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CURVAS TEMPORALES DE
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Discusión
OBJETIVOS
Conocer las características generales de las
enzimas como catalizadores biológicos.
 Adquirir la habilidad para medir la actividad de
una enzima utilizando un método
espectrofotométrico.
 Relacionar los distintos parámetros asociados a
la medición de la actividad enzimática que
permiten seguir y evaluar la purificación de una
enzima (actividad específica, rendimiento y
enriquecimiento).

LACTATO DESHIDROGENASA
DATOS OBTENIDOS DE LA ACTIVIDAD DE LOS EXTRACTOS DE LAS
FRACCIONES OBTENIDAS DE LA PURIFICACIÓN DE LA LDH DE MÚSCULO
DE BOVINO
TIEMPO

FRACCION 3
FRACCION 4
fpii
Fpii2
FPA
dil 1:20
dil 1:20
conc
conc
conc
0.5
1.027
1.047
1.257
1.263
1.107
1
0.919
0.922
1.257
1.263
1.109
1.5
0.8
0.798
1.253
1.261
1.105
2
0.697
0.68
1.261
1.106
2.5
0.59
0.567
1.261
1.008
3
0.487
0.461
1.261
1.007
3.5
0.392
0.364
1.237
1.26
1.008
4
0.307
0.276
1.240
1.26
1.008
4.5
0.23
0.202
1.240
1.259
1.007
5
0.166
0.141
1.237
1.241
Después se grafican los datos para obtener las
pendientes de las curvas
1.005
Curva temporal de actividad de la LDH
FRACCIONES OBTENIDAS DE SU PURIFICACIÓN
Absorbancia 340 nm
1.4
1.2
1
FRACCION 3
FRACCION 4
0.8
FPii
0.6
FPii
0.4
FPA
0.2
0
0
1
2
3
Tiempo (min)
4
5
6
CÁLCULOS
mg proteína F3= 0.01812 mg (lo obtuve al considerar que había 7.25 /L en el
concentrado (datos de determinación de proteína de mi extracto) al diluir 1:20
quedaron 0.3625 g/L, como añadí 50 L entonces la celda tenía 0.01812 mg)
ACTIVIDAD DE LDH DE LAS FRACCIONES 3 Y
4 DEL PROCESO DE PURIFICACIÓN DE AL
ENZIMA
Fracción 3
(mol min-1mg-1)
Fracción 4
(mol min-1mg-1)
m
0.1946
0.2043
r2
0.99
0.99
Actividad
29.490499
33.293998
¿CÓMO CALCULAR EL FACTOR DE PURIFICACIÓN
O LAS VECES DE PURIFICACIÓN?
Cuando se purifica a una proteína es habitual usar una tabla con
datos que nos indiquen si el proceso que se llevo a cabo fue efectivo.
 Cuando una proteína no pierde actividad biológica esta se sigue a
través de medir esa actividad.
Etapa
Volumen
(ml)
Actividad
Total
(U)
Proteína
Total
(mg)
Act. Espec.
(U/mg)
EC
500
3,000
15,000
0,2
100
SA
100
2,400
4,000
0,6
80
3,0
CII
45
1,440
500
2,9
48
14,5
FG
50
1,000
125
8.0
33
40,0
EC: Extracto crudo. SA: Precipitación con sulfato de amonio. CII: Cromatografía de intercambio iónico. FG: Filtración en gel.
Cantidad
Factor de
(%)
Purificación
Diagrama de flujo generalizado de la
purificación de la Lactato Deshidrogenasa.
Fase 1 Homogeneizado del músculo esquelético de ternera.
Fase 2 Precipitación por salado, remoción de proteínas no
requeridas.
Fase 3 Obtención de proteína purificada, por cromatografía de
exclusión molecular seguida de la cromatografía de afinidad.
TABLA DE PURIFICACIÓN DE LA LDH DE
MÚSCULO ESQUELETO DE BOVINO (EQUIPO 6)
Fracción
Proteína [µg
/µL]
Volumen total de la
fracción [µL]
Proteína total en la fracción
[µg]
Rendimiento
1
13.72
30000
411600
100%
2
14.13
29000
282600
68.66%
3
15.55
2500
38875
9.44%
4
15.93
1000
15930
3.88%
FPA
1.474
900
1326.6
0.32%
FPB
1.364
900
1227.6
0.29%
PURIFICACIÓN DE LA LDH
Logaritmo del peso
molecular
3
y = -1.3374x + 2.244
R² = 0.9382
2.5
2
1.5
Series1
Linea…
1
0.5
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2