Download Replicación del DNA

REPLICACIÓN DEL DNA
Mecanismos de replicación celular
“Una hebra es el complemento de la otra”
Proceso mediante el cual la secuencia de nucleótidos de una hebra de DNA, es copiada
por
apareamiento de bases complementarias (A-T, G-C) en una nueva secuencia de DNA
Se requiere:
-
Reconocimiento de cada nucleótido en la hebra molde, por otro nucleótido libre
complementario
-
Separación de las hebras de la doble hélice del DNA
-
Polimerización catalizada por enzima
Replicación es semiconservativa
Experimento de Meselson-Stahl
a.
b.
c.
Células cultivadas en medio donde la única fuente de
Nitrógeno, NH4Cl poseía 15N.
Células se transfirieron a medio con 14N y se obtuvo DNA
después de una generación.
Segunda generación genera don DNA´s híbridos y dos DNA
con 14N
Preguntas por resolver
-
¿Las hebras de DNA parentales están completamente
desenrolladas antes de ser replicadas?
-
¿La replicación comienza en lugares aleatorios o en único
punto?
-
¿Ocurre en una sola dirección?
Replicación del cromosoma de E. coli
John Cairns demostró la replicación del cromosoma de E. coli en 1963

Marcó radioactivamente el cromosoma con 3H-Timidina

Luego aisló los cromosomas lisando las células suavemente

Los observó mediante autoradiografía
Se demostró:
- E. coli tiene un cromosoma circular de 1,7mm de longitud
- Tiene un único origen de replicación
- En E. coli cuando se desenrrolla el DNA simultáneamente se da la replicación
Replicación unidireccional o
bidireccional?
John Cairns con una varió el experimento con 3H-Timidina

Cultivó E. coli en medio con 3H-Timidina de baja actividad específica

Esperó a que las células estuvieran a la mitad de la replicación

Pulsó las células con 3H-Timidina de alta actividad específica
Se demostró:
- El cromosoma de E. coli efectúa replicación bidireccional
Origen de replicación
Denaturation mapping
• Técnica que se basa en la desnaturalización de regiones ricas en T y A
• DNA con loops de replicación son parcialmente desnaturalizados
• Se mapean la posición y el avance de las horquillas de replicación
• Se demostró la existencia de un origen de replicación
Horquilla de replicación



En la horquilla de replicación, el DNA de las nuevas hebras hermanas es
sintetizado por un complejo multienzimático
La polimerización se da por la enzima DNA polimerasa que polimeriza en
dirección 5’-3’, descubierta en 1957
No se conoce una enzima que polimerice de 3´a 5´
La horquilla es una estructura asimétrica
-
La hebra en dirección 5’-3’ es polimerizada
continuamente y se denomina la hebra líder
La hebra hermana hermana que es sintetizada
de forma discontinua se conoce como hebra
rezagada
Fragmentos de Okazaki
•
•
•
Fragmentos de DNA de 1000-2000pb en Procariotes y 100-200pb en Eucariotes
Se sintetizan en la hebra rezagada en la dirección 5´-3´
La hebra rezagada debe esperar a que la hebra líder exponga la hebra molde en
los cuáles son sintetizados los fragmentos de Okazaki
Inicio de la replicación
Modelo de replicón del inicio de replicación
Replicador: Set de secuencias que son suficientes para
dirigir
el inicio de la replicación del DNA
Incluye al origen de replicación
Proteína iniciadora: Reconoce un elemento de DNA en el
replicador que activa la iniciación
Proteínas para abrir la doble hélice


La doble hélice de DNA debe ser abierta al frente de la horquilla de replicación
Dos proteínas contribuyen en este proceso: DNA helicasas y Single Strand DNA-Binding
Proteins
DNA Helicasas: Hidrolizan ATP para hacer trabajo mecánico. De esta manera se genera
propulsión cuando están ligadas a hebras sencillas de DNA.
Al encontrar doble hélice la separan a una velocidad de 1000 nucleótidos por segundo.
Single Strand DNA-Binding Proteins: También son conocidas como proteínas
desestabilizadoras
de la hélice. Se unen fuertemente a DNA de cadena sencilla sin cubrir las bases. Ayudan a las
DNA helicasa a mantener el DNA abierto.
Adicionalmente impiden la formación de hairpines.
DNA polimerasas

Su función principal es catalizar él ataque nucleofílico del grupo hidroxilo ubicado
en la posición 3´ del nucleótido ubicado en la hebra que se está sintetizando al
fósforo α del deoxinucleótido 5’ trifosfato
DNA polimerasas

La enzima tiene preferencia estructural por aquellos nucleótidos que son
complementarios

Adicionalmente la DNA polimerasa corrige los errores que se puedan generar en
la polimerización mediante actividad exonucleasa
Nick translation
Arquitectura de una DNA polimerasa
Resumen del proceso
DNA topoisomerasas

Cada 10 pares de bases se completa un giro alrededor del eje central

Ocurre un problema de torción

La polimerasa rompe el enlace fosfodiester para que las dos secciones del DNA
puedan rotar