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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO II:
AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS
LISIS ALCALINA
ENSAYOS DE RESTRICCIÓN
ESQUEMA GENERAL
SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para
que adquieran resistencia a un antibiótico
SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de
Lisis alcalina
SESIÓN 3: FUNCIÓN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en
un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio
DNA genómico
• Forma el nucleoide.
• Es circular.
• Tiene entre 4000 a 5500 genes.
• Tiene un origen de replicación.
DNA plasmídico
• Es DNA extracromosómico
• Circular
• Varían de tamaño
• Su replicación es independiente
del DNA genómico
• Un origen de replicación único o
múltiple.
• Una bacteria puede tener varios
plásmidos diferentes.
• Le
confieren
características
específicas como: resistencia,
patogenecidad y prototrofía.
Superenrrollamiento de plásmidos
Tipos de enrollamiento
• Linearizado: Cuando se cortan ambas cadenas de DNA sólo una vez.
• Parcialmente linearizado: Cuando se ha cortado sólo una de las
cadenas.
• DNA relajado circular: DNA que no se ha empacado.
• Superenrrollado desnaturalizado: Covalentemente cerrado pero
menos empacado que el superenrrollado.
• Superenrrollado: Covalentemente cerrado y muy empacado.
Lineal
Circular
Superenrrollado
Las diferencias en el tamaño de DNA cromosomal y el DNA
plasmídico permite desarrollar las diferentes técnicas de purificación.
Plásmidos
Existen distintos procesos para la purificación de DNA
plasmídico, pero todos incluyen tres pasos:
1. Crecimiento de bacterias en un medio selectivo de
aquellas que llevan el plásmido.
1. Lisis de las bacterias para la liberación del plásmido.
1. Purificación del DNA plasmídico
Purificación de plásmidos
Química
1. Lisis
Mecánica
Cambios en la Tempratura
2. Remover partículas grandes
3. Purificación intermedia
4. Purificación alta resolución
5. Conservar
Disolver
Liofilizar
Formular
Centrifugación
Filtración (uso de membranas)
Precipitación fraccionada
Adsorción a membranas
Métodos cromatográficos:
Intercambio iónico
Filtración en gel
Afinidad
Lisis Alcalina
Es la técnica más utilizada en el aislamiento de plásmidos circulares
provenientes de células bacterianas
Es una método simple,
barato y reproducible
Lisis Alcalina
Es una técnica que explota las diferencia en las propiedades de desnaturalización y
renaturalización del DNA plasmídico (círculos cerrados covalentemente) y el DNA
cromosómico (fragmentado).
La alcalinización con NaOH en presencia de un detergente aniónico fuerte (SDS),
que provoca la lisis celular, desnaturalización del DNA cromosómico y de las
proteínas y la liberación del DNA plasmídico.
Los plásmidos se ven poco afectados por su estructura circular y superenrrollada.
La presencia de alta sal (acetato de potasio), permite la neutralización del medio y
la precipitación de las proteínas y del DNA cromosómico.
El DNA cromosómico y los agregados de proteínas insolubles se separan de el DNA
plasmídico por centrifugación.
El DNA plasmídico queda en el sobrenadante, conservando mayoritariamente su
estructura nativa.
Extracción de DNA plasmídico de bacterias de E. coli transformadas.
Las bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria
Recuperación y tratamiento de las bacterias transformadas
1
2
4
3
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1.- Agregar cultivo de bacterias.
2.- Centrifugar.
3.- Descartar el sobrenadante.
4.- Drenar todo el medio de cultivo.
5.- Resuspender el pellet en solución GTE: (50mM Glucosa, 25mM TrisHCl pH 8.0 y EDTA 10mM):
• La glucosa funciona como osmolito.
• EDTA debilita la membrana, uniéndose a cationes divalentes como
Ca2* y Mg2*.
6.- Resuspender con pipeteo.
Lisis alcalina
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10
7.- Adicionar solución de lisis (NaOH 0.2 N y SDS 1%):
• Ayuda a disolver los fosfolípidos de las membranas y los
componentes proteicos.
• El NaOH desnaturaliza el DNA cromosomal y plasmídico.
8.- Incubar en hielo durante 5 minutos.
9.- Centrifugar.
10.- Transferir el sobrenadante.
11.- Descartar el pellet.
Neutralización y recuperación de DNA plasmídico
11
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13
11.- Adicionar solución de Acetato de potasio 3M preenfriado:
PRECIPITA EL SDS JUNTO CON PROTEÍNAS Y LÍPIDOS
12.- Incubar en hielo durante 5 minutos.
13.- Centrifugar.
14.- Transferir el sobrenadante.
15.- Descartar el pellet.
El DNA cromosomal neutralizado, se precipita junto con el
SDS, las proteínas y los lípidos.
El DNA plasmídico y el RNA no se precipitan, por lo que SE
MANTIENEN EN EL SOBRENADANTE.
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Precipitación del DNA plasmídico
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15.- adicionar Isopropanol:
El isopropanol nos permite precipitar en DNA plasmídico.
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18.- Adicionar etanol 70%:
ESTE PASO INTERMEDIO NOS PERMITE
ELIMINAR LAS SALES SDS Y EL ISOPROPANOL (LA
MEZCLA ISOPROPANOL-ETANOL SE EVAPORA
CON MAYOR RAPIDEZ)
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19
18
16.- Centrifugar.
17.- Descartar el sobrenadante.
19.- Drenar el líquido restante (Ser cuidadoso porque se puede ir la pastilla).
20.- Incubar 5 minutos a TA, o hasta que la muestra este seca.
20
Verificación de la purificación
Para monitorear el progreso de la purificación del plásmido,
y verificar la correcta purificación, se llevan a cabo dos
técnicas principalmente:
1.- Absorbancia a 260 nm
2.- Electroforesis en geles de Agarosa
Absorbancia a 260 nm
Pureza
deldel
DNA
Pureza
DNA
Determinación
de pureza
Pureza
del
DNA
Pureza
del
DNA
Determinación de pureza
Pureza
del
DNA
Determinación
pureza
Contaminantes:
Determinación
de de
pureza
n
n
n
n
A260/A280
A260
n Determinación
de/A
pureza
280
n Relación de 1.9-2.0 alta pureza
/A
A260An/A
Relación
de 1.9-2.0 alta pureza
260
280 280
A260/A
n Relación
1.9-2.0
pureza
n Relación
de280de
1.9-2.0
altaalta
pureza
Determinación de contaminantes de DNA
n Relación
de 1.9-2.0 alta
Determinación
depureza
contaminantes de DNA
Determinación
contaminantes
de DNA
Absorbancia
a 230
contaminación
por fenol o urea
Determinación
de de
contaminantes
de DNA
Absorbancia a 230 contaminación por fenol o urea
Electroforesis en geles de Agarosa
Monitoreo de purificación mediante distintas técnicas:
Electroforesis en geles de Agarosa
1 Precipitación con
isopropanol
2 Cromatografía
intercambío aniónico
3 Filtración con membrana
de nitrocelulosa
4 Lo que se retuvo en la
membrana de
nitrocelulosa
DNA cromosomal
Plásmido abierto
ESQUEMA GENERAL
SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para
que adquieran resistencia a un antibiótico
SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de
Lisis alcalina
SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en
un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio
Los plásmidos tienen:
• Un origen de replicación: Le permite hacer copias de si mismo (replicarse),
independientemente del cromosoma hospedero.
•
Marcadores de selección: Contiene un gen que le confiere resistencia a
algún antibiótico (generalmente), permitiendo aislar las células que nos
sean de interés.
• Sitio de clonación múltiple: Son sitios de secuencia repetida, conocidos
como sitios de restricción. Se encuentran en regiones no esenciales y le
permiten al plásmido abrirse para insertar el DNA.
Enzimas de restricción
Las nucleasas o fosfodiesterasas son enzimas que catalizan la hidrólisis
de los enlaces fosfodiéster.
Existen varias nucleasas como:
restricción
Exonucleasas: Cortan en el último nucleótido.
Endonucleasas: Cataliza la ruptura de enlaces fosfodiester en los
nucleótidos
del interior
n, también
conocidas
comode un polinucleótido.
s que cortan los enlaces
Ribonucleasas:
Son enzimas específicas para ruptura de RNA.
nético
a partir de una
Desoxirribonucleasas: Enzimas específicas para ruptura de DNA.
Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción son endonucleasas que cortan DNA viral
en fragmentos pequeños, convirtiéndolos en no funcionales, de esta
manera la bacteria evita la invasión del bacteriófago (defensa).
Para evitar cortar el propio DNA de la bacteria, se llevan a cabo
modificaciones en su DNA, como metilaciones.
Se les denomina enzimas de restricción, porque restringen la
invasión del bacteriófago.
Existen varios tipos de enzimas de restricción.
Los tipos I y III:
Tienen capacidad de restricción y de metilación.
Reconocen regiones grandes y asimétricas.
Cortan en un sitio diferente al de reconocimiento:
Tipo I: Cortan a una distancia grande de la secuencia de
reconocimiento, en sitios al azar, ya sea río arriba o río abajo. La
enzima que reconoce el sitio de restricción posee 3 subunidades.
Tipo III: Cortan en 5 a 8 pares después del sitio de
reconocimiento.
Características de los diferentes tipos de enzimas de restricción
Enzimas de restricción tipo II:
Este tipo de enzimas de restricción que únicamente cortan, no metilan.
Son endonucleasas (no todas son enzimas de restricción).
La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento.
Cortan enlaces fosfodiéster en sitios de secuencias específicas de 4 a 8
nucleótidos que reconocen y que se denominan sitios de restricción o secuencias
de reconocimiento.
Reconocen secuencias en el DNA palindrómicas (que se leen igual de ambas
direcciones)
Son usadas en Biología
Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen
secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en
molecular,
porque permiten romper en sitios
ambas direcciones)
específicos.
Reconocimiento y Corte de las enzimas de restricción
Los cortes de las enzimas de restricción se dividen en dos tipos de
acuerdo a su sitio de corte en la doble cadena de DNA:
• Extremos cohesivos
• Extremos romos
Extremos romos
Se generan cuando la enzima corta las dos cadenas en el mismo
lugar, generando dos extremos con doble cadena.
Extremos cohesivos
Se generan cuando la enzima corta las dos hebras
asimétricamente, dejando los dos extremos en cadena simple,
complementarios entre sí .
Sitios de restricción útiles en la clonación
• En Biología molecular los sitios de restricción son útiles para la clonación
de genes de interés.
• Estos extremos deben de ser una secuencia conocida, que el gen de
interés tenga en su secuencia.
Enzimas de restricción usadas en Biología molecular
Nomenclatura de las enzimas de restricción
Las enzimas de restricción se nombran de acuerdo al organismo del cuál
provienen y sus características.
Nombre: Eco RI
Enzimas de restricción
E
co
R
I
Ejemplo
Corresponde a:
EscherichiaNomenclatura
Género
E
Escherichia
Género de la bacte
coli
Especie
co
coli bacteriana
Especie de la bact
RY13
Cepa
R a la primera Número
RY13 de identificación
Cepa de la bacteri
Corresponde
I
La primera enzima identificada Orden de identifica
enzima identificada
En la práctica:
Aislamiento de plásmido mediante Lisis alcalina
Objetivos:
• Conocer los fundamentos para la purificación del DNA
plasmídico y su separación del DNA genómico.
• Realizar el aislamiento del DNA plasmídico.
Obtención del plásmido mediante lisis alcalina
Bacterias E. coli transformadas
Figura 4.3. Protocolo de obtención de DNA plasmídico a partir de las células transformantes que se obtuvieron en
la práctica anterior.
En la práctica:
Ensayos de restricción de plásmido
Objetivos:
• Conocer el principio de separación y detección de ácidos
nucleicos en geles de agarosa.
• Emplear electroforesis en geles de agarosa para visualizar
ácidos nucleicos.
• Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos
separados en geles de agarosa.
• Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en la
transformación genética y la biotecnología.
Bacterias E. coli transformadas
En la práctica….
Qué esperamos de:
1) Digestión con BamHl
2) Digestión con Ndel
3) Digestión con BamHl +Ndel