Download Slide 1 - REDBIO Argentina

“Resistencia a fitopatógenos en
plantas transgénicas de
Solanum tuberosum:
Estudio de la función y regulación
del gen snakin-1”
Principales agentes fitopatógenos que afectan al cultivo de papa:
Hongos:
• Tizón tardío = Phytophthora infestans
• Tizón temprano = Alternaria solani
• Sarna negra = Rhizoctonia solani (Cancro del tallo)
• Fusariosis = Fusarium oxysporum, Fusarium sp.
Bacterias:
• Podredumbre blanda = Erwinia carotovora subssp.carotovora
• Podredumbre parda = Ralstonia solanacearum
• Marchitez bacteriana = Pseudomonas solanacearum
• Sarna común = Streptomyces scabies.
Además existen enfermedades producidas por:
• Virus
• Insectos
• Ácaros
• Nemátodos
• Rhizoctonia solani: Hongo imperfecto habitante del suelo, principalmente
radicular y/o basal, produce cancros en la base del tallo y esclerocios
negros sobre la superficie del tubérculo.
• Erwinia carotovora: Bacteria de pequeños bacilos, Gram negativos con
flagelos perítricos y causa la pudrición del tejido afectado.
Las plantas han desarrollado una gran variedad de mecanismos de defensa
que incluyen:
•
•
•
•
•
•
La producción de especies reactivas de oxígeno
La acumulación de ácido salicílico y benzoico
La fortificación de la pared celular
Un aumento de la actividad lipoxigenasa
La producción de compuestos y proteínas relacionadas con patogénesis
Los péptidos antimicrobianos
Péptidos antimicrobianos:
Poseen entre 6-50 aminoácidos con carga neta positiva y un alto número de
cisteínas por lo que pueden establecer puentes disulfuro. Su expresión puede
ser constitutiva o inducible, se han aislado de fuentes muy diversas y se han
caracterizado varias familias:
 Tioninas
 Defensinas
 “Hevein-like”
 “Knottin-like”
 LTPs (“lipid transfer proteins”)
 Snakin/GASA
Péptido antimicrobiano codificado por el gen snakin-1 (SN1)
(Segura y col., MPMI Vol. 12, No. 1, 1999, pp. 16–23)
• Fue aislado de tubérculos de papa (Solanum tuberosum cv. Desirée).
•Posee 63 aminoácidos (12 son cisteínas).
•Presenta motivos en común con una proteína hemotóxica de veneno de víbora
(“snake”) aunque no contiene el motivo tóxico.
• Presentó in vitro actividad frente a patógenos:
Fúngicos: Botrytis cinerea, Fusarium solani, Fusarium culmorum, Fusarium oxyspotum f.sp
conglutinans, Fusarium oxyspotum f. sp lycopersici, Plectosphaerella cucumerina, Colletotrichum
graminicola, Colletotrichum lagenarium, Bipolares maydys y Aspergilus flavus.
Bacterianos: Ralstonia solanaceacerum, Erwinia chrysanthemi, Rhizobium meliloti, Listeria
monocytogenes y Clavibacter michiganesis subespecie sepedonicus
• Posee la capacidad de agregar bacterias in vitro.
Objetivo principal:
Estudiar la función y regulación del gen snakin-1
(SN1) en plantas transgénicas de Solanum tuberosum
Caracterizar el potencial antifúngico in vivo de la proteína
codificada por el gen SN1.
Plantas de papa que sobreexpresan SN1
fueron desafiadas con Rhizoctonia solani
S5
NT
• Las líneas transgénicas que acumulan altos niveles de mRNA
de SN1 exhibieron reducciones de los síntomas causados por la
infección y mostraron niveles de supervivencia
significativamente mayores a los de las plantas controles.
Transgénicas
Caracterizar el potencial
antibacteriano in vivo de la proteína
codificada por el gen SN1.
Plantas de papa transgénicas para
SN1 fueron desafiadas con Erwinia
carotovora.
No transgénica
• Las líneas sobreexpresantes de SN1 que habían mostrado
tolerancia a R. solani mostraron también un fenotipo tolerante
frente a infecciones provocadas por E. carotovora.
Proteínas homólogas a SN1 fueron caracterizadas en numerosas especies
vegetales involucradas en:
 La regulación de la elongación celular
 División celular
 Estimulación o inhibición de la elongación del tallo y la corola
En consecuencia plantas transgénicas que sobreexpresan o silencian dichos
genes presentan cambios morfológicos, aunque sus funciones no fueron
completamente dilucidadas…
¿Además del rol en defensa SN1 participa en otros procesos vegetales ?
Evaluar si existen diferencias en el tamaño celular de las plantas
sobreexpresantes del gen SN1
Se realizaron estudios de microscopía de barrido
para determinar el tamaño de las células de secciones
maduras del tallo de las plantas transgénicas.
No transgénica
S1
Area total celular
*
6000
5000
*
*
4000
3000
2000
1000
0
S1
S3
S5
NT
Longitud Celular
*
400
300
*
200
100
0
S3
S5
S1
S3
S5
NT
• Las células del tallo de las líneas transgénicas exhibieron mayor superficie total que las
plantas control sin transformar, debido principalmente al aumento de la longitud celular.
Estudiar el efecto de la sobreexpresión y del silenciamiento del gen SN1
en el fenotipo de plantas de papa transgénicas.
Se realizaron estudios morfológicos de plantas transgénicas que
sobreexpresan o silencian el gen SN1.
Peso Fresco Foliar
60
*
*
50
40
Peso Fresco de los Tallos
*
*
40
Gramos
Gramos
50
60
30
20
10
S1
S3
S5
NT
K1
20
10
*
0
30
K2
*
0
S1
S3
S5
NT
K1
K2
Porcentaje de Agua en Hojas
Largo Total de Tallo Mayor
70
100
*
60
98
96
40
30
94
*
20
92
10
90
0
S1
S3
S5
NT
K1
S1
K2
S3
Peso promedio de los tuberculos
70
60
*
50
Gramos
Centímetros
50
40
30
20
*
*
K1
K2
10
0
S5
NT
S5
NT
K1
K2
• Las plantas que sobreexpresan SN1 presentan un aumento de la
masa vegetal total que se debe principalmente a un aumento de la
longitud de los tallos y a la cantidad de agua acumulada en las
hojas.
•Las plantas silenciadas evidencian un comportamiento opuesto y
además exhibieron una reducción significativa del peso promedio
de los tubérculos respecto a las controles.
Evaluar los niveles de Especies Reactivas del Oxígeno en plantas
sobreexpresantes y silenciadas para el gen SN1.
Se midieron los niveles de emisión de fluorescencia verde producida al reaccionar el
compuesto H2DCF con el peróxido de hidrógeno presente en el tejido vegetal.
• Estos resultados demuestran que la sobreexpresión del gen SN1
reduce los niveles de ROS mientras que su silenciamiento los aumenta,
al menos en las condiciones ensayadas
Determinar la localización subcelular de SN1
Primero se realizó
un estudio in silico y
luego se ensayó
empíricamente
mediante una fusión
traduccional de SN1 a
la proteína verde
fluorescente GFP.
Luz Blanca
• Al observar
las células
transformadas
con la
construcción
SN1-GFP, la
fluorescencia fue
detectada en
apoplasto
SN1- GFP
RE - GFP
Estudiar la regulación espacial y temporal del gen SN1
1421 pb río arriba del gen SN1 a partir de la variedad comercial S. tuberosum spp. tuberosum
cv Kennebec
Se identificaron 98 elementos regulatorios en total en la secuencia de S. tuberosum spp. tuberosum cv
Kennebec
Resumiendo fueron identificados sitios de unión de factores de transcripción relacionados con:














Especificidad de xilema
Inducción por anaerobiosis
Activación por luz
Respuesta a etileno
Respuesta a giberelinas
Respuesta a altas/bajas temperaturas
Regulación metabólica
Expresión en endosperma
Respuesta a defensa y/o estrés
Respuesta a ácido salicílico
Auxinas
Expresión en meristemas
Respuesta a metil-jasmónico
Respuesta a sequía
Promotor SN1 de S. tuberosum spp. tuberosum cv Kennebec
Respuesta a
Auxinas
Expresión en
Meristemas
Respuesta a Acido Salicílico
Respuesta a
alta/baja
Temperaturas
Respuesta a Etileno
Respuesta a
Expresión en
Endosperma
Luz
-1421 -1300 -1200 -1100 -1000 -900 -800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100
Respuesta a
MetilJasmónico
Respuesta a
Sequía
Respuesta en
Defensa y estrés
Activador de la
Transcripción
Elementos de Respuesta a Luz
Respuesta a Giberelinas
Regulación
Metabólica
Específico
de Xilema
+1
0
1345 “CAT
BOX”
1376 “TATA
BOX”
Inducción por Anaerobiosis
Punto del inicio de la secuencia de 671 pb
Activadores de la transcripción (“Enhancers”)
“Matrix score” (puntaje de la matriz) para todos los elementos
>= 5
Obtención de plantas de Arabidopsis thaliana portadoras del promotor del gen SN1
dirigiendo la expresión de la proteína reportera beta-glucuronidasa.
Obtención de construcciones binarias portadoras de la secuencia de 1421 pb río arriba del gen SN1
de la variedad comercial S. tuberosum spp. tuberosum cv Kennebec y los controles pertinentes.
 18 líneas estables portadoras del
promotor del gen SN1
 4 portadoras del casete carente de
secuencia regulatoria (EV)
 7 líneas portadoras del promotor 35S
Arabidopsis thaliana
Analizar la
regulación espacial
de SN1 en la
especie modelo
Arabidopsis thaliana.
• La proteína reportera
se detectó
principalmente en la
vasculatura de hojas,
raíces y flores y en
zonas de activa
división celular como
la zona de elongación
de la raíz o la base de
las flores.
Analizar la
regulación
temporal de SN1 en
la especie modelo
Arabidopsis thaliana.
Se seleccionaron 4
líneas transgénicas para
SN1-pCAMBIA dos de
tinción intermedia (líneas
2B y 5C), una de expresión
fuerte (línea 8B) y una de
expresión muy tenue (línea
11A)
• Mediante el
método
colorimétrico se
detectó una intensa
expresión de la
proteína reportera
en las primeras
semanas que fue
decreciendo hacia la
sexta semana
Comprobar la funcionalidad in vivo de los sitios de reconocimiento de los factores de
transcripción, determinados por el estudio in silico, en la especie modelo Arabidopsis thaliana.
Se estudió el efecto de la temperatura sobre la expresión dirigida por el promotor de SN1. Plantas
crecidas a 20°C fueron trasladadas a una cámara a 4°C o a 37°C durante 4 horas y evaluadas.
Linea 2B
80
60
40
*
*
40
*
*
30
20
20
10
0
0
4°C
20°C
*
100
4°C
37°C
Linea 8B
120
3
2.5
80
2
60
1.5
40
1
20
0.5
20°C
37°C
Linea 11A
*
0
0
4°C
500
Linea 5C
50
20°C
37°C
4°C
20°C
37°C
Control 35S
400
300
200
100
0
4°C
20°C
37°C
• En todas las líneas transgénicas para SN1-pCAMBIA se detectó mayor expresión de la proteína reportera
en las plantas incubadas en alta / baja temperatura.
Se estudió el efecto
de las heridas sobre la
expresión dirigida por
el promotor de SN1.
En las plantas se
confeccionaron
heridas presionando
las hojas con una
pinza y luego fueron
evaluadas, junto con
plantas intactas.
40
• En todas las
líneas transgénicas
para SN1pCAMBIA también
se observó una
inducción de la
expresión la
proteína reportera
en las plantas
heridas.
Linea 2B
40
30
30
20
20
10
10
0
Linea 5C
30
*
No heridas
1.2
*
20
10
0
Heridas
Linea 8B
0
Heridas
Linea 11A
No heridas
300
0.8
200
0.4
100
0
Heridas
Control 35S
0
Heridas
No heridas
Heridas
No heridas
No heridas
Obtención de plantas de Solanum tuberosum portadoras del promotor del gen SN1
dirigiendo la expresión de la proteína reportera beta-glucuronidasa.
Con las construcciones binarias portadoras del promotor del gen SN1 y los controles pertinentes.
 16 líneas estables portadoras del
promotor del gen SN1
 7 portadoras del casete carente de
secuencia regulatoria (EV)
 7 líneas portadoras del promotor 35S
Solanum tuberosum
Analizar la regulación espacial de SN1 en el sistema homólogo Solanum tuberosum.
• La proteína reportera se detectó principalmente en las zonas meristemáticas del ápice , en el tejido vascular
del tallo, en hojas jóvenes, en el extremo de las raíces, en las yemas laterales, en los carpelos, en el polen , en el
estigma y en puntos del botón floral.
Se evaluó la expresión en tubérculos en 3 líneas transgénicas para SN1-pCAMBIA:
una de expresión fuerte (Línea E), una de expresión muy tenue (Línea F1.1) y una de
expresión intermedia (Líneas M1.1).
Línea EV
Línea F1.1
Línea EV
Línea M1.1
Línea M1.1
Línea E
Control 35S
Control 35S
• Los tubérculos de las líneas transgénicas para el promotor de SN1 exhibieron una intensa
coloración en la parte medular pero escasa o nula en la parte central y en la cáscara.
Analizar la regulación temporal de
SN1 en la especie homóloga Solanum
tuberosum.
Línea M1.1
Línea E
Línea Q1.1
2
3
4
5 semanas
Línea F1.1
Línea W1.1
• La expresión se detectó principalmente en la
parte aérea cercana al ápice, en las zonas de las
yemas laterales y en raíces a partir de la segunda
semana, intensamente en la tercera y cuarta
semanas pero decreciendo a partir de la quinta.
Comprobar la funcionalidad in vivo de los sitios de reconocimiento de los factores de
transcripción en el sistema homólogo de Solanum tuberosum.
Se estudió el efecto
de las hormona GA3
sobre la expresión
dirigida por el promotor
de SN1 (familia
Snakin/GASA).
12
10
Linea E
*
*
3
8
6
2
4
1
2
• En las 3 líneas
transgénicas para
SN1-pCAMBIA se
observó una
inducción de la
expresión la
proteína reportera
en las plantas
tratadas con GA3.
Linea M1.1
4
0
GA3
Agua
Linea W1.1
10
0
GA3
160
6
120
4
80
2
40
0
Control 35S
200
8
Agua
0
GA3
Agua
GA3
Agua
Se estudió el efecto de la temperatura sobre la expresión dirigida por el promotor de SN1. Plantas
crecidas a 20°C fueron trasladadas a una cámara a 4°C o a 37°C durante 6 horas y evaluadas.
14
12
*
Linea E
Linea F1.1
0.14
0.12
10
0.1
8
0.08
6
0.06
4
0.04
2
0.02
0
20°C
37°C
Linea Q1.1
10
6
6
15
4
10
2
5
*
4
3
2
1
0
20°C
37°C
Linea W1.1
25
20
Linea M1.1
5
4°C
8
*
7
*
0
4°C
8
4°C
20°C
37°C
Control 35S
300
250
200
150
0
100
50
0
4°C
20°C
37°C
0
4°C
20°C
37°C
4°C
20°C
37°C
• En todas las líneas transgénicas para SN1-pCAMBIA se detectó mayor actividad específica de la proteína
reportera en plantas incubadas en alta /baja temperatura.
¿ SN1: más de una función?
Regulador del
desarrollo celular
Ácido Giberélico
Conclusiones y Discusión
Señalización de los
mecanismos de Defensa
Promotor
Localización
tisular
Tejido vascular, zonas
de activa división
celular, en las primeras
etapas del desarrollo
Protección frente a
patógenos
Determinación
del tamaño
celular
snakin-1
Localización
subcelular
Función in vivo
Apoplasto
Defensa
Modo acción
Primer
obstáculo para
los patógenos
Regulador
positivo del
desarrollo celular
Antioxidante
Coordinar los
procesos
fisiológicos de la
expansión celular
Patogénesis
Intervención en la elongación
celular (relajación de la pared
y el clivado de los
polisacáridos)
Gracias
Se generó
un árbol
filogenético
mediante el
método de
Neighborjoining
• Las secuencias provenientes de la misma especie no se agrupan sino que por el contrario aparecen nodos que
agrupan secuencias de diversas especies.
Evaluar si existe una acción directa de los extractos proteicos de las líneas
sobreexpresantes de SN1 sobre el patógeno fúngico Rhizoctonia solani .
Se realizaron ensayos de inhibición
de crecimiento del hongo en placa con
extractos agregados de plantas de papa
transgénicas o control
2,3 cm
100 %
Sin extracto
76 %
5,25% plantas S3
1,8 cm
2 cm
98 %
5,25% plantas control
58 %
12,5% plantas S3
• Los valores de inhibición del crecimiento del hongo fueron mayores para los extractos provenientes
de plantas transgénicas. Además se observó la formación de micelio aéreo, el oscurecimiento del halo,
la formación de anillos concéntricos menos definidos y la compactación del micelio.
Estudiar el mecanismo de acción del péptido antimicrobiano SN1.
Determinar la capacidad de
interactuar de las moléculas de SN1,
mediante ensayos de BiFC, empleando
dos construcciones capaces de expresar
SN1 fusionadas por separado a la parte
amino-terminal y a la parte carboxiterminal de la proteína fluorescente
amarilla YFP.
• Las zonas agroinfiltradas con las
construcciones SN1-YFPN + SN1-YFPC
mostraron la restauración de la
fluorescencia evidenciando que existe
interacción entre al menos dos moléculas
de SN1 in vivo.