Download Vectores de Clonaje

Los Vectores de Clonaje
Mapa de Restricción de pUC18 y pUC19 ( se diferencian la secuencia de MCS )
Los pUC son vectores típicos de Clonaje. Vemos que su tamaño es de 2686 bp
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
MCS
Multi Cloning Site
Ampicilin
Resistencia
Ori C
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
pUC18 MCS
5´ 396
3´ 455
GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
Hind III
Sph I
Pst I
Sal I
Xba I BamH I Sma I
Kpn I Sac I EcoR I
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Supongamos que preparamos el vector para insertar un
fragmento de DNA que tiene extremos Hind III y BamH I
Hind III
BamH I
AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAG
GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
GCCA
AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
GCCA
GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC
ACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAG
CGGTTCGAACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGGGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG
CGGTTCGA
ACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGGGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG
CGGTTCGA
GGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
MCS
Multi Cloning Site
Estamos linearizando
el vector
Hind III
AGCTTG
AC
BamH I
CCGGG
GGCCCCTAG
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Ahora podemos unir Vector e inserto si ambos fueron digeridos con los mismos enzimas
Hind III
BamH I
AGCTTG
AC
CCGGG
GGCCCCTAG
VECTOR LINEARIZADO
Hind III
BamH I
CCGGG
GGCCCCTAG
AGCTTG
AC
INSERTO DIGERIDO CON Hind III y BamH I
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AGCTTG
AC
CCGGG
GGCCCCTAG
+
VECTOR LINEARIZADO
CCGGG
GGCCCCTAG
AGCTTG
AC
INSERTO
LIGACIÓN
Ampicilin
Resistencia
Ori C
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Las Bacterias se transforman con el vector conteniendo el inserto
bacteria
Vector con inserto
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Al añadir el antibiótico solo resistirán y crecerán las bacterias antibióticoresistentes, que tienen el vector con el gen de resistencia. A esto se le denomina
selección.
ampicilina
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Una vez crecidas las bacterias, se lisan y se recoge el vector.
Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid
Ahora tenemos “amplificado” el vector con el inserto. Tenemos un gran número de
copias del inserto.
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Al digerir con los enzimas de restricción adecuados ( Hind III y BamH I ) el vector,
se libera un gran número de copias del inserto clonado.
HindIII
BamH I
AGCTTG
AC
CCGGG
GGCCCCTAG
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Características de un vector de Clonaje
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