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Lic. Biotec. Diego Dusso
Trabajo final del curso “Diseño, ejecución y reporte de experimentos de
retrotranscripción seguida de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en
tiempo real (RT qPCR)”.
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Diseño experimental
 Definición de grupos de control y experimental: 4 ml de un cultivo de 24 hs a 42 ºC en
caldo Mueller Hinton sangre de Cepas de Campylobacter jejuni aisladas clínicamente y de
alimentos (20 en total) y la cepa de referencia Campylobacter jejuni ATCC 29428 serán
inoculadas en 100 ml de caldo Mueller Hinton sangre fresco y crecidas durante 7 hs en las
condiciones antes descritas para alcanzar la fase exponencial de crecimiento. Pasadas las 7 hs,
las células serán recolectadas por centrifugación a 13000 g durante 5 minutos y resuspendidas
en 20 ml de caldo MH sangre fresco para luego ser expuestas a condiciones de stress (1 hora a
500 µM del agente oxidante paraquat (N, N'-Dimethyl-4, 4′-bipyridinium dichloride), 1 hora a 4
ºC (Shock frío), y fase estacionaria luego de 24 hs de crecimiento). Como control se utilizara el
vehículo en el cual se produjo el stress (Caldo MH sangre sin ningún tratamiento durante 1
hora).
 Numero dentro de cada grupo: 21 cepas expuestas a cada condición de stress y 21
cepas enfrentadas a la condición control.
Muestra
 Descripción: Cultivos celulares crecidos durante 7 hs en caldo mueller hinton sangre
(fase exponencial) y posterior enfrentamiento a las condiciones de stress durante 1 hora.
Cepas control se enfrentan solo al vehículo (Caldo MH sangre sin ningún tratamiento).
 Procedimiento de procesado: Las cepas se cultivarán a 42 ºC durante el tiempo de
tratamiento (1h), posteriormente serán centrifugadas a 13000 rpm x 5 minutos y por ultimo
resuspendidas en agua purificada esteril (5ml).
 Condiciones y duración del almacenamiento de la muestra: Las muestras fueron
almacenadas a -70 ºC durante 24 hs antes de la extracción de RNA.
Extracción de ácidos nucléicos
 Procedimiento e instrumentación: Extracción de RNA utilizando Trizol (invitrogen)
según especificaciones del fabricante. Las muestras serán tratadas con 1 ml de trizol por cada 5
ml de agua purificada con las células resuspendidas. Después de la homogeneización, el
material insoluble del homogenado se separa por centrifugación a 12.000 g durante 10
minutos a 4 °C. El ARN purificado se disuelve en 40 µl agua tratada con DEPC y se almacena a
-70 ° C.
 Nombre del kit y detalles: Reactivo Trizol (invitrogen). Se siguen las especificaciones
del fabricante.
 Detalle de tratamientos con DNasa y RNasa: Tratamiento con DNasa I (Sigma, St.
Louis, MI, USA). El tratamiento con DNasa se realiza según especificaciones del fabricante.
 Evaluación de contaminación (DNA y RNA): La contaminación con DNA será evaluada
por PCR punto final del gen constitutivo cadF.
 Cuantificación de ácidos nucleicos: El RNA se chequea por espectrofotometría
midiendo Abs a 260 nm.
Instrumentos y métodos: Se utiliza la relación de 1 Un. ABS es 40 µg/ml, por lo tanto
uso la formula: CCARN= Abs260*40* Fdil

 Integridad del RNA: La integridad será ensayada por la relación entre las intesidades
de las bandas de los rRNA 16s y 28S luego de electroforesis en gel de agarosa 1.5% teñido con
bromuro de etidio. Solo las muestras con la relación 28s/16s ≥1.7 serán utilizadas
 Testeo de inhibición: La curva estándar será considerada como suficiente para
corroborar que no existe inhibición de la reacción.
Transcripción reversa
 Condiciones completa de reacción: La reacción de transcripción reversa se realizará
con the RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Euromedex, Souffelweyersheim,
France), con primer específicos para el mRNA de interés de acuerdo a especificaciones del
fabricante.
 Cantidad de RNA y volumen de reacción: se utilizarán 250 ng de RNA en cada muestra
en 20 µl de volumen de reacción.
 Oligonucleótidos cebadores y concentración: 3`-ACCAAAATGACCTTCCAAAG-5` a una
concentración de 1.25 µM.
 Transcriptasa reversa y concentración: RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis
Kit (Euromedex, Souffelweyersheim, France)
 Temperatura y tiempo: RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit
(Euromedex, Souffelweyersheim, France)
 Fabricante del reactivo y número de catálogo del programa de análisis de qPCR
(fuente, versión):

Condiciones de almacenamiento del cDNA: Almacenamiento a -20 ºC. Una ves diluido
no se almacenara por mas de un mes.
Información del target de qPCR

Símbolo del gen: flaA

Número de acceso a la secuencia:

Longitud del amplicón: 113 pb
 In silico specificity screen (BLAST, and so on): Todos los primers fueron chequeados
para especificidad utilizando NCBI Primer-BLAST.
Oligonucleótidos de qPCR

Secuencias de primers: flaA FW AGTGGCGAAGTACAATTTAC
flaAREV TCATCTGCTAAAGCTCCAAG
Primers: Fabricante Sigma Aldrich

Secuencia de sonda: No corresponde
Protoolo de qPCR
 Condiciones completas de reacción: PCR cuantitativa en tiempo real se realizó con
SYBR Green I (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) en termociclador applied Biosistem
microamp fast 96 well reaction plates (nº catálogo 4346907). La composición de la mezcla de
PCR para cada muestra es el siguiente: 5 µl de la muestra, cebador reverso (1 µM), cebador de
directo (1 µM) y 15 µl de SYBR Green I Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA,
EE.UU.). El programa de amplificación es como sigue: un paso inicial de desnaturalización a 95
°C (10 min), seguido por 40 ciclos de 15 s a 95 °C y 1 minuto a 60 °C. En cada corrida un control
negativo se incluyó. Una curva de fusión se obtuvo de un primer paso a partir de 50 a 95 ° C,
para controlar las especificidades de la reacción de PCR cuantitativa para cada pareja de
cebadores.
 Volumen de reacción y cantidad de DNA: 20 µl volumen final de reacción y 5 µl de una
dilución 1/40 del RNA.

Concentración de primers, sondas, Mg2+ y dNTP: Primers a 1µM

Identidad y concentración de la Taq polimerasa: 20 µl d SYBR GREEN I master mix
 Identidad y manufactura del buffer kit: (Applied Biosystems, Foster City,
CA, USA).
 Aditivos: No corresponde
 Parámetros completos de termociclado: Desnaturalización inicial 10 min a 95 ºC,
seguidos por 40 ciclos de 95 ºC por 15 seg y 60 ºC por 1 minuto. Desde el 1º paso a partir de
50 ºC a 95 ºC se obtendrá la curva de melting para control de especificidad
 Manufactura del instrumento de qPCR: GeneAmp: applied Biosistem microamp fast
96 well reaction plates (nº catálogo 4346907).
Validación de qPCR
 Especificidad: La especificidad será chequeada por la curva de melting realizada desde
el 1º paso a partir de la rampa de 50 ºC a 95 ºC, y se espera obtener una única curva indicando
reacción específica.
 Curvas de calibración con pendiente y ordenada al origen: La curva de calibración se
realiza corriendo qPCR de distintas diluciones del cDNA del gen de interés.
 Eficiencia de la PCR calculado de la pendiente: Se espera obtener una eficiencia en el
rango de 1.8 a 2 obtenido de la pendiente de la curva

R2 de la curva de calibración: No menor a 0.985

Rango dinámico de linealidad: Se espera linealidad en el rango de diluciones de cDNA
de las diluciones 1/40 a 1/800.
 Cq variation at LOD: Medidas del límite de detección no son necesarias para
cuantificación relativa

Evidencia para LOD:
Análisis de los datos

Programa de análisis de qPCR (fuente, versión):
 Método de determinación de Cq: El umbral se determinara utilizando el método del
umbral basado en amplificación. El umbral se utiliza para especificar los valores de Cq de
muestras.

Identificación y disposición de los outlier

Resultados para NTC: El NTC no debe dar señal.
 Justificación del número y fuente de genes de referencia: El gen de referencia
utilizado es el gen rpoA, el cual se expresa constitutivamente en todas las cepas y no varía con
las condiciones en estudio.
 Descripción del método de normalización: Se utilizo el gen de referencia rpoA para
normalizar la reacción. Se expresan los resultados relativos del gen de interes en función del
gen de referencia

Número y etapas de replicas técnicas: La qPCR será realizada por duplicado

Repetibilidad:
 Métodos estadísticos para la significación de los resultados: Los datos son analizados
por ANOVA.

Software (fuente, versión): Sin datos