuesta inmune ((+) LT supresor) - apoptosis de células T citotox. (ligados FAS) Efectos del tumor en el huesped • Daño por : - localización y efecto de masa - actividad funcional - hemorragias o infecciones -sintomas agudos Efectos locales y normales • Tumor endocrino benigno endocrinopatia • Cancer en una glándula • Cancer colon • Presión insuficiencia obstrucción tumor benigno • Erosion y destrucción tumor maligno Caquexia • Síndrome: Pérdida de grasa y masa corporal con dedebilidad, anorexia, anemia - Alteación: gusto y olfato - Gasto Calórico e indice metabólico basal - Es reproducible al administrar FNT Síndrome Paraneoplásico Signos y síntomas de un px. con Ca. que no se explica por efecto del tumor local, metástasis ni actividad funcional. Producción hormonal ectópica (Cushing) 50% Ca. Pulmón Hipercalcemia (mama, pulmón, riñón, ovario) Síndrome neuromiopático: Ac anti tumor Acantosis Nigricans: 50% con Rx cruzada c/neuronas 40 años y Ca. Osteoartropatía hipertrófica: 1-10% de Ca. Broncogénicos Graduación y estadificación de los tumores • Mediante - grado de diferenciación y mitosis existentes Es proporcianal a la agresividad (I - IV) 2 Sistema 1 UICC = Sistema TNM TO= in situ, T1 - T4 tamaño NO= no ganglios, N1 - N3 # ganglio afectados MO= no mets MI - mets presente Mz - Mets Hematógena 2 AJCC - O - n Tamaño, ganglios, metástasis Diagnóstico del cancer • Histológico y citológico Inmunotinción Diganóstico molécular Citometría del Flujo Marcadores Tumorales • Datos clínicos muestra adecuada y representativa material bien fijado por BAAF, biopsia, BTO técnica de apoyo Historia Tinción facilita la distinción diferentes componentes celulares. HyE Weigert, Harris, Mayer 1939 Histoenzimología 1942 Coons Inmunoflourescencia 1972 NakaneAvrameas Peroxidasa 1980 Hsu Complejo Avidina –Biotina 1972 Stenberg PAP 1992 Adams Ampificación Tirimidina Tinción especial • Subjetividad histopatologia • Identificar célula en particular , tejido o enfermedad • Técnica auxiliar • Sensibilidad y especificidad aceptable en el diagnóstico morfológico • Posibilidad de clarificar la histogénesis HIS Telepatología 3D Morfo In situ PCR Computadoras PCR IHQ Biología Molecular Histoquímica Inmunología ME Química Bioquímica Física 1940 1950 1960 1970 1980 1990 Métodos en Patología Qx. • • • • • • Macroscopico Microscopia luz Histoquimica Inmunohistoqx. Ultraesructura Citopatologia • CFU • Análisis de Imagen • Hibridización In situ • PCR • FISH Macro melanosomas IHQ PAS HISF Inf. Clínica Técnica Especimen Resultados Consideraciones Técnicas Especimen: • • • • • Bloques celulares Citología o frotis secado al aire Citologías teñidas previamente Citologías BAAF Transferencia de células Transferencia de celulas HMBE-1 PAP ACE CK8 Logística de Estudio Lesiones Neoplásicas Citopatología Evaluación Clínica y sitio de la lesión Citopatólogo DX. Diferencial Grupos Morfológicos I. Epitelioides II. Fusocelulares III. Mixtos IV. Células pequeñas CA vs. Melanoma CA vs. Linfoma Linfoma vs. TNEP CA sarc. vs. Sarcoma Panel Racional Inicial PLAP Réglas Básicas Interpretación Filamentos Actina G.secretorios Filamentos Sinaptoficina Cromogranina CK8 Réglas Básicas Interpretación Lámina basal Filamentos Filamentos Filamentos Colagena IV Actina Desmina Historia Clinica 1 • Paciente masculino campesino de 58 años de edad con tumor en region cervical • Tele de Torax normal • TAC normal • Estudios de laboratrio dentro de limites normales Diagnosticos diferenciales Melanoma Histocitoma Fibroso Maligno Carcinoma sarcomatide Sarcoma epitelioide CK 13 CD 68 Negativo Prot S-100 negativo CK8 negativo CK 7 Negativo CD 10 Negativo Carcinoma Espinocelular sarcomatoide HMB45 Cocktail CK Inmunofenotipo Patología Quirúrgica • Proceso reactivo vs. Neoplásico • Linfoma vs. Neoplasia no Linfoide • Inmunotipificación de Linfomas Protocolo de Estudio Lesiones Neoplásicas Poco Diferenciadas Evaluación Clínica y sitio de la lesión Morfología G. Morfológicos I. Epitelioides II. Fusocelulares III. Mixtos IV. Células pequeñas Panel Dx Inicial ME, PCR BM Dx Def. No Concl. Panel p/ SC Dx. Histogenetico Clasificación de tumores indiferenciados • • • • • • CK VIM Des PAGF ACL APE epitelial mesenquimatoso muscular gliales linfomas tiroglobulina - ca específico Diagnóstico molecular • • • • • • Diferenciar población polimonoclonal Detección de traslocaciones por FISH Detección de transcripción por PCR Determinar el pronóstico Detección de enfermedad residual por PCR Predisposición hereditaria BRCA1, BRCA2 RET. Diagnóstico Pronóstico y R=Tx Selección y manejo Tx.génico Personas normales 11 2 1.00- 8030 D 2l de DNA 1. 00- 8030 D 1l de DNA ZP3 2. 00- 4572 B ZP3 Her-2/Neu Her-2/Neu Pacientes M marcador de peso molecular 3. 01- 330 B M 3 4 4. 00- 733 A 5. 01- 146 M 6. 01Q- 1226 HSJ 7. GG- 866- a 8. 01Q- 658 9. GG- 3275D 10. 01Q- 815B 11. 01Q- 1111B 12. 01Q- 978B 5 6 7 8 9 10 11 12 ZP3 Her-2/Neu N° de copias 1 10 2 28 3 11 4 10 5 10 6 12 7 12 8 24 9 08 10 24 11 04 12 02 Citometría de flujo - Identificación de antígenos de superficie - Aneuploidia pronóstico Marcadores tumorales - Apoyo al diagnóstico - Indican recidiva - Establece respuesta al tratamiento (AFP, CEA, HGC, etc) Gracias por escuchar A mi papá.
