Download técnicas para el estudio de la expresión diferencial de genes

Cuales genes están activos, en que momento,
de que manera y en que cantidad se activan
determinan las propiedades y funciones de cada
célula.
LINEA DE TIEMPO
Técnicas para el estudio de expresión
diferencial de genes
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Hibridación sustractiva
SAGE
ADNc – AFLP
DDRT – PCR
Arrays de ADN
Tratamiento con bisulfito
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Northern Blot
RPA
Real Time PCR
Hibridación In Situ
Estudio de la
expresión
global
Epigenética
Expresión de genes
específicos
Arrays de ADN
(Chips o Disposiciones de ADN)
Tipos de arrays
Arrays de ADN
•
•
•
•
Microarrays
Gene-chip®
Chips microelectrónicos
Macroarrays
Arrays de Tejidos
¿Qué es un array de ADN?
Un array es un conjunto de sondas moleculares de
composición conocida fijadas de manera ordenada
sobre un soporte sólido.
Estas sondas pueden ser clones de ADN, productos
de PCR o bien oligonucleótidos sintéticos.
Microarray
de ácidosde
nucleicos
Microdisposiciones
ADN
o Microarrays
• Tecnología basada en capacidad de hibridación de los
ácidos nucleicos
PERO ENTONCES… ¿QUÉ DIFERENCIA
EXISTE ENTRE UN MICROARRAY Y EL
NORTHERN BLOT?
Hibridación
Procedimiento experimental
1.La hélice de doble cadena (ADN)
es separada mediante un proceso
físico (calor) o químico, rompe los
enlaces por puente de hidrógeno
que mantienen unidas las dos
hebras del ADN.
2.Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.
3.Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con
otra muestra de cadenas simples marcadas (sonda).
4. En la muestra combinada las moléculas sencillas se van uniendo por
las zonas complementarias y se va formando una nueva molécula
hibridada.
Microarray
Northern Blot
• Sonda fijada sobre un
soporte
• La muestra se marca y
se agrega
• Se fijan distintas
sondas para varios
genes.
• Evalúa la expresión de
varios genes en dos
muestras a la misma
vez.
• Muestra fijada sobre un
soporte
• La sonda se marca y
se agrega
• Se utiliza una sonda
para un gen.
• Evalúa la expresión de
un gen en una sola
muestra.
Pasos
seguir…
Pasos aa seguir…
ejemplo: comparación de expresión de RNA
Adquirir el soporte (“comprar”)
Aislar RNA de células ó muestras de tejidos
Convertir RNA en cDNA
Unir cDNA con nucleótidos fluorescentes
Hibridarlo con la matriz
Detectar y cuantificar fluorescencia
utilizando un scanner laser
Analizar los resultados
Impresión de Microarray
Síntesis previa
Aislar el material que quiero estudiar…
Extracción de
RNAt o RNAm
Extracción de
RNAt o RNAm
RNA A
RNA B
RNA A
RNA B
RT con un
nucleótido marcado
con un colorante
cDNA A
cDNA B
Hibridación con la matriz
Detector de fluorescencia
El detector envía TODOS los datos a una
computadora
cDNA B
cDNA A
AyB
La señal es proporcional a la cantidad de transcripto en la muestra original
Análisis de resultados
SIEMPRE se normalizan los resultados de
los
genes
analizados
con
genes
“housekeeping” (es decir, aquel que no
debería variar de una muestra a otra)
Ventajas y desventajas
PROS
• Permite analizar un gran número de genes al mismo
tiempo en un sólo experimento
•Se puede observar nivel de expresión
•Permite comparaciones inter e intraespecies
CONS
• No es una medida cuantitativa
• Se requiere conocimiento previo de la secuencia
• Alto costo
•Análisis muy riguroso y matemáticamente dificultoso
• El análisis de los perfiles de
transcripción, no es suficiente para
explicar los cambios funcionales
observados en la célula.
• Los resultados deben confirmarse con
técnicas complementarias (Northern blot,
Real Time-RT-PCR, Hidridación In Situ), lo
que supone una labor adicional.
Otras aplicaciones del Microarray
 Detección de mutaciones y polimorfismos
 Secuenciación
 Diagnóstico clínico
 Screening y toxicología de fármacos
•Farmacogenómica (asociación entre perfil genético
y respuesta terapéuticas a drogas)
•Toxicogenómica (evaluar cambios frente a
sustancias tóxicas)
 Seguimiento de terapia
 Medicina preventiva
 Hibridación comparativa del genoma
 Inmunoprecipitación de la cromatina
GeneChip®
• 50.000 sondas
• No se pueden
procesar dos
muestras a la vez
GeneChip® en el desarrollo de vacunas
Chips microelectrónicos o Nanochip®
Macroarrays
EXTRACCIÓN
DE ARN
ARNm a ADNc
MARCACIÓN
RADIOACTIVA
DE ADNc
HIBRIDACIÓN CON SONDAS
FIJAS EN SOPORTE
(NITROCELULOSA O NYLON)
REVELADO
VENTAJAS: MÁS BARATO, RESULTADO VISIBLE A SIMPLE VISTA
DESVENTAJAS: UNA MUESTRA POR ARRAY, RADIOACTIVIDAD
Arrays de Tejidos o TMA
Consiste en un bloque de
parafina (soporte) que
contiene
hasta
1000
muestras
de
distintos
tejidos
tomadas
de
biopsias y dispuestas en
forma ordenada y en una
posición precisa.
Arrays de Tejidos o TMA
Técnicas para el estudio de expresión
diferencial de genes
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Hibridación Sustractiva
SAGE
ADNc – AFLP
DDRT – PCR
Arrays de ADN
Tratamiento con bisulfito
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Northern Blot
RPA
Real Time PCR
Hibridación In Situ
Estudio de la
expresión
global
Epigenética
Expresión de genes
específicos
Estudio de la metilación del ADN
Técnicas para el estudio de expresión
diferencial de genes
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Hibridación Sustractiva
SAGE
ADNc – AFLP
DDRT – PCR
Arrays de ADN
Tratamiento con bisulfito
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Northern Blot
RPA
Real Time PCR
Hibridación In Situ
Estudio de la
expresión
global
Epigenética
Expresión de genes
específicos
Northern Blot
ARNm