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ELECTROFORESIS
Cátodo
Electroforesis: migración de una
+ +
Ánodo
partícula cargada sometida a un
campo eléctrico
ELECTROFORESIS
Cátodo
-
Velocidad = E
q
f
+ E: gradiente de potencial. E=V/d
+
Ánodo
q: carga eléctrica de la partícula (depende de pH)
f: coeficiente de fricción
tamaño
forma
Criterios de separación electroforética
Cátodo
-
q (carga)
Velocidad = E
f (tamaño, forma)
+ 1. Separación por tamaño
+
Ánodo
2. Separación por carga
3. Separación por tamaño y carga
ELECTROFORESIS
Cátodo
+ -
Velocidad = E
1.
q (carga)
f (tamaño, forma)
Muestra
2. Tampón: mantenimiento de pH y conductividad
+
Ánodo
3. Soporte
4. Equipo electroforético:
• Fuente de alimentación
• Cubeta de electoforesis
SOPORTES ELECTROFORÉTICOS
Cátodo
-
1. Electroforesis libre (Arne Tiselius, 1937)
En solución. Difusión, convección.
2. Electroforesis de zona
+ -
•
Soportes no restrictivos
• Papel, acetato de celulosa
• Almidón, agar, agarosa
+
•
Soportes restrictivos
• Agarosa (ácidos nucleicos)
• Poliacrilamida
Ánodo
EQUIPOS ELECTROFORÉTICOS
Cátodo
+ +
Ánodo
Carga eléctrica de la
biomoléculas
1. Ácidos nucleicos
2. Proteínas
Enlace
fosfodiéster
8
Lehninger. Principios de Bioquímica
Electroforesis de ácidos nucleicos
en geles de agarosa
Electroforesis de ácidos nucleicos
en geles de agarosa
DNA viral
DNA genómico
RNA
ELECTROFORESIS MICROCAPILAR
(Bioanalyzer(R))
Lab-on-a-Chip: electroforesis miniaturizada
y automatizada
ELECTROFORESIS MICROCAPILAR
(Bioanalyzer(R))
Electroforesis de ácidos nucleicos
en geles de agarosa
DNA viral
DNA genómico
RNA
Criterios de separación electroforética
Cátodo
-
q (carga)
Velocidad = E
f (tamaño, forma)
+ 1. Separación por tamaño
+
Ánodo
2. Separación por carga
3. Separación por tamaño y carga
Electroforesis de ácidos nucleicos
en geles de agarosa
1. DNA hebra doble: condiciones no desnaturalizantes
•
Tampón: Tris/Borato/EDTA (TBE) o Tris/Acetato/EDTA (TAE)
•
Muestra: TBE o TAE, Glicerol, Azul de bromofenol
2. RNA, DNA hebra simple: condiciones desnaturalizantes
•
Tampón: MOPS + formaldehído
•
Muestra: Formamida, Azul de bromofenol
Topología del DNA
Se aisló el DNA circular del virus SV40 y se analizó
por electroforesis en gel de agarosa. El resultado se
muestra en la calle 1.
a) ¿Por qué se separa el DNA en una electroforesis
en gel de agarosa? ¿En qué se diferencia el DNA
de cada banda?
b) A continuación se incubó el DNA con
topoisomerasa I durante 5 min y se analizó por
electroforesis (calle 2). ¿A que tipos de DNA
corresponde cada banda?
c) Otra muestra se incubó durante 30 min con
topoisomerasa I. ¿Qué significa el hecho de
encontrar más DNA de las formas de movilidad
reducida?
Electroforesis de DNA en geles de agarosa
SSCP: single-strand conformation polymorphism
ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE
(PFGE): separación de moléculas de DNA de gran tamaño
pulsed field gel electrophoresis
• FIGE: field inversion gel electrophoresis
• TAFE: transverse alternating field
electrophoresis
• RGE: rotating gel electrophoresis
• CHEF: Contour-clamped homogeneous
electric field
ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE
(PFGE)
Rotating gel electrophoresis (RGE)
separation of 3000 to 6000 kb DNA
Schizosaccharomyces pombe
chromosomes. Run conditions: 50 V, 1.4
V/cm, 100 hrs, 100 angle, concatamated
multiple runs: 2500 sec./50hrs, 3000
sec./50hrs, 0.5X TBE, 0.8% megarose
(Clontech), 10 C.
ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE
(PFGE)
Rotating gel electrophoresis (RGE)
separation Saccharomyces cercevisiae
chromosomes (245-2190 kb). Run
conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120
angle, 60-120 sec. pulse ramp, 0.5X TBE,
1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs
were used on the same gel to load 32
samples, a maximum of 72 are possible
Hibridación de ácidos nucleicos:
Southern blot
gel
Nitrocelulosa
Hibridación de ácidos nucleicos:
Southern blot
1.Transferencia a
nitrocelulosa o nylon
2. Hibridación con sonda
específica radiactiva
3. Lavado y autoradiografía
Electroforesis
DNA
Autoradiografía
Southern blot: RFLP
Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción
Electroforesis
DNA genómico
Autoradiografía
(B)
EcoRI
EcoRI
EcoRI
(A)
SONDA
EcoRI
(A)
(B)
EcoRI
Hibridación de ácidos nucleicos:
Northern blot
Electroforesis
RNA
Autoradiografía
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS DEL
SUERO EN ACETATO DE CELULOSA
Soporte no restictivo: Separación por carga
ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA EN
ACETATO DE CELULOSA
Anemia falciforme:
Mutación en hemoglobina A
• Mutación GAG -> GTG
•
Glu -> Val
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-PAGE)
Gel de empaquetamiento (3% PA)
Gel de separación (8-20% PA)
Soporte restrictivo: Separación por tamaño
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-PAGE)
• Concentración de poliacrilamida
• Homogénea
• Gradiente
• Tampón de muestra
• Reductor (2-mercaptoetanol)
• No reductor
• Detección de las proteínas separadas
• Tinción (Azul Coomassie, sales de plata)
• Fluorescencia
• Inmunodetección
ISOELECTROENFOQUE
ELECTROFORESIS
BIDIMENSIONAL
ELECTROFORESIS CAPILAR
Electroforesis capilar de alta resolución (HPCE)
• Soporte: capilar 7-100 cm, 20-200 micras de diámetro
• Voltaje: >500 V/cm
• Automatizada, gran resolución
• Detector: Espectrofotómdetro, fluorímetro, espectrómetro de masas …
ELECTROFORESIS CAPILAR
• CZE: de zona. Medio líquido, homogéneo,
capilares con carga uniforme
• CGE: en gel. Poliacrilamida, PA lineal,
metilcelulosa.
• CIEF: Isoelectroenfoque capilar.
• Isotachophoresis (ITP).
• Electrokinetic Chromatography (EKC).
• Micellar Electrokinetic Capillary
Chromatography (MECC OR MEKC.
• Micro Emulsion Electrokinetic
Chromatography (MEEKC).
• Non-Aqueous Capillary Electrophoresis
(NACE).
• Capillary Electrochromatography (CEC.
Secuenciación de DNA
Método de Sanger automatizado
5´--C T T A A
-
Oligo:
Molde: 3´--G A A T T C G C T A A T G C ---5´
- DNA polimerasa
- Nucleótidos
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
-Terminadores fluorescentes
ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP
Separación de los
fragmentos de DNA
marcados, mediante
electroforesis
capilar
5´--C T T A A G -3´
5´--C T T A A G C -3´
5´--C T T A A G C G -3´
+
5´--C T T A A G C G A -3´
5´--C T T A A G C G A T -3´
5´--C T T A A G C G A T T -3´
láser
Detector de
fluorescencia
G C G A T T A C G . . .
5´--C T T A A G C G A T T A -3´
5´--C T T A A G C G A T T A C -3´
5´--C T T A A G C G A T T A C G -3´
39
CENTRIFUGACIÓN, CÁLCULO DE
FUERZA CENTRÍGA RELATIVA
¿A qué fuerza centrífuga relativa equivalen, en un rotor de 10 cm de radio,
las siguientes velocidades de giro?
•1.000 rpm
•10.000 rpm
•30.000 rpm
•100.000 rpm