Download SDS-PAGE

JA Carde, PhD
Modificado de Dra. Liza Jiménez
UPR-Ag
Lab Biol 4019
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

Distinguir los diferentes geles de
poliacrilamida utilizados para estudiar
proteínas.
Describir la importancia biológica que posee
la electroforesis de SDS-PAGE en el estudio
de las proteínas.
Caracterizar la proteína α-Lactalbumina a
través de electroforesis de SDS-PAGE.

Extracción, purificación y caracterización

Para verificar si la proteína obtenida es la
deseada.

Pruebas para las propiedades físicas,
químicas o biológicas de la proteína.

SDS-PAGE: Forma de caracterizar la proteína
Arne Tiselius
1937
(Nobel 1948)
ELECTROFORESISSeparar y analizar
moléculas:
Proteínas ADN/ARN
... en función de su diferente carga eléctrica.
Moléc. +  cátodo (-)
Moléc. -  ánodo (+)
cátodo
SOPORTE
+-
ánodo
ELECTROFORESIS DE ZONA
 MATRIZ
(que retiene las moléculas)
Arne Tiselius
1937
(Nobel 1948)

Las proteínas y los ácidos nucleicos: moléculas con
cargas netas que pueden ser separadas en una matriz
gelatinosa utilizando un campo eléctrico
(electroforesis).

La velocidad con que se mueven las moléculas sobre
la matriz gelatinosa depende de
 1) los parámetros físicos de la molécula (forma, carga)
2) la fricción de la molécula y la viscosidad del medio
3) la fuerza del campo eléctrico
1 Campo eléctrico
Diferencia de potencial (V-voltios):
bajo voltaje (10-500 V)
alto voltaje (500-10000 V)
Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica.
depende de V y de R.
Resistencia: determinada por el soporte.
Temperatura: efecto joule  refrigerantes
2 Muestra
Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula
Tamaño: debido al poro de la matriz.
Forma: forma globular vs lineal: avanza más.
3 Amortigudor
pH: determina el grado de solvatación y la carga de las moléculas
generalmente es ligeramente básico  moléc. Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no interfiera
4 Soporte
Adsorción
Porosidad molecular



Las proteínas son separadas utilizando geles
de poliacrilamida.
Los geles son mezcla de acrilamida y bisacrilamida.
A esta mezcla se le añade catalizadores del
proceso de polimerización
 persulfato de amonio (perSO4NH4
 TEMED (N,N,N’N’-tetramethylethylenediamine)
Porosidad
∞ %
Soporte: (restrictivo) :Poliacrilamida
* Polimerización de dos componentes:
Acrilamida + Bisacrilamida
* Variación de la concentración  variación del tamaño de poro
Electroforesis vertical
Ventajas:
* Gran poder de separación(resolución) por CARGA y por
TAMAÑO.
* Químicamente inertes.
* Transparentes (densitograma).
* Estables (pH, fuerza iónica, temperatura).
* Versatilidad en cuanto al tamaño de poro.
1.
2.
3.
4.
5.
Preparación del gel.
Montaje de la cubeta
Aplicación de la muestra.
Electroforesis.
Detección por tinción:
Azul de coomassie
Sales de plata
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


Coloque 15 µl de la muestra de α-Lactalbumina en un
microtubo de 500 µl.
Añada 5 µl de amortiguador de la muestra (Sample Buffer).
Este amortiguador contiene mercaptoetanol, un agente que
reduce los enlaces de disulfuro en las proteínas, asegurando
que se mantiene la configuración helicoidal necesaria para la
determinación del peso molecular (figura 4).
Coloque el tubo en un baño de María a 95º C por 5 minutos.
Remueva el tubo del baño de María y colóquelo en hielo
mientras prepara el gel de poliacrilamida y el tanque de
electroforesis.
DTT/Mercaptoetanol
SDS
Glicerol
Azul Bromofenol
Tris-EDTA
Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa
Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa
Electroforesis horizontal
+
Muestra
Avance de las proteínas
Campo eléctrico (ΔV)
1. Aplicación de la muestra.
1. Electroforesis.
2. Detección por tinción:
Azul de coomassie
Negro amido
Aplicaciones diagnósticas en serología
-
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



Pueden ser desnaturalizados o nativos.
desnaturalizados: se le añade SDS (Sodium
Dodecyl Sulfate), detergente con carga negativa.
El SDS al unirse a la proteina la desdobla haciendo la
molécula soluble.
El SDS le confiere aTODOS los polipéptidos cargas
negativas, la separación de las moléculas es sólo por
tamaño
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
Geles nativos no se utiliza SDS la separación…
Aplicaciones:
 Separar proteínas
 Determinar peso molecular de una proteína
 Separar proteínas oligoméricas
SDS-PAGE
 Separar proteínas en función de su pI
Electroenfoque
 Separar proteínas de mezclas muy complejas
Electroforesis 2D
 Ver si hay una proteína en concreto
Western Blot
Condiciones de la PAGE:
* No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO  PAGE
* Desnaturalizantes: separación sólo por TAMAÑO  SDS-PAGE
Agentes desnaturalizantes: SDS
Urea
Reductores (DTT, b-mercaptoetanol)
S-S
S-S
S-S
S-S
+ SDS
50 kDa
- - - --- -- -- -- - - S-S --
+ SDS
+ DTT
- - - - - -- - - - - - - -
25 kDa
44 kDa
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



Los geles pueden ser continuos o geles
discontinuos. (%, pH,)
continuos: la porosidad (PLT el %) es uniforme a
largo de todo el gel.
discontinuos: poseen diferentes concentraciones
(%) de acrilamida y bis-acrilamida a través de ellos.
“stacking gel”, un gel con poros más grandes; sirve
para empaquetar la muestra en un punto específico.
“resolving gel”, un gel de poros más pequeños;
produce una mayor resolución en la separación de
las proteínas
* Punto isoeléctrico (pI)
pI es el valor de pH en el que la carga de la proteína = 0
si pH > pI: carga –
si pH < pI: carga +
GRADIENTE DE pH
* Gel de poliacrilamida (PAGE) con gradiente de pH.
pH 2
(ácido)
+
+
+
+ +
pH=pI de la proteína
+
0
pI=6
0
0
pH 10
(básico)
Proteínas migran
hasta la zona del gel
donde
-
-
-
pI=7
* 1ra dimensión: ELECTROENFOQUE  separa por pI
* 2da Dimensión:SDS-PAGE  separa por PM
* Immnoblot  interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA
* Detectar una proteína específica dentro de una mezcla
(muy sensible).
1. SDS-PAGE
Electroforesis
2. Transferencia a membrana
3. Incubación con los Anticuerpos
proteínas
2dario
HRP
1ario
proteínas
Resultado
SDS-PAGE
Western BLOT
proteína
interés
4. Revelado
proteína
interés
HRP SUSTRATO
PRODUCTO
Todas las
proteínas
Proteína
de interés
LUZ

Correr junto a las muestras un marcador molecular
estándar (de 8 a 10 proteínas de las cuales se conoce el peso
molecular).

Relación lineal entre el logaritmo del peso molecular de las
moléculas y la distancia recorrida en el gel.

Crear una curva estándar de la distancia de migración versus
el log10 del peso molecular de las proteínas del marcador.

Esta curva se usa para extrapolar el peso molecular de
aquellas proteínas en estudio.

Para crear la curva estándar es necesario:

1) Medir la distancia desde el punto de partida (fosas) del
marcador hasta cada una de las bandas observadas en el
marcador. Se repite lo mismo con las proteínas en estudio.






2) Determinar el log10 del peso molecular de las proteínas que
se encuentran en el marcador estándar y trazar en el eje de Y
utilizando papel de gráfica regular.
3) Trazar la distancia recorrida en el eje de X. Al terminar la
gráfica se observa una línea.
4) Utilizar la distancia recorrida por las muestras y extrapolar a
la línea para determinar el peso molecular.
Marcadores de peso
molecular:
* Mezcla de diferentes
proteínas pre-teñidas de las que
conocemos el peso molecular.
* Por comparación y
extrapolación podemos
averiguar el PM de nuestra
proteína.
1. Coloque los platos que contienen el gel de poliacrilamida entre las






pinzas que lo sostendrán dentro del tanque de electroforesis. Coloque
las pinzas con el gel dentro del tanque.
2. Añada el amortiguador de la corrida (Running Buffer) al tanque de
electroforesis. Asegúrese de cubrir el gel completamente.
3. Utilizando una pipetta de 1-10 µl, añada 5 µl del marcador estándar
a la primera fosa del gel.
4. Utilizando una pipetta de 10-100 µl, añada los 20 µl de la muestra
de α-Lactalbumina (preparada en la parte A) a la segunda fosa del gel.
5. Continué con el paso 4 para cada grupo de trabajo.
6. Coloque la tapa del tanque de electroforesis y conéctela a la caja
de electricidad. Verifique que los polos están correctamente
conectados.
7. Corra la electroforesis a 100 V por 1 hora.
1. Luego de la hora apague la caja de
electricidad.
 2. Saque los platos con el gel de
poliacrilamida. Con mucho cuidado
despegue los platos y remueva el gel.
 3. Coloque el gel en una solución de
“Coomassie Blue” y agite por 30-60
minutos a temperatura ambiente. El
“Coomassie Blue” es preparado en una
solución de ácido acético y etanol, los
cuales fijan las proteínas al gel (figura 5).
 4. Descarte el “Coomassie Blue” y lave
el gel por 10 minutos con agua destilada.
 5. Utilizando una regla mida las
distancias entre las fosas y las diferentes
bandas observadas.

Utilizando los datos obtenidos en la parte experimental
prepare una curva estándar. Estime el peso molecular de la(s)
banda(s) observada(s) en el gel de poliacrilamida.
 2. Al analizar los resultados obtenidos en este ejercicio de
laboratorio, ¿Usted puede concluir que los objetivos del pasado
ejercicio de laboratorio (modulo 9: Extracción y purificación de
proteínas de leche) fueron logrados? Explique su respuesta.
 3. Explique porqué observa más de una banda en la muestra de
-Lactalbumina ¿Qué representan las bandas en la muestra de αLactalbumina?
 4. Mencione otros métodos que pueden ser utilizados para
teñir los geles de poliacrilamida.
 5. Desarrolle una prueba donde se caracterice la αLactalbumina en base a sus propiedades físicas, químicas o
biológicas.


1.
1. SDS
2. Mercaptoetanol
3. Comassie
4. Stacking gel
5. per SO4 NH4
6. Bromofenol
7. PAGE
8. Caracterizar
9. Purificar
10.Calor
a. poliacrilamida
b. cuál es su tamaño?
c. catalizador polimerización
d. azul, buffer de muestra
e. romper puentes H |||| O
f. cargas negatvias
g. solamente eso
h. azul, teñir
i. romper puentes S-S
j. gel discontínua